RU2746950C1

RU2746950C1 - Method for cryopreservation of plasma microvesicles

Info

Publication number: RU2746950C1
Application number: RU2020131189A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Игоревич Соколов; Ксения Львовна Маркова; Сергей Алексеевич Сельков
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2021-04-22

Abstract

FIELD: medical biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to medical biotechnology, namely to cryopreservation methods. It can be used for cryopreservation of blood plasma microvesicles. For this purpose, venous blood is taken into test tubes with sodium citrate; dextrose solution and sodium heparin solution are added in a ratio of 3.8% of sodium citrate, 3.68 mg of dextrose, and 30 units of heparin per 1 ml of venous blood. After that, the mixture is centrifuged, then platelet-depleted plasma is mixed with DMSO and filtered fetal calf serum (hereinafter – FCS) in a ratio of 40% FCS, 10% DMSO, 50% plasma and frozen in liquid nitrogen.EFFECT: method makes it possible to improve the quality of freezing of microvesicles, increase the preservation of microvesicles after cryofreeze, reduce costs and ensure the availability of the necessary funds for research.1 cl, 1 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к лабораторной медицине, а именно к способам криоконсервации, и может быть использовано для криоконсервации микровезикул плазмы крови.The invention relates to laboratory medicine, namely to methods of cryopreservation, and can be used for cryopreservation of blood plasma microvesicles.

Микровезикулы - субклеточные везикулы, размером 150-1000 нм, выделяемые клетками во внеклеточное пространство как в норме, так и при патологии [Mause, S.F. and С.Weber, Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res, 2010. 107(9): p.1047-57.]. Интерес к ним обусловлен тем, что предполагается их использование в качестве диагностических маркеров различных заболеваний [D'Souza-Schorey, С.and J.W. Clancy, Tumor-derived microvesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers. Genes Dev, 2012. 26(12): p. 1287-99.], так как показано, что при наличии патологии, уровень микровезикул в биологических жидкостях возрастает [Chironi, G., et al, Circulating leukocyte-derived microparticles predict subclinical atherosclerosis burden in asymptomatic subjects. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006. 26(12): p. 2775-80.3].Microvesicles are subcellular vesicles, 150-1000 nm in size, secreted by cells into the extracellular space in both normal and pathological conditions [Mause, S.F. and C. Weber, Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res, 2010. 107 (9): p. 1047-57.]. Interest in them is due to the fact that they are supposed to be used as diagnostic markers of various diseases [D'Souza-Schorey, C. and J.W. Clancy, Tumor-derived microvesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers. Genes Dev, 2012.26 (12): p. 1287-99.], Since it has been shown that in the presence of pathology, the level of microvesicles in biological fluids increases [Chironi, G., et al, Circulating leukocyte-derived microparticles predict subclinical atherosclerosis burden in asymptomatic subjects. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006.26 (12): p. 2775-80.3].

По данным мировой литературы в настоящее время проводится множество исследований микровезикул. Однако работа с микровезикулами достаточно трудоемка и требует большого количества времени, также исследование микровезикул пациентов предполагает сбор значительного количества материала для набора исследуемых групп пациентов. В связи с этим разработка протоколов и методов криоконсервации микровезикул является актуальной задачей.According to the world literature, many studies of microvesicles are currently being carried out. However, work with microvesicles is quite laborious and requires a lot of time, and the study of patient microvesicles involves the collection of a significant amount of material for recruiting the studied groups of patients. In this regard, the development of protocols and methods for cryopreservation of microvesicles is an urgent task.

В настоящее время существуют протоколы по заморозке клеток, они хорошо отработаны. Но микровезикулы более чувствительный объект, нежели клетки, поэтому стандартные протоколы криоконсервации клеток не подходят для криоконсервации микровезикул.Currently, there are protocols for freezing cells, they are well established. But microvesicles are more sensitive than cells, so standard protocols for cell cryopreservation are not suitable for cryopreservation of microvesicles.

