RU2743426C1 - Method for determining biological macromolecules based on nmr relaxometry - Google Patents
Method for determining biological macromolecules based on nmr relaxometry Download PDFInfo
- Publication number
- RU2743426C1 RU2743426C1 RU2020113131A RU2020113131A RU2743426C1 RU 2743426 C1 RU2743426 C1 RU 2743426C1 RU 2020113131 A RU2020113131 A RU 2020113131A RU 2020113131 A RU2020113131 A RU 2020113131A RU 2743426 C1 RU2743426 C1 RU 2743426C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- analyte
- nanoparticles
- wells
- determined
- conjugate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 title claims abstract description 4
- 238000000679 relaxometry Methods 0.000 title description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000011852 carbon nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 9
- QMQXDJATSGGYDR-UHFFFAOYSA-N methylidyneiron Chemical compound [C].[Fe] QMQXDJATSGGYDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000605534 Homo sapiens Prostate-specific antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000592517 Homo sapiens Puromycin-sensitive aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004638 bioanalytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для количественного определения любых соединений способных к стереоспецифическим взаимодействиям (антигенов, антител, нуклеиновых кислот, биологически активных макромолекул).The invention relates to the field of molecular immunobiotechnology and can be used in the production of highly sensitive test systems for the quantitative determination of any compounds capable of stereospecific interactions (antigens, antibodies, nucleic acids, biologically active macromolecules).
К настоящему времени достаточно хорошо известны системы гомогенного ЯМР-анализа, основанные на способности магнитных наноматериалов изменять время продольной (Т1) или поперечной (Т2) релаксации окружающих протонов воды [1]. Ключевой особенностью данных методов является кластеризация (или декластеризация) магнитных нано- или микрочастиц при наличии в исследуемом образце определяемого соединения (аналита). Отдельные частицы и кластеры имеют различную релаксивность (способность изменять Т1 или Т2). Таким образом, концентрацию аналита можно определить путем измерения времени релаксации. К преимуществам таких анализов можно отнести сокращение времени анализа и простоту аранжировки. Несмотря на это подобные методы анализа имеют, как правило, относительно низкую чувствительность и специфичность из-за отсутствия этапов промывки, которые позволили бы удалить присутствующие в образце примеси, в первую очередь белковые молекулы, способные к неспецифическому связыванию, что, кроме того, снижает надежность и воспроизводимость результатов анализа.By now, systems of homogeneous NMR analysis are well known, based on the ability of magnetic nanomaterials to change the time of longitudinal (T1) or transverse (T2) relaxation of the surrounding water protons [1]. A key feature of these methods is the clustering (or declustering) of magnetic nano- or microparticles in the presence of the analyte (analyte) in the test sample. Individual particles and clusters have different relaxivity (the ability to change T1 or T2). Thus, the concentration of the analyte can be determined by measuring the relaxation time. The advantages of such analyzes include reduced analysis time and ease of arrangement. Despite this, such analytical methods have, as a rule, relatively low sensitivity and specificity due to the absence of washing steps that would remove impurities present in the sample, primarily protein molecules capable of non-specific binding, which, in addition, reduces reliability and reproducibility of analysis results.
С этих позиций привлекательное значение имеют методы гетерогенного анализа, основанные на сорбции связывающих аналит соединений (анти-аналитов) на твердую фазу. Эти методы имеют более высокую чувствительность и специфичность, так как процедура их постановки включает в себя этапы промывки на каждой стадии, а также этап блокирования неспецифических сайтов связывания, что само по себе существенно снижает уровень фонового сигнала. Актуальность разработки методов анализа с высокой чувствительностью определяется необходимостью детектировать соединения, которые находятся в биологических средах в следовых количествах и/или низких концентрациях и являются маркерами опасных заболеваний (онкологических заболеваний, инфекций различной этиологии); либо вещества, даже малые количества которых могут представлять опасность для жизни. Разработка таких методов анализа может способствовать не только повышению эффективности диагностики, в первую очередь ранней, но и появлению возможности своевременного вмешательства в процесс проводимой терапии. При этом особое значение приобретают воспроизводимость и надежность используемых методов анализа.From these positions, methods of heterogeneous analysis based on the sorption of analyte-binding compounds (anti-analytes) onto the solid phase are of attractive importance. These methods have a higher sensitivity and specificity, since the procedure for their formulation includes the stages of washing at each stage, as well as the stage of blocking nonspecific binding sites, which in itself significantly reduces the level of the background signal. The relevance of the development of analytical methods with high sensitivity is determined by the need to detect compounds that are in biological media in trace amounts and / or low concentrations and are markers of dangerous diseases (oncological diseases, infections of various etiologies); or substances, even small quantities of which can be life-threatening. The development of such methods of analysis can contribute not only to an increase in the efficiency of diagnostics, primarily early ones, but also to the emergence of the possibility of timely intervention in the process of ongoing therapy. In this case, the reproducibility and reliability of the analysis methods used are of particular importance.
Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности и достигаемому результату является метод иммуноферментного анализа, в котором в качестве детектирующих реагентов чаще всего используются ферментные конъюгаты пероксидазы хрена с распознающими молекулами. Детекцию и количественную оценку аналита, в данном методе проводят спектрофотометрически. На сегодняшний день иммуноферментный анализ является наиболее широко используемым и надежным методом лабораторной диагностики.The closest to the claimed method in technical essence and the achieved result is the enzyme-linked immunosorbent assay, in which enzyme conjugates of horseradish peroxidase with recognition molecules are most often used as detecting reagents. The detection and quantification of the analyte in this method is carried out spectrophotometrically. Today, enzyme immunoassay is the most widely used and reliable method of laboratory diagnostics.
С позиции критики должно отметить тот факт, что в методе иммуноферментного анализа в качестве метки используется фермент, как правило, пероксидаза хрена, имеющий ряд недостатков: высокая стоимость синтеза и требовательность к условиям его приведения, что также относится к условиям хранения и транспортировки готового продукта (тест-систем) [2]. Например, известно, что активность пероксидазы хрена существенно снижается при использовании в анализе реагентов, в состав которых включен такой широко используемый консервант, как азид натрия. Низкая стабильность реагентов, применяемых в процедуре анализа, а также их чувствительность к окружающей среде приводит к снижению как надежности, так и воспроизводимости результатов. К непривлекательным сторонам ИФА относятся также токсичность субстратов, необходимых для проведения ферментной детекции, нестойкость продуктов реакции и процедурная сложность анализа.From the standpoint of criticism, it should be noted that in the method of enzyme-linked immunosorbent assay, an enzyme, usually horseradish peroxidase, is used as a label, which has a number of disadvantages: the high cost of synthesis and exactingness to the conditions of its reduction, which also applies to the storage and transportation conditions of the finished product ( test systems) [2]. For example, it is known that the activity of horseradish peroxidase is significantly reduced when reagents are used in the analysis, which include such a widely used preservative as sodium azide. The low stability of the reagents used in the analysis procedure, as well as their sensitivity to the environment, leads to a decrease in both reliability and reproducibility of results. The unattractive aspects of ELISA also include the toxicity of the substrates required for enzymatic detection, the instability of the reaction products, and the procedural complexity of the analysis.
Заявляемый способ позволяет решать задачу повышения воспроизводимости и надежности результатов анализа, за счет использования высокостабильных (фиг. 1 и фиг. 2) конъюгатов железоуглеродных наночастиц с распознающими молекулами в тандеме с высокочувствительным методом детекции на основе ЯМР-релаксометрии в аранжировке твердофазного гетерогенного анализа. Это имеет существенное значение, особенно в ситуациях, когда определяемый аналит (маркер), является индикатором таких серьезных и потенциально угрожающих жизни патологических процессов, как например, злокачественные новообразования. В подобных случаях надежность и воспроизводимость получаемых предлагаемым способом результатов играет существенную роль для принятия решений в части своевременного начала лечения и коррекции в ходе проводимой терапии.The inventive method allows you to solve the problem of increasing the reproducibility and reliability of the analysis results, through the use of highly stable (Fig. 1 and Fig. 2) conjugates of iron-carbon nanoparticles with recognition molecules in tandem with a highly sensitive detection method based on NMR-relaxometry in the arrangement of solid-phase heterogeneous analysis. This is essential, especially in situations where the analyte (marker) being determined is an indicator of such serious and potentially life-threatening pathological processes as, for example, malignant neoplasms. In such cases, the reliability and reproducibility of the results obtained by the proposed method plays a significant role in making decisions regarding the timely initiation of treatment and correction during the therapy.
