RU2741224C1

RU2741224C1 - Method of biological tissue treatment for implantable bioprosthesis

Info

Publication number: RU2741224C1
Application number: RU2019142029A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Владимирович Требушат; Андрей Владимирович Дубровин
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Ангиолайн Ресерч"
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-01-22

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions refers to medicine, particularly to endoprosthesis, and discloses a biological tissue, which is a collagen-containing tissue of mammals, for an implantable bioprosthesis used in cardiovascular surgery and representing an aortic valve, an implantable bioprosthesis and methods for preparing them.

EFFECT: inventions enable to obtain a strong, elastic, suitable for long-term storage biological tissue with reduced probability of rejection and calcification after implantation into the patient's body.

17 cl, 2 tbl, 3 ex, 2 dwg

Description

Область техникиTechnology area

[001] Настоящие изобретение относится к области медицины, в частности к способам обработки биологической ткани для создания биопротезов с целью повышения биосовместимости и подавления кальцификации биопротезов после имплантации в организм пациента.[001] The present invention relates to the field of medicine, in particular to methods of processing biological tissue to create bioprostheses in order to increase biocompatibility and suppress calcification of bioprostheses after implantation into a patient's body.

Уровень техникиState of the art

[002] Различные типы имплантируемых биопротезов, используемых в медицине, могут быть полностью или частично сформированы из биологической ткани. Примеры биологических тканей, которые используются для формирования имплантируемых биопротезов, включают сердечные клапаны, кровеносные сосуды, кожу, твердую мозговую оболочку, перикард, связки и сухожилия. Эти биологические ткани обычно содержат такие структурные белки, как коллаген и эластин. Эластичность и жесткость биологической ткани в значительной степени определяется относительными количествами коллагена и эластина, присутствующими в ткани. Биологическая ткань для изготовления биопротезов подвергается химической обработке с целью придания ткани иммунологической инертности, механической прочности и устойчивости к биоразложению. Такая химическая обработка называется фиксацией биологической ткани. Для фиксации чаще всего используются химические вещества, называемые кросслинкирующими агентами. Молекулы кросслинкирующих агентов имеют относительно небольшие размеры и легко проникают в биологическую ткань, где образуют ковалентные поперечные связи между полипептидными цепями в пределах одной молекулы структурного белка (то есть, внутримолекулярные поперечные связи) или между соседними молекулами структурных белков (то есть межмолекулярными поперечными связями).[002] Various types of implantable bioprostheses used in medicine can be formed in whole or in part from biological tissue. Examples of biological tissues that are used to form implantable bioprostheses include heart valves, blood vessels, skin, dura mater, pericardium, ligaments, and tendons. These biological tissues usually contain structural proteins such as collagen and elastin. The elasticity and stiffness of biological tissue is largely determined by the relative amounts of collagen and elastin present in the tissue. Biological tissue for the manufacture of bioprostheses undergoes chemical treatment in order to impart immunological inertness, mechanical strength and resistance to biodegradation to the tissue. This chemical treatment is called tissue fixation. The most commonly used fixing agents are chemicals called crosslinking agents. Molecules of cross-linking agents are relatively small and easily penetrate biological tissue, where they form covalent cross-links between polypeptide chains within one molecule of a structural protein (i.e., intramolecular cross-links) or between adjacent molecules of structural proteins (i.e., intermolecular cross-links).

[003] В результате воздействия кросслинкирующего агента повышается устойчивость биологической ткани к механическому, термическому и ферментативному разрушению. При этом биологическая ткань становиться более прочной, но при этом частично теряет свою эластичность. Баланс между эластичностью и жесткостью определяется концентрацией и временем воздействия кросслинкирующего агента, а также температурой и кислотностью среды, в которой проводится процедура фиксации биологической ткани. При этом форма, которую биологическая ткань принимает во время фиксации, необратима и сохраняется на всех последующих этапах работы с биологической ткани.[003] As a result of the action of the crosslinking agent, the resistance of biological tissue to mechanical, thermal and enzymatic destruction is increased. At the same time, biological tissue becomes more durable, but at the same time it partially loses its elasticity. The balance between elasticity and stiffness is determined by the concentration and time of exposure of the crosslinking agent, as well as the temperature and acidity of the environment in which the biological tissue fixation procedure is performed. At the same time, the form that the biological tissue takes during fixation is irreversible and remains at all subsequent stages of working with biological tissue.

[004] Примеры кросслинкирующих агентов, которые используют для обработки биологической ткани, включают: альдегиды, например, формальдегид, глутаровый альдегид (глутаральдегид), диальдегидный крахмал, параформальдегид, глицероальдегид, глиоксаль, ацетальдегид, акролеин; диизоцианаты, например, гексаметилендиизоцианат, карбодиимиды и некоторые полиэпоксидные соединения, например, Denacol-810, ЕХ-512, диглицидиловый эфир этиленгликоля. В некоторых случаях вместо химических веществ применяют фотоокисление.[004] Examples of crosslinking agents that are used to treat biological tissue include: aldehydes, eg formaldehyde, glutaraldehyde (glutaraldehyde), dialdehyde starch, paraformaldehyde, glyceroaldehyde, glyoxal, acetaldehyde, acrolein; diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate, carbodiimides and some polyepoxy compounds such as Denacol-810, EX-512, ethylene glycol diglycidyl ether. In some cases, photooxidation is used instead of chemicals.

[005] Известен способ обработки материала яремной вены крупного рогатого скота (КРС) для последующего изготовления содержащего клапан кондуита, который включает фиксацию биологической ткани с помощью эпоксидного кросслинкирующим агента - диглицидилового эфира этиленгликоля (патент № RU 2633544 C1, опубликован: 13.10.2017 г., МПК A61F 2/00). Недостатком указанного способа фиксации является недостаточно высокая частота поперечных сшивок, которые обеспечивает диглицидиловый эфир этиленгликоля, что приводит к сниженной механической прочности фиксированной биологической ткани.[005] A known method of processing material of the jugular vein of cattle (cattle) for the subsequent manufacture of a conduit containing a valve, which includes fixation of biological tissue using an epoxy cross-linking agent - ethylene glycol diglycidyl ether (patent No. RU 2633544 C1, published: 13.10.2017. , IPC A61F 2/00). The disadvantage of this method of fixation is the insufficiently high frequency of cross-linking, which is provided by the diglycidyl ether of ethylene glycol, which leads to a reduced mechanical strength of the fixed biological tissue.

[006] Наиболее популярным кросслинкирующим агентом, применяемым для обработки биологических тканей при создании биопротезов, является глутаральдегид. Глутаральдегид имеет небольшие молекулы, каждая из которых содержит две альдегидные группы, разделенные гибкой цепью из трех метиленовых групп. В образовании связей между полипептидными цепями одного или разных белков задействованы именно альдегидные группы глутаральдегида. В водных растворах глутаральдегид присутствует в виде мономеров и полимеров переменного размера, и в образовании поперечных связей участвуют, как правило, не отдельные мономеры, а полимеры глутаральдегида. Из полимерной цепи глутаральдегида выступают свободные альдегидные группы, которые наряду с концевыми альдегидными группами взаимодействуют с аминогруппами белков, что обеспечивает большую плотность поперечных связей между полипептидными цепями структурных белков и, соответственно, прочность биологической ткани.[006] Glutaraldehyde is the most popular crosslinking agent used to treat biological tissues when creating bioprostheses. Glutaraldehyde is a small molecule, each of which contains two aldehyde groups separated by a flexible chain of three methylene groups. It is the aldehyde groups of glutaraldehyde that are involved in the formation of bonds between the polypeptide chains of one or different proteins. In aqueous solutions, glutaraldehyde is present in the form of monomers and polymers of variable size, and, as a rule, not individual monomers, but polymers of glutaraldehyde are involved in cross-linking. Free aldehyde groups protrude from the polymer chain of glutaraldehyde, which, along with the terminal aldehyde groups, interact with the amino groups of proteins, which provides a high density of cross-links between polypeptide chains of structural proteins and, accordingly, the strength of biological tissue.

[007] Основными проблемами, связанными с применением биопротезов, выполненных из фиксированных биологических тканей, является их отторжение и кальцификация после имплантации в организм пациента. Эти ограничения являются основными причинами реопераций у взрослых пациентов и высокой смертности у детей из-за высокой скорости кальцификации биопротезов в раннем детском возрасте. Отторжение является результатом иммунного ответа организма пациента на клеточный аппарат биологической ткани, в первую очередь на белки, заякоренные в цитоплазматической мембране и расположенные на поверхности клеток. Фиксация глутаральдегидом частично позволяет снизить иммуногенность биологической ткани за счет изменения третичной и четвертичной структуры белков и частичной маскировки эпитопов, которые могут опознаваться антителами в организме пациента и вызывать иммунный ответ. Однако любая фиксация биологической ткани, в том числе и фиксация глутаральдегидом, вызывает разрушение клеток и высвобождение большого количества антигенов. Кроме того, остатки клеток (клеточный дебрис), и в особенности фосфолипиды, входящие в состав клеточных мембран, провоцируют раннюю кальцификацию биологической ткани (Schoen and Levy, 2005). При этом установлена прямая связь между специфическим иммунным ответом в организме пациента посредством антител и кальцификацией биопротеза (Human and Zilla, 2001, Characterization of the immune response to valve bioprostheses and its role in primary tissue failure. Ann Thorac Surg.). В связи с этим для уменьшения иммунного ответа на биопротез и для предотвращения его кальцификации предлагаются методы обработки фиксированной биологической ткани, обеспечивающие удаление клеточного дебриса. Для этого используют различные подходы, включая обработку гипотоническим шоком, протеолитическими ферментами, нуклеазами и детергентами.[007] The main problems associated with the use of bioprostheses made from fixed biological tissues is their rejection and calcification after implantation into the patient's body. These limitations are the main reasons for reoperations in adult patients and high mortality in children due to the high rate of calcification of bioprostheses in early childhood. Rejection is the result of the patient's immune response to the cellular apparatus of biological tissue, primarily to proteins anchored in the cytoplasmic membrane and located on the cell surface. Fixation with glutaraldehyde partially reduces the immunogenicity of biological tissue by changing the tertiary and quaternary structure of proteins and partial masking of epitopes that can be recognized by antibodies in the patient's body and cause an immune response. However, any fixation of biological tissue, including fixation with glutaraldehyde, causes the destruction of cells and the release of a large number of antigens. In addition, cell debris (cellular debris), and in particular the phospholipids found in cell membranes, provoke early calcification of biological tissue (Schoen and Levy, 2005). At the same time, a direct relationship was established between the specific immune response in the patient's body through antibodies and the calcification of the bioprosthesis (Human and Zilla, 2001, Characterization of the immune response to valve bioprostheses and its role in primary tissue failure. Ann Thorac Surg.). In this regard, in order to reduce the immune response to the bioprosthesis and to prevent its calcification, methods of processing fixed biological tissue are proposed, which ensure the removal of cellular debris. For this, various approaches are used, including treatment with hypotonic shock, proteolytic enzymes, nucleases and detergents.