Известен способ криоконсервации микровезикул плазмы крови, заключающийся в том, что производится забор венозной крови в специальные пробирки, содержащие цитрат натрия и декстрозу (пробирки - коммерческий продукт), затем производится серия центрифугирований плазмы, обеднение ее от тромбоцитов и быстрая заморозка нескольких миллилитров полученной обедненной от тромбоцитов плазмы в жидком азоте с возможностью хранения образцов в жидком азоте в течение продолжительного срока [Gelderman, М.Р. and J. Simak, Flow cytometric analysis of cell membrane microparticles. Methods Mol Biol. 2008. 484: p. 79-931.There is a known method for cryopreservation of blood plasma microvesicles, which consists in the fact that venous blood is taken into special tubes containing sodium citrate and dextrose (tubes are a commercial product), then a series of plasma centrifugations is performed, depleting it from platelets and quickly freezing several milliliters of the resulting depleted plasma platelets in liquid nitrogen with the possibility of storing samples in liquid nitrogen for an extended period [Gelderman, MR. and J. Simak, Flow cytometric analysis of cell membrane microparticles. Methods Mol Biol. 2008.484: p. 79-931.

Недостатком способа является частичная гибель микровезикул по сравнению с исходным материалом, а также выпадение в осадок фибрина после размораживания. Кроме того, в России в стандартных медицинских учреждениях не используют готовые пробирки, предлагаемые исследователями из США, поэтому для проведения исследования их нужно приобретать за рубежом.The disadvantage of this method is the partial death of microvesicles in comparison with the starting material, as well as precipitation of fibrin after thawing. In addition, in Russia, standard medical institutions do not use ready-made test tubes offered by researchers from the United States, therefore, to conduct a study, they must be purchased abroad.

Известен способ заморозки микровезикул из культуральной среды, заключающийся в том, что после культивирования ткани в качестве криопротектора используют вещество диметилсульфоксид (ДМСО), при этом исследуют концентрации ДМСО, необходимые для сохранения микровезикул на уровне исходной культуральной среды, а также сравнивают протоколы криоконсервации при различных температурных режимах. Анализ микровезикул производили при помощи проточного цитофлюориметра [Романов Ю.А., Волгина Н.Е., Дугина Т.Н., Кабаева Н.В., Сухих Г.Т., Влияние условий хранения на сохранность микровезикул мультипотентных мезаенхимальных стромальных клеток пупочного канатика человека Клеточные технологии в биологии и медицине, 2019. 1: р. 12-16].There is a known method for freezing microvesicles from a culture medium, which consists in the fact that after culturing the tissue, the substance dimethyl sulfoxide (DMSO) is used as a cryoprotectant, while investigating the concentration of DMSO necessary to preserve microvesicles at the level of the original culture medium, and also comparing cryopreservation protocols at different modes. The analysis of microvesicles was performed using a flow cytometer [Romanov Yu.A., Volgina N.E., Dugina T.N., Kabaeva N.V., Sukhikh G.T., The effect of storage conditions on the safety of microvesicles of multipotent mesenchymal stromal cells of the umbilical cord Human Cell technologies in biology and medicine, 2019.1: p. 12-16].

Недостатком способа является то, что в способе не рассматриваются микровезикулы плазмы крови, то есть способ применим к другой культуральной среде.The disadvantage of this method is that the method does not consider microvesicles of blood plasma, that is, the method is applicable to another culture medium.

Технический результат изобретения заключается в увеличении сохранности микровезикул плазмы крови после криозаморозки, снижении расходов, в доступности необходимых средств для исследования.The technical result of the invention consists in increasing the safety of blood plasma microvesicles after cryo-freezing, reducing costs, in the availability of the necessary means for research.

Указанный технический результат достигается в способе криоконсервации микровезикул плазмы крови, включающем забор венозной крови с добавлением цитрата натрия и декстрозы, центрифугирование с целью обеднения тромбоцитами в режиме 9900g при температуре 10°С в течение 5 минут и быструю заморозку в жидком азоте для длительного хранения, в котором венозную кровь забирают в пробирки с цитратом натрия, добавляют раствор декстрозы и раствор гепарина в соотношении 3,8% цитрата натрия, 3,68 мг декстрозы, 30 ЕД гепарина на 1 мл венозной крови, центрифугируют, затем плазму, обедненную от тромбоцитов, смешивают с ДМСО и фильтрованной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) в соотношении: 40% ЭТС, 10% ДМСО, 50% плазмы, замораживают в жидком азоте.The specified technical result is achieved in the method of cryopreservation of blood plasma microvesicles, including the collection of venous blood with the addition of sodium citrate and dextrose, centrifugation for the purpose of depletion of platelets in the 9900g mode at a temperature of 10 ° C for 5 minutes and rapid freezing in liquid nitrogen for long-term storage, in in which venous blood is taken into tubes with sodium citrate, dextrose solution and heparin solution in the ratio of 3.8% sodium citrate, 3.68 mg dextrose, 30 U of heparin per 1 ml of venous blood are added, centrifuged, then the plasma depleted of platelets is mixed with DMSO and filtered fetal calf serum (FBS) in the ratio: 40% FBS, 10% DMSO, 50% plasma, frozen in liquid nitrogen.

