RU2745663C1

RU2745663C1 - Method of anufacturing a matrix biosensor based on reduced graphene oxide and a matrix biosensor on a polymer substrate

Info

Publication number: RU2745663C1
Application number: RU2019145358A
Authority: RU
Inventors: Владимир Александрович Нелюб; Максим Андреевич Орлов; Александр Николаевич Калинников; Алексей Сергеевич Бородулин; Иван Александрович Комаров; Ольга Михайловна Антипова; Николай Сергеевич Стручков
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-03-30

Abstract

FIELD: biotech.

SUBSTANCE: essence of the invention lies in the fact that the manufacture of a matrix biological sensor based on reduced graphene oxide includes the formation of a graphene oxide film on a polymer substrate, local modification of an oxide-graphene film according to a given pattern with the formation of several conducting channels and immobilization of biomolecules on a modified oxide-graphene film providing selective interaction with other biological agents. Moreover, the formation of a graphene oxide film is carried out using liquid deposition methods. Local modification of the oxide-graphene film with a given topological pattern is carried out by incomplete restoration of the region with this pattern with further removal of the unreduced film in order to improve the adhesion of the protective polymer film. The resulting blank of the biological sensor is covered with a protective polymer film, with the exception of the areas of contacts and holes located above the areas of immobilization of biomolecules. Immobilization of biomolecules is carried out by the method of liquid deposition from solutions independently on different areas due to the interaction of biomolecules with oxygen-containing functional groups in reduced graphene oxide. Also, biomolecules sensitive to different biological agents are immobilized on different biosensitive areas.

EFFECT: provision of the possibility of creating a highly sensitive and highly selective biological sensor, which makes it possible to obtain information about the presence of several biological agents in one sample and which makes it possible to ensure multiple measurements and integration into personal devices for monitoring the human health state.

13 cl, 2 dwg

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию устройств с несколькими биочувствительными областями на основе восстановленного оксида графена. Способ изготовления матричного биологического сенсора на основе восстановленного оксида графена включает формирование на полимерной подложке пленки оксида графена, локальную модификацию оксид-графеновой пленки по заданному рисунку с образованием нескольких проводящих каналов и иммобилизацию на модифицированной оксид-графеновой пленке биомолекул, обеспечивающих избирательное взаимодействие с другими биологическими агентами. При этом формирование пленки оксида графена проводится с помощью жидкостных методов нанесения. Локальную модификацию оксид графеновой пленки с заданным топологическим рисунком осуществляют путем неполного восстановления области с данным рисунком с дальнейшим удалением невосстановленной пленки с целью улучшения адгезии защитной полимерной пленки. Полученную заготовку биологического сенсора покрывают защитной полимерной пленкой за исключением областей контактов и отверстий, находящихся над областями иммобилизации биомолекул. Иммобилизацию биомолекул проводят методом жидкостного нанесения из растворов независимо на разные области за счет взаимодействия биомолекул с кислородсодержащими фукнциональными группами в восстановленном оксиде графена. При этом на разные биочувствительные области производится иммобилизация биомолекул, чувствительных к отличным друг от друга биологическим агентам. Изобретение позволяет создать высокочувствительный и высокоселективный биологический сенсор, позволяющий получать информацию о присутствии нескольких биологических агентов в одной пробе и позволяет обеспечить многократные измерения и интеграцию в персональные устройства мониторинга состояния здоровья человека.The invention relates to biotechnology, in particular to the creation of devices with several biosensitive regions based on reduced graphene oxide. A method for manufacturing a matrix biological sensor based on reduced graphene oxide includes the formation of a graphene oxide film on a polymer substrate, local modification of an oxide-graphene film according to a given pattern with the formation of several conducting channels, and immobilization of biomolecules on a modified oxide-graphene film providing selective interaction with other biological agents ... In this case, the formation of a graphene oxide film is carried out using liquid deposition methods. Local modification of a graphene oxide film with a given topological pattern is carried out by incomplete restoration of the region with this pattern with further removal of the unreduced film in order to improve the adhesion of the protective polymer film. The resulting blank of the biological sensor is covered with a protective polymer film, except for the areas of contacts and holes located above the areas of immobilization of biomolecules. Immobilization of biomolecules is carried out by the method of liquid deposition from solutions independently on different areas due to the interaction of biomolecules with oxygen-containing functional groups in reduced graphene oxide. At the same time, biomolecules sensitive to different biological agents are immobilized on different biosensitive areas. The invention makes it possible to create a highly sensitive and highly selective biological sensor, which makes it possible to obtain information about the presence of several biological agents in one sample and allows for multiple measurements and integration into personal devices for monitoring the state of human health.