[008] Альтернативной стратегией по снижению уровня кальцификации биопротеза является обработка фиксированной биологической ткани аминоолиевой кислотой (AOA, amino oleic acid). Эта стратегия направлена на устранение одной из специфических причин кальцификации биопротезов, связанных с фиксацией биологической ткани глутаральдегидом. Дело в том, что в полимерных цепях глутаральдегида, участвующик в кросслинкировании белков, остаются ни с чем не связанные боковые альдегидные группы, которые невозможно вымыть из ткани. Эти свободные альдегидные группы, а также непрореагировавшие молекулы глутаральдегида, не вымытые из ткани, являются центрами нуклеации фосфатов кальция из плазмы крови, с последующим ростом кристаллов гидроксиапатита. Аминоолиевая кислота соединяется с остатками альдегида, предотвращая отложения кальция. Однако Шиффовы основания, образуемые при взаимодействии остатков альдегида с аминоолиевой кислотой, являются обратимыми и соответственно ингибирование кальцификации не может считаться надежным в долгосрочной перспективе (Дроздовский и Линник, 2016).[008] An alternative strategy to reduce the level of calcification of the bioprosthesis is the treatment of fixed biological tissue with aminoolic acid (AOA, amino oleic acid). This strategy is aimed at eliminating one of the specific causes of calcification of bioprostheses associated with fixation of biological tissue with glutaraldehyde. The fact is that in the polymer chains of glutaraldehyde, which is involved in the crosslinking of proteins, there remain unconnected side aldehyde groups that cannot be washed out of the tissue. These free aldehyde groups, as well as unreacted glutaraldehyde molecules not washed out of the tissue, are nucleation centers for calcium phosphates from blood plasma, followed by the growth of hydroxyapatite crystals. Aminolic acid combines with aldehyde residues to prevent calcium deposits. However, Schiff bases formed during the interaction of aldehyde residues with aminoolic acid are reversible and, accordingly, inhibition of calcification cannot be considered reliable in the long term (Drozdovskiy and Linnik, 2016).

[009] Еще один способ обработки фиксированной биологической ткани предполагает инкубацию биологической ткани со 100%-ным глицерином для удаления липидов с поверхности биологической ткани, что снижает интенсивность иммунологического ответа и кальцификацию (заявка № WO 2011109433 A2, опубликована: 09.09.2011 г., МПК C12N 5/071, A61L 27/38, A61K 35/12, A61F 2/02). Однако использование растворов глицерина с концентрацией выше 60% приводит к ухудшению механической прочности биологической ткани.[009] Another method of processing fixed biological tissue involves incubation of biological tissue with 100% glycerol to remove lipids from the surface of biological tissue, which reduces the intensity of the immunological response and calcification (application No. WO 2011109433 A2, published: 09.09.2011, IPC C12N 5/071, A61L 27/38, A61K 35/12, A61F 2/02). However, the use of glycerol solutions with a concentration above 60% leads to a deterioration in the mechanical strength of biological tissue.

[0010] Еще один вариант антикальциевой обработки фиксированной биологической ткани включает нанесение хитозанового покрытия (патент № RU 2519219 C1, опубликован: 10.06.2014 г., МПК A61L 27/36, A61F 2/24, A61L 27/28, A61L 27/20). Хитозан является одним из компонентов хитина и представляет собой длинную молекулу, по физическим параметрам напоминающую коллаген и способную образовывать связи с другими белками фиксированной биологической ткани. При этом хитозановое покрытие исключает возможность образования кальциевого осадка на поверхности фиксированной глутаральдегидом биологической ткани. Недостатком описанного способа обработки является сложность получения и нанесения покрытия. Кроме того, остается неясной долговечность хитозанового покрытия в условиях реальной работы биопротеза после имплантации. Так, в экспериментах, проведенных на крысах, было показано, что через четыре месяца после имплантации, в биологической ткани, обработанной хитозаном, накапливается значительное количество кальция с образованием кристаллов гидроксиапатита (Baucia et al., 2006). Таким образом использование хитозана в качестве средства против кальцификации биологической ткани, фиксированной глутаральдегидом, пока остается неэффективным.[0010] Another variant of the anticalcium treatment of fixed biological tissue involves the application of a chitosan coating (patent No. RU 2519219 C1, published: June 10, 2014, IPC A61L 27/36, A61F 2/24, A61L 27/28, A61L 27/20 ). Chitosan is one of the components of chitin and is a long molecule that physically resembles collagen and is able to form bonds with other proteins of fixed biological tissue. At the same time, the chitosan coating excludes the possibility of calcium precipitate formation on the surface of biological tissue fixed with glutaraldehyde. The disadvantage of the described method of processing is the complexity of obtaining and applying the coating. In addition, the durability of the chitosan coating under the conditions of actual operation of the bioprosthesis after implantation remains unclear. Thus, in experiments carried out on rats, it was shown that four months after implantation, a significant amount of calcium accumulates in the biological tissue treated with chitosan with the formation of hydroxyapatite crystals (Baucia et al., 2006). Thus, the use of chitosan as an agent against calcification of biological tissue fixed with glutaraldehyde remains ineffective.

[0011] Известен способ, описанный в патенте № US 6214054 (опубликован: 10.04.2001 г., МПК A61L 27/00, A61L 27/36, A61L 33/00, A61L 33/12). Указанный способ подразумевает фиксацию биологической ткани глутаральдегидом с последующей инкубацией фиксированной биологической ткани в растворе, содержащем детергент, спирт и формальдегид. Указанный раствор избавляет фиксированную биологическую ткань от остаточного альдегида и удаляет сайты инициации кальцификации, связанные с клеточным дебрисом. В указанном способе обработка биологической ткани завершается стерилизацией в растворе глутаральдегида. Описанный способ обработки биологической ткани усовершенствован в настоящем изобретении за счет контроля формы биологической ткани во время процедуры фиксации, за счет способа раскроя биологической ткани, а также за счет модификации процедуры стерилизации.[0011] The known method is described in patent No. US 6214054 (published: 10.04.2001, IPC A61L 27/00, A61L 27/36, A61L 33/00, A61L 33/12). This method involves the fixation of biological tissue with glutaraldehyde, followed by incubation of the fixed biological tissue in a solution containing detergent, alcohol and formaldehyde. This solution removes residual aldehyde from fixed biological tissue and removes calcification initiation sites associated with cellular debris. In this method, the processing of biological tissue is completed by sterilization in a glutaraldehyde solution. The described method for processing biological tissue is improved in the present invention by controlling the shape of biological tissue during the fixation procedure, by means of cutting biological tissue, and also by modifying the sterilization procedure.

[0012] В настоящее время остается потребность в разработке новых сравнительно простых и воспроизводимых способов обработки биологических тканей, позволяющих получать качественный материал для создания биопротезов со сниженной вероятностью отторжения и кальцификации после имплантации в тело пациента.[0012] Currently, there remains a need for the development of new relatively simple and reproducible methods of processing biological tissues, allowing to obtain high-quality material for creating bioprostheses with a reduced probability of rejection and calcification after implantation into the patient's body.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

[0013] Задачей настоящего изобретения является является разработка надежного, воспроизводимого способа контролируемой обработки биологической ткани для создания имплантируемых биопротезов со сниженной способностью к отторжению и кальцификации после имплантации в тело пациента.[0013] The object of the present invention is to provide a reliable, reproducible method for controlled processing of biological tissue for the creation of implantable bioprostheses with reduced rejection and calcification after implantation into the patient's body.

[0014] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как получение качественного материала для создания имплантируемых биопротезов, представляющего собой прочную, эластичную, пригодную для длительного хранения биологическую ткань определенной формы со сниженной вероятностью отторжения и кальцификации после имплантации в тело пациента.[0014] This problem is solved by the claimed invention by achieving such a technical result as obtaining a high-quality material for creating implantable bioprostheses, which is a strong, elastic, suitable for long-term storage biological tissue of a certain shape with a reduced probability of rejection and calcification after implantation into the patient's body.

[0015] Заявленный технический результат достигается за счет того, что способ обработки биологической ткани включает следующие этапы. После извлечения биологической ткани из тела животного ее механически очищают от остатков жировой ткани и слизи. Остатки жира и слизи могут приводить к неравномерности последующей химической обработке биологической ткани, а также способствовать кальцификации или отторжению биопротеза после имплантации. Механическую обработку проводят с помощью ткани, смоченной в изотоническом растворе, который позволяет избежать дегидратации или избыточной гидратации биологической ткани.[0015] The claimed technical result is achieved due to the fact that the method for processing biological tissue includes the following steps. After removing biological tissue from the body of the animal, it is mechanically cleaned from the remains of adipose tissue and mucus. Residual fat and mucus can lead to irregularities in the subsequent chemical treatment of biological tissue, as well as promote calcification or rejection of the bioprosthesis after implantation. Mechanical treatment is carried out using a tissue soaked in an isotonic solution, which avoids dehydration or excessive hydration of biological tissue.

[0016] После механической обработки проводят визуальный контроль биологической ткани на предмет наличия кровоизлияний и механических повреждений, локальных точечных истончений и утолщений. Отбирают биологическую ткань с равномерной поверхностью, что позволяет в дальнейшем избежать неконтролируемых повреждений деталей биопротеза после его имплантации в организм пациента.[0016] After mechanical treatment, the biological tissue is visually inspected for the presence of hemorrhages and mechanical damage, local punctate thinning and thickening. A biological tissue with a uniform surface is selected, which allows to further avoid uncontrolled damage to the parts of the bioprosthesis after its implantation into the patient's body.

[0017] Затем биологическую ткань фиксируют в растворе глутаральдегида. Использование глутаральдегида в качестве кросслинкирующего агента позволяет получать оптимальное количество поперечных связей между полипептидными цепями коллагена, что стабилизирует коллагеновую структуру и сохраняет эластичность биологической ткани. Для того чтобы фиксированная биологическая ткань имела плоскую форму, оптимальную для создания деталей биопротеза, фиксацию биологической ткани проводят на плоских пластинах.[0017] The biological tissue is then fixed in a glutaraldehyde solution. The use of glutaraldehyde as a crosslinking agent makes it possible to obtain the optimal amount of cross-links between the collagen polypeptide chains, which stabilizes the collagen structure and maintains the elasticity of biological tissue. In order for the fixed biological tissue to have a flat shape, which is optimal for creating bioprosthesis parts, the biological tissue is fixed on flat plates.

[0018] Из фиксированной биологической ткани с помощью лазерной резки вырезают детали биопротеза. Лазерную резку фиксированной биологической ткани производят в жидкости, что позволяет уменьшить краевое повреждение биологической ткани, возникающее при воздействии лазерного излучения. Во время лазерной резки биологическая ткань может быть полностью погружена в жидкость или может орошаться жидкостью. Жидкость может быть очищенной водой или изотоническим раствором. Изотонический раствор является более предпочтительным вариантом, так как позволяет избежать набухания и деформации ткани.[0018] Parts of the bioprosthesis are cut out from the fixed biological tissue using laser cutting. Laser cutting of fixed biological tissue is performed in a liquid, which makes it possible to reduce the edge damage to biological tissue that occurs when exposed to laser radiation. During laser cutting, biological tissue can be completely immersed in liquid or can be irrigated with liquid. The liquid can be purified water or isotonic solution. Isotonic solution is the preferred option, as it avoids tissue swelling and deformation.