Соотношение 3,8% цитрата натрия, 3,68 мг декстрозы, 30 ЕД гепарина на 1 мл венозной крови определено экспериментально. Могут быть использованы стандартные пробирки с цитратом натрия.The ratio of 3.8% sodium citrate, 3.68 mg dextrose, 30 U of heparin per 1 ml of venous blood was determined experimentally. Standard sodium citrate tubes can be used.

Добавление гепарина в плазму на этапе криконсервации позволяет избежать выпадения в осадок фибрина после разморозки плазмы.The addition of heparin to plasma at the stage of cryopreservation avoids fibrin precipitation after plasma thawing.

Смешивание плазмы, обедненной от тромбоцитов, с ДМСО и ЭТС в соотношении 40% ЭТС, 10% ДМСО, 50% плазмы позволяет сохранить микровезикулы различных клеточных популяций, в том числе минорных популяций.Mixing platelet-depleted plasma with DMSO and ETS in a ratio of 40% ETS, 10% DMSO, 50% plasma allows preserving microvesicles of various cell populations, including minor populations.

Таким образом, основные отличительные признаки заявляемого способа позволяют улучшить качество криоконсервации плазмы крови, повысить сохранность микровезикул после разморозки, а также удешевить способ и сделать его более доступным.Thus, the main distinguishing features of the proposed method can improve the quality of cryopreservation of blood plasma, increase the safety of microvesicles after defrosting, as well as reduce the cost of the method and make it more accessible.

Анализ микровезикул проводили на проточном цитофлюориметре.Microvesicles were analyzed using a flow cytometer.

Для анализа микровезикул образцы плазмы быстро размораживали на водяной бане при 37°С, центрифугировали ее, проводили серию отмывок специальными буферами (коммерческие реагенты) полученного осадка микровезикул, далее микровезикулы окрашивали антителами и исследовали при помощи проточного цитофлюориметра.To analyze microvesicles, plasma samples were quickly thawed in a water bath at 37 ° C, centrifuged, a series of washes were performed with special buffers (commercial reagents) of the obtained microvesicle sediment, then the microvesicles were stained with antibodies and examined using a flow cytometer.

Производилась криоконсервация плазмы доноров, в отсутствии каких-либо криопротекторов, так и присутствии отдельных криопротекторов и их смесей, а также произведено сравнение с нативной свежей плазмой. Исследуемые способы криоконсервации (соотношения реагентов везде одинаковые):Cryopreservation of donor plasma was carried out, in the absence of any cryoprotectants, and in the presence of individual cryoprotectants and their mixtures, and a comparison with native fresh plasma was made. The investigated methods of cryopreservation (the ratio of the reagents is the same everywhere):

1. Криоконсервация плазмы в отсутствии криопротекторов;1. Plasma cryopreservation in the absence of cryoprotectants;

2. Криоконсервация плазмы с добавлением только декстрозы;2. Plasma cryopreservation with the addition of dextrose only;

3. Криоконсервация плазмы с добавлением только ДМСО;3. Plasma cryopreservation with the addition of DMSO only;

4. Криоконсервация плазмы с добавлением только ЭТС;4. Plasma cryopreservation with the addition of only ETS;

5. Криоконсервация плазмы с добавлением ЭТС и ДМСО;5. Plasma cryopreservation with the addition of ETS and DMSO;

6. Криоконсервация плазмы с добавлением декстрозы, ДМСО и ЭТС (заявляемый способ);6. Cryopreservation of plasma with the addition of dextrose, DMSO and ETS (the inventive method);

В табл. 1 представлены результаты сравнения способов криоконсервации. Показано количество событий, собранных в результате анализа содержания микровезикул после разморозки плазмы на проточном цитофлюориметре.Table 1 shows the results of a comparison of cryopreservation methods. The number of events collected as a result of analysis of the content of microvesicles after plasma thawing on a flow cytometer is shown.

Данные представлены в виде «медиана {нижний квартиль; верхний квартиль}». Достоверность различий между группами: ## - р<0.01 - отличие от способа криоконсервации с добавлением декстрозы, ДМСО и ЭТС (заявляемый способ); && - р<0.01, &&& - р<0.001 - отличие от свежей плазмы.Data are presented as “median {lower quartile; upper quartile} ". The reliability of differences between the groups: ## - p <0.01 - the difference from the cryopreservation method with the addition of dextrose, DMSO and ETS (the claimed method); && - p <0.01, &&& - p <0.001 - difference from fresh plasma.

