RU2740566C1 - Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold - Google Patents
Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold Download PDFInfo
- Publication number
- RU2740566C1 RU2740566C1 RU2020119705A RU2020119705A RU2740566C1 RU 2740566 C1 RU2740566 C1 RU 2740566C1 RU 2020119705 A RU2020119705 A RU 2020119705A RU 2020119705 A RU2020119705 A RU 2020119705A RU 2740566 C1 RU2740566 C1 RU 2740566C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- scaffold
- cell migration
- sample
- cells
- depth
- Prior art date
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 22
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 22
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 13
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920002601 oligoester Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101000851054 Homo sapiens Elastin Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000054289 human ELN Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предполагаемое изобретение относится к биомедицине, медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам оценки миграции клеток в толщу материала или скаффолда.The alleged invention relates to biomedicine, medicine, biotechnology, regenerative medicine, in particular, to methods for assessing cell migration into the material or scaffold.
В настоящее время благодаря развитию новых уникальных технологий во всем мире разрабатываются биосовместимые конструкции и материалы, расширяющие применение биомедицинских продуктов для замещения или восстановления поврежденных или утраченных тканей и органов. Одной из базовых характеристик, которой должны обладать материалы и скаффолды, предназначенные для заселения клетками и создания биомедицинских продуктов - это пористость («Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends» Salerno, Maio, Iannace, Netti Journal of Porous Materials volume 19, pagesl81-188 2012). Наличие системы взаимосвязанных пор позволяет клеткам заселить материал или скаффолд и нормально функционировать в дальнейшем, что, в конечном счете, обеспечивает целостность создаваемого биомедицинского клеточного продукта и его интеграцию в ткани реципиента при имплантации. Заселение материала / скаффолда происходит при высеве клеток на их поверхность in vitro либо путем рекрутинга клеток из окружающих тканей после его имплантации (Rnjak-Kovacina, J., Wise, S., Li, Z., Maitz, P., Young, C, Wang, Y., and Weiss, A. «Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering». Biomaterials 32, 6729, 2011; Freed LE1, Vunjak-Novakovic G, Biron RJ, Eagles DB, Lesnoy DC, Barlow SK, Langer R. «Biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering». Biotechnology 1994 Jul; 12(7):689-93.). Клетки должны мигрировать в структуру материала / скаффолда и заселить создаваемый на их основе конструкт. В тоже время наличие пористости материала / скаффолда как таковой еще не гарантирует успешной миграции клеток в его структуру. Так, малый размер пор, отсутствие межпоровых пространств, особенности свойств поверхности внутренней структуры и т.д. могут препятствовать миграции клеток и не позволить им заселить материал / скаффолд (Takahashi, Y., and Tabata, Y. «Effect of the fiber diameterand porosity of non-woven PET fabrics on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells». J Biomater Sci Polym Ed 15, 41, 2004). В связи с этим оценка миграции клеток в структуру образцов является одним из важнейших показателей при разработке материалов / скаффолдов. Однако, новые материалы / скаффолды часто являются плотными и непрозрачными, в связи с чем они становятся недоступными для исследования обычными оптическими методами. Поэтому разработка новых способов оценки миграции клеток в структуру материала /скаффолда является актуальной задачей, решение которой позволит на этапе in vitro разработки материалов / скаффолдов спрогнозировать возможность их заселения клетками и провести отбор наиболее перспективных образцов для дальнейшей разработки биомедицинских продуктов. Прогнозирующее тестирование in vitro новых материалов / скаффолдов требует современных ревалентных способов, позволяющих проводить не только качественную, но и количественную оценку. Такой подход является неотъемлемой частью во время доклинических исследований в качестве предварительного этапа перед началом исследований in vivo. В тоже время, существующие методы оценки миграционной способности клеток не являются универсальными и часто позволяют оценить только миграционную активность самих клеток, но не их миграционную способность в структуру материала. Так, например, одними из самых распространенных методов оценки миграционной активности клеток in vitro является оценка миграции клеток с помощью камеры Брейдона или теста "раны монослоя" клеток (Э.В. Бойко, Д.С. Мальцев, В.