[0019] Фиксированную биологическую ткань, с целью снижения возможности последующих кальцификации и отторжения, обрабатывают раствором, содержащим детергент, этанол, формальдегид и буферный раствор. Детергент и этанол служат для удаления клеточного дебриса из биологической ткани. Кроме того, этанол вызывает изменения структуры коллагена, что снижает вероятность его кальцификации. Формальдегид в растворе используют в качестве стерилизующего агента. Буферный раствор поддерживает кислотность раствора, оптимальную для эффективности и стабильности остальных компонентов раствора.[0019] The fixed biological tissue, in order to reduce the possibility of subsequent calcification and rejection, is treated with a solution containing a detergent, ethanol, formaldehyde and a buffer solution. Detergent and ethanol are used to remove cellular debris from biological tissue. In addition, ethanol causes changes in the structure of collagen, which makes it less likely to calcify. Formaldehyde in solution is used as a sterilizing agent. The buffer solution maintains the acidity of the solution, which is optimal for the effectiveness and stability of the remaining components of the solution.

[0020] В одном варианте реализации настоящего изобретения антикальциевую обработку биологической ткани проводят после фиксации, но до раскроя биологической ткани. В другом варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после раскроя фиксированной биологической ткани, но до сборки биопротеза. Еще в одном варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после сборки биопротеза.[0020] In one embodiment of the present invention, the anticalcium treatment of biological tissue is performed after fixation, but before cutting the biological tissue. In another embodiment, the anticalcium treatment of the biological tissue is performed after cutting the fixed biological tissue, but before assembling the bioprosthesis. In yet another embodiment, the anticalcium treatment of biological tissue is performed after the bioprosthesis is assembled.

[0021] Стерилизацию биологической ткани проводят в растворе, содержащем стерилизующий агент и буферный раствор, обеспечивающий pH = 5.0-7.4. В предпочтительном варианте изобретения в качестве стерилизующего агента выступает глутаральдегид. Указанное значение рН обеспечивает стабильность глутаральдегида в растворе, что позволяет хранить стерилизованную биологическую ткань в течение длительного времени.[0021] Sterilization of biological tissue is carried out in a solution containing a sterilizing agent and a buffer solution providing pH = 5.0-7.4. In a preferred embodiment, the sterilizing agent is glutaraldehyde. The specified pH value ensures the stability of glutaraldehyde in solution, which makes it possible to store sterilized biological tissue for a long time.

Описание чертежейDescription of drawings

[0022] На фиг. 1А представлен пример биопротеза согласно настоящему изобретению, вид сбоку.[0022] FIG. 1A shows an example of a bioprosthesis according to the present invention, side view.

[0023] На фиг. 1Б представлен пример биопротеза согласно настоящему изобретению, вид сверху.[0023] FIG. 1B shows an example of a bioprosthesis according to the present invention, top view.

Подробное описания изобретенияDetailed description of the invention

[0024] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.[0024] In the following detailed description of an implementation of the invention, numerous implementation details are provided to provide a thorough understanding of the present invention. However, it will be obvious to a person skilled in the art how the present invention can be used with or without these implementation details. In other instances, well-known techniques, procedures, and components are not described in detail so as not to obscure the details of the present invention.

[0025] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.[0025] In addition, it is clear from the foregoing that the invention is not limited to the foregoing implementation. Numerous possible modifications, changes, variations and substitutions, while retaining the spirit and form of the present invention, will be apparent to those skilled in the art.

[0026] Способ согласно настоящему изобретению может применяться для обработки различных коллагенсодержащих тканей свиньи, КРС, лошади или других млекопитающих.[0026] The method of the present invention can be used to treat a variety of collagen-containing tissues of pigs, cattle, horses or other mammals.

[0027] Обработку биологической ткани начинают не более чем через 8 ч от момента начала извлечения биологической ткани из тела животного.[0027] The treatment of biological tissue begins no more than 8 hours after the start of the extraction of biological tissue from the body of the animal.

[0028] Биологическую ткань помещают в чистый контейнер и промывают изотоническим раствором, например, раствором 0,9% масс. хлорида натрия. Изотонический раствор позволяет избежать гипогидратации или гипергидратации биологической ткани. Это исключает механическую деформацию биологической ткани за счет набухания или сморщивания, а также предотвращает преждевременное разрушение клеток биологической ткани. Разрушение клеток опасно тем, что при этом высвобождается содержимое лизосом, что может приводить к деградации структурных белков биологической ткани. Содержание 0.9% масс. хлорида натрия в растворе обеспечивает осмоляльность ~ 300 мОсм/л, что соответствует осмолярности крови и мягких тканей млекопитающих (Кудрявцева с соавт., 2013). Биологическую ткань разделяют на лоскуты, которые подвергают механической обработке. С помощью марлевой салфетки, смоченной в изотоническом растворе, например, 0.9% масс. хлорида натрия, очищают поверхность лоскутов биологической ткани, удаляя остатки жировой ткани и слизи. Затем тщательно обследуют лоскуты биологической ткани на отсутствие кровоизлияний и механических повреждений, локальных точечных истончений и утолщений. Отбирают лоскуты биологической ткани с равномерной поверхностью. Неравномерность толщины или повреждения биологической ткани могут приводить к механической непрочности деталей биопротеза, к неконтролируемому искажению нагрузок на детали биопротеза после его имплантации и преждевременной деградации биопротеза.[0028] The biological tissue is placed in a clean container and washed with an isotonic solution, for example, a solution of 0.9% of the mass. sodium chloride. Isotonic solution avoids hypohydration or overhydration of biological tissue. This eliminates mechanical deformation of biological tissue due to swelling or shrinkage, and also prevents premature destruction of biological tissue cells. The destruction of cells is dangerous because the contents of the lysosomes are released, which can lead to the degradation of the structural proteins of biological tissue. Content 0.9% wt. sodium chloride in solution provides osmolality of ~ 300 mOsm / L, which corresponds to the osmolality of blood and soft tissues of mammals (Kudryavtseva et al., 2013). The biological tissue is divided into flaps, which are subjected to mechanical processing. Using a gauze pad soaked in isotonic solution, for example, 0.9% of the mass. sodium chloride, clean the surface of biological tissue flaps, removing the remnants of adipose tissue and mucus. Then, the biological tissue flaps are carefully examined for the absence of hemorrhages and mechanical damage, local point thinning and thickening. Selected flaps of biological tissue with a uniform surface. Uneven thickness or damage to biological tissue can lead to mechanical fragility of bioprosthesis parts, uncontrolled distortion of loads on bioprosthesis parts after implantation, and premature degradation of the bioprosthesis.

[0029] Лоскуты биологической ткани раскладывают на очищенной гладкой поверхности плоской пластины. Коррозионная активность водных растворов глутаральдегида сопоставима с коррозионной активностью воды при том же рН. Соответственно, во избежание разрушения пластины и попадания материала пластины на биологическую ткань, можно использовать только те пластины, которые выполнены из материала, не подверженного коррозии в воде. В одном варианте исполнения пластина может быть выполнена из нержавеющей стали, никеля, никель-хром-молибденового сплава, титана. В другом варианте исполнения пластина может быть выполнена из стекла, полиэтилена или полипропилена. В предпочтительном варианте исполнения пластина выполнена из пластика, например, из поливинилхлорида (ПВХ) или полиметилметакрилата (оргстекло). В этом случае поверхность пластины предварительно очищают раствором изопропилового спирта. Лоскуты биологической ткани равномерно распределяют по поверхности пластин и закрепляют любым подходящим способом, например, с помощью кнопок или клипс, выполненных из нержавеющей стали, пластика или другого материала, не оказывающего химического воздействия на биологическую ткань и не подверженного разрушению на последующих этапах обработки биологической ткани. Фиксация на пластинах необходима, так как форма, которую лоскуты биологической ткани принимают во время фиксации, необратима и сохраняется на всех последующих этапах обработки биологической ткани. Неправильная форма лоскута фиксированной биологической ткани может приводить к дефекту биопротеза. Например, при изготовлении протеза клапана сердца неконтролируемое искривление лоскута биологической ткани, из которого выполнены створки клапана, может приводить к неполной кооптации и перивальвулярным утечкам после имплантации протеза. Натяжение биологической ткани после закрепления на пластинах составляет 0.2-3.0 Н. Натяжение на нижней границе указанного диапазона позволяет сохранить естественную извитость волокон коллагена. Расправление извитых волокон коллагена обеспечивает эластичность фиксированной биологической ткани. В то же время извитость волокон коллагена увеличивает толщину фиксированной биологической ткани. Натяжение на верхней границе указанного диапазона приводит к полному и необратимому распрямлению волокон коллагена. При этом наблюдается повышение механической прочности фиксированной биологической ткани и снижение эластичности. Превышение указанной верхней границы приводит к разрыву волокон коллагена внутри биологической ткани (Овчаренко, 2016; Яблонский, 2016). Опасность таких разрывов в том, что они не видны без специальных гистологических исследований, и при этом отрицательно сказываются на долговечности биологической ткани, а также на ее способности гасить ударную нагрузку, например, при открытии/закрытии створчатого аппарата биопротеза клапана сердца, выполненного из фиксированной биологической ткани. Кроме того, механическое повреждение волокон коллагена способствует последующей кальцификации биологической ткани (Vyavahare and Tam, 2018). Конкретное натяжение биологической ткани во время фиксации зависит от требований к толщине и соотношению прочности/эластичности биологической ткани, определяемому специфическими функциями биопротеза, который будет изготовлен с применением данной фиксированной биологической ткани.[0029] The biological tissue scraps are laid out on a cleaned, smooth surface of a flat plate. The corrosive activity of aqueous solutions of glutaraldehyde is comparable to that of water at the same pH. Accordingly, in order to avoid the destruction of the plate and the ingress of the plate material onto biological tissue, only those plates can be used that are made of a material that does not corrode in water. In one embodiment, the plate can be made of stainless steel, nickel, nickel-chromium-molybdenum alloy, titanium. In another embodiment, the plate can be made of glass, polyethylene or polypropylene. In a preferred embodiment, the plate is made of plastic, such as polyvinyl chloride (PVC) or polymethyl methacrylate (plexiglass). In this case, the surface of the plate is pre-cleaned with a solution of isopropyl alcohol. The biological tissue flaps are evenly distributed over the surface of the plates and fixed in any suitable way, for example, using buttons or clips made of stainless steel, plastic or other material that does not chemically affect biological tissue and is not subject to destruction in subsequent stages of biological tissue processing. Fixation on the plates is necessary, since the shape that biological tissue flaps take during fixation is irreversible and retains at all subsequent stages of biological tissue processing. An irregularly shaped flap of fixed biological tissue can lead to a defect in the bioprosthesis. For example, in the manufacture of a heart valve prosthesis, uncontrolled curvature of the biological tissue flap from which the valve leaflets are made can lead to incomplete co-optation and perivalvular leaks after implantation of the prosthesis. The tension of the biological tissue after fixing on the plates is 0.2-3.0 N. The tension at the lower limit of the specified range allows maintaining the natural crimp of collagen fibers. The straightening of the crimped collagen fibers provides elasticity to the fixed biological tissue. At the same time, the crimp of collagen fibers increases the thickness of the fixed biological tissue. Tension at the upper limit of the specified range leads to complete and irreversible straightening of collagen fibers. At the same time, there is an increase in the mechanical strength of the fixed biological tissue and a decrease in elasticity. Exceeding this upper limit leads to rupture of collagen fibers inside the biological tissue (Ovcharenko, 2016; Yablonsky, 2016). The danger of such ruptures is that they are not visible without special histological studies, and at the same time adversely affect the durability of biological tissue, as well as its ability to absorb shock loads, for example, when opening / closing the leaflet apparatus of a bioprosthesis of a heart valve made of a fixed biological fabrics. In addition, mechanical damage to collagen fibers contributes to the subsequent calcification of biological tissue (Vyavahare and Tam, 2018). The specific tension of the biological tissue during fixation depends on the requirements for the thickness and the strength / elasticity ratio of the biological tissue, determined by the specific functions of the bioprosthesis, which will be made using this fixed biological tissue.