Описание изобретенияDescription of the invention

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию устройств с несколькими биочувствительными областями на основе восстановленного оксида графена, конкретно к созданию на его основе матричного биосенсора на гибкой подложке, который может быть использован в диагностической медицине для одновременного обнаружения нескольких разнотипных биологических агентов.The invention relates to biotechnology, namely to the creation of devices with several biosensitive regions based on reduced graphene oxide, specifically to the creation on its basis of a matrix biosensor on a flexible substrate, which can be used in diagnostic medicine for the simultaneous detection of several different types of biological agents.

Известны способы получения биологических сенсоров на основе оксида графена, восстановленного оксида графена и углеродных нанотрубок, которые включают в которые включают в себя формирование пленки ОГ/ВОГ, путем нанесения из водной или органической суспензии капельным, струйным, аэрозольным, центрифужным методом, методом Лэнгмюр-Блоджетт или иным на поверхности диэлектрической подложки (стеклянной, кварцевой или полимерной) сдальнейшим ковалентным связыванием с ОГ/ВОГ химических соединений, обладающих биологической чувствительностью.Known methods for producing biological sensors based on graphene oxide, reduced graphene oxide and carbon nanotubes, which include the formation of an exhaust gas / FOG film, by applying a drop, jet, aerosol, centrifugal method from an aqueous or organic suspension, by the Langmuir-Blodgett method or otherwise on the surface of a dielectric substrate (glass, quartz or polymer) with further covalent bonding of chemical compounds with biological sensitivity to OG / ROG.

Из уровня техники в патенте HP 2848929 А1 [Г] описан биологический сенсор на основе графенового полевого транзистора, являющийся чувствительным к биомолекулам - переносчикам запахов. Согласно приведенным данным изобретение относится к биомолекулярному сенсорному устройству, содержащему по меньшей мере один графеновый слой в качестве полупроводникового материала, причем к слою графена привязан слой лигандосвязывающих белков. Принцип работы устройства заключается в том, что белок при связывании за счет своего электрического заряда влияет на такие характеристики устройства как полевой эффект или импеданс.Недостатком данного сенсора является относительная сложность конструкции графенового полевого транзистора, а также невозможность использования гибких подложек, что с учетом ориентации на носимые устройства персонализированного мониторинга здоровья представляется существенным ограничением в практическом применении.From the prior art patent HP 2848929 A1 [D] describes a biological sensor based on a graphene field-effect transistor, which is sensitive to biomolecules - carriers of odors. According to the above data, the invention relates to a biomolecular sensor device containing at least one graphene layer as a semiconductor material, and a layer of ligand-binding proteins is attached to the graphene layer. The principle of operation of the device is that the protein, when bound due to its electric charge, affects such characteristics of the device as the field effect or impedance. The disadvantage of this sensor is the relative complexity of the graphene field-effect transistor design, as well as the impossibility of using flexible substrates, which, taking into account the orientation to wearable personalized health monitoring devices appear to be a significant limitation in practical application.

