RU2744614C1

RU2744614C1 - Method for reducing toxicity of cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide after thawing of hematopoietic stem cells

Info

Publication number: RU2744614C1
Application number: RU2020108143A
Authority: RU
Inventors: Сергей Вячеславович Утемов; Константин Александрович Ветошкин; Максим Геннадьевич Князев; Людмила Афанасьевна Безрукова; Наталья Васильевна Исаева; Наталья Викторовна Минаева; Андрей Александрович Костяев
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2021-03-11

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, in particular to clinical transfusiology, and in particular to a method for reducing the toxicity of a cryopreservation solution. A method for reducing the toxicity of a cryopreserved solution based on dimethyl sulfoxide includes defrosting hematopoietic stem cells (HSC) followed by adding into the suspension a solution containing 6% polyglucin with a molecular weight of 50,000-60,000 daltons and 10% albumin in a ratio of 1:4, when the ratio of decryopreserved cells to the solution is 1:4, then centrifugation is carried out at 2000 g for 6 minutes, the supernatant is removed and the cells are resuspended in the above washing solution in a 1:1 V/V ratio.

EFFECT: above method makes it possible to minimize the content of the cryopreservative in the transplant product before administration to the patient, and also increases efficiency of the transplantation of washed HSCs and timely engraftment of the graft in the recipient.

1 cl, 2 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической трансфузиологии. Решение вопросов долгосрочного хранения клеток крови в условиях низких и ультранизких температур стало возможным при введении в биологические системы криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать повреждение биологических объектов и обеспечивать их сохранность в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии после замораживания-отогревания. С 2003 г. при криоконсервировании трансплантационного материала начал применяться высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5,0-7,5%. [1] Наиболее эффективной для криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и применения в клинической практике признана 10% концентрация ДМСО. Замораживание ГСК до ультранизких температур считается эффективным и надежным технологическим решением, обеспечивающим долговременное хранение до трансплантации.The invention relates to medicine, in particular to clinical transfusiology. The solution of the issues of long-term storage of blood cells in conditions of low and ultra-low temperatures became possible with the introduction of cryoprotectants into biological systems - substances that have the ability to prevent damage to biological objects and ensure their safety in a viable and functionally complete state after freezing and rewarming. Since 2003, highly purified dimethyl sulfoxide (DMSO) at a final concentration of 5.0-7.5% has been used for cryopreservation of the transplant material. [1] The most effective for cryopreservation of hematopoietic stem cells (HSC) and use in clinical practice is recognized as 10% concentration of DMSO. Freezing HSCs to ultra-low temperatures is considered to be an effective and reliable technological solution providing long-term storage prior to transplantation.

ДМСО относится к оксидам, представляет собой молекулу (молекулярная масса - 78,13 г/моль) со свойствами амфифильности (гидрофильная группу сульфоксида и две гидрофобные метиловые группы). Вещество является высокополярным, хорошо проникает в клетки, связывает молекулы воды в растворе посредством водородных связей, что, в свою очередь, блокирует отток воды из цитоплазмы и предотвращает дегидратацию клеток во время замораживания. При кристаллизации растворов, содержащих ДМСО, получается близкая к аморфной, мелкоячеистая структура, которая малотравматична для клеток. ДМСО относится к хладоограждающим веществам внутриклеточного типа [2]. Для компенсации токсического действия и повышения цитопротективных свойств ДМСО необходим подбор оптимальной его концентрации, обеспечивающей максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на ядерные клетки крови (ЯКК). Рядом авторов проведены исследования по уменьшению конечной концентрации ДМСО [4]. В результате данных работ было показано, что снижение концентрации ниже 7-5% приводит к значительным потерям стволовых клеток, что является существенным недостатком указанного методического подхода [2, 3].DMSO refers to oxides, is a molecule (molecular weight 78.13 g / mol) with amphiphilic properties (hydrophilic sulfoxide group and two hydrophobic methyl groups). The substance is highly polar, penetrates well into cells, binds water molecules in solution through hydrogen bonds, which, in turn, blocks the outflow of water from the cytoplasm and prevents cell dehydration during freezing. Upon crystallization of solutions containing DMSO, a close to amorphous, fine-celled structure is obtained, which is less traumatic for cells. DMSO belongs to the intracellular type of cold-protecting substances [2]. To compensate for the toxic effect and increase the cytoprotective properties of DMSO, it is necessary to select its optimal concentration, which provides maximum cryoprotective properties with a minimum damaging effect on nuclear blood cells (NBC). A number of authors have carried out studies to reduce the final concentration of DMSO [4]. As a result of these studies, it was shown that a decrease in concentration below 7-5% leads to significant losses of stem cells, which is a significant disadvantage of this methodological approach [2, 3].