[0030] Пластины с закрепленными на них лоскутами биологической ткани перемещают в чистую емкость, заполненную фиксирующим раствором. Фиксирующий раствор содержит глутаральдегид в любом подходящем буферном растворе, например, фосфатном буфере PBS. Буферный раствор необходим, чтобы стабилизировать нейтральное значение рН раствора. Когда клетки биологической ткани погибают во время процесса фиксации, содержимое лизосом высвобождается, и pH становится кислым, что негативно сказывается на структуре коллагена (Zanaboni et al., 2000; Hayashi and Nagai, 1973). Буферный раствор обеспечивает pH 7.2-7.4. При таком значении рН глутаральдегид достаточно активен как кросслинкирующий агент, и при этом биологическая ткань находится в среде, кислотность которой близка к физиологической (Eltoum et al., 2001; Rasmussen and Albrechtsen, 1974). Было показано, что стабильность молекул коллагена выше при приблизительно нейтральном рН, чем при кислом или щелочном рН (Hayashi and Nagai, 1973). Поэтому для сохранения максимально нативной структуры волокон коллагена важна близкая к нейтральной кислотность раствора во время всего процесса фиксации, вплоть до его окончания. После фиксации структура коллагена стабилизируется за счет поперечных связей, и при дальнейших манипуляциях с биологической тканью уже нет необходимости выдерживать рН в столь узком диапазоне.[0030] The plates with biological tissue patches attached to them are transferred into a clean container filled with fixing solution. The fixative solution contains glutaraldehyde in any suitable buffer solution, for example, phosphate buffer PBS. A buffer solution is required to stabilize the neutral pH of the solution. When biological tissue cells die during the fixation process, the contents of the lysosomes are released and the pH becomes acidic, which negatively affects the collagen structure (Zanaboni et al., 2000; Hayashi and Nagai, 1973). The buffer solution provides a pH of 7.2-7.4. At this pH value, glutaraldehyde is quite active as a crosslinking agent, while biological tissue is in an environment whose acidity is close to physiological (Eltoum et al., 2001; Rasmussen and Albrechtsen, 1974). Collagen molecules have been shown to be more stable at approximately neutral pH than at acidic or alkaline pH (Hayashi and Nagai, 1973). Therefore, in order to maintain the maximum native structure of collagen fibers, it is important that the acidity of the solution is close to neutral during the entire fixation process, up to its end. After fixation, the collagen structure is stabilized by cross-linking, and with further manipulations with biological tissue, there is no longer a need to maintain pH in such a narrow range.

[0031] Применение глутаральдегида в качестве фиксирующего агента позволяет добиться высокой плотности поперечных связей между полипептидными цепями структурных белков, прежде всего, коллагена. При этом глутаральдегид также выступает в роли стерилизующего агента. Содержание глутаральдегида в фиксирующем растворе составляет 0.6±0.3% масс. и является оптимальным для фиксации биологической ткани при создании биопротезов. Слишком низкое содержание глутаральдегида в фиксирующем растворе приводит к неоправданному увеличению времени фиксации биологической ткани и, соответственно, производства биопротезов. Слишком высокое содержание глутаральдегида в фиксирующем растворе придает биологической ткани чрезмерную жесткость, затрудняет очищение биологической ткани от не прореагировавших молекул глутаральдегида после окончания фиксации, а также приводит к повышению уровня кальцификации фиксированной биологической ткани. Так, было показано, что увеличение концентрации глутаральдегида до 1.2% масс. приводит к повышению содержания кальция в фиксированной биологической ткани в 2 раза и более, в зависимости от используемого типа биологической ткани. В то же время снижение концентрации глутаральдегида до 0,3% масс. не оказывает существенного влияния на уровень кальцификации (Sinha et al., 2012). Масса фиксирующего раствора превышает массу лоскутов биологической ткани на пластинах не менее чем в 10 раз. Это обусловлено тем, что молекулы глутаральдегида расходуются при образовании связей между полипептидными цепями структурных белков, соответственно, количество молекул глутаральдегида должно заведомо превышать количество потенциальных сайтов кросслинкирования. При этом фиксирующий раствор полностью покрывает пластины с лоскутами биологической ткани. Контейнер герметично закрывают крышкой. Фиксацию лоскутов биологической ткани проводят при температуре от 20°С до не более 37°С. Температура влияет на скорость фиксации, а также на сохранность биологической ткани. Чем ниже температура фиксации, тем лучше сохраняется структура коллагеновых волокон, однако это сильно увеличивает время фиксации. С другой стороны, фиксация при 37°C способствует экстракции жидких компонентов цитоплазмы (Park et al., 2016), что может быть полезно для уменьшения антигенности биологической ткани. Однако, при температуре 37°C и выше возникает риск необратимой денатурации структурных белков биологической ткани (Xu, 2009; Leikina et al 2002). В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения температура фиксации биологической ткани составляет 18-25°C, что соответствует комнатной температуре. Это позволяет избежать использования дополнительного оборудования, такого как объемные термостаты, вмещающие большие емкости с биологической тканью. Через 24-72 часов с момента начала фиксации проводят замену фиксирующего раствора на свежий фиксирующий раствор в том же соотношении к массе лоскутов биологической ткани. Замена раствора обусловлена тем, что непрореагировавшие молекулы глутаральдегида в растворе со временем образуют олигомеры, которые медленнее проникают вглубь биологической ткани. Поэтому необходимо использовать новую порцию фиксирующего раствора, не содержащего длинных олигомеров. Фиксацию проводят в течение 3-14 суток. Такое время фиксации обеспечивает наиболее полное кросслинкирование структурных белков. Кроме того, на примере тканей перикарда свиньи было показано, что увеличение времени фиксации биологической ткани приводит к снижению уровня кальцификации фиксированной биологической ткани после имплантации (Sinha et al., 2012). Вероятно, это связано с тем, что по мере увеличения времени фиксации, увеличивается и количество альдегидных групп в моно- и полимерах глутаральдегида.[0031] The use of glutaraldehyde as a fixing agent makes it possible to achieve a high density of cross-links between polypeptide chains of structural proteins, primarily collagen. In this case, glutaraldehyde also acts as a sterilizing agent. The glutaraldehyde content in the fixing solution is 0.6 ± 0.3 wt%. and is optimal for fixing biological tissue when creating bioprostheses. Too low content of glutaraldehyde in the fixing solution leads to an unjustified increase in the fixation time of biological tissue and, accordingly, in the production of bioprostheses. Too high a glutaraldehyde content in the fixing solution imparts excessive rigidity to biological tissue, makes it difficult to cleanse biological tissue of unreacted glutaraldehyde molecules after fixation ends, and also leads to an increase in the level of calcification of the fixed biological tissue. Thus, it was shown that an increase in the concentration of glutaraldehyde to 1.2% of the mass. leads to an increase in the calcium content in the fixed biological tissue by 2 times or more, depending on the type of biological tissue used. At the same time, a decrease in the concentration of glutaraldehyde to 0.3% of the mass. does not significantly affect the level of calcification (Sinha et al., 2012). The mass of the fixing solution exceeds the mass of biological tissue flaps on the plates by at least 10 times. This is due to the fact that glutaraldehyde molecules are consumed during the formation of bonds between the polypeptide chains of structural proteins; accordingly, the number of glutaraldehyde molecules must certainly exceed the number of potential crosslinking sites. In this case, the fixing solution completely covers the plates with biological tissue flaps. The container is sealed with a lid. Fixation of biological tissue flaps is carried out at a temperature from 20 ° C to no more than 37 ° C. Temperature affects the speed of fixation, as well as the safety of biological tissue. The lower the fixation temperature, the better the structure of collagen fibers is preserved, but this greatly increases the fixation time. On the other hand, fixation at 37 ° C facilitates the extraction of liquid components of the cytoplasm (Park et al., 2016), which may be useful for reducing the antigenicity of biological tissue. However, at temperatures of 37 ° C and above, there is a risk of irreversible denaturation of the structural proteins of biological tissue (Xu, 2009; Leikina et al 2002). In a preferred embodiment of the present invention, the fixation temperature of the biological tissue is 18-25 ° C, which corresponds to room temperature. This avoids the use of additional equipment such as volumetric thermostats that can accommodate large containers of biological tissue. 24-72 hours after the start of fixation, the fixing solution is replaced with a fresh fixing solution in the same ratio to the mass of biological tissue flaps. The replacement of the solution is due to the fact that unreacted glutaraldehyde molecules in solution form oligomers over time, which more slowly penetrate deep into the biological tissue. Therefore, it is necessary to use a new portion of fixing solution, which does not contain long oligomers. The fixation is carried out within 3-14 days. This fixation time provides the most complete crosslinking of structural proteins. In addition, using the example of porcine pericardial tissues, it was shown that an increase in the fixation time of biological tissue leads to a decrease in the level of calcification of the fixed biological tissue after implantation (Sinha et al., 2012). This is probably due to the fact that as the fixation time increases, the amount of aldehyde groups in the mono- and polymers of glutaraldehyde also increases.

[0032] Были проведены исследования механической прочности аортальных клапанов, выполненных из перикарда свиньи, фиксированного либо глутаральдегидом согласно заявленному способу, либо с помощью эпоксисоединения - диглицидилового эфира этиленгликоля (ДЭЭ). При этом в одном случае перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом подвергался последующей антикальциевой обработке, описанной ниже. В другом случае перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом не подвергался последующей антикальциевой обработке. И в случае фиксации ДЭЭ фиксированный перикард также подвергался последующей антикальциевой обработке, описанной ниже. Исследования на усталостном тестере, представленные в Таблице 1, показывают, что фиксация глутаральдегидом обеспечивает большую механическую прочность биопротеза аортального клапана, чем фиксация перикарда ДЭЭ.[0032] Studies have been carried out on the mechanical strength of aortic valves made from porcine pericardium, fixed either with glutaraldehyde according to the claimed method, or using an epoxy compound - ethylene glycol diglycidyl ether (DEE). In this case, in one case, the pericardium of a pig, fixed with glutaraldehyde, was subjected to subsequent anticalcium treatment, described below. In another case, the glutaraldehyde-fixed porcine pericardium was not subjected to subsequent anticalcium treatment. And in the case of DEE fixation, the fixed pericardium was also subjected to the subsequent anticalcium treatment described below. The fatigue tester studies presented in Table 1 show that glutaraldehyde fixation provides greater mechanical strength for the aortic valve bioprosthesis than DEE pericardial fixation.

[0033] После окончания процесса фиксации лоскуты биологической ткани снимают с пластин и могут хранить в непрозрачном пластиковом контейнере, заполненном раствором для хранения. Раствор для хранения содержит 0.05-0.3% масс. глутаральдегида в качестве стерилизующего агента, а также изотонический или буферный раствор, например, раствор 0.9% масс. хлорида натрия или фосфатный буфер PBS. При этом раствор для хранения полностью покрывает лоскуты фиксированной биологической ткани.[0033] After the end of the fixation process, the biological tissue flaps are removed from the plates and can be stored in an opaque plastic container filled with storage solution. The storage solution contains 0.05-0.3% of the mass. glutaraldehyde as a sterilizing agent, as well as an isotonic or buffer solution, for example, a solution of 0.9% of the mass. sodium chloride or phosphate buffer PBS. In this case, the storage solution completely covers the flaps of fixed biological tissue.