В патенте RU 2527699 С1 [2] описан способ получения биологического сенсора, который включает в себя стадии нанесения металлической пленки, промежуточного связующего слоя и биоспецифического слоя. При этом достигается высокая чувствительность биосенсора в сочетании с высокой биоспецифичностью, появляется возможность детектирования крупных биологических объектов. Заявленный биологический сенсор работает на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, где в качестве основы сенсора выступают тонкие пленки графена, оксида графена или углеродных нанотрубок. Конструкция данного сенсора включает подложку, на поверхность которой нанесена тонкая металлическая пленка, на которую, в свою очередь нанесен слой графена, оксида графена или углеродных нанотрубок, использующийся в качестве связывающего или промежуточного для нанесения биоспецифического слоя. Данный слой также выполняет как функцию адсорбата биоспецифических молекул и веществ, так и защищает металлическую пленку от внешних воздействий и позволяет использовать в процессе биодетектирования реагенты, которые могли бы повредить поверхность металла, а также использовать такие плазменные материалы, как серебро. В качестве биоспецефического слоя могут выступать молекулы авидина, стрептавидина, дегликозилированного авидина, пары рецептор-лиганд, антиген-антитело, ферментсубстрат. Связывающим партнером анализируемого вещества может являться антитело, кроме того, связывающим партнером анализируемого вещества может являться связывающий партнер протеинов, липидов, ДНК, РНК, вирусов, клеток, бактерий или токсинов, а также химических модификаций приведенных веществ. К недостаткам данного устройства можно отнести необходимость в использовании только твердых подложек, а также необходимость в подключении к системе формирования электромагнитных волн (обычно световых, т.е. обычно фотоизлучатель и фотоприемник), что ограничивает интегрируемость данной конструкции сенсора в носимые устройства персонализированного мониторинга состояния здоровья.Patent RU 2527699 C1 [2] describes a method for producing a biological sensor, which includes the steps of applying a metal film, an intermediate bonding layer and a biospecific layer. In this case, a high sensitivity of the biosensor is achieved in combination with a high biospecificity, and it becomes possible to detect large biological objects. The claimed biological sensor operates on the effect of surface plasmon resonance, where thin films of graphene, graphene oxide, or carbon nanotubes act as the sensor base. The design of this sensor includes a substrate, on the surface of which a thin metal film is applied, on which, in turn, a layer of graphene, graphene oxide or carbon nanotubes is deposited, which is used as a binding or intermediate for the deposition of a biospecific layer. This layer also serves as an adsorbate of biospecific molecules and substances, and protects the metal film from external influences and allows the use of reagents in the biodetection process that could damage the metal surface, as well as the use of plasma materials such as silver. Molecules of avidin, streptavidin, deglycosylated avidin, receptor-ligand pairs, antigen-antibody, enzyme-substrate can act as a biospecific layer. The binding partner of the analyte can be an antibody; in addition, the binding partner of the analyte can be a binding partner of proteins, lipids, DNA, RNA, viruses, cells, bacteria, or toxins, as well as chemical modifications of these substances. The disadvantages of this device include the need to use only solid substrates, as well as the need to connect to a system for generating electromagnetic waves (usually light, i.e. usually a photo emitter and a photodetector), which limits the integrability of this sensor design into wearable devices for personalized health monitoring. ...

В публикации заявки US 2017/0059507 А1 [3| описан сенсор чувствительный к формальдегиду электрохимический сенсор на основе графена с иммобилизованной на его поверхности формальдегиддегидрогеназы. Кроме того, конструкция сенсора предполагает наличие флюидной системы, с помощью которой происходить подача формальдегид содержащего раствора к чувствительной области, а также чувствительной области, находящейся между рабочим и противоэлектродом. Конструкция данного сенсора также предполагает использование твердотельной подложки, а также использование традиционных методов формирования паттернов контактов и чувствительных областей, таких как фотолитография. Эти особенности конструкции определяют относительную дороговизну и сложность приборного оснащения производства подобных сенсоров, а также ограниченные возможности по использованию сенсоров такой конструкции в носимых устройствах мониторинга.In the publication of the application US 2017/0059507 A1 [3 | A formaldehyde-sensitive electrochemical sensor based on graphene with formaldehyde dehydrogenase immobilized on its surface is described. In addition, the design of the sensor assumes the presence of a fluid system, with the help of which the formaldehyde-containing solution is supplied to the sensitive area, as well as the sensitive area located between the working and counter electrodes. The design of this sensor also involves the use of a solid substrate, as well as the use of traditional methods of contact patterning and sensitive areas, such as photolithography. These design features determine the relative high cost and complexity of the instrumentation for the production of such sensors, as well as the limited possibilities for using sensors of this design in wearable monitoring devices.

В публикации заявки WO 2011004136 А1 [4], которую предлагается взять в качестве прототипа для заявляемых объектов, описан биосенсор на основе графена, включающий в себя паттернированную графеновую область, два электрических контакта, расположенных в контакте с наттернированной графеновой областью и предназначенных для определения проводимости графеновой области. В конструкции сенсора также предусмотрен как минимум один линкер, требующийся для связи с биологической молекулой. В качестве линкера предлагается использовать анилин, диазониевый ион или диазониевая соль. Также в патенте описан способ функционализации графена за счет нанесения на его поверхность нитробензола с восстановлением его до анилина. Однако, конструкция сенсора, описанная в данном техническом решении опять же предполагает использование твердых кристаллических подложек (в частности, карбида кремния), что ограничивает возможности интеграции сенсора в персонализированные носимые устройства мониторинга состояния здоровья.In the publication of the application WO 2011004136 A1 [4], which is proposed to be taken as a prototype for the claimed objects, a graphene-based biosensor is described, which includes a patterned graphene region, two electrical contacts located in contact with the interned graphene region and designed to determine the conductivity of the graphene area. The sensor design also provides at least one linker required to bind to a biological molecule. It is proposed to use aniline, diazonium ion or diazonium salt as a linker. The patent also describes a method for functionalizing graphene by applying nitrobenzene to its surface with its reduction to aniline. However, the sensor design described in this technical solution again assumes the use of solid crystalline substrates (in particular, silicon carbide), which limits the possibilities of integrating the sensor into personalized wearable health monitoring devices.