Известно, что для конструирования надежных систем анализа важную роль играет надежность используемых реагентов. В реализации предлагаемого способа использовали конъюгаты, синтезированные по авторской методике [3]. Для исследования стабильности диагностических реагентов были использованы конъюгаты магнитных железоуглеродных наночастиц с белком G стрептококков, обладающим способностью аффинно связываться с Fc-фрагментами IgG человека и большинства животных [4] и магнитных железоуглеродных наночастиц с стрептавидином, способным активно связываться с любыми биотинилированными соединениями [4]. Условно такие конъюгаты обозначают, как Fe@C-NH2/BSA4/балок G и Fe@C-NH2/BSA/стрептавидин. На фиг. 1. представлены результаты исследования структурной стабильности конъюгатов Fe@C-NH2/BSA/белок G в различных элюирующих растворах через 0, 1 и 2 ч. экспозиции. Фиг. 2 иллюстрирует результаты исследования структурной стабильность конъюгатов Fe@C-NH2/BSA/стрептавидин при хранении в течении 30 дней при +4°С в ЗФР.It is known that the reliability of the reagents used plays an important role in the design of reliable analysis systems. In the implementation of the proposed method used conjugates, synthesized by the author's method [3]. To study the stability of diagnostic reagents, conjugates of magnetic iron-carbon nanoparticles with the protein G of streptococci, which have the ability to bind affinity to Fc-fragments of IgG of humans and most animals [4] and magnetic iron-carbon nanoparticles with streptavidin, which can actively bind to any biotinylated compounds, were used [4]. Conventionally, such conjugates are designated as Fe @ C-NH 2 / BSA4 / bar G and Fe @ C-NH 2 / BSA / streptavidin. FIG. 1.presents the results of a study of the structural stability of conjugates Fe @ C-NH 2 / BSA / protein G in various elution solutions after 0, 1 and 2 hours of exposure. FIG. 2 illustrates the results of a study of the structural stability of the conjugates Fe @ C-NH 2 / BSA / streptavidin during storage for 30 days at + 4 ° C in PBS.
Сущность изобретения. Стенки лунок стандартного иммунологического планшета сенсибилизируют соединением (анти-аналитом), способным специфически связывать определяемое соединение. Описанная процедура является предварительным этапом, приводящим к формированию твердофазного реагенты (иммуносорбента), пригодного для конструирования соответствующей тест-системы. В ходе реализации аналитической процедуры в лунки планшета вносят исследуемый образец, содержащий определяемое соединение (аналит). После соответствующей инкубации и промывки в лунки планшета вносят детектирующий реагент, представляющий собой конъюгат железоуглеродных наночастиц с соединением, специфично взаимодействующим с определяемым соединением. После инкубации лунки отмывают буферным раствором. В результате проведенных процедур на стенках лунок планшета образуется комплекс, состоящий из связывающего соединения, определяемого аналита и конъюгата. В дальнейшем в лунки вносят раствор NaOH, что приводит к освобождению наночастиц конъюгата из связанного состояния и перехода их в раствор. Лунки отделяют от планшета и помещают в измерительную ячейку ЯМР-релаксометра для измерения времени релаксации протонов в данном образце. По данному показателю прибор количественно позволяет оценить содержание определяемого соединения в образце в соответствии с ранее проведенной калибровкой.The essence of the invention. The walls of the wells of a standard immunological plate are sensitized with a compound (anti-analyte) capable of specifically binding the compound to be determined. The described procedure is a preliminary step leading to the formation of a solid-phase reagent (immunosorbent) suitable for constructing an appropriate test system. During the implementation of the analytical procedure, a test sample containing the compound to be determined (analyte) is introduced into the wells of the plate. After appropriate incubation and washing, a detection reagent is introduced into the wells of the plate, which is a conjugate of iron-carbon nanoparticles with a compound that specifically interacts with the compound to be determined. After incubation, the wells are washed with buffer solution. As a result of the procedures carried out, a complex is formed on the walls of the wells of the plate, consisting of a binding compound, an analyte to be determined and a conjugate. Subsequently, a NaOH solution is added to the wells, which leads to the release of the conjugate nanoparticles from the bound state and their transition into solution. The wells are separated from the plate and placed in the measuring cell of an NMR relaxometer to measure the relaxation time of protons in a given sample. According to this indicator, the device quantitatively allows to estimate the content of the analyte in the sample in accordance with the previously performed calibration.
Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что измерение величины времени релаксации протонов (Т2), обусловленного количеством магнитных наночастиц извлеченных из специфического комплекса, осуществляется в суспензии, лишенной примесей. При этом уровень измеряемого параметра находится в прямой зависимости от количества определяемого аналита. Проведение специфической реакции по отношению к определяемому аналиту в формате твердофазного анализа позволяет освободится от примесных компонентов, содержащихся в анализируемом образце и способных значимо и невоспроизводимо влиять на результат измерения. Перевод наночастиц, количество которых пропорционально количеству определяемого аналита, в суспензию позволяет с высокой точностью измерить время релаксации протонов, прямо зависящее от количества наночастиц, с помощью ЯМР-релаксометра.Signs of the method that meet the criterion of novelty are that the measurement of the value of the relaxation time of protons (T2), due to the amount of magnetic nanoparticles extracted from a specific complex, is carried out in a suspension devoid of impurities. In this case, the level of the measured parameter is in direct proportion to the amount of the analyte being determined. Carrying out a specific reaction in relation to the analyte to be determined in the solid-phase analysis format allows you to get rid of the impurity components contained in the analyzed sample and can significantly and irreproducibly influence the measurement result. The transfer of nanoparticles, the amount of which is proportional to the amount of the analyte to be determined, into a suspension makes it possible to measure with high accuracy the relaxation time of protons, which is directly dependent on the amount of nanoparticles, using an NMR relaxometer.
Предлагаемый способ позволяет решить любую аналитическую (диагностическую) задачу, связанную с количественным определение любого маркера (аналита), который в ходе аналитической процедуры может быть включен в специфично формирующийся комплекс, например, антитела (антианалит)-антиген (определяемый аналит)-антитела/магнитные наночастицы (конъюгат). Дальнейшее измерение времени релаксации протонов с помощью извлеченных из комплекса наночастиц и ЯМР регистрации объективно не зависит от природы определяемого маркера, что обеспечивает универсальность и мультиплексность предлагаемого способа.The proposed method allows you to solve any analytical (diagnostic) problem associated with the quantitative determination of any marker (analyte), which during the analytical procedure can be included in a specifically formed complex, for example, antibodies (antianalyte) -antigen (determined analyte) -antibodies / magnetic nanoparticles (conjugate). Further measurement of the relaxation time of protons using extracted from the complex of nanoparticles and NMR registration objectively does not depend on the nature of the determined marker, which ensures the versatility and multiplexity of the proposed method.
Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.The proposed technical solution is illustrated by the following examples.
Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, и никоим образом не ограничивают спектр соединений, которые могут быть определены при помощи предлагаемого способа анализа.The following examples are provided only for the purpose of demonstrating the possibilities of the present invention, and in no way limit the range of compounds that can be determined using the proposed method of analysis.
Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.The specific quantitative parameters given in the examples, even in the area of the indicated ranges, are not fixed by the claims, because they are not fundamental conditions for the implementation of the proposed method.
Пример 1. Количественное определение простатспецифического антигена в формате твердофазного анализа с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц с моноклональными антителами (клон 1А6), специфичными к ПСА человека (Fe@C-1А6).Example 1. Quantification of prostate-specific antigen in the format of solid-phase analysis using a conjugate of iron-carbon nanoparticles with monoclonal antibodies (clone 1A6) specific to human PSA (Fe @ C-1A6).