[0034] Для создания биопротеза раскрой фиксированной биологической ткани производят в слое жидкости с помощью лазерной резки. При этом используют газовый углекислотный лазер (СО₂ лазер). Было показано, что СО₂ лазер является оптимальным для раскроя биологической ткани при изготовлении биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии (Барбараш с соавт., 2010). Кроме того, СО₂ лазер является недорогим по сравнению с другими лазерами, и его использование снижает стоимость производства биопротезов. Однако при рассечении биологической ткани с помощью СО₂ лазера по всей толщине наблюдались деструктивные изменения биологической ткани за зоной разреза. При взаимодействии биологической ткани с лазерным излучением доминирует поглощение. Поглощенная энергия излучения преобразуется в тепло, достигающее температуры более 200°С, вследствие чего происходит выпаривание биологической ткани - как жидкой, так и твердой ее фазы - что и приводит к рассечению (Пушкарева, 2008). В то же время участки биологической ткани, прилегающие к зоне воздействия лазерного излучения, также подвергаются нагреву, за счет чего формируется зона термонекроза шириной до 1.2 мм. В этой зоне наблюдается слипание волокон коллагена (Барбараш с соавт., 2010). Лазерная резка в слое жидкости позволяет уменьшить ширину зоны термонекроза до не более, чем 0.2 мм, и кроме того край вырезанной детали биопротеза получается более ровным. Во время лазерной резки биологическая ткань может быть полностью погружена в жидкость. При этом слой жидкости составляет не более 1,5 мм. Дальнейшее увеличение количества жидкости не приводит к дальнейшему уменьшению ширины зоны термонекроза, при этом большая толщина слоя жидкости затрудняет манипуляции с биологической тканью. В другом варианте реализации настоящего изобретения рассекаемая лазерным излучением поверхность биологической ткани может быть смочена жидкостью путем орошения. Жидкость, которую используют при лазерной резке, представляет собой очищенную воду или изотонический раствор, например, раствор 0,9% масс. хлорида натрия. Изотонический раствор является более предпочтительным вариантом, так как позволяет избежать набухания и деформации ткани.[0034] To create a bioprosthesis, cutting of a fixed biological tissue is performed in a liquid layer using laser cutting. In this case, a gas carbon dioxide laser (CO ₂ laser) is used. It was shown that CO ₂ laser is optimal for cutting biological tissue in the manufacture of bioprostheses for cardiovascular surgery (Barbarash et al., 2010). In addition, the CO ₂ laser is inexpensive compared to other lasers, and its use reduces the cost of manufacturing bioprostheses. However, during dissection of biological tissue using a CO ₂ laser through the entire thickness destructive changes were observed for the area of the biological tissue incision. When biological tissue interacts with laser radiation, absorption dominates. The absorbed radiation energy is converted into heat, reaching a temperature of more than 200 ° C, as a result of which biological tissue evaporates - both its liquid and its solid phases - which leads to dissection (Pushkareva, 2008). At the same time, the areas of biological tissue adjacent to the zone of exposure to laser radiation are also heated, due to which a zone of thermonecrosis up to 1.2 mm wide is formed. Collagen fibers stick together in this zone (Barbarash et al., 2010). Laser cutting in the liquid layer allows to reduce the width of the thermal necrosis zone to no more than 0.2 mm, and in addition, the edge of the cut out part of the bioprosthesis is smoother. During laser cutting, biological tissue can be completely immersed in liquid. In this case, the liquid layer is no more than 1.5 mm. A further increase in the amount of fluid does not lead to a further decrease in the width of the thermonecrosis zone, while the large thickness of the fluid layer makes it difficult to manipulate the biological tissue. In another embodiment of the present invention, the surface of biological tissue dissected by laser radiation can be wetted with a liquid by irrigation. The liquid that is used in laser cutting is purified water or isotonic solution, for example, a solution of 0.9% of the mass. sodium chloride. Isotonic solution is the preferred option, as it avoids tissue swelling and deformation.

[0035] Вырезанную деталь биопротеза визуально осматривают под увеличением на предмет наличия таких дефектов, как порезы, разрывы, неоднородности, посторонние включения. Каждую раскроенную деталь биопротеза по всей поверхности измеряют высокоточным толщинометром. Для дальнейшей работы используют только те детали биопротеза, которые не имеют видимых дефектов или отклонений толщины биологической ткани от необходимой.[0035] The cut out part of the bioprosthesis is visually inspected under magnification for the presence of defects such as cuts, tears, irregularities, foreign inclusions. Each cut out part of the bioprosthesis is measured over the entire surface with a high-precision thickness gauge. For further work, only those parts of the bioprosthesis are used that do not have visible defects or deviations in the thickness of the biological tissue from the required one.

[0036] Раскроенные детали биопротеза помещают в контейнер, заполненный раствором для хранения. Условия хранения деталей биопротеза совпадают с условиями хранения фиксированной биологической ткани.[0036] The cut bioprosthesis parts are placed in a container filled with storage solution. The storage conditions for bioprosthesis parts coincide with the storage conditions for fixed biological tissue.

[0037] Для антикальциевой обработки биологическую ткань помещают в чистый контейнер с плотной крышкой, содержащий раствор для антикальциевой обработки, и инкубируют 15-50 часов при 18-37°С. Раствор для антикальциевой обработки содержит 0.1 до 4.0% масс. детергнета, 10-40% масс. этанола, 0.1-8.0% масс. формальдегида и до 100% буферного раствора, например, фосфатного буфера (PBS).[0037] For anticalcium treatment, biological tissue is placed in a clean container with a tight lid containing an anticalcium treatment solution and incubated for 15-50 hours at 18-37 ° C. The solution for anticalcium treatment contains 0.1 to 4.0% of the mass. detergnet, 10-40% of the mass. ethanol, 0.1-8.0% of the mass. formaldehyde and up to 100% buffer solution such as phosphate buffer (PBS).

[0038] Буферный раствор обеспечивает приближенный к физиологическому рН 7.4±0.3, оптимальный для функционирования остальных компонентов раствора, в частности формальдегида, о чем будет сказано ниже.[0038] The buffer solution provides an approximate physiological pH of 7.4 ± 0.3, optimal for the functioning of the remaining components of the solution, in particular formaldehyde, which will be discussed below.

[0039] Детергент в растворе служит для удаления клеточного дебриса из фиксированной биологической ткани. В предпочтительном варианте изобретения используется Triton Х-100 (октилфенилполиоксиэтилен), который является неионным детергентом и обладает способностью мягко растворять мембраны клеток без денатурирующей активности за счет взаимодействия с фосфолипидами клеточных мембран (Курапеев с соавт., 2012). Удаление остатков клеточных мембран крайне важно для снижения последующей кальцификации фиксированной глутаральдегидом биологической ткани. Дело в том, что глутаральдегид, воздействуя на клетки биологической ткани, вызывает увеличение притока кальция в цитоплазму. Возросшее количество внутриклеточного кальция, вместе с фосфором из фрагментов фосфолипидной мембраны и клеточного дебриса, запускает образование фосфата кальция. После этого происходит кальцификация коллагена, ведущая к прогрессирующему разрушению биопротезов в теле пациента (Kim et al., 1999). Соответственно, удаление клеточного дебриса, и особенно фосфолипидов клеточных мембран, снижает кальцификацию фиксированной биологической ткани в составе биопротеза в теле пациента. Кроме того, удаление клеточного дебриса с помощью Triton Х-100 снижает иммуногенность фиксированной биологической ткани (Meyer et al., 2006).[0039] The detergent in solution serves to remove cellular debris from fixed biological tissue. In a preferred embodiment of the invention, Triton X-100 (octylphenylpolyoxyethylene) is used, which is a non-ionic detergent and has the ability to gently dissolve cell membranes without denaturing activity by interacting with phospholipids of cell membranes (Kurapeev et al., 2012). Removal of debris from cell membranes is essential to reduce the subsequent calcification of glutaraldehyde-fixed biological tissue. The fact is that glutaraldehyde, acting on the cells of biological tissue, causes an increase in the influx of calcium into the cytoplasm. The increased amount of intracellular calcium, together with phosphorus from fragments of the phospholipid membrane and cellular debris, triggers the formation of calcium phosphate. After this, collagen calcification occurs, leading to the progressive destruction of bioprostheses in the patient's body (Kim et al., 1999). Accordingly, the removal of cellular debris, and especially the phospholipids of cell membranes, reduces the calcification of the fixed biological tissue in the bioprosthesis in the patient's body. In addition, removal of cellular debris with Triton X-100 reduces the immunogenicity of fixed biological tissue (Meyer et al., 2006).

[0040] Обработка этанолом фиксированной глутаральдегидом биологической ткани также способствует удалению фосфолипидов клеточной мембраны и клеточного дебриса. Кроме того, этанол, будучи денатурирующим агентом, вызывает конформационные изменения в коллагене, что препятствует кристаллизации солей кальция на фиксированном коллагене и, соответственно, снижает вероятность кальцификации биопротеза (Schoen et al., 2005; Vyavahare and Tam, 2018).[0040] Ethanol treatment of glutaraldehyde-fixed biological tissue also helps to remove cell membrane phospholipids and cell debris. In addition, ethanol, as a denaturing agent, induces conformational changes in collagen, which prevents the crystallization of calcium salts on fixed collagen and, accordingly, reduces the likelihood of bioprosthesis calcification (Schoen et al., 2005; Vyavahare and Tam, 2018).