О. Полякова Влияние рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа на клеточную культуру пигментного эпителия сетчатки человека // Вестник офтальмологии 2017, 1, С. 42-48). Данный метод оценки миграции клеток имеет ряд преимуществ, как то не требует специального оборудования или реагентов. Через несколько часов после "ранения" монослоя направленная коллективная миграция легко оценивается и определяется количественно. Однако данный способ не может использоваться с целью оценки миграции клеток в структуру материала. Он позволяет проводить оценку миграционной способности непосредственно культуры клеток и клеток под воздействием, например, тестируемых жидкостей.Currently, thanks to the development of new unique technologies, biocompatible structures and materials are being developed all over the world, expanding the use of biomedical products for replacing or restoring damaged or lost tissues and organs. One of the basic characteristics that materials and scaffolds intended for populating cells and creating biomedical products should have is porosity ("Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends" Salerno, Maio, Iannace , Netti Journal of Porous Materials volume 19, pagesl81-188 2012). The presence of a system of interconnected pores allows cells to populate the material or scaffold and function normally in the future, which ultimately ensures the integrity of the created biomedical cell product and its integration into the recipient's tissue during implantation. The material / scaffold is colonized by sowing cells on their surface in vitro or by recruiting cells from surrounding tissues after its implantation (Rnjak-Kovacina, J., Wise, S., Li, Z., Maitz, P., Young, C, Wang, Y., and Weiss, A. “Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.” Biomaterials 32, 6729, 2011; Freed LE1, Vunjak-Novakovic G, Biron RJ, Eagles DB. Lesnoy DC, Barlow SK, Langer R. “Biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering.” Biotechnology 1994 Jul; 12 (7): 689-93.). The cells must migrate into the material / scaffold structure and populate the construct created on their basis. At the same time, the presence of porosity of the material / scaffold as such does not yet guarantee successful migration of cells into its structure. So, small pore size, absence of interpore spaces, features of the surface properties of the internal structure, etc. can interfere with cell migration and prevent them from colonizing the material / scaffold (Takahashi, Y., and Tabata, Y. “Effect of the fiber diameterand porosity of non-woven PET fabrics on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.” J Biomater Sci Polym Ed 15, 41, 2004). In this regard, the assessment of cell migration into the structure of samples is one of the most important indicators in the development of materials / scaffolds. However, new materials / scaffolds are often dense and opaque, which makes them unavailable for investigation by conventional optical methods. Therefore, the development of new methods for assessing the migration of cells into the structure of a material / scaffold is an urgent task, the solution of which will allow at the stage of in vitro development of materials / scaffolds to predict the possibility of their colonization by cells and to select the most promising samples for further development of biomedical products. In vitro predictive testing of new materials / scaffolds requires modern revalent methods that allow not only qualitative but also quantitative assessment. This approach is an integral part of preclinical studies as a preliminary step before starting in vivo studies. At the same time, the existing methods for assessing the migration ability of cells are not universal and often allow assessing only the migration activity of the cells themselves, but not their migration ability into the structure of the material. So, for example, one of the most common methods for assessing the migration activity of cells in vitro is the assessment of cell migration using a Braydon chamber or the test of "wound monolayer" of cells (E.V. Boyko, D.S. Maltsev, V.O. Polyakova The effect of recombinant plasminogen activator of the urokinase type on the cell culture of the pigment epithelium of the human retina // Bulletin of Ophthalmology 2017, 1, pp. 42-48). This method for assessing cell migration has a number of advantages, such as it does not require special equipment or reagents. A few hours after the "wound" of the monolayer, directed collective migration is easily assessed and quantified. However, this method cannot be used to assess the migration of cells into the material structure. It allows you to assess the migration ability of a culture of cells and cells directly under the influence of, for example, the tested fluids.