На стенки лунок разборного полистирольного планшета для иммунологических реакций сорбируют из объема 100 мкл мышиные моноклональные антитела (МКА) из клона 3А6 (производитель - Биалекса, Россия), специфичные к ПСА, разведенные в 0,2 М карбонатном буфере с рН 9,6 до концентрации 0,05 мг/мл. Сорбцию производят в течение 2 часов при температуре 37°С. Лунки планшета трижды промывают 250 мкл 0,15М раствора NaCl, забуференного 0,015М Na-фосфатами и содержащим 0,1% азида натрия и 0,1% твин-20, рН 7,25 (ЗФРТ), используя устройство для промывки микропланшетов, затем добавляют 200 мкл блокирующего буфера (ЗФТР + 2% казеин + 1% БСА), планшеты выдерживают в течение 1 часа. В отмытые после блокирования лунки добавляют образцы ПСА в объеме 100 мкл, разведенные кратно 10-ти в блокирующем буфере, начиная с концентрации 0,01 мг/мл и инкубируют в течение 60-ти мин., после чего в промытые как описано выше лунки вносят суспензию Fe@C-1А6 (100 мкл, 0,05 мг/мл) в ЗФРТ + 2% казеина. Время инкубации 60 минут. В отмытые лунки вносят по 100 мкл элюирующего раствора (0,1М NaOH) и через 60 мин. измеряют время релаксации протонов в каждой лунке, для чего каждую лунку отделяют от планшета и помещают в измерительную ячейку релаксометра. Результаты измерений для приведенного примера представлены в таблице 1. Все этапы анализа, за исключением этапов промывки и измерения, выполняют при +37°С. Общее время анализа 180-200 мин., без учета времени подготовки твердой фазы, что может быть выполнено заблаговременно.Mouse monoclonal antibodies (MCA) from clone 3A6 (manufacturer - Bialexa, Russia), specific to PSA, diluted in 0.2 M carbonate buffer with pH 9.6 to a concentration of 100 μl are sorbed onto the walls of the wells of a collapsible polystyrene plate for immunological reactions. 0.05 mg / ml. Sorption is carried out within 2 hours at a temperature of 37 ° C. The wells of the plate are washed three times with 250 μl of 0.15 M NaCl solution buffered with 0.015 M Na-phosphates and containing 0.1% sodium azide and 0.1% tween-20, pH 7.25 (PBS), using a device for washing microplates, then add 200 μl of blocking buffer (PBS + 2% casein + 1% BSA), the plates are incubated for 1 hour. PSA samples are added to the washed wells after blocking in a volume of 100 μl, diluted in multiples of 10 in blocking buffer, starting at a concentration of 0.01 mg / ml and incubated for 60 minutes, after which the wells washed as described above are added suspension of Fe @ C-1A6 (100 μl, 0.05 mg / ml) in PBS + 2% casein. Incubation time 60 minutes. In washed wells add 100 μl of elution solution (0.1 M NaOH) and after 60 min. the relaxation time of protons in each well is measured, for which each well is separated from the plate and placed in the measuring cell of the relaxometer. The measurement results for the given example are presented in Table 1. All stages of the analysis, with the exception of the stages of washing and measurement, are performed at + 37 ° C. The total analysis time is 180-200 minutes, excluding the preparation time for the solid phase, which can be done in advance.
Пример 2. Количественное непрямое определение антител (Ат) к столбнячному анатоксину на твердой фазе с использованием конъюгата железо-углеродных наночастиц с белком G (Fe@С-белок G).Example 2. Quantitative indirect determination of antibodies (Ab) to tetanus toxoid on the solid phase using a conjugate of iron-carbon nanoparticles with protein G (Fe @ C-protein G).