[0041] Формальдегид в растворе для антикальциевой обработки выполняет функцию стерилизующего агента. Формальдегид инактивирует микроорганизмы путем алкилирования амино- и сульфгидрильных групп белков и кольцевых атомов азота пуриновых оснований (Rutala et al., 2008). Формальдегид при использовании в надлежащих концентрациях и при достаточном времени контакта эффективно убивает многие микроорганизмы, включая бактерии, грибы, споры, и вирусы. Показано, что уже при концентрации 0.04% масс. формальдегид останавливает рост таких сложных для инактивации микроорганизмов, как Bacillus anthracis, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Yersina pestis и др. (Chua et al., 2019). Однако при малой концентрации формальдегида требуется длительное время обработки биологической ткани (14-21 день). При использовании формальдегида в качестве стерилизующего агента его концентрация в растворе обычно не превышает 8%, что обусловлено раздражающим действием формальдегида на ткани человека (Дульнева с соавт., 2005). Предпочтительной является концентрация формальдегида около 4.0% масс. Этой концентрации достаточно для уничтожения даже устойчивых микроорганизмов, в то же время такая концентрация позволяет в дальнейшем легко отмыть обработанную биологическую ткань от непрореагировавших молекул формальдегида, чтобы избежать раздражающего действия. На эффективность действия формальдегида влияют температура и кислотности среды. Причем температура играет двойную роль: повышение температуры, с одной стороны, усиливает проникающую способность формальдегида, но с другой стороны, увеличивает диссоциацию формальдегида и субстрата. Оптимальной являются температура 18-37°С и слабо щелочная среда с рН 7.0-8.0 (Fox et al., 1985 ; Thavarajah et al., 2012). Комбинация формальдегида с этиловым спиртом дополнительно повышает его стерилизующие свойства.[0041] Formaldehyde in the anticalcium treatment solution acts as a sterilizing agent. Formaldehyde inactivates microorganisms by alkylation of amino and sulfhydryl groups of proteins and ring nitrogen atoms of purine bases (Rutala et al., 2008). Formaldehyde, when used in the correct concentration and contact time, effectively kills many microorganisms, including bacteria, fungi, spores, and viruses. It is shown that even at a concentration of 0.04% wt. formaldehyde stops the growth of microorganisms that are difficult to inactivate, such as Bacillus anthracis, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Yersina pestis, etc. (Chua et al., 2019). However, at a low concentration of formaldehyde, a long processing time of biological tissue is required (14-21 days). When formaldehyde is used as a sterilizing agent, its concentration in solution usually does not exceed 8%, which is due to the irritating effect of formaldehyde on human tissue (Dulneva et al., 2005). Preferred is a formaldehyde concentration of about 4.0 wt%. This concentration is sufficient to destroy even resistant microorganisms, at the same time, this concentration makes it possible to easily wash the treated biological tissue from unreacted formaldehyde molecules in the future to avoid irritating effects. The effectiveness of formaldehyde is influenced by the temperature and acidity of the environment. Moreover, temperature plays a double role: an increase in temperature, on the one hand, enhances the penetrating ability of formaldehyde, but on the other hand, increases the dissociation of formaldehyde and substrate. The optimum temperature is 18-37 ° C and a weakly alkaline medium with a pH of 7.0-8.0 (Fox et al., 1985; Thavarajah et al., 2012). The combination of formaldehyde with ethyl alcohol further enhances its sterilizing properties.

[0042] Формальдегид в качестве стерилизующего агента был выбран еще и потому, что дополнительно усиливает антикальцификационную эффективность указанного раствора. Способность формальдегида снижать кальцификацию фиксированной биологической ткани была обнаружена в экспериментах с фиксированными глутаральдегидом тканями перикарда свиньи и КРС. После фиксации глутаральдегидом ткани перикарда хранили в 4.0% масс. растворе формальдегида для предотвращения размножения микроорганизмов. В экспериментах с различными вариантами антикальциевой обработки фиксированную ткань перикарда, хранящуюся в 4.0% масс. растворе формальдегида, использовали как один из контролей. Оказалось, что хранение фиксированной глутаральдегидом ткани перикарда в 4.0% масс. растворе формальдегида приводит к снижению уровня кальцификации указанных тканей перикарда (Gong et al., 1991; Baucia et al., 2006).[0042] Formaldehyde was also chosen as a sterilizing agent because it further enhances the anti-calcification efficiency of said solution. The ability of formaldehyde to reduce the calcification of fixed biological tissue was found in experiments with glutaraldehyde-fixed pericardial tissues of pigs and cattle. After fixation with glutaraldehyde, pericardial tissues were stored at 4.0 wt%. formaldehyde solution to prevent the growth of microorganisms. In experiments with various variants of anticalcium treatment, fixed pericardial tissue stored in 4.0% of the mass. formaldehyde solution was used as one of the controls. It turned out that storage of pericardial tissue fixed with glutaraldehyde in 4.0% of the mass. formaldehyde solution leads to a decrease in the level of calcification of these pericardial tissues (Gong et al., 1991; Baucia et al., 2006).

[0043] В патенте US 6214054, формальдегид используется в качестве кросслинкирующего агента, однако данные, представленные в Таблице 1, показывают, что дополнительное кросслинкирование биологической ткани после фиксации глутаральдегидом не требуется. Так, аортальный клапан, выполненный из биологической ткани, фиксированной глутаральдегидом без последующей антикальциевой обработки, выдержал 17189 тыс. циклов на усталостном тестере. В то же время аортальный клапан, выполненный из биологической ткани, фиксированной глутаральдегидом с последующей антикальциевой обработкой, в среднем выдержал 16750 тыс. циклов на усталостном тестере. Таким образом, кросслинкирующие свойства формальдегида в растворе для антикальциевой обработки никак не увеличивают механическую прочность обработанной биологической ткани.[0043] In US patent 6214054, formaldehyde is used as a crosslinking agent, however, the data presented in Table 1 shows that additional crosslinking of biological tissue after fixation with glutaraldehyde is not required. Thus, the aortic valve, made of biological tissue fixed with glutaraldehyde without subsequent anticalcium treatment, withstood 17189 thousand cycles on a fatigue tester. At the same time, the aortic valve, made of biological tissue fixed with glutaraldehyde followed by anticalcium treatment, withstood an average of 16,750,000 cycles on a fatigue tester. Thus, the crosslinking properties of formaldehyde in the solution for anticalcium treatment do not in any way increase the mechanical strength of the treated biological tissue.

[0044] Как указано выше, заявленная антикальциевая обработка фиксированной биологической ткани приводит к некоторому снижению прочности обработанной биологической ткани. Однако исследование кальцификации фиксированной глутаральдегидом биологической ткани показало, что указанная заявленная обработка приводит к значительному снижению относительного содержания кальция в образце фиксированной глутаральдегидом биологической ткани, по сравнению с образцом фиксированной глутаральдегидом биологической ткани без антикальциевой обработки (Таблица 2). Дополнительно были проведены исследования уровня кальцификации створок биопротеза аортального клапана CoreValve (Medtronic), изготовленного из перикарда свиньи, фиксированного глутаральдегидом и дополнительно обработанного аминоолиевой кислотой (АОА). Данные, представленные в Таблице 2, говорят о том, что антикальциевая обработка согласно настоящему изобретению как минимум в 3 раза эффективнее снижает относительное содержание кальция в фиксированной глутаральдегидом биологической ткани, чем обработка АОА.[0044] As indicated above, the claimed anticalcium treatment of fixed biological tissue results in some decrease in the strength of the treated biological tissue. However, a study of the calcification of glutaraldehyde-fixed biological tissue showed that this claimed treatment leads to a significant decrease in the relative content of calcium in a sample of glutaraldehyde-fixed biological tissue, compared to a sample of glutaraldehyde-fixed biological tissue without anticalcium treatment (Table 2). Additionally, studies were conducted on the level of calcification of the leaflets of the CoreValve (Medtronic) aortic valve bioprosthesis, made from porcine pericardium, fixed with glutaraldehyde and additionally treated with aminoolic acid (AOA). The data presented in Table 2 indicate that the anticalcium treatment according to the present invention is at least 3 times more effective in reducing the relative calcium content in the glutaraldehyde-fixed biological tissue than the AOA treatment.

[0045] Исходя из результатов проведенных исследований, можно сделать вывод о том, что фиксация биологической ткани глутаральдегидом с последующей инкубацией фиксированной биологической ткани в заявленном растворе для антикальциевой обработки обеспечивает оптимальное сочетание механической прочности и низкого уровня кальцификации обработанной биологической ткани.[0045] Based on the results of the studies, it can be concluded that fixation of biological tissue with glutaraldehyde followed by incubation of fixed biological tissue in the claimed solution for anticalcium treatment provides an optimal combination of mechanical strength and low calcification of the treated biological tissue.

[0046] По окончании инкубации биологическую ткань отмывают от детергента, этанола и формальдегида в изотоническом растворе, например, растворе 0.9% масс. хлорида натрия в течение 2-20 минут. Обработанную биологическую ткань помещают в контейнер со стерилизующим раствором, описанным ниже.[0046] At the end of the incubation, the biological tissue is washed from detergent, ethanol and formaldehyde in an isotonic solution, for example, a solution of 0.9% of the mass. sodium chloride for 2-20 minutes. The treated biological tissue is placed in a container with the sterilizing solution described below.

[0047] В одном варианте реализации настоящего изобретения антикальциевую обработку биологической ткани проводят после фиксации, но до раскроя биологической ткани. В другом варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после раскроя фиксированной биологической ткани, но до сборки биопротеза. Еще в одном варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после сборки биопротеза.[0047] In one embodiment of the present invention, the anticalcium treatment of biological tissue is performed after fixation, but before cutting the biological tissue. In another embodiment, the anticalcium treatment of the biological tissue is performed after cutting the fixed biological tissue, but before assembling the bioprosthesis. In yet another embodiment, the anticalcium treatment of biological tissue is performed after the bioprosthesis is assembled.

[0048] Для стерилизации биологической ткани в чистый закрытый контейнер наливают стерилизующий раствор, в который при комнатной температуре помещают биологическую ткань. Затем контейнер герметично запечатывают и нагревают контейнер и его содержимое до 30-37°С. Указанную температуру контейнера и его содержимого поддерживают в течение 2-7 суток. Затем контейнер и его содержимое охлаждают до комнатной температуры и, не распечатывая контейнер, хранят при комнатной температуре. Стерилизующий раствор содержит стерилизующий агент и буферный раствор, например, PBS, обеспечивающий pH 5.0-7.4. В качестве стерилизующего агента могут применяться формальдегид, этиловый спирт с формальдегидом, этиловый спирт с глутаральдегидом. Однако в предпочтительном варианте изобретения в качестве стерилизующего агента используется только глутаральдегид в концентрации 0.025-1.0% масс. Присутствие этанола в стерилизующем растворе нежелательно, так как при длительном воздействии этанол, в силу своих денатурирующих свойств, может необратимо повреждать структуру коллагена, ухудшая механические свойства биологической ткани. Использование глутаральдегида обусловлено широким спектром его биоцидной активности при сравнительно низкой концентрации. В указанном диапазоне концентраций глутаральдегид эффективно убивает такие различные микроорганизмы, как грамположительные бактерии - Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus; грамотрицательные бактерии - Legionella pneumophila, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens; дрожжевые грибки - Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae; плесневые грибки - Stachybotrys atra, Penicillium funiculosum, Aspergillus niger, Trichoderma viridae; водоросли - Scenedesmus obliquus, Euglena gracillis, Chlorella pyrenoidosa; и вирусы - гепатита А, гепатита В, гепатита С, иммунодефицита человека и другие (Gorman and Scott, 1980; Passagot et al., 1987; Payan et al., 2001; Ciesek et al., 2010; Druce et al., 1995). Предпочтительной является концентрация глутаральдегида 0.2% масс. Такая концентрация, с одной стороны, надежно убивает микроорганизмы при обработке в течение указанного времени, а с другой стороны, позволяет легко очистить биологическую ткань от молекул глутаральдегида перед имплантацией путем промывания в физиологическом растворе. Сравнительно низкое значение рН обеспечивает длительную функциональность стерилизующего раствора. Было показано, что растворы глутарового альдегида более устойчивы в кислой среде. Когда pH раствора превышает 5.0, мономер глутаральдегида демонстрирует тенденцию к полимеризации. Причем чем выше становится рН, тем быстрее растет полимеризации глутаральдегида, достигая существенного уровня при рН 7.5 (Rasmussen and Albrechtsen, 1974).[0048] To sterilize biological tissue, a sterilizing solution is poured into a clean, closed container, into which biological tissue is placed at room temperature. Then the container is hermetically sealed and the container and its contents are heated to 30-37 ° C. The specified temperature of the container and its contents is maintained for 2-7 days. Then the container and its contents are cooled to room temperature and, without opening the container, stored at room temperature. The sterilizing solution contains a sterilizing agent and a buffer solution such as PBS to provide a pH of 5.0-7.4. Formaldehyde, ethyl alcohol with formaldehyde, ethyl alcohol with glutaraldehyde can be used as a sterilizing agent. However, in a preferred embodiment of the invention, only glutaraldehyde is used as a sterilizing agent at a concentration of 0.025-1.0% by weight. The presence of ethanol in the sterilizing solution is undesirable, since with prolonged exposure to ethanol, due to its denaturing properties, it can irreversibly damage the collagen structure, impairing the mechanical properties of biological tissue. The use of glutaraldehyde is due to its broad spectrum of biocidal activity at a relatively low concentration. In the specified range of concentrations, glutaraldehyde effectively kills various microorganisms such as gram-positive bacteria - Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus; gram-negative bacteria - Legionella pneumophila, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens; yeast fungi - Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae; molds - Stachybotrys atra, Penicillium funiculosum, Aspergillus niger, Trichoderma viridae; algae - Scenedesmus obliquus, Euglena gracillis, Chlorella pyrenoidosa; and viruses - hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, human immunodeficiency and others (Gorman and Scott, 1980; Passagot et al., 1987; Payan et al., 2001; Ciesek et al., 2010; Druce et al., 1995 ). Preferred is the concentration of glutaraldehyde 0.2% of the mass. Such a concentration, on the one hand, reliably kills microorganisms when treated for a specified time, and on the other hand, it makes it easy to cleanse biological tissue from glutaraldehyde molecules before implantation by washing in saline. The relatively low pH value ensures long-term functionality of the sterilizing solution. It was shown that solutions of glutaraldehyde are more stable in acidic media. When the pH of the solution exceeds 5.0, the glutaraldehyde monomer tends to polymerize. Moreover, the higher the pH becomes, the faster the glutaraldehyde polymerization grows, reaching a significant level at pH 7.5 (Rasmussen and Albrechtsen, 1974).