В качестве прототипа изобретения использована работа группы авторов [5], которые предлагают отмывание биоматериала от ДМСО. Для удаления криопротектора из взвеси декриоконсервированных стволовых клеток авторы используют раствор, содержащий 2,5% человеческого альбумина и 5% Декстран 40 в изотоническом растворе натрия хлорида, в объеме равном объему взвеси клеток, с последующим центрифугированием при 400 g в течении 10 мин. Затем супернатант удаляют, а осажденные клетки медленно ресуспендируют в новой порции раствора содержащего 2,5% альбумина и 5% Декстрана до объема, подходящего для инфузии пациентам. Из представленных в прототипе результатов следует, что предложенный способ обеспечивает удовлетворительные результаты сохранности клеток, однако количество жизнеспособных лейкоцитов снижается на 39%.As a prototype of the invention, the work of a group of authors [5] was used, who propose washing the biomaterial from DMSO. To remove the cryoprotectant from the suspension of decryopreserved stem cells, the authors use a solution containing 2.5% human albumin and 5% Dextran 40 in isotonic sodium chloride solution, in a volume equal to the volume of the cell suspension, followed by centrifugation at 400 g for 10 minutes. Then the supernatant is removed, and the precipitated cells are slowly resuspended in a new portion of a solution containing 2.5% albumin and 5% Dextran to a volume suitable for infusion to patients. From the results presented in the prototype, it follows that the proposed method provides satisfactory results in the preservation of cells, but the number of viable leukocytes is reduced by 39%.

Предлагаемый способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора заключается в уменьшении (минимизации) количества ДМСО, вводимого в организм реципиента при трансплантации ГСК.The proposed method for reducing the toxicity of a cryopreservation solution consists in reducing (minimizing) the amount of DMSO introduced into the recipient's body during HSC transplantation.

Указанная цель достигается благодаря уменьшению объема концентрата ГСК и, соответственно, снижению объема криоконсерванта, а также за счет отмывания криопротектора (ДМСО) от взвеси ядерных клеток непосредственно перед введением реципиенту. Способ позволяет сохранить 87,8±13,2% жизнеспособных ГСК.This goal is achieved due to a decrease in the volume of the HSC concentrate and, accordingly, a decrease in the volume of the cryopreservative, as well as by washing the cryoprotectant (DMSO) from the suspension of nuclear cells immediately before administration to the recipient. The method allows you to save 87.8 ± 13.2% of viable HSCs.

ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВАEXAMPLE OF USING THE TOOL

Заявляемый способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора на основе диметилсульфоксида после размораживания гемопоэтических стволовых клеток включает в себя несколько этапов и отличается тем, что непосредственно перед процедурой отмывания готовят смесь 10% альбумина и 6% раствора полиглюкина в соотношении 1:4. Часть полученного раствора в объеме 50 мл по магистральной трубке переводят во второй контейнер (спутник) и закрывают пластикатным зажимом, третий контейнер оставляют пустым.The claimed method for reducing the toxicity of a cryopreservation solution based on dimethyl sulfoxide after thawing hematopoietic stem cells includes several stages and differs in that immediately before the washing procedure, a mixture of 10% albumin and 6% polyglucin solution is prepared in a ratio of 1: 4. Part of the resulting solution in a volume of 50 ml is transferred through the main tube into the second container (satellite) and closed with a plastic clamp, the third container is left empty.

В контейнер с размороженными ГСК вводят смесь альбумина и полиглюкина при соотношении ГСК к смеси 1:4 при постоянном помешивании содержимого криопакета. Строенный комплект помещают в центрифужный стакан и уравновешивают на весах «LEadCORe», затем центрифугируют при 2000 g в течение 6 минут при температуре от 4 до 6°С (центрифуга для разделения донорской крови «ROTO SILENTA 630R»).A mixture of albumin and polyglucin is introduced into a container with thawed HSCs at a HSC to mixture ratio of 1: 4 with constant stirring of the contents of the cryopack. The triple set is placed in a centrifuge beaker and balanced on a LEadCORe balance, then centrifuged at 2000 g for 6 minutes at a temperature of 4 to 6 ° C (ROTO SILENTA 630R centrifuge for separating donated blood).