На стенки лунок разборного полистирольного планшета для иммунологических реакций сорбируют из объема 100 мкл столбнячный анатоксин, разведенный в 0,2 М карбонатном буфере с рН 9,6 до концентрации 0,05 мг/мл. Сорбцию производят в течение 2 часов при температуре 37°С. Лунки планшета трижды промывают 250 мкл 0,15М раствора NaCl, забуференного 0,015М Na-фосфатами и содержащим 0,1% азида натрия и 0,1% твин-20, рН 7,25 (ЗФРТ), используя устройство для промывки микропланшетов, затем добавляют 200 мкл блокирующего буфера (ЗФТР + 2% казеин + 1% БСА), планшеты выдерживают в течение 1 часа. В отмытые после блокирования лунки добавляют образцы антител к столбнячному анатоксину в объеме 100 мкл, разведенные кратно 4-м в отрицательной сыворотке крови кролика (предварительно разведенной в 100 раз в блокирующем буфере), начиная с концентрации 100 мМЕ/мл и инкубируют в течение 60-ти мин., после чего в промытые как описано выше лунки вносят суспензию Fe@C - белок G (100 мкл, 0,05 мг/мл) в ЗФРТ + 2% казеина. Время инкубации 60 минут. В отмытые лунки вносят по 100 мкл элюирующего раствора (0,1М NaOH) и после 60-ти минутной инкубации измеряют время релаксации протонов, для чего каждую лунку отделяют от планшета и помещают в измерительную ячейку релаксометра. Результаты измерений для приведенного примера представлены в таблице 2. Все этапы анализа, за исключением этапов промывки и измерения, выполняют при +37°С. Общее время анализа 180-200 мин., без учета времени подготовки твердой фазы, что может быть выполнено заблаговременно. 
Одной из основных задач, решаемой при помощи разработанного способа, было повышение воспроизводимости и точности результатов анализа, поскольку эти аналитические характеристики важны для получения надежных достоверных данных в диагностических процедурах. С целью подтверждения высокой воспроизводимости и точности предлагаемого метода были проведены соответствующие исследования.One of the main tasks solved by the developed method was to increase the reproducibility and accuracy of the analysis results, since these analytical characteristics are important for obtaining reliable reliable data in diagnostic procedures. In order to confirm the high reproducibility and accuracy of the proposed method, appropriate studies were carried out.
Для оценки воспроизводимости анализа в отрицательную предварительно разведенную в 100 раз блокирующим буфером кроличью сыворотку вносили известное количество антител к столбнячному анатоксину. Всего было проанализировано 8 образцов с концентрацией от 0.2 до 80 мМЕ/мл в 10 повторностях. Во всех образцах коэффициент вариации не превышал 7,5% (таблица 3), что соответствует допустимым пределам [5].To assess the reproducibility of the assay, a known amount of antibodies to tetanus toxoid was added to the negative rabbit serum, previously diluted 100 times with blocking buffer. A total of 8 samples were analyzed with a concentration of 0.2 to 80 mIU / ml in 10 replicates. In all samples, the coefficient of variation did not exceed 7.5% (table 3), which corresponds to the permissible limits [5].
Для подтверждения точности разработанного анализа была проведена оценка степени извлечения методом добавок (spike-recovery test). Использовали образцы кроличьей сыворотки крови с известным содержанием антител (5, 3 и 1.3 мМЕ/мл) против столбнячного анатоксина. Предлагаемым методом определяли концентрацию Ат. Далее рассчитывали степень извлечения (таблица 4). Степень извлечения, выраженная в процентах, находилась в допустимых пределах [5].To confirm the accuracy of the developed analysis, the recovery rate was assessed by the spike-recovery test. We used samples of rabbit blood serum with known antibody levels (5, 3, and 1.3 mIU / ml) against tetanus toxoid. The proposed method was used to determine the concentration of Ab. Further, the degree of extraction was calculated (table 4). The recovery, expressed as a percentage, was within acceptable limits [5].
Таким образом, технологический результат от использования предлагаемого изобретения заключается, в том, что разработанный способ анализа объективно не зависит от применения дорогостоящих реагентов и позволяет получать надежные результаты с высокой воспроизводимостью и точностью за счет применения эффективных реагентов: конъюгатов магнитных наночастиц, которые стабильны и не теряют своих структурных и функциональных свойств в течении длительного времени хранения (фиг. 1, 2), а также за счет разработанного способа, предусматривающего возможность в ходе анализа освободиться от примесей, влияющих на его результат.Thus, the technological result from the use of the proposed invention is that the developed method of analysis is objectively independent of the use of expensive reagents and allows obtaining reliable results with high reproducibility and accuracy due to the use of effective reagents: conjugates of magnetic nanoparticles that are stable and do not lose their structural and functional properties during a long storage period (Fig. 1, 2), as well as due to the developed method, which provides for the ability to get rid of impurities during the analysis that affect its result.