В качестве прототипа выбран способ, применяемый для оценки миграционной способности фибробластов кожи человека (ФЧ), мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК-ЖТ) и эпидермальных кератиноцитов (ЭКЦ), в толщу непрозрачного 3D пластического материала в виде губки толщиной 10 мм (Рахматуллин Рамиль Рафаилевич «Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии» Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, М: 2014), включающий предварительное трансфицирование ФЧ геном зеленого флуоресцирующего белка EGFP под CMV-промотором или предварительное трансфицирование геном красного флуоресцирующего белка TagRFP под CMV-промотором (МСК-ЖТ, ЭКЦ) при помощи лентовирусной конструкции, после чего клетки можно наблюдали на губке с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа Olympus IX51 (Olympus, Япония) по видеозаписи с трехсуточными циклами на протяжении периода культивирования до 26 суток.As a prototype, the method used to assess the migration capacity of human skin fibroblasts (FP), mesenchymal stromal cells of human adipose tissue (MSC-VT) and epidermal keratinocytes (ECC), into the thickness of an opaque 3D plastic material in the form of a sponge 10 mm thick (Rakhmatullin Ramil Rafailevich "Bioplastic material based on hyaluronic acid hydrocolloid and a peptide complex for reconstructive and reconstructive surgery" Abstract of the thesis for the degree of Doctor of Biological Sciences, M: 2014), including preliminary transfection of PS with the green fluorescent protein EGFP genome under the CMV promoter or preliminary transfection the genome of the red fluorescent protein TagRFP under the CMV promoter (MSC-VT, ECC) using a ribbon-viral construct, after which the cells can be observed on a sponge using an Olympus IX51 wide-field fluorescence microscope (Olympus, Japan) by video recording with three-day cycles for cultivation period up to 26 days.
Способ, представленный в прототипе, требует дорогостоящих, изготавливаемых только под заказ расходных материалов, в частности конструирование лентивирусного вектора, кодирующего указанную заказчиком последовательность ДНК под контролем универсального промотора цитомегаловируса человека (CMV). Еще одним недостатком является длительность и трудоемкость способа, так как наработка лентивирусных частиц с необходимым титром (с титром 105-106 TU/мл) требует затрат временного ресурса, кроме того работа с конструированием лентивирусов проводится в ограниченном количестве биотехнологических компаний, как в России, так и за рубежом, что резко ограничивает применимость метода. В предложенном способе, в качестве репортерных генов использовали сразу два цветных флуоресцентных белка: зеленый флуоресцирующий белок EGFP для фибробластов кожи человека и красный флуоресцирующий белок TagRFP для мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК-ЖТ) и эпидермальных кератиноцитов. Следовательно, все перечисленные денежные и временные затраты увеличиваются как минимум вдвое. В итоге, для реализации всего способа необходимы редкие, изготавливаемые только под заказ, лентивирусные конструкции, дорогостоящие технологии и значительные временные затраты.The method presented in the prototype requires expensive, custom-made consumables, in particular the construction of a lentiviral vector encoding a customer-specified DNA sequence under the control of a universal human cytomegalovirus (CMV) promoter. Another disadvantage is the duration and laboriousness of the method, since the production of lentiviral particles with the required titer (with a titer of 10 5 -10 6 TU / ml) requires a time resource, in addition, work with the design of lentiviruses is carried out in a limited number of biotechnological companies, as in Russia and abroad, which sharply limits the applicability of the method. In the proposed method, two colored fluorescent proteins were used as reporter genes at once: green fluorescent protein EGFP for human skin fibroblasts and red fluorescent protein TagRFP for mesenchymal stromal cells of human adipose tissue (MSC-AT) and epidermal keratinocytes. Consequently, all the listed money and time costs are increased at least twice. As a result, the implementation of the entire method requires rare, manufactured only to order, lentiviral constructions, expensive technologies and significant time costs.
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.The objective of the proposed invention is to improve the method.
Технический результат - удешевление, сокращение временных затрат, трудоемкости и повышение доступности способа для оценки миграции клеток в структуру материала /скаффолда.The technical result is a reduction in cost, reduction in time costs, labor intensity and increased availability of the method for assessing the migration of cells into the structure of the material / scaffold.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем высев культуры клеток на исследуемый образец и оценку их миграции в толщу материала с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии, на образцы материала или скаффолда высевают интактные мезенхимальные стволовые клетки или фибробласты, затем последовательно через 24, 72 и 144 часа образцы с клетками окрашивают флуорохромом, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК, проводят флуоресцентную микроскопию в 10 полях зрения с послойной съемкой по оси Z на глубину миграции клеток в структуру образца, с фиксацией глубины залегания ядер клеток относительно поверхности образца и последующим расчетом скорости миграции клеток в структуру материала или скаффолда по формуле: A=B/t, где А - скорость миграции клеток в структуру образца материала или скаффолда (μm/ч); В - средняя величина глубины миграции клеток в структуру образца по 10 полям зрения (μm); t - время с момента высева клеток на поверхность образца до момента исследования.The technical result is achieved due to the fact that in a method including sowing a cell culture on a test sample and assessing their migration into the material using wide-field fluorescence microscopy, intact mesenchymal stem cells or fibroblasts are seeded on samples of the material or scaffold, then sequentially after 24, 72 and 144 hours, samples with cells are stained with a fluorochrome having a high specificity for a double-stranded DNA molecule, fluorescence microscopy is carried out in 10 fields of view with layer-by-layer imaging along the Z axis to the depth of cell migration into the sample structure, with fixing the depth of cell nuclei relative to the sample surface and subsequent calculation the rate of cell migration into the structure of the material or scaffold according to the formula: A = B / t, where A is the rate of cell migration into the structure of the material sample or scaffold (μm / h); B — average depth of cell migration into the sample structure over 10 fields of view (μm); t is the time from the moment of sowing cells on the sample surface to the moment of examination.