Особенностями способов создания биосенсоров в описанных выше работах 1-4 является использование графена в качестве слоя проводящего материала, к которому в дальнейшем идет привязка биочувствительного слоя. Во всех известных устройствах используются различные линкеры, которые позволяют формировать поверх графенового слоя слой биочвуствительного компонента. При этом формирование биочувствителыюго слоя предполагает связывание биочувствительного агента через какой-либо линкер.A feature of the methods for creating biosensors in the above-described works 1-4 is the use of graphene as a layer of a conductive material, to which the biosensitive layer is subsequently bound. In all known devices, various linkers are used, which make it possible to form a layer of a biosensitive component over the graphene layer. In this case, the formation of a biosensitive layer involves the binding of a biosensitive agent through a linker.

Раскрытие изобретении.Disclosure of the invention.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение селективности и чувствительности, а также возможности проводить одновременную детекцию нескольких различных биологических агентов за счет способа его получения, включающего формирование нескольких каналов проводимости из слабовосстановленного оксида графена и последующей иммобилизации биомолекул - аптамеров на поверхность восстановленного оксида графена без применения промежуточного звена - линкеров. Сформированный сенсор является устройством резистивного типа (большая часть аналогов из уровня техники созданы на основе полевого транзистора), что позволяет формировать сенсор на гибких полимерных подложках, а также упрощать и удешевлять технологию его производства.The technical objective of the present invention is to increase the selectivity and sensitivity, as well as the ability to carry out the simultaneous detection of several different biological agents due to the method of its preparation, including the formation of several conduction channels from weakly reduced graphene oxide and subsequent immobilization of biomolecules - aptamers on the surface of reduced graphene oxide without the use of an intermediate - linkers. The formed sensor is a resistive device (most of the prior art analogs are based on a field-effect transistor), which makes it possible to form a sensor on flexible polymer substrates, as well as to simplify and reduce the cost of its production technology.

Техническим результатом является создание высокочувствительного матричного биосенсора на основе восстановленного оксида графена с несколькими чувствительными областями на единой подложке, имеющего возможность многократных независимых измерений на присутствие нескольких различных биологических агентов и интеграции в персонализированные устройства мониторинга состояния здоровья человекаThe technical result is the creation of a highly sensitive matrix biosensor based on reduced graphene oxide with several sensitive regions on a single substrate, which has the ability to multiple independent measurements for the presence of several different biological agents and integration into personalized devices for monitoring human health

Сущность технического решения состоит в следующем.The essence of the technical solution is as follows.

Пленка оксида графена на гибкой или твердой подложке могут использоваться такие методы нанесения растворов как капельное или центрифужное нанесение. С помощью указанных методов формируется пленка толщиной 0,005-2 мкм.Graphene oxide film on a flexible or solid substrate can be applied by such methods of deposition of solutions as drop or centrifugal deposition. Using these methods, a film with a thickness of 0.005-2 microns is formed.

В качестве материала подложки используются полимеры с температурой плавления не менее 240°С, выдерживающие сушку при температуре более 100°С с помощью термошкафа, электроплитки, паяльного фена и других подобных устройств, с целью удаления растворителя. К подобным полимерам, в частности, относятся полиэтилентерефталат и полиэтиленнафталат.As a substrate material, polymers with a melting point of at least 240 ° C are used, which can withstand drying at a temperature of more than 100 ° C using an oven, electric stove, soldering hair dryer and other similar devices in order to remove the solvent. Such polymers include, in particular, polyethylene terephthalate and polyethylene naphthalate.

Для обеспечения ковалентной иммобилизации биологически-чувствительного вещества (аптамера) необходимо, чтобы в области топологического рисунка происходило неполное восстановление оксида графена, что обеспечивает наличие карбоксильных функциональных групп, которые являются сайтами ковалентного связывания восстановленного оксида графена с аминомодифицированным аптамером.To ensure the covalent immobilization of a biologically sensitive substance (aptamer), it is necessary that incomplete reduction of graphene oxide occurs in the region of the topological pattern, which ensures the presence of carboxyl functional groups, which are the sites of covalent binding of reduced graphene oxide with an aminomodified aptamer.