Сравнение способов криоконсервации плазмы иллюстрируется также фиг 1, где:Comparison of methods for plasma cryopreservation is also illustrated in Fig. 1, where:

П-плазма, Плазма_крио - способ криоконсервации плазмы в отсутствии криопротекторов; П+декстроза - способ криоконсервации плазмы с добавлением только декстрозы; П+ДМСО - способ криоконсервации плазмы с добавлением только ДМСО; П+ЭТС - способ криоконсервации плазмы с добавлением только ЭТС; П+ДМСО+ЭТС - способ криоконсервации плазмы с добавлением ЭТС и ДМСО; П+декстроза+ДМСО+ЭТС - способ криоконсервации плазмы с добавлением декстрозы, ДМСО и ЭТС (заявляемый способ); Плазма_свежая - нативная свежая плазма. Данные представлены в виде «медиана {нижний квартиль; верхний квартиль}». Достоверность различий между группами: ## - р<0.01 -отличие способа криоконсервации с добавлением декстрозы, ДМСО и ЭТС отличие способа криоконсервации с добавлением декстрозы, ДМСО и ЭТС (заявляемый способ); && - р<0.01,&&& - р<0.001 - отличие от свежей плазмы.P-plasma, Plasma_kryo - a method of plasma cryopreservation in the absence of cryoprotectants; P + dextrose - a method of plasma cryopreservation with the addition of only dextrose; P + DMSO - a method of plasma cryopreservation with the addition of only DMSO; P + ETS - a method of plasma cryopreservation with the addition of only ETS; P + DMSO + ETS - a method of plasma cryopreservation with the addition of ETS and DMSO; P + dextrose + DMSO + ETS - a method of plasma cryopreservation with the addition of dextrose, DMSO and ETS (the inventive method); Plasma_Fresh - native fresh plasma. Data are presented as “median {lower quartile; upper quartile} ". Significance of differences between groups: ## - p <0.01 - difference in cryopreservation method with the addition of dextrose, DMSO and ETS; difference in cryopreservation method with the addition of dextrose, DMSO and ETS (the inventive method); && - p <0.01, &&& - p <0.001 - difference from fresh plasma.

Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы Graph Prism 8.0. Для сравнение полученных данных использовался многофакторный дисперсионный анализ Anova. Статистически значимыми признавались различия при р<0,05, р<0,01, р<0,001. Эксперименты проводили четыре раза, в каждом эксперименте для каждого способа криоконсервации использовали по 3 повтора.The data obtained were statistically processed using the Graph Prism 8.0 software. Anova multivariate analysis of variance was used to compare the data obtained. Differences were recognized as statistically significant at p <0.05, p <0.01, p <0.001. The experiments were carried out four times, in each experiment for each method of cryopreservation, 3 repetitions were used.

Выявлено, что заявляемый способ криоконсервации позволяет сохранить популяцию лейкоцитарных микровезикул - минорную популяцию микровезикул плазмы крови, на уровне сопоставимом со свежей нативной плазмой.It was revealed that the claimed method of cryopreservation allows preserving the population of leukocyte microvesicles - a minor population of blood plasma microvesicles, at a level comparable to fresh native plasma.

Способ осуществляют, например, следующим образом.The method is carried out, for example, as follows.

Материалы и растворы, необходимые для криоконсервации микровезикул из периферической крови:Materials and solutions required for cryopreservation of microvesicles from peripheral blood:

1. Декстроза (моногидрат D-глюкозы).1. Dextrose (D-glucose monohydrate).

2. Раствор Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺ или эквивалентный раствор.2. Hanks solution without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ or an equivalent solution.

3. Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС).3. Fetal bovine serum (FBS).

4. Диметилсульфоксид (ДМСО).4. Dimethyl sulfoxide (DMSO).

5. Гепарин натрия (раствор для инъекций).5. Heparin sodium (solution for injection).

6. Пробирки для забора крови, содержащие 3.8% цитрата натрия или эквивалентные пробирки с содержанием цитрата натрия, достаточным для ингибирования свертывания крови.6. Collection tubes containing 3.8% sodium citrate or equivalent tubes containing sufficient sodium citrate to inhibit blood clotting.

7. Мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.7. Membrane filters with a pore diameter of 0.2 µm.

8. Пробирки эппендорф.8. Eppendorf tubes.