Способ оценки миграционной способности клеток в структуру материала или скаффолда осуществляют следующим образом:The method for assessing the migration ability of cells into the structure of a material or scaffold is as follows:
Шаг 1. На образцы материала или скаффолда высевают культуру мезенхимальных стволовых клеток или дермальных фибробластов человека с плотностью высева 10 тыс./см2. Образцы помещают в СO2-инкубатор и культивируют при 37°С и 5% СO2.Step 1. A culture of human mesenchymal stem cells or human dermal fibroblasts with a seeding density of 10 thousand / cm 2 is seeded on samples of material or scaffold. The samples are placed in a CO 2 incubator and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 .
Шаг 2. В контрольные сроки (например, 24, 72 или 144 часа), образец материала помещают в 24-луночный планшет для флуоресцентной микроскопии с непрозрачными боковыми стенками. Затем проводят прижизненное окрашивание ядер клеток, высеянных на образец флуорохромом, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК (например, флуорохром Hoechst 33342). Для этого в лунку, содержащую образец и 2 мл культуральной среды (DMEM или α-МЕМ содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки), добавляют прижизненный краситель, который обладает высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК, согласно инструкции производителя (например, 1 мкл раствора Hoechst 33342 в концентрации 10 мкг/мл). Планшет помещают в термостат и инкубируют в течение 30 мин. при 37°С. После инкубации образец дважды отмывают фосфатным буфером. Затем к образцу добавляют 1 мл фосфатного буфера для предотвращения пересыхания образца.Step 2. At control times (eg 24, 72 or 144 hours), a sample of material is placed in a 24-well fluorescence microscope plate with opaque sidewalls. Then, in vivo staining of cell nuclei seeded on the sample with a fluorochrome having high specificity for a double-stranded DNA molecule (for example, Hoechst 33342 fluorochrome) is carried out. To do this, an in vivo dye is added to the well containing the sample and 2 ml of the culture medium (DMEM or α-MEM containing 10% fetal calf serum), which has a high specificity for the double-stranded DNA molecule, according to the manufacturer's instructions (for example, 1 μl of Hoechst 33342 solution at a concentration of 10 μg / ml). The plate is placed in a thermostat and incubated for 30 minutes. at 37 ° C. After incubation, the sample is washed twice with phosphate buffer. Then 1 ml of phosphate buffer is added to the sample to prevent drying out of the sample.
Шаг 3. Планшет образцом переносят на оборудование, позволяющее проводить широкопольную флуоресцентную микроскопию (например, имиджер Cytation™ 5). В 10 полях зрения с использованием объектива с 4-кратным увеличением проводят послойную съемку по оси Z. Съемку по оси Z проводят, используя функцию Z-stack, от первой клетки (которая лежит на поверхности материала) до последней клетки (которая максимально глубоко мигрировала в толщу материала).Step 3: Transfer the plate with the sample to a wide-field fluorescence microscopy capable equipment (eg Cytation ™ 5 imager). In 10 fields of view, using a lens with 4x magnification, a layer-by-layer survey is performed along the Z-axis. The survey along the Z-axis is performed using the Z-stack function, from the first cell (which lies on the surface of the material) to the last cell (which migrated as deeply as possible into thickness of material).