Неполное восстановление оксида графена можно проводить как химическими, так и термическими методами. Однако для обеспечения возможности формирования требуемого топологического рисунка с несколькими чувствительными областями предпочтительно использовать метод лазерного-индуцированного восстановления. При использовании метода лазерно-индуцированного восстановления достигается локализация областей восстановления ОГ и обеспечивается высокая точность воспроизведения параметров. Техническая реализация восстановления оксида графена может быть произведена как импульсными лазерными установками, так и установками непрерывного действия.Incomplete reduction of graphene oxide can be carried out by both chemical and thermal methods. However, in order to be able to form the desired topological pattern with several sensitive regions, it is preferable to use the method of laser-induced reconstruction. When using the method of laser-induced recovery, localization of the areas of exhaust gas recovery is achieved and high accuracy of the parameters reproduction is ensured. The technical implementation of the reduction of graphene oxide can be carried out both by pulsed laser devices and continuous-action devices.

Для обеспечения биодетекции на топологический рисунок областей восстановленного оксида графена производится ковалентная иммобилизация аптамеров, при этом для каждой области используется отдельный тип аптамеров, что позволяет создавать матрицу из биочувствительных областей на единой подложке. Для ковалентной иммобилизации аптамеров на функциональных группах -СООН чаще всего применяется связка 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) и N-Гидроксисукцинимид (NHS), при этом иммобилизация происходит в несколько стадий. Для создания предлагаемого матричного биосенсора, в отличие от вышеуказанных источников уровня техники, используется одностадийный процесс иммобилизации аптамеров на восстановленный оксид графена с помощью раствора EDC в дистиллированной воде с добавлением этанола.To provide biodetection on the topological pattern of reduced graphene oxide regions, aptamers are covalently immobilized, with a separate type of aptamer used for each region, which makes it possible to create a matrix of biosensitive regions on a single substrate. For the covalent immobilization of aptamers on the -COOH functional groups, a ligament of 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-Hydroxysuccinimide (NHS) is most often used, while the immobilization occurs in several stages. To create the proposed matrix biosensor, in contrast to the above-mentioned prior art sources, a one-stage process of immobilization of aptamers on reduced graphene oxide using an EDC solution in distilled water with the addition of ethanol is used.

Для электрической изоляции областей экспонирования используется изоляционный слой в виде нанесенной полимерной пленки полиэтилентерефталата толщиной до 60 мкм.For electrical isolation of the exposure areas, an insulating layer is used in the form of an applied polymer film of polyethylene terephthalate up to 60 µm thick.

Для ограничения областей экспонирования и исключения возможности замыкания подводящих электродов в заданных местах изоляции формируются окна с подобранным размером, соответствующим ширине топологического рисунка области восстановленного оксида графена в данном месте.To limit the areas of exposure and to exclude the possibility of closing the lead electrodes in the specified places of the insulation, windows are formed with a selected size corresponding to the width of the topological pattern of the region of reduced graphene oxide in this place.

Для обеспечения высокой адгезии защитной пленки к поверхности подложки со сформированным топологическим рисунком требуется удаление слоя невосстановленного оксида графена, т.к. в противном случае из-за крайне низкой адгезии клеевого состава к оксиду графена происходит деламинация пленки и возможны короткие замыкания между токопроводящими дорожками, а также неспецифичные взаимодействия биологических агентов с поверхностью токопроводящих дорожек вис чувствительной области. В целом, каждое из указанных негативных последствий деламинации ведет к невозможности дальнейшего использования всей сенсорной структуры.To ensure high adhesion of the protective film to the surface of the substrate with the formed topological pattern, it is necessary to remove the layer of unreduced graphene oxide, since otherwise, due to the extremely low adhesion of the adhesive to graphene oxide, film delamination occurs and short circuits between the conductive paths are possible, as well as nonspecific interactions of biological agents with the surface of the conductive paths in the sensitive area. In general, each of these negative consequences of delamination leads to the impossibility of further use of the entire sensory structure.

Для обеспечения качественного электрического контакта и простой интеграции в устройства персонального мониторинга состояния здоровья или в другие электронные устройства геометрия подводящих электродов и подложки выполнена таким образом, чтобы обеспечивать электрический контакт со стандартными разъемами для гибких шлейфов.To ensure good electrical contact and easy integration into personal health monitoring devices or other electronic devices, the lead electrodes and substrate are geometrically designed to provide electrical contact with standard flex connectors.