Применение разработанного способа анализа может найти свою реализацию не только при создании эффективных тест-систем, предназначенных для диагностики различный заболеваний и аналитических исследований, но и в решении таких актуальных проблем как разработка способов оценки загрязнения окружающей среды и продуктов питания различными агентами.The application of the developed analysis method can find its implementation not only in the creation of effective test systems designed for the diagnosis of various diseases and analytical studies, but also in solving such urgent problems as the development of methods for assessing environmental and food pollution by various agents.
Библиографический списокBibliographic list
1. Zhang Y. et al. Recent Advances on Magnetic Relaxation Switching Assay-Based Nanosensors // Bioconjugate Chemistry. 2017. Vol. 28. №4. P. 869-879.1. Zhang Y. et al. Recent Advances on Magnetic Relaxation Switching Assay-Based Nanosensors // Bioconjugate Chemistry. 2017. Vol. 28. No. 4. P. 869-879.
2. Huang Y., Ren J., Qu X. Nanozymes: Classification, Catalytic Mechanisms, Activity Regulation, and Applications // Chemical Reviews. 2019. Vol. 119. №6. P. 4357-4412.2. Huang Y., Ren J., Qu X. Nanozymes: Classification, Catalytic Mechanisms, Activity Regulation, and Applications // Chemical Reviews. 2019. Vol. 119. No. 6. P. 4357-4412.
3. Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции // Патент РФ №2684325. 2019. Бюл. №10. / Раев М.Б., Храмцов П.В., Бочкова М.С. и др.3. A method of producing a conjugate based on magnetic metal-carbon nanoparticles, suitable for diagnostic and analytical purposes, using NMR relaxometry as a detection method // RF Patent No. 2684325. 2019. Bul. No. 10. / Raev M.B., Khramtsov P.V., Bochkova M.S. and etc.
4. Khramtsov P. et al. Conjugation of carbon coated-iron nanoparticles with biomolecules for NMR-based assay // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2019. Vol. 176. P. 256-2644. Khramtsov P. et al. Conjugation of carbon coated-iron nanoparticles with biomolecules for NMR-based assay // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2019. Vol. 176. P. 256-264
5. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry/ U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration / [Электронный ресурс]. - Режим доступа: URL: https://www.fda.gov/media/70858/download (дата обращения: 20.02.2020).5. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry / U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration / [Electronic resource]. - Access mode: URL: https://www.fda.gov/media/70858/download (date of access: 20.02.2020).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020113131A RU2743426C1 (en) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | Method for determining biological macromolecules based on nmr relaxometry |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020113131A RU2743426C1 (en) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | Method for determining biological macromolecules based on nmr relaxometry |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2743426C1 true RU2743426C1 (en) | 2021-02-18 |
Family
ID=74666236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020113131A RU2743426C1 (en) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | Method for determining biological macromolecules based on nmr relaxometry |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2743426C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113376371A (en) * | 2021-05-10 | 2021-09-10 | 华中农业大学 | Construction method and application of platinum-shell gold core nanoenzyme-mediated magnetic relaxation sensing signal amplification system |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2543631C2 (en) * | 2013-07-23 | 2015-03-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН | Method for functionalising surface of magnetic nanoparticles |
| RU2684325C1 (en) * | 2018-05-03 | 2019-04-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук ("ПФИЦ УрО РАН") | Method of producing conjugate based on magnetic metall-carbon nanoparticles suitable for diagnostic and analytical target using nmr-relaxometry as a detection method |
-
2020
- 2020-03-26 RU RU2020113131A patent/RU2743426C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2543631C2 (en) * | 2013-07-23 | 2015-03-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН | Method for functionalising surface of magnetic nanoparticles |