[0049] Эффективность глутаральдегида как стерилизующего агента напрямую связана с его высокой проникающей способностью. Поэтому эффективен раствор глутаральдегида, состоящий из мономеров и олигомеров, т.е. молекул, достаточно маленьких для быстрого и глубокого проникновения в биологическую ткань и инактивации микроорганизмов. Исходя из этого, логично, что рН раствора для стерилизации должен быть смещен в кислую сторону. Однако биоцидная активность глутаральдегида, обусловленная взаимодействием его карбонильных групп с сульфгидрильными, гидроксильными, карбоксильными и аминогруппами белков микроорганизмов, максимально проявляется в слабо щелочной среде (McKeen 2012). В предпочтительном варианте настоящего изобретения стерилизующий раствор имеет рН 6.0±0.5. Такая кислотность раствора для стерилизации является оптимальной с точки зрения биоцидной эффективности глутаральдегида и стабильности стерилизующего раствора. При этом не максимальная биоцидная эффективность глутаральдегида компенсируется продолжительным временем стерилизации, которое оказывается возможным благодаря стабильности стерилизующего раствора. Стерилизацию указанным способом проводят один раз за все время обработки биологической ткани после сборки биопротеза. Стабильность глутаральдегида в стерилизующем растворе позволяет хранить стерилизованную биологическую ткань в закрытом контейнере до двух лет перед имплантацией биопротеза.[0049] The effectiveness of glutaraldehyde as a sterilizing agent is directly related to its high permeability. Therefore, an effective solution of glutaraldehyde, consisting of monomers and oligomers, i.e. molecules small enough for rapid and deep penetration into biological tissue and inactivation of microorganisms. Based on this, it is logical that the pH of the sterilization solution should be shifted to the acidic side. However, the biocidal activity of glutaraldehyde, due to the interaction of its carbonyl groups with sulfhydryl, hydroxyl, carboxyl, and amino groups of proteins of microorganisms, is most pronounced in a weakly alkaline environment (McKeen 2012). In a preferred embodiment of the present invention, the sterilizing solution has a pH of 6.0 ± 0.5. This acidity of the sterilization solution is optimal from the point of view of the biocidal efficacy of glutaraldehyde and the stability of the sterilization solution. At the same time, not the maximum biocidal efficiency of glutaraldehyde is compensated by the long sterilization time, which is possible due to the stability of the sterilizing solution. Sterilization by this method is performed once during the entire processing time of biological tissue after assembly of the bioprosthesis. The stability of glutaraldehyde in the sterilizing solution allows the sterilized biological tissue to be stored in a closed container for up to two years before the implantation of the bioprosthesis.

[0050] В результате заявленной обработки биологической ткани получаются прочные, эластичные детали для биопротеза. Детали имеют плоскую форму и ровные края с минимальной шириной термонекроза, что позволяет минимизировать количество биологической ткани, используемой в биопротезе и не участвующей в выполнении специфических функций биопротеза.[0050] As a result of the claimed processing of biological tissue, strong, elastic parts for a bioprosthesis are obtained. Parts have a flat shape and smooth edges with a minimum width of thermonecrosis, which allows minimizing the amount of biological tissue used in a bioprosthesis and not participating in the performance of specific functions of a bioprosthesis.

[0051] Биопротезы, выполненные с использованием биологической ткани, обработанной согласно настоящему изобретению, могут содержать дополнительные элементы, выполненные из других материалов. В этом случае биологическая ткань прикрепляется к дополнительному элементу с помощью шитья, клея, сплавления или иным подходящим способом.[0051] Bioprostheses made using biological tissue treated according to the present invention may contain additional elements made from other materials. In this case, the biological tissue is attached to the additional element by sewing, glue, fusion, or in another suitable way.

[0052] Биопротезы, выполненные с использованием биологической ткани, обработанной согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются, протезы артерий и сосудов нижних конечностей, перикардиальные лоскуты, аллографты и биопротезы клапанов сердца. На Фиг. 1А и 1Б в качестве примера показана принципиальная схема каркасного биопротеза аортального клапана. Данный биопротез содержит металлический сетчатый каркас 1, функцией которого является позиционирование и удержание биопротеза клапана в теле пациента после имплантации. К каркасу присоединено тело клапана 2, выполненное из биологической ткани, обработанной согласно настоящему изобретению. Тело клапана включает створчатый аппарат 3. При этом тело клапана может быть пришито, приклеено, приварено или присоединятся к каркасу любым другим подходящим способом.[0052] Bioprostheses made using biological tissue treated according to the present invention include, but are not limited to, lower limb artery and vascular grafts, pericardial flaps, allografts, and heart valve bioprostheses. FIG. 1A and 1B as an example, a schematic diagram of a frame aortic valve bioprosthesis is shown. This bioprosthesis contains a metal mesh frame 1, the function of which is to position and hold the valve bioprosthesis in the patient's body after implantation. Attached to the frame is a valve body 2 made of biological tissue processed according to the present invention. The valve body includes a flap assembly 3. In this case, the valve body can be sewn, glued, welded, or joined to the frame in any other suitable way.

Описание реализации изобретенияDescription of the implementation of the invention

[0053] Пример 1. Фиксация биологической ткани на плоских пластинах.[0053] Example 1. Fixation of biological tissue on flat plates.

[0054] Механически обработанный лоскут перикарда свиньи разложили на плоской поверхности пластины, выполненной из оргстекла. Поверхность пластины была предварительно очищена раствором изопропилового спирта. Лоскут перикарда равномерно распределили по поверхности пластины так, чтобы максимально плотно прижать перикард к поверхности пластины. Затем края лоскута перикарда прикрепили к краям пластины при помощи кнопок, выполненных из нержавеющей стали. При этом натяжение закрепленного перикарда было несколько неравномерным и составляло от 0.5 Н до 1 Н зависимости от участка перикарда. Указанное натяжение позволило в сильной степени сохранить естественную извитость волокон коллагена в фиксированном перикарде, что обеспечило эластичность фиксированного перикарда, необходимую для правильной работы створчатого аппарата биопротеза аортального клапана, который был впоследствии изготовлен из данного перикарда. Кроме того, толщина фиксированного перикарда составила от 180 до 360 мкм, что позволило изготовить из него биопротез аортального клапана, доставляемый к месту имплантации через катетер. Пластину с закрепленным на ней лоскутом перикарда переместили в чистую емкость, заполненную фиксирующим раствором. Фиксирующий раствор содержал 0.6% масс. глутаральдегида в фосфатном буфере PBS, рН 7.4. Масса фиксирующего раствора превышала массу лоскута перикарда на пластине приблизительно в 10 раз и полностью покрывал пластину с прикрепленным лоскутом перикарда. Контейнер герметично закрыли крышкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 48 часов. Затем контейнер открыли и произвели полную замену фиксирующего раствора в контейнере. При этом новая порция фиксирующего раствора превышала массу лоскута перикарда на пластине приблизительно в 10 раз и полностью покрывала пластину с прикрепленным лоскутом перикарда. Далее контейнер герметично закрыли крышкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 суток. После окончания процесса фиксации контейнер открыли, открепили кнопки, удерживающие лоскут перикарда на пластине. Затем лоскут перикарда сняли с пластины и переместили в непрозрачный пластиковый контейнер, заполненный раствором для хранения.[0054] The machined pig pericardial flap was laid out on a flat surface of a Plexiglas plate. The plate surface was preliminarily cleaned with isopropyl alcohol solution. The pericardial flap was evenly distributed over the plate surface so as to press the pericardium as tightly as possible to the plate surface. Then the edges of the pericardial flap were attached to the edges of the plate using stainless steel buttons. The tension of the fixed pericardium was somewhat uneven and ranged from 0.5 N to 1 N, depending on the pericardial region. This tension made it possible to strongly preserve the natural crimp of collagen fibers in the fixed pericardium, which provided the elasticity of the fixed pericardium, which is necessary for the correct operation of the leaflet apparatus of the aortic valve bioprosthesis, which was subsequently made from this pericardium. In addition, the thickness of the fixed pericardium was from 180 to 360 μm, which made it possible to manufacture a bioprosthesis of the aortic valve from it, which was delivered to the implantation site through a catheter. The plate with the pericardial flap attached to it was transferred to a clean container filled with fixative solution. The fixing solution contained 0.6% of the mass. glutaraldehyde in phosphate buffer PBS, pH 7.4. The weight of the fixative solution was approximately 10 times the weight of the pericardial flap on the plate and completely covered the plate with the attached pericardial flap. The container was sealed with a lid and incubated at room temperature for 48 hours. The container was then opened and a complete replacement of the fixing solution in the container was made. The new portion of the fixing solution exceeded the weight of the pericardial flap on the plate by approximately 10 times and completely covered the plate with the attached pericardial flap. Then the container was sealed with a lid and incubated at room temperature for 5 days. After the end of the fixation process, the container was opened, the buttons holding the pericardial flap on the plate were detached. The pericardial flap was then removed from the plate and transferred to an opaque plastic container filled with storage solution.