Изобретение иллюстрируется графическими материалами:The invention is illustrated by graphic materials:

Фигура 1. Схема матричного биологического сенсора, где:Figure 1. Schematic of a matrix biological sensor, where:

110 - полимерная подложка. 120 - контактные области электродов, 130 - электроды чувствительных областей, 140 область восстановленного оксида графена с иммобилизированными аптамерами,.110 — polymer backing. 120 - contact areas of electrodes, 130 - electrodes of sensitive areas, 140 - area of reduced graphene oxide with immobilized aptamers ,.

Фигура 2 - отклик сенсора на белки тромбин, который является таргетным белком и альбумин, который является референсным белком.Figure 2 - Sensor response to proteins thrombin, which is a target protein, and albumin, which is a reference protein.

Пример конкретного исполнения.An example of a specific execution.

Первоначально определялась зависимость толщины пленки оксида графена на полимерной подложке от числа итераций нанесения. Полимерная подложка полиэтилентерефталата (ПЭГ) размером 40×40 мм толщиной порядка 150 мкм подвергалась предварительной очистке с помощью 2-пропанола. Для нанесения использовалась водная суспензия оксида графена с концентрацией 4,72 мг/мл. Суспензия объемом 200 мкл наносилась на подложку методом капельного нанесения (drop-casting), после чего производился нагрев подложки до температуры 110°С. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) выявила формирование пленок оксида графена с регулированной толщиной порядка 1 мкм.Initially, the dependence of the thickness of a graphene oxide film on a polymer substrate on the number of deposition iterations was determined. The polymer substrate of polyethylene terephthalate (PEG) with a size of 40 × 40 mm and a thickness of about 150 μm was pre-cleaned with 2-propanol. For deposition, an aqueous suspension of graphene oxide with a concentration of 4.72 mg / ml was used. A suspension with a volume of 200 μL was applied onto a substrate by drop casting, after which the substrate was heated to a temperature of 110 ° C. Atomic force microscopy (AFM) revealed the formation of graphene oxide films with a regulated thickness of the order of 1 μm.

Далее сформированная пленка была локально восстановлена с помощью лазерного излучения (445 им, мпкросскуидные импульсы) с формированием нескольких П-образных проводящих областей с шириной дорожки 2 мм и различными длинами по принципу «матрешки». При этом происходит неполное восстановление ОГ, т.к. в этом случае в материале остаются функциональные группы, требующиеся для обеспечения ковалентного связывания биочувствительного агента (аптамера) с восстановленным оксидом графена. Площадь области восстановленного оксида графена составляет 27 мм².Further, the formed film was locally reconstructed using laser radiation (445 nm, mcrosskoidal pulses) with the formation of several U-shaped conducting regions with a track width of 2 mm and different lengths according to the "nesting dolls" principle. In this case, an incomplete recovery of the exhaust gas occurs, because In this case, functional groups remain in the material, which are required to ensure covalent binding of the biosensitive agent (aptamer) with reduced graphene oxide. The area of the reduced graphene oxide region is 27 mm ² .

Измерения сопротивления и исследования свойств полученных областей восстановленного оксида графена показали, что степень восстановления пленки оксида графена, при которой в материале еще присутствуют функциональные карбоксильные группы, однако проводимость уже достаточна для измерения неспециализированными приборами, достигается при флюенсе лазера порядка 15 Дж/см².Measurements of the resistance and properties of the research areas of the reduced graphene oxide showed that the degree of reduction of graphene oxide film, at which the material still contains carboxyl functional groups, however have conductivity sufficient for measurement instruments unspecialized achieved when the laser fluence of about 15 J / cm ^2.

После формирования П-образпой проводящей области подложка покрывалась ламинирующей пленкой толщиной около 60 мкм с отверстиями диаметром 2 мм. Отверстия формируется таким образом, чтобы они находились над перемычками П-образных области над центром перемычки и выполняют функцию «окон», которые ограничивают чувствительную область сенсорной структуры и служат для исключения возможности замыкания проводящих областей экспонируемым раствором. Кроме того, перед нанесением ламинации невосстановленный оксид графена удаляется со всем площади подложки для исключения явления деламинации из-за плохой адгезии клеевого состава к поверхности восстановленного оксида графена.After the formation of a U-shaped conducting region, the substrate was covered with a laminating film about 60 μm thick with holes 2 mm in diameter. The holes are formed in such a way that they are located above the bridges of the U-shaped area above the center of the bridge and act as "windows" that limit the sensitive area of the sensor structure and serve to exclude the possibility of closing the conductive areas with the exposed solution. In addition, before lamination is applied, unreduced graphene oxide is removed from the entire substrate area to exclude the phenomenon of delamination due to poor adhesion of the adhesive to the reduced graphene oxide surface.