После центрифугирования контейнер с осажденными клетками помещают в плазмоэкстрактор «ПЭК-3» для удаления надосадочного слоя. Надосадок переводят в пустой контейнер, отсоединяют и утилизируют. В полученную взвесь клеток вводят при постоянном помешивании отмывающий раствор. В результате процедуры отмывания в биопродукте происходит частичная замена криоконсервирующего раствора, содержащего ДМСО, на смесь альбумина и полиглюкина, сокращается время контакта размороженных ядросодержащих клеток (ЯСК) с внеклеточным ДМСО [4, 5].After centrifugation, the container with the precipitated cells is placed in a PEC-3 plasma extractor to remove the supernatant layer. The supernatant is transferred to an empty container, disconnected and disposed of. The resulting suspension of cells is injected with a washing solution with constant stirring. As a result of the washing procedure in the biological product, the cryopreservation solution containing DMSO is partially replaced with a mixture of albumin and polyglucin, the time of contact of thawed nucleated cells (NSC) with extracellular DMSO is reduced [4, 5].

Экспериментальные исследования выполнены на базе отделения трансфузиологии и процессинга ГСК, лабораторий клеточных технологий и клеточной и молекулярной иммунологии ФГБУН КНИИГиГЖ ФМБА России.Experimental studies were carried out on the basis of the Department of Transfusion and Processing of HSCs, the Laboratories of Cell Technologies and Cellular and Molecular Immunology of the Federal State Budgetary Institution KNIIGiGZh FMBA of Russia.

Оценивали общее количество лейкоцитов (до замораживания, после размораживания и отмывания). Подсчет числа жизнеспособных кроветворных клеток-предшественников проводили методом проточной цитометрии по наличию экспрессии маркера CD34. Сохранность ЯСК и ГСК определяли как соотношение абсолютного количества лейкоцитов и CD34-позитивных клеток после размораживания (отмывания) к аналогичному показателю до криоконсервирования.The total number of leukocytes was assessed (before freezing, after thawing and washing). The number of viable hematopoietic progenitor cells was counted by flow cytometry based on the presence of expression of the CD34 marker. The safety of NSC and HSC was determined as the ratio of the absolute number of leukocytes and CD34-positive cells after thawing (washing) to the same indicator before cryopreservation.

Количество ЯСК до замораживания варьировало от 3,4 до 79,8×10⁹ (медиана - 29,6×10⁹), а содержание криоконсервированных CD34-положительных клеток - от 15,5 до 1895,5×10⁶ (медиана - 328,1×10⁶). После размораживания при отсутствии отмывания от криофилактика содержание ЯКК составило 5,8-76,9×10⁹ (медиана 26,7×10⁹), a CD34+ клеток - от 17,2 до 1226,5×10⁶ (медиана - 107,0×10⁶). Сохранность лейкоцитов и ГСК равнялась соответственно 91,8±7,4% и 87,8±13,2% (n=200) от их исходного уровня. В случае проведения процедуры отмывания от криофилактика размороженных ЯКК их количество составило 3,3-50,9×10⁹ (медиана 24,5×10⁹). Сохранность содержания лейкоцитов и ГСК равнялась соответственно 83,4±9,4% и 86,3±13,5% (n=65) от уровня до криоконсервирования. Достоверных отличий в сохранности ГСК в отсутствие и при проведении процедуры отмывания от криоконсерванта не обнаружено (р>0,05).The number of NSCs before freezing varied from 3.4 to 79.8 × 10 ⁹ (median - 29.6 × 10 ⁹ ), and the content of cryopreserved CD34-positive cells - from 15.5 to 1895.5 × 10 ⁶ (median - 328 , 1 × 10 ⁶ ). After thawing in the absence of washing from cryophilactic, the content of UCC was 5.8-76.9 × 10 ⁹ (median 26.7 × 10 ⁹ ), and CD34 + cells - from 17.2 to 1226.5 × 10 ⁶ (median - 107, 0 × 10 ⁶ ). The preservation of leukocytes and HSCs was 91.8 ± 7.4% and 87.8 ± 13.2% (n = 200), respectively, of their initial level. In the case of the procedure for laundering from cryophilaxis of thawed UCC, their number was 3.3-50.9 × 10 ⁹ (median 24.5 × 10 ⁹ ). Preservation of the leukocyte and HSC content was 83.4 ± 9.4% and 86.3 ± 13.5% (n = 65), respectively, from the level before cryopreservation. There were no significant differences in the preservation of HSC in the absence and during the procedure of washing from the cryopreservative (p> 0.05).

Несмотря на меньшую сохранность общего количества лейкоцитов, процедура удаления ДМСО не оказывает существенного влияния на сохранность ГСК, не влияет на качество получаемого трансплантационного продукта.Despite the lower preservation of the total number of leukocytes, the procedure for removing DMSO does not significantly affect the preservation of HSCs, does not affect the quality of the resulting transplant product.