Шаг 4. Снимки в количестве 10 штук полученные по п. 3 обрабатываются с целью наблюдения трехмерного распределения клеток по структуре материала. Проводят анализ послойных снимков материала с клетками от верхних слоев к более глубоким, фиксируя начальный уровень поверхности образца (Н) и глубину миграции клеток в структуру материала (М) - глубину залегания ядер в структуре образца относительно поверхности образца). Для каждого поля зрения рассчитывают абсолютное значение глубины миграции клеток по формуле Г=М-Н. Рассчитывают среднюю величину глубины миграции клеток в структуру материала по 10 полям зрения (В) по формуле В=(Г1+Г2+…Г10)/10, где Г1 - абсолютное значение глубины миграции клеток на снимке 1, Г2 - абсолютное значение глубины миграции клеток на снимке 2. и т.д.Step 4. Pictures in the amount of 10 pieces obtained according to item 3 are processed in order to observe the three-dimensional distribution of cells over the structure of the material. Analysis of layer-by-layer images of the material with cells from the upper layers to the deeper ones is carried out, fixing the initial level of the sample surface (H) and the depth of cell migration into the material structure (M) - the depth of the nuclei in the sample structure relative to the sample surface). For each field of view, the absolute value of the depth of cell migration is calculated according to the formula G = M-H. Calculate the average value of the depth of cell migration into the structure of the material for 10 fields of view (B) according to the formula B = (G1 + G2 + ... G10) / 10, where G1 is the absolute value of the depth of cell migration in image 1, G2 is the absolute value of the depth of cell migration on picture 2., etc.
Шаг 5. Проводят расчет скорости миграции клеток в структуру материала по формуле: A=B/t, где А - скорость миграции клеток в структуру образца материала или скаффолда (μm/ч); В - средняя величина глубины миграции клеток в структуру образца по 10 полям зрения (μm); t - время с момента высева клеток на поверхность образца до момента исследования.Step 5. Calculate the rate of cell migration into the material structure using the formula: A = B / t, where A is the rate of cell migration into the structure of the material sample or scaffold (μm / h); B — average depth of cell migration into the sample structure over 10 fields of view (μm); t is the time from the moment of sowing cells on the sample surface to the moment of examination.
Полученные данные позволяют оценить миграцию клеток в структуру материала или скаффолда по изменению значения Z-stack в течение времени и расчитать скорость миграции клеток.The data obtained make it possible to evaluate the migration of cells into the structure of the material or scaffold by the change in the Z-stack value over time and to calculate the rate of cell migration.
Способ оценки миграции клеток в структуру материала или скаффолда поясняется фигурами, приложенными к данному описанию.A method for evaluating cell migration into a material or scaffold structure is illustrated by the figures attached to this description.
Фиг. 1. Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Начальный уровень поверхности образца, глубина по оси Z=106 μm.FIG. 1. An example of a photomicrograph of a sample under study, obtained by layer-by-layer shooting along the Z axis using wide-field fluorescence microscopy. Initial level of the sample surface, depth along the Z axis = 106 μm.
Фиг. 2 Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок, глубина по оси Z=318 μm.FIG. 2 An example of a photomicrograph of a sample under study, obtained by layer-by-layer shooting along the Z axis using wide-field fluorescence microscopy. Intermediate micrograph, depth along the Z axis = 318 μm.
Фиг. 3 Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок, глубина по оси Z=530 μm.FIG. 3 An example of a photomicrograph of a sample under study, obtained by layer-by-layer shooting along the Z axis using wide-field fluorescence microscopy. Intermediate micrograph, depth along the Z axis = 530 μm.
Фиг. 4. Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Глубина по оси Z=689 μm, глубже ядра клеток не фиксировались.FIG. 4. An example of a photomicrograph of a sample under study, obtained by layer-by-layer shooting along the Z axis using wide-field fluorescence microscopy. Depth along the Z axis = 689 μm; deeper than cell nuclei were not recorded.
Фиг. 5 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Начальный уровень поверхности образца - по оси Z=105 μm.FIG. 5 Example of obtained photographs from a sample with Z-axis layered photography using wide-field fluorescence microscopy. The initial level of the sample surface is along the Z axis = 105 μm.
Фиг.6 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=119μm.Fig. 6 An example of obtained photographs from a sample with Z-axis layering using wide-field fluorescence microscopy. Intermediate micrograph - along the Z axis = 119μm.