| RU2684325C1 (en) * | 2018-05-03 | 2019-04-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук ("ПФИЦ УрО РАН") | Method of producing conjugate based on magnetic metall-carbon nanoparticles suitable for diagnostic and analytical target using nmr-relaxometry as a detection method |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KHRAMTSOV P. et al. Conjugation of carbon coated-iron nanoparticles with biomolecules for NMR-based assay // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 01.04.2019, V.176, pp.256-264. * |
| KOH. I. et al. Sensitive NMR Sensors Detect Antibodies To Influenza // Angew Chem. Int. Ed. Engl., 2008, V.47, pp.4119-4121. * |
| KOH. I. et al. Sensitive NMR Sensors Detect Antibodies To Influenza // Angew Chem. Int. Ed. Engl., 2008, V.47, pp.4119-4121. KHRAMTSOV P. et al. Conjugation of carbon coated-iron nanoparticles with biomolecules for NMR-based assay // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 01.04.2019, V.176, pp.256-264. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113376371A (en) * | 2021-05-10 | 2021-09-10 | 华中农业大学 | Construction method and application of platinum-shell gold core nanoenzyme-mediated magnetic relaxation sensing signal amplification system |
| CN113376371B (en) * | 2021-05-10 | 2024-01-30 | 华中农业大学 | Construction method and application of platinum-shell gold-core nano-enzyme-mediated magnetic relaxation sensing signal amplification system |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peterson et al. | Enhanced sandwich immunoassay using antibody-functionalized magnetic iron-oxide nanoparticles for extraction and detection of soluble transferrin receptor on a photonic crystal biosensor | |
| Zhu et al. | Simultaneous detection of high-sensitivity cardiac troponin I and myoglobin by modified sandwich lateral flow immunoassay: proof of principle | |
| US8956823B2 (en) | Anti-antibody reagent | |
| Chinnasamy et al. | A lateral flow paper microarray for rapid allergy point of care diagnostics | |
| US10488408B2 (en) | Detection of target molecules in a sample by using a magnetic field | |
| JPS598779B2 (en) | Antibodies, Antigens or Antibodies: Methods for Analyzing Antigen Complexes | |
| Juntunen et al. | Effects of blood sample anticoagulants on lateral flow assays using luminescent photon-upconverting and Eu (III) nanoparticle reporters | |
| Bocková et al. | Surface plasmon resonance biosensor for detection of pregnancy associated plasma protein A2 in clinical samples | |
| JP2016536587A (en) | Competitive ligand binding assay to detect neutralizing antibodies | |
| Hu et al. | SERS-based boronate affinity biosensor with biomimetic specificity and versatility: Surface-imprinted magnetic polymers as recognition elements to detect glycoproteins | |
| Singampalli et al. | Rapid magneto-enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive protein detection | |
| US4138213A (en) | Agglutination immunoassay of immune complex with RF or Clq | |
| CN107356743B (en) | Assay kit for detecting myoglobin | |
| Qu et al. | Development of a nano-gold capillary immunochromatographic assay for rapid and semi-quantitative detection of clenbuterol residues | |
| EP0968422B1 (en) | Improving performance of binding assays by use of more than one label | |
| Muñoz-San Martín et al. | First bioelectronic immunoplatform for quantitative secretomic analysis of total and metastasis-driven glycosylated haptoglobin | |
| RU2743426C1 (en) | Method for determining biological macromolecules based on nmr relaxometry | |
| von Lode et al. | One-step quantitative thyrotropin assay for the detection of hypothyroidism in point-of-care conditions | |
| JPH11133023A (en) | Formulations to reduce the effects of urea in immunochromatographic assays using urine samples | |
| Qin et al. | A new immunofluorescence determination of Parkinson's disease biomarkers using silver nanoparticles | |
| CN113295869B (en) | Immunoassay method based on ultrasensitive magnetic relaxation time sensor | |
| Liang et al. | All-in-one microfluidic immunosensing device for rapid and end-to-end determination of salivary biomarkers of cardiovascular diseases | |
| Fana et al. | Development and evaluation of a rapid lateral flow immunochromatographic strip assay for detection of 17β-estradiol in sheep sera | |
| Jain et al. | A multi-analyte immunoassay for thyroid related analytes | |
| Cristina Muñoz-San et al. | First bioelectronic immunoplatform for quantitative secretomic analysis of total and metastasis-driven glycosylated haptoglobin |