На следующем шаге проводилась резка сенсоров на отдельные структуры и подгон размеров контактной области для установки в коннекторы для гибких шлейфов (конкретная модель коннектора побирается в зависимости от числа чувствительных областей). Как правило требуется отрезать порядка 0,1-0,2 мм с каждой стороны сенсора для точной беззазорной установки в коннектор.At the next step, the sensors were cut into separate structures and the size of the contact area was adjusted for installation in connectors for flexible stubs (a specific connector model was selected depending on the number of sensitive areas). Typically, it is required to cut about 0.1-0.2 mm on each side of the sensor for accurate, backlash-free installation into the connector.

Далее производилась процедура ковалентной иммобилизации аптамеров на поверхности. Процедура иммобилизации аптамера включает в себя подготовку наносимого раствора, включающего в себя активатор EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид, буферный раствор на основе MES (2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты. Реакцию проводили в буферном растворе 100 моль/л MES, pi 1=6.0, с добавлением 50% этанола при комнатной температуре в атмосфере инертного газа. Конечная концентрация аптамера при реакции конъюгации составляла 50 мкМ. Далее в окно для экспонирования наносится указанный раствор объемом 2 мкл и выдерживается 24 часа во влажной атмосфере.Then the procedure of covalent immobilization of aptamers on the surface was carried out. The aptamer immobilization procedure includes the preparation of an applied solution containing an EDC activator (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, a buffer solution based on MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid). The reaction was carried out in a buffer solution 100 mol / L MES, pi 1 = 6.0, with the addition of 50% ethanol at room temperature in an inert gas atmosphere.The final aptamer concentration in the conjugation reaction was 50 μM. humid atmosphere.

Далее проводятся измерения отклика матрицы сенсоров на тагретные белки в зависимости от типа иммобилизованного в каждую чувствительную область аптамера.Then, the response of the sensor matrix to tagret proteins is measured, depending on the type of aptamer immobilized in each sensitive area.

Схематически созданный биосепсор изображен на фиг. 1The generated biosepsor is shown schematically in FIG. one

Созданный биологический сенсор имеет гибкую подложку из термостойкого полиэтилентерефталата толщиной 150 мкм, на которую нанесен слой оксида графена толщиной порядка 1000 им, с областью локально восстановленного до проводящего состояния оксида графена (ВОГ). Области ВОГ представлены в виде топологического рисунка (паттерна), имеющих П-образную форму, с не менее чем двумя чувствительными областями и соответствующими им электродами для подключения к коннектору гибких шлейфов. Слой оксида графена, в том числе паттернированная область, покрыт ламинирующей пленкой толщиной 60 мкм по всей площади сенсора, за исключением электрических контактов и специальных окон, открывающих область иммобилизации чувствительного вещества - аптамера, предназначенного для экспонирования молекул биологических агентов.The created biological sensor has a flexible substrate made of heat-resistant polyethylene terephthalate with a thickness of 150 μm, on which a layer of graphene oxide with a thickness of about 1000 nm is applied, with a region of graphene oxide (ROG) locally reduced to a conducting state. FOG areas are presented in the form of a topological drawing (pattern) having a U-shape, with at least two sensitive areas and corresponding electrodes for connecting flexible stubs to the connector. The graphene oxide layer, including the patterned area, is covered with a 60-μm-thick laminating film over the entire area of the sensor, with the exception of electrical contacts and special windows that open the area of immobilization of a sensitive substance - an aptamer intended for exposing molecules of biological agents.

Биосенсор работает следующим образом: сенсор с помощью контактов 120, сформированных па гибкой подложке 110, подключается к измерительному прибору, после чего производятся необходимые калибровки измерительной системы. Далее в область окна для экспонирования 140, производится экспонирование раствора, в котором предположительно содержаться белки-маркеры детектируемого заболевания. За счет наличия в области 140 ковалентно иммобилизованных через функциональную группу аптамеров происходит перераспределение заряда на восстановленном оксиде графена 140, что выражается в изменении сопротивления всей токопроводящей области 120, 130 и 140. В итоге изменение сопротивления будет иметь вид, представленный на фиг. 3, где приведены графики изменения сопротивления биосенсора при экспонировании таргетным белком тромбином и рсфсрснсным белком - альбумином.The biosensor works as follows: the sensor is connected to the measuring device using contacts 120 formed on a flexible substrate 110, after which the necessary calibrations of the measuring system are performed. Further, in the area of the window for exposure 140, the exposure of the solution is performed, which is supposed to contain the proteins-markers of the detected disease. Due to the presence of aptamers covalently immobilized through the functional group in the region 140, the charge is redistributed on the reduced graphene oxide 140, which is expressed in a change in the resistance of the entire conductive region 120, 130, and 140. As a result, the change in resistance will have the form shown in Fig. 3, which shows the graphs of changes in the resistance of the biosensor when exposed to the target protein thrombin and the rsphsrn protein - albumin.