Фиг. 7 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=134μm.FIG. 7 An example of obtained photographs from a sample with a layer-by-layer Z-axis using wide-field fluorescence microscopy. Intermediate micrograph - along the Z axis = 134μm.
Фиг. 8 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=148μm.FIG. 8 Example of obtained photographs from a sample with Z-axis layering using wide-field fluorescence microscopy. Intermediate micrograph - along the Z axis = 148μm.
Фиг. 9 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=162μm.FIG. 9 Example of obtained photographs from a sample with Z-axis layered photography using widefield fluorescence microscopy. Intermediate micrograph - along the Z axis = 162μm.
Фиг. 10 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Финальный снимок - глубина по оси Z=177 μm.FIG. 10 Example of obtained photographs from a sample with Z-axis layering using wide-field fluorescence microscopy. Final image - depth along the Z axis = 177 μm.
Достижение заявленного технического результата подтверждается следующими примерами.The achievement of the claimed technical result is confirmed by the following examples.
Пример 1.Example 1.
Пример 2.Example 2.
Пример 1Example 1
Для оценки миграции клеток в структуру костнозамещающего материала на основе гидроксиапатита, коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов был взят образец материала и согласно представленному способу, на его поверхность были высеяны интактные мезенхимальные стволовые клетки, как описано в шаге 1 данного способа. Далее согласно шагам 2-4 данного способа через 72 часа была проведена окраска и широкопольная флуоресцентная микроскопия с послойной съемкой по оси Z на имиджере Cytation™5. В результате в 10 полях зрения с использованием объектива с 4-кратным увеличением проведена послойная съемка по оси Z на глубину визуализации от поверхности образца (первой клетки на поверхности) до последней клетки в структуре материала (Фиг. 1-4) с фиксацией глубины миграции клеток в структуру материала (глубины залегания ядер в структуре образца относительно поверхности образца) и последующим расчетом скорости миграции клеток в структуру материала согласно шагу 5 данного способа.To assess the migration of cells into the structure of bone-replacing material based on hydroxyapatite, collagen and sulfated glycosaminoglycans, a sample of the material was taken and according to the presented method, intact mesenchymal stem cells were seeded on its surface, as described in step 1 of this method. Further, according to steps 2-4 of this method, after 72 hours, staining and wide-field fluorescence microscopy with layer-by-layer Z-axis imaging were carried out on a Cytation ™ 5 imager. As a result, in 10 fields of view using a lens with 4x magnification, a layer-by-layer survey was carried out along the Z axis to the imaging depth from the surface of the sample (the first cell on the surface) to the last cell in the material structure (Fig. 1-4) with fixing the depth of cell migration into the structure of the material (the depth of the nuclei in the structure of the sample relative to the surface of the sample) and then calculating the rate of migration of cells into the structure of the material according to step 5 of this method.
Согласно полученным результатам костнозамещающии материал, в состав которого входит гидроксиапатит, коллаген и сульфатированные гликозаминогликаны, позволяет клеткам проявлять высокую миграционную способность в структуру материала. Клетки в среднем мигрировали на глубину 594 μm со 8,25 μm/ч (Табл. 1).According to the results obtained, the bone substitute material, which includes hydroxyapatite, collagen and sulfated glycosaminoglycans, allows cells to exhibit a high migration ability into the structure of the material. The cells migrated on average to a depth of 594 μm from 8.25 μm / h (Table 1).