9. Криопробирки.9. Cryotubes.

10. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 300 мкл, до 1000 мкл.10. Disposable tips for variable volume pipettes up to 10 µl, up to 300 µl, up to 1000 µl.

Необходимое оборудование:Necessary equipment:

1. Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.1. Vertical laminar flow cabinet.

2. Набор механических дозаторов переменного объема.2. A set of mechanical dispensers of variable volume.

3. Центрифуга.3. Centrifuge.

4. Холодильник 6+2°С.4. Refrigerator 6 + 2 ° С.

5. Жидкий азот и сосуд Дьюара для жидкого азота.5. Liquid nitrogen and Dewar vessel for liquid nitrogen.

6. Аккумуляторы холода (хладагенты) лабораторные.6. Laboratory cold accumulators (refrigerants).

Перед криоконсервацией микровезикул необходимо:Before cryopreservation of microvesicles, it is necessary:

1. Сделать стерильный раствор декстрозы в растворе Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺ или эквивалентном растворе, профильтровать его через фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм.1. Make a sterile dextrose solution in Hanks solution without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ or an equivalent solution, filter it through filters with a pore diameter of no more than 0.2 µm.

2. Инактивировать ЭТС, и профильтровать ее через фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм.2. Inactivate the ETS and filter it through filters with a pore diameter of no more than 0.2 µm.

Затем осуществляют криоконсервацию микровезикул.Then carry out the cryopreservation of microvesicles.

Это можно делать как в стерильных условия, работая в ламинарно-потоковом шкафу, так и в нестерильных условиях. В обоих случаях необходимо работать с использованием лабораторных хладагентов.This can be done both under sterile conditions, working in a laminar flow cabinet, and under non-sterile conditions. In both cases, it is necessary to work with laboratory refrigerants.

1. Произвести забор крови из локтевой вены в пробирку с голубой крышкой, содержащей 3.8% цитрата натрия или эквивалентную пробирку с содержанием цитрата натрия, достаточным для ингибирования свертывания крови.1. Draw blood from the cubital vein into a blue-capped tube containing 3.8% sodium citrate or an equivalent tube containing sufficient sodium citrate to inhibit blood coagulation.

2. Пробирки со свежей кровью хранить не более 1 часа при +4°С.2. Store tubes with fresh blood for no more than 1 hour at + 4 ° C.

3. В пробирку со свежей кровью добавляют раствор декстрозы, приготовленный в растворе Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺ или эквивалентном растворе из расчета 3,68 мг декстрозы на 1 мл периферической крови.3. Add a dextrose solution prepared in Hanks solution without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ or an equivalent solution to a test tube with fresh blood at the rate of 3.68 mg dextrose per 1 ml of peripheral blood.

4. Аккуратно перемешивают содержимое пробирки, переворачивая ее несколько раз.4. Gently mix the contents of the tube by inverting it several times.

5. Центрифугируют пробирку с периферической кровью и раствором декстрозы при +10°С, 2600g 15 минут (стадия обеднения плазмы от клеточной массы);5. Centrifuge the tube with peripheral blood and dextrose solution at + 10 ° C, 2600g for 15 minutes (stage of plasma depletion from cell mass);

6. Переносят плазму, обедненную от клеточной массы в пробирки эппендорф.6. Transfer the cell-depleted plasma into Eppendorf tubes.

7. Добавляют гепарин натрия в пробирки эппендорф с отобранной плазмой из расчета 30 ЕД гепарина натрия на 1 мл плазмы.7. Add sodium heparin to Eppendorf tubes with the selected plasma at the rate of 30 units of sodium heparin per 1 ml of plasma.

8. Центрифугируют пробирки эппендорф с плазмой при +10°С, 9900g 5 минут (стадия обеднения плазмы от тромбоцитов).8. Centrifuge Eppendorf tubes with plasma at + 10 ° C, 9900g for 5 minutes (stage of depletion of plasma from platelets).

9. Маркируют криопробирки, переносят в них плазму, обедненную от тромбоцитов, добавляют ЭТС и ДМСО. Конечный раствор плазмы в криопротекторах должен содержать: 40% ЭТС, 10% ДМСО и 50% плазмы.9. Cryotubes are labeled, plasma depleted of platelets is transferred into them, ETS and DMSO are added. The final plasma solution in cryoprotectants should contain: 40% ETS, 10% DMSO and 50% plasma.

10. Аккуратно перемешивают содержимое, переворачивая криопробирку несколько раз.10. Gently mix the contents by inverting the cryovial several times.