ЛИТЕРАТУРАLITERATURE

1. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 25 июля 2003 г. №325 «О развитии клеточных технологий». - URL: http://www.rba.ru (дата обращения: 06.05.2019).1. Order of the Ministry of Health of the Russian Federation of July 25, 2003 No. 325 "On the development of cellular technologies." - URL: http://www.rba.ru (date of access: 06.05.2019).

2. Kostyaev A.A., Utyomov S.V., Andreev A.A., Polezhaeva Т.V., Martusevich А.K, Isaeva N.V., Sherstnyov P.S., Vetoshkin K.A., Kalinina E.N., Knyazev M.G. A four class systematization of biocryoconservants. The first class of cold preserving solutions - endocellular cryoprotectants. Vestnik gematologii. 2016; 12 (3); 28-35. (inRuss.)].2. Kostyaev A.A., Utyomov S.V., Andreev A.A., Polezhaeva T.V., Martusevich A.K, Isaeva N.V., Sherstnyov P.S., Vetoshkin K.A., Kalinina E.N., Knyazev M.G. A four class systematization of biocryoconservants. The first class of cold preserving solutions - endocellular cryoprotectants. Vestnik gematologii. 2016; 12 (3); 28-35. (inRuss.)].

3. Консервирование живых тканей или органов Патентообладатель А01N1/02: Лобынцева Г.С (UA) Приоритеты: публикация патента: 10.08.2004.3. Conservation of living tissues or organs Patent holder А01N1 / 02: Lobyntseva GS (UA) Priorities: patent publication: 10.08.2004.

4. Патент RU 2563117 "Комбинированный криопротектор диметилсульфоксид/реополиглюкин" для криоконсервации стволовых клеток и способ их криоконсервации для клинического применения, авторы патента: Астрелина Т.A. (RU), Кобзева И.В RU. https://findpatent.ru/patent/256/2563117.html) 2012-2019.4. Patent RU 2563117 "Combined cryoprotectant dimethyl sulfoxide / rheopolyglucin" for cryopreservation of stem cells and a method for their cryopreservation for clinical use, the authors of the patent: Astrelin T.A. (RU), Kobzeva I.V. RU. https://findpatent.ru/patent/256/2563117.html) 2012-2019.

5. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubinstein, L. Dobrila, R. Rosenfield., et. al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1995. - Vol. 92, №22. - P. 10119-10122.5. Processing and cryopreservation of placental / umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubinstein, L. Dobrila, R. Rosenfield., Et. al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1995. - Vol. 92, no. 22. - P. 10119-10122.

6. Влияние отмывания криопротектора диметилсульфоксида на свойства гемопоэтических стволовых клеток трансплантационного материала / Степанов А.А., Коротаев Е.В., Бессмельцев С.С2, Рабинович В.И., Астахова Л.П., Пономарев С.А. www.medline.ru Т., 14, Гематология 25 мая 2013.6. The effect of washing the cryoprotectant dimethyl sulfoxide on the properties of hematopoietic stem cells of the transplant material / Stepanov AA, Korotaev EV, Bessmeltsev S.S2, Rabinovich VI, Astakhova LP, Ponomarev SA. www.medline.ru T., 14, Hematology May 25, 2013.

7. Сохранность количества размороженных гемопоэтических стволовых клеток после процедуры отмывания от диметилсульфоксида / К.А Ветошкин, Н.В. Минаева, Н.А. Зорина [и др.] // Трансфузиология. Тезисы IV Московской международной конференции специалистов производственной и клинической трансфузиологии. - 2018. - С. 32-34.7. Preservation of the number of thawed hematopoietic stem cells after the procedure for washing from dimethyl sulfoxide / K.A. Vetoshkin, N.V. Minaeva, N.A. Zorina [et al.] // Transfusiology. Abstracts of the IV Moscow international conference of specialists in industrial and clinical transfusiology. - 2018 .-- S. 32-34.

Claims

A method for reducing the toxicity of a cryopreserved solution based on dimethyl sulfoxide after thawing hematopoietic stem cells, characterized in that a solution containing 6% polyglucin with a molecular weight of 50,000-60,000 daltons and 10% albumin in a ratio of 1: 4 is added to the suspension of decryopreserved cells to a solution of 1: 4, followed by centrifugation at 2000 g for 6 minutes, removing the supernatant and resuspending the cells in the above washing solution in a 1: 1 V / V ratio.