Пример 2Example 2
Для оценки миграционной способности клеток были взят образец скаффолда сформированного на основе олигоэфир(мет)акрилатов. На образцы скаффолда были высеяны интактные фибробласты, как описано в шаге 1 представленного способа. Далее, согласно шагам 2-4 способа через 144 часа была проведена окраска и исследование с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии с послойной съемкой по оси Z на имиджер Cytation™ 5. В результате в 10 полях зрения с использованием объектива с 4-кратным увеличением проведена послойная съемка по оси Z на глубину визуализации от первой (на поверхности) до последней (в толще материала) клетки, с фиксацией глубины миграции клеток в структуру материала (глубины залегания ядер в структуре образца относительно поверхности образца) и последующим определением скорости миграции клеток в структуру материала согласно шагу 5 данного способа (Фиг. 5-10).To assess the migration ability of cells, a sample of a scaffold formed on the basis of oligoester (meth) acrylates was taken. Intact fibroblasts were seeded onto scaffold samples as described in step 1 of the presented method. Further, according to steps 2-4 of the method, after 144 hours, staining and examination were carried out using wide-field fluorescence microscopy with layer-by-layer Z-axis imaging on the Cytation ™ 5 imager. As a result, layer-by-layer photography was carried out in 10 fields of view using a lens with 4x magnification. along the Z axis to the imaging depth from the first (on the surface) to the last (in the material) cell, with fixing the depth of cell migration into the material structure (the depth of the nuclei in the sample structure relative to the sample surface) and subsequent determination of the cell migration rate into the material structure according to step 5 of this method (Fig. 5-10).
Таким образом, предложенный способ позволяет оценить миграцию клеток в структуру материала или скаффолда и определить скорость и время миграции клеток.Thus, the proposed method makes it possible to assess the migration of cells into the structure of the material or scaffold and to determine the rate and time of cell migration.
Согласно полученным результатам образец скаффолда сформированного на основе олигоэфир(мет)акрилатов не позволял клеткам активно мигрировать в структуру материала. Клетки в среднем мигрировали на глубину 67μm со 0,47 μm/ч (Табл. 2).According to the results obtained, a scaffold sample formed on the basis of oligoester (meth) acrylates did not allow cells to actively migrate into the material structure. The cells migrated on average to a depth of 67μm from 0.47 μm / h (Table 2).
Таким образом, предложенный способ позволяет получить объективные данные позволяющие оценить миграцию клеток в структуру материала / скаффолда с использованием стандартных методов высева интактных клеток на исследуемый образец и достаточно простых и распространенных методов окрашивания образцов с их исследованием методом широкопольной флуоресцентной микроскопии. Способ не требует дорогостоящих, изготавливаемых только под заказ расходных материалов, а реализуется с использованием стандартных флуорохромов, что значительно удешевляет реализацию и повышает доступность представленного способа. Несомненным преимуществом способа является то, что он не требует длительных, сложных и трудоемких подготовок (например, наработка лентивирусных частиц с необходимым титром), требующих больших временных затрат, а реализуется стандартными методами, доступными многим биотехнологическим лабораториям. Использование для оценки миграции клеток в структуру материала/скаффолда съемки по 10 полям зрения по оси Z с фиксацией залегания глубины ядер позволяет объективно и с высокой степенью точности не только качественно охарактеризовать возможность миграции клеток в структуру (толщу) исследуемых, но и дать количественную оценку процесса рассчитав скорость миграции клеток.Thus, the proposed method allows one to obtain objective data allowing to evaluate the migration of cells into the material / scaffold structure using standard methods of sowing intact cells on a test sample and fairly simple and common methods of staining samples with their study by wide-field fluorescence microscopy. The method does not require expensive consumables manufactured only to order, but is implemented using standard fluorochromes, which significantly reduces the cost of implementation and increases the availability of the presented method. The undoubted advantage of the method is that it does not require lengthy, complex and laborious preparations (for example, the production of lentiviral particles with the required titer), requiring a lot of time, but is implemented by standard methods available to many biotechnological laboratories. The use of shooting along 10 fields of view along the Z axis with fixation of the depth of nuclei to assess the migration of cells into the structure of the material / scaffold allows you to objectively and with a high degree of accuracy not only qualitatively characterize the possibility of cell migration into the structure (thickness) of the studied, but also give a quantitative assessment of the process calculating the rate of cell migration.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020119705A RU2740566C1 (en) | 2020-06-08 | 2020-06-08 | Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020119705A RU2740566C1 (en) | 2020-06-08 | 2020-06-08 | Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2740566C1 true RU2740566C1 (en) | 2021-01-15 |