Предложенная конструкция устройства обеспечивает ковалентную иммобилизацию аптамера при сохранении чувствительности по сравнению с прототипом, что обеспечивает решение поставленной технической задачи. Кроме того, создается набор чувствительных структур на гибкой основе, что расширяет возможности применения матричных биосенсоров.The proposed design of the device provides covalent immobilization of the aptamer while maintaining sensitivity compared to the prototype, which provides a solution to the technical problem posed. In addition, a set of sensitive structures is created on a flexible basis, which expands the possibilities of using matrix biosensors.

Claims

1. A method of manufacturing a biological sensor based on graphene oxide, including the formation of a film of graphene-containing material on a substrate, patterning of the resulting film with the formation of a conducting channel, the signal of which is measured by the formation of supply electrical contacts, and modification of the film surface with chemical compounds providing selective binding with biological molecules characterized in that

the formation of a graphene oxide film of a given thickness is carried out on a flexible polymer substrate by the method of drop deposition from a highly concentrated liquid medium,

film patterning is carried out by controlled incomplete reduction of the graphene oxide film to the formation of a conducting region using laser radiation, while the conducting region is formed in the form of a given topological pattern,

then the resulting preform with the formed pattern is covered with a laminating polymer film, with the exception of the areas of electrical contacts intended for signal pickup and holes that are above the conductive areas and act as "windows" for exposing the sensor,

modification of the open surface of the film is carried out by immobilizing aptamers on functional oxygen-containing, for example, carboxyl groups remaining in the region of partial reduction of graphene oxide, by applying an aqueous-alcoholic solution of 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide reagent into the "window" for exposure in an insulating film and subsequent exposure in a humid atmosphere until the end of the reaction,

then, control measurements of the performance of the aptamers immobilized over the "window" area to the response to biological markers are carried out.

2. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that the thickness of the graphene oxide film is up to 1 μm.

3. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that a highly concentrated aqueous dispersion of graphene oxide is used as a liquid medium for application.

4. A method of manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that

the topological pattern (pattern) of the electrodes and the sensitive area has several disjoint U-shaped areas in the plane.

5. A method of manufacturing a biosensor according to claim 4, characterized in that

In the U-shaped form of the topological pattern, above the “crossbar” fragments, there are “windows” for exposure, and the “racks” function as supply electrodes that provide electrical contact with standard connectors of electronic devices for signal removal.

6. A method for manufacturing a biosensor according to claim 5, characterized in that a thin film of gold is applied to the area of electrical contact of the supply electrodes by vacuum deposition through a formed mask providing a predetermined pattern of contacts.

7. A method of manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that

The parameters of laser radiation are selected in such a way that functional groups remain in the region of incomplete reduction of graphene oxide, providing linker-free covalent conjugation of the aptamer with reduced particles of graphene oxide.

8. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that the laser radiation fluence is about 15 J / cm ² .

9. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that each sensitive area uses its own type of aptamer.

10. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that a polyethylene terephthalate film with a thickness of 150 μm or more is used as a flexible polymer substrate.

11. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that the thickness of the laminating polymer film is up to 60 microns.

12. A method for manufacturing a biosensor according to claim 1, characterized in that the openings of the "windows" for exposing the sensitive areas of the matrix biosensor in the laminating film are made round.

13. Biosensor according to the method according to PP. 1-12, on a flexible polymer substrate, on which a graphene oxide layer with a thickness of about 1 μm is applied, with patterned regions of graphene oxide locally reduced to a conducting state in the form of a U-shaped topological pattern with at least two sensitive regions and 4 areas for connecting connectors, while the sensor is covered with a laminating film 60 microns thick over its entire area, with the exception of electrical contacts and special windows that open areas for immobilization of a biosensitive substance - an aptamer designed to detect molecules of targeted biological agents.