[0055] Полученный фиксированный перикард использовали для изготовления биопротеза аортального клапана, аналогичного представленному на Фиг. 1. Исследование механической прочности и уровня кальцификации проводили по стандартной методике после стерилизации биопротеза. Биопротез помещали в усталостный тестер Heart Valve Durability Tester, Model MDV (Blockwise Engineering LLC, USA) и запускали циклы открытия/закрытия створчатого аппарата в растворе, содержащем кальций в концентрации 1,3 г/л. Испытание биопротеза проводились при 15 Гц и перепаде давления 100 мм.рт.ст., длительность испытания составила 13 дней. При этом створчатый аппарат биопротеза выдержал 17189 тыс. циклов открытия/закрытия. После окончания испытания биопротез извлекли из усталостного тестера и отрезали от него створчатый аппарат, который затем отдали в лабораторию НИОХ СО РАН для определения абсолютной и относительной массы Са в сухом образце фиксированного перикарда. По результатам исследования створчатый аппарат биопротеза содержал 1,5% масс. Са.[0055] The resulting fixed pericardium was used to make an aortic valve bioprosthesis similar to that shown in FIG. 1. The study of mechanical strength and calcification level was carried out according to the standard procedure after sterilization of the bioprosthesis. The bioprosthesis was placed in a Heart Valve Durability Tester, Model MDV (Blockwise Engineering LLC, USA), and the opening / closing cycles of the valve apparatus were started in a solution containing calcium at a concentration of 1.3 g / L. The bioprosthesis was tested at 15 Hz and a pressure drop of 100 mm Hg, the duration of the test was 13 days. At the same time, the bioprosthesis valve apparatus withstood 17189 thousand opening / closing cycles. After the end of the test, the bioprosthesis was removed from the fatigue tester and the valve apparatus was cut off from it, which was then given to the laboratory of the NIOCH SB RAS to determine the absolute and relative mass of Ca in a dry sample of the fixed pericardium. According to the results of the study, the bioprosthesis valve apparatus contained 1.5% of the mass. Ca.

[0056] Пример 2. Антикальциевая обработка биологической ткани.[0056] Example 2. Anticalcium treatment of biological tissue.

[0057] Биопротез аортального клапана, аналогичный тому, который описан в Примере 1, подвергли антикальциевой обработке. Для этого биопротез поместили в чистый контейнер, содержащий раствор для антикальциевой обработки. Раствор для антикальциевой обработки содержал 1.2% масс. Triton Х-100, 22% масс. этанола, 4% масс. формальдегида и 72.8% масс. фосфатного буфера PBS. Контейнер герметично закрыли и поместили в термостат, где инкубировали 24 часа при 37°С. По окончании инкубации контейнер открыли и переместили обработанный биопротез в раствор 0.9% масс. хлорида натрия, где инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. За время инкубации дважды меняли порцию раствора хлорида натрия.[0057] An aortic valve bioprosthesis similar to that described in Example 1 was subjected to anticalcium treatment. For this, the bioprosthesis was placed in a clean container containing a solution for anticalcium treatment. The solution for anticalcium treatment contained 1.2% of the mass. Triton X-100, 22% of the mass. ethanol, 4% of the mass. formaldehyde and 72.8% of the mass. phosphate buffer PBS. The container was sealed and placed in a thermostat, where it was incubated for 24 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the container was opened and the treated bioprosthesis was transferred to a solution of 0.9 wt%. sodium chloride, where it was incubated for 10 minutes at room temperature. During the incubation, the portion of the sodium chloride solution was changed twice.

[0058] Исследование уровня кальцификации проводили после стерилизации биопротеза тем же способом, который описан в Примере 1. По результатам исследования створчатый аппарат обработанного биопротеза содержал 0.12% масс. Са.[0058] The study of the level of calcification was carried out after sterilization of the bioprosthesis in the same way as described in Example 1. According to the results of the study, the valve apparatus of the treated bioprosthesis contained 0.12 wt% Ca.

[0059] Пример 3. Лазерная резка фиксированной биологической ткани в слое жидкости.[0059] Example 3. Laser cutting of fixed biological tissue in a liquid layer.

[0060] Из лоскута фиксированного перикарда свиньи, полученного в Примере 1, вырезали детали биопротеза путем лазерной резки с использованием СО₂ лазера. Для этого лоскут фиксированного перикарда из емкости для хранения выложили на манипуляционный стол автоматизированного лазерного комплекса. Далее выбрали визуально равномерный участок лоскута фиксированного перикарда и запустили процесс лазерной резки по программе, загруженной в лазерный комплекс.[0060] From the fixed porcine pericardium flap obtained in Example 1, parts of the bioprosthesis were cut out by laser cutting using a CO ₂ laser. For this, a flap of the fixed pericardium from the storage container was laid out on the manipulation table of the automated laser complex. Next, we chose a visually uniform section of the fixed pericardium flap and launched the laser cutting process according to the program loaded into the laser complex.

[0061] В одном случае лоскут фиксированного перикарда во время лазерной резки был полностью покрыт слоем раствора 0.9% масс. хлорида натрия, толщина которого составляла 1,5 мм. В другом случае лоскут фиксированного перикарда орошали раствором 0.9% масс. Хлорида натрия во время лазерной резки. В третьем случае перикард никак не увлажняли во время лазерной резки.[0061] In one case, a flap of the fixed pericardium during laser cutting was completely covered with a layer of a solution of 0.9% of the mass. sodium chloride, the thickness of which was 1.5 mm. In another case, the flap of the fixed pericardium was irrigated with a solution of 0.9% of the mass. Sodium chloride during laser cutting. In the third case, the pericardium was not moistened in any way during laser cutting.

[0062] Вырезанные детали осмотрели под увеличением на предмет наличия видимых порезов, разрывов, неоднородностей и посторонних включений, и измерили ширину зоны термонекроза в нескольких местах каждой детали. В первых двух случаях, когда лоскут фиксированного перикарда был полностью покрыт или орошался раствором хлорида натрия во время лазерной резки, зона термонекроза на краю вырезанных деталей составляла в среднем 0.2±0.01 мм. Детали, вырезанные из лоскута фиксированного перикарда без покрытия раствором хлорида натрия, имели зону термонекроза шириной в среднем 1±0.01 мм. Кроме того, детали, вырезанные из лоскута фиксированного перикарда без покрытия раствором хлорида натрия, имели более неровный и бугристый край, чем детали, вырезанные с применением раствора хлорида натрия.[0062] The cut parts were examined under magnification for visible cuts, tears, irregularities and impurities, and the width of the thermonecrosis zone was measured at several locations on each part. In the first two cases, when the fixed pericardium flap was completely covered or irrigated with sodium chloride solution during laser cutting, the thermal necrosis zone at the edge of the cut parts averaged 0.2 ± 0.01 mm. Parts cut from a fixed pericardial flap without coating with sodium chloride solution had a zone of thermonecrosis with an average width of 1 ± 0.01 mm. In addition, parts cut from a fixed pericardial flap without sodium chloride solution coating had a more uneven and bumpy edge than parts cut with sodium chloride solution.

[0063] Для дальнейшего создания биопротеза аортального клапана использовали детали, вырезанные с применением раствора хлорида натрия.[0063] To further create the aortic valve bioprosthesis, parts cut with sodium chloride solution were used.

[0064] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.[0064] In the present application materials, the preferred disclosure of the implementation of the claimed technical solution is presented, which should not be used as limiting other, particular embodiments of its implementation, which do not go beyond the scope of the claimed scope of legal protection and are obvious to specialists in the relevant field of technology.

[0065] Таблица 1. Механическая прочность биопротезов аортального клапана, выполненных из перикарда свиньи, обработанного различными способами.[0065] Table 1. Mechanical strength of aortic valve bioprostheses made from porcine pericardium treated in various ways.

ОбразецSample Количество циклов на усталостном тестереCycles per fatigue tester Биопротез аортального клапана, выполненный из перикарда свиньи, фиксированного глутаральдегидом c последующей антикальциевой обработкойAortic valve bioprosthesis made of porcine pericardium, fixed with glutaraldehyde, followed by anticalcium treatment 1674516745 Биопротез аортального клапана, выполненный из перикарда свиньи, фиксированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля c последующей антикальциевой обработкойAortic valve bioprosthesis made of porcine pericardium fixed with ethylene glycol diglycidyl ether followed by anticalcium treatment 1665416654 Биопротез аортального клапана, выполненный из перикарда свиньи, фиксированного глутаральдегидом без последующей антикальциевой обработкиAortic valve bioprosthesis made from porcine pericardium fixed with glutaraldehyde without subsequent anticalcium treatment 1718917189

[0066] Таблица 2. Уровень кальцификации перикарда свиньи, обработанного различными способами.[0066] Table 2. The level of calcification of the pericardium of the pig treated with different methods.

ОбразецSample Относительное содержание Ca, % масс.The relative content of Ca,% wt. Перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом без последующей антикальциевой обработкиPorcine pericardium fixed with glutaraldehyde without subsequent anticalcium treatment 1.51.5 Перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом с последующей антикальциевой обработкойPig pericardium fixed with glutaraldehyde followed by anticalcium treatment 0.120.12 Corevalve 1 створкаCorevalve 1 sash 0.750.75 Corevalve 2 створкаCorevalve 2 sash 1.01.0 Corevalve 3 створкаCorevalve 3 sash 0.360.36

Claims

1. A method of processing biological tissue, which is a collagen-containing tissue of mammals, for an implantable bioprosthesis used in cardiovascular surgery, and representing an aortic valve, which includes the following steps:

mechanical treatment of biological tissue in isotonic solution;

fixation of biological tissue, carried out in a solution containing glutaraldehyde;

laser cutting of biological tissue in a liquid layer;

anticalcium treatment of biological tissue by incubation;

biological tissue in a solution containing detergent, ethanol, formaldehyde and buffer solution;

sterilization of biological tissue in a sterilizing solution containing a sterilizing agent and a buffer solution.

2. The method according to claim 1, wherein the fixation of the biological tissue is carried out on flat plates.

3. The method according to claim 1, wherein the fixation of the biological tissue is carried out at a temperature from about 20 to no more than 37 ° C.

4. The method according to claim 1, wherein the liquid layer during laser cutting of biological tissue is not more than 1.5 mm.

5. The method of claim 1, wherein the liquid is an isotonic solution.

6. The method according to claim 1, wherein the biological tissue is sterilized in a solution containing glutaraldehyde.

7. A method according to claim 6, wherein the biological tissue is sterilized in a solution having a pH of 5.0-7.4.

8. A method of processing biological tissue, which is a collagen-containing tissue of mammals for an implantable bioprosthesis used in cardiovascular surgery and representing an aortic valve, which includes the following steps:

mechanical treatment of biological tissue in isotonic solution;

fixation of biological tissue, carried out on flat plates made of a material that does not corrode in water, in a solution containing glutaraldehyde;

laser cutting of biological tissue;

anticalcium treatment of biological tissue by incubating biological tissue in a solution containing detergent, ethanol, formaldehyde and buffer solution;

9. The method according to claim 8, wherein the mechanical processing of the biological tissue is carried out using a tissue soaked in an isotonic solution.

10. The method of claim 8, wherein the fixation of the biological tissue is carried out at a temperature of from about 20 to not more than 37 ° C.

11. The method according to claim 8, wherein laser cutting of biological tissue is performed in a liquid layer.

12. The method according to claim 11, wherein the liquid layer during laser cutting of biological tissue is not more than 1.5 mm.

13. The method of claim 11, wherein the liquid is an isotonic solution.

14. The method according to claim 8, wherein the biological tissue is sterilized in a solution containing glutaraldehyde.

15. The method according to claim 14, wherein the biological tissue is sterilized in a solution having a pH of 5.0-7.4.

16. Biological tissue for an implantable bioprosthesis obtained by the method according to claim 1 or 6.

17. Implantable bioprosthesis obtained by the method according to claim 1 or 6.