Family
ID=74183852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020119705A RU2740566C1 (en) | 2020-06-08 | 2020-06-08 | Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2740566C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2399664C1 (en) * | 2009-02-09 | 2010-09-20 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН | Method for determination of production of stem cell homing factors |
| WO2016161311A1 (en) * | 2015-04-02 | 2016-10-06 | The New York Stem Cell Foundation | In vitro methods for assessing tissue compatibility of a material |
| RU2675376C1 (en) * | 2017-07-17 | 2018-12-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
-
2020
- 2020-06-08 RU RU2020119705A patent/RU2740566C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2399664C1 (en) * | 2009-02-09 | 2010-09-20 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН | Method for determination of production of stem cell homing factors |
| WO2016161311A1 (en) * | 2015-04-02 | 2016-10-06 | The New York Stem Cell Foundation | In vitro methods for assessing tissue compatibility of a material |
| RU2675376C1 (en) * | 2017-07-17 | 2018-12-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| РАХМАТУЛЛИН Р.Р. Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии. Автореф. дисс. доктора биол. наук. Москва, 2014, 318 c. [Найдено 01.12.2020] [онлайн]. Найдено в Интернете, научная библиотека диссертаций и автоов disserCat: URL: https://www.dissercat.com/content/bioplasticheskii-material-na-osnove-gidrokolloida-gialuronovoi-kisloty-i-peptidnogo-kompleks . * |
| РАХМАТУЛЛИН Р.Р. Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии. Автореф. дисс. доктора биол. наук. Москва, 2014, 318 c. [Найдено 01.12.2020] [онлайн]. Найдено в Интернете, научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat: URL: https://www.dissercat.com/content/bioplasticheskii-material-na-osnove-gidrokolloida-gialuronovoi-kisloty-i-peptidnogo-kompleks . * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102085390B (en) | Cartilage cell removal matrix and preparation method and application thereof | |
| US20180305668A1 (en) | Method of osteogenic differentiation in microfluidic tissue culture systems | |
| Chen et al. | Real-time observation of leukocyte–endothelium interactions in tissue-engineered blood vessel | |
| US20110052693A1 (en) | Method for producing artificial skin | |
| Serban et al. | Effects of extracellular matrix analogues on primary human fibroblast behavior | |
| Kluge et al. | Bioreactor system using noninvasive imaging and mechanical stretch for biomaterial screening | |
| Ardila et al. | TGFβ2 differentially modulates smooth muscle cell proliferation and migration in electrospun gelatin-fibrinogen constructs | |
| Bardsley et al. | Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live cell imaging | |
| Unger et al. | Human endothelial and osteoblast co-cultures on 3D biomaterials | |
| Duchi et al. | A new holistic 3D non-invasive analysis of cellular distribution and motility on fibroin-alginate microcarriers using light sheet fluorescent microscopy | |
| Belay et al. | Optical projection tomography imaging of single cells in 3D gellan gum hydrogel | |
| Metzler et al. | Live en face imaging of aortic valve leaflets under mechanical stress | |
| RU2740566C1 (en) | Method of estimating cell migration into structure of material or scaffold | |
| Hodge et al. | Tissue‐mimetic culture enhances mesenchymal stem cell secretome capacity to improve regenerative activity of keratinocytes and fibroblasts in vitro | |
| Alsaykhan et al. | Investigating materials and orientation parameters for the creation of a 3D musculoskeletal interface co-culture model | |
| Sun et al. | In situ image analysis of interactions between normal human keratinocytes and fibroblasts cultured in three-dimensional fibrin gels | |
| Bodhak et al. | Combinatorial cassettes to systematically evaluate tissue-engineered constructs in recipient mice | |
| Kiewisz et al. | High-throughput screening of mitotic mammalian cells for electron microscopy using classic histological dyes | |
| Rödling et al. | Fabrication of biofunctionalized, cell-laden macroporous 3D PEG hydrogels as bone marrow analogs for the cultivation of human hematopoietic stem and progenitor cells | |
| US20210063374A1 (en) | Abnormal cardiac rhythm myocardial model and method for producing same, agent for forming abnormal cardiac rhythm myocardial model, and method for evaluating drug efficacy of heart disease therapeutic | |
| Gea et al. | Study of bacterial cellulose as scaffold on cartilage tissue engineering | |
| RU2675376C1 (en) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold | |
| Przytulska et al. | The evaluation of 3D morphological structure of porous membranes based on a computer-aided analysis of their 2D images | |
| Nie et al. | Spheroid formation of human keratinocyte: Balancing between cell-substrate and cell-cell interaction | |
| Almici et al. | Engineering cell-derived matrices with controlled 3D architectures for pathophysiological studies |