11. Криопробирки с содержимым быстро замораживают в жидком азоте. Для этого помещают криопробирки в резервуар для хранения в жидком азоте (сосуд Дьюара), хранят до проведения дальнейшего анализа.11. Cryotubes containing the contents are quickly frozen in liquid nitrogen. For this, cryovials are placed in a storage tank in liquid nitrogen (Dewar flask), stored until further analysis.

Способ позволяет повысить качество заморозки микровезикул, увеличить сохранности микровезикул плазмы крови после криозаморозки, снизить расходы на исследование, обеспечить доступность необходимых средств для исследования.The method allows to improve the quality of freezing of microvesicles, to increase the safety of blood plasma microvesicles after cryofreezing, to reduce research costs, to ensure the availability of the necessary means for research.

Список литературыBibliography

1. Mause, S.F. and С.Weber, Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res, 2010. 107(9): p. 1047-57.1. Mause, S.F. and C. Weber, Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res, 2010.107 (9): p. 1047-57.

2. D'Souza-Schorey, C. and J.W. Clancy, Tumor-derived micro vesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers. Genes Dev, 2012. 26(12): p. 1287-99.2. D'Souza-Schorey, C. and J.W. Clancy, Tumor-derived micro vesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers. Genes Dev, 2012.26 (12): p. 1287-99.

3. Chironi, G., et al., Circulating leukocyte-derived microparticles predict subclinical atherosclerosis burden in asymptomatic subjects. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006. 26(12): p. 2775-80.3. Chironi, G., et al., Circulating leukocyte-derived microparticles predict subclinical atherosclerosis burden in asymptomatic subjects. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006.26 (12): p. 2775-80.

4. Federici, C, et al., Natural-Killer-Derived Extracellular Vesicles: Immune Sensors and Interactors. Front Immunol, 2020. 11: p. 262.4. Federici, C, et al., Natural-Killer-Derived Extracellular Vesicles: Immune Sensors and Interactors. Front Immunol, 2020.11: p. 262.

5. Mikhailova, V.A., et al., Detection of microparticles of leukocytic origin in the peripheral blood in normal pregnancy and preeclampsia. Bull Exp Biol Med, 2014.157(6): p. 751-6.5. Mikhailova, V.A., et al., Detection of microparticles of leukocytic origin in the peripheral blood in normal pregnancy and preeclampsia. Bull Exp Biol Med, 2014.157 (6): p. 751-6.

6. Khalaj, K., et al., Extracellular vesicles from endometriosis patients are characterized by a unique miRNA-lncRNA signature. JCI Insight, 2019. 4(18).6. Khalaj, K., et al., Extracellular vesicles from endometriosis patients are characterized by a unique miRNA-lncRNA signature. JCI Insight, 2019.4 (18).

7. Gelderman, M.P. and J. Simak, Flow cytometric analysis of cell membrane microparticles. Methods Mol Biol, 2008. 484: p. 79-93.7. Gelderman, M.P. and J. Simak, Flow cytometric analysis of cell membrane microparticles. Methods Mol Biol, 2008.484: p. 79-93.

8. Романов Ю.А., Волгина Н.Е., Дугина Т.Н., Кабаева Н.В., Сухих Г.Т., Влияние условий хранения на сохранность микровезикул мультипотентных мезаенхимальных стромальных клеток пупочного канатика человека Клеточные технологии в биологии и медицине, 2019. 1: р. 12-16.8. Romanov Yu.A., Volgina N.Ye., Dugina T.N., Kabaeva N.V., Sukhikh G.T., Influence of storage conditions on the safety of microvesicles of multipotent mesenchymal stromal cells of the human umbilical cord Cell technologies in biology and medicine, 2019.1: p. 12-16.

Claims

A method for cryopreservation of blood plasma microvesicles, including the collection of venous blood with the addition of sodium citrate and dextrose, centrifugation for depletion of platelets in the mode of 9900 g at a temperature of 10 ° C for 5 minutes and rapid freezing in liquid nitrogen for long-term storage, characterized in that venous blood is taken into tubes with sodium citrate, dextrose solution and sodium heparin solution in the ratio of 3.8% sodium citrate, 3.68 mg dextrose, 30 U of heparin per 1 ml of venous blood are centrifuged, then the plasma depleted of platelets is mixed with DMSO and filtered fetal calf serum (FBS) at a ratio of 40% FBS, 10% DMSO, 50% plasma and frozen in liquid nitrogen.