RU2739117C1

RU2739117C1 - Fasciopathy simulation method in experimental animals

Info

Publication number: RU2739117C1
Application number: RU2020120704A
Authority: RU
Inventors: Герман Григорьевич Дзюба; Вадим Николаевич Силантьев; Михаил Анатольевич Турушев; Дмитрий Викторович Серый; Марина Владимировна Маркелова; Николай Константинович Кузнецов
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2020-12-21

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to experimental medicine and can be used for simulating plantar fasciopathy in laboratory animals. Method involves administering an alprostadil diluted to concentration of 5,000 ng in 1 ml of the final solution into a pelvic sole abdomen of dogs. Alprostadil solution is introduced intra- and paraaponeurotically at 1 cm distally from the attachment point of the plantar aponeurosis to the calcaneal bone once week for 4 weeks in high-dose 20,000 ng.

EFFECT: use of the invention enables simulating in 100 % experimental animals long-term degenerative changes in the structure of aponeurosis similar to those in humans, which is necessary for developing methods of treating plantar fasciopathy and assessing their effectiveness, the clinical model is characterized by representativeness, accessibility, reproducibility, technical simplicity and does not require use of complex equipment and prolonged anaesthesia of animals.

1 cl, 2 dwg

Description

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования подошвенной фасциопатии у лабораторных животных, с целью воспроизведения дегенеративных процессов в структурах подошвенного апоневроза для оценки эффективности консервативных и оперативных способов лечения, а также для изучения механизмов патогенеза.The invention relates to experimental medicine and can be used to model plantar fasciopathy in laboratory animals in order to reproduce degenerative processes in the structures of the plantar aponeurosis to assess the effectiveness of conservative and surgical methods of treatment, as well as to study the mechanisms of pathogenesis.

Подошвенная фасциопатия относится к тендинопатиям, характеризующимся хронической болью в сухожилиях, апоневрозах и фасциях, связанной, как правило, с чрезмерной физической и осевой нагрузкой. Патогенетически изученными факторами патологического процесса являются: дегенерация коллагена, снижение васкуляризации, а также увеличение количества свободных афферентных нервных окончаний [Alfredson H, Ohberg L, Forsgren S. Is vasculoneural ingrowth the cause of pain in chronic Achilles tendinosis? An investigation using ultrasonography and colour Doppler, immunohistochemistry and diagnostic injections. Knee Surg Sports Traumatol Arthosc. 2003;11:334-338.], протекающие при отсутствии воспалительной реакции [Tasto, J.P. Radiofrequency-Based Micro-Tenotomy for Treatment of Chronic Tendinosis. 2003].Plantar fasciopathy refers to tendinopathies characterized by chronic pain in the tendons, aponeuroses and fascia, usually associated with excessive physical and axial stress. The pathogenetically studied factors of the pathological process are: collagen degeneration, decreased vascularization, and an increase in the number of free afferent nerve endings [Alfredson H, Ohberg L, Forsgren S. Is vasculoneural ingrowth the cause of pain in chronic Achilles tendinosis? An investigation using ultrasonography and color Doppler, immunohistochemistry and diagnostic injections. Knee Surg Sports Traumatol Arthosc. 2003; 11: 334-338.] Occurring in the absence of an inflammatory response [Tasto, J.P. Radiofrequency-Based Micro-Tenotomy for Treatment of Chronic Tendinosis. 2003].

В настоящее время нет единого мнения о выборе метода лечения подошвенной фасциопатии. Консервативные варианты лечения обеспечивают ремиссию у 60-90% пациентов в течение полугода [Neufeld SK, Cerrato R. Plantar fasciitis: Evaluation and treatment. J Am Acad Orthop Surg 2008 June;16(6):338-46.]. При устойчивых к консервативным методам лечения случаях используют оперативные методы лечения, такие, как открытый или эндоскопический релиз апоневроза, чрескожное или открытое биполярное радиочастотное воздействие и пр. [Thomas ZM, Thomas KJ. Foot Ankle Spec. 2017 Jun;10(3):240-241. Technique Tip: Single-Incision Endoscopic Plantar Fasciotomy. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27885102]. Но, так как количество резистентных к консервативному лечению случаев подошвенной пяточной боли остается стабильным, сохраняется необходимость научного поиска новых методов хирургического лечения. Моделирование подошвенной фасциопатии на экспериментальных животных позволит оценивать эффективность оперативных методов лечения, основываясь на изучении патогенеза и патологической анатомии пораженного апоневроза. На данный момент в доступной научной литературе модели формирования подошвенной фасциопатии у экспериментальных животных не представлены.There is currently no consensus on the choice of treatment for plantar fasciopathy. Conservative treatment options provide remission in 60-90% of patients within six months [Neufeld SK, Cerrato R. Plantar fasciitis: Evaluation and treatment. J Am Acad Orthop Surg 2008 June; 16 (6): 338-46.]. In cases resistant to conservative methods of treatment, surgical methods of treatment are used, such as open or endoscopic aponeurosis release, percutaneous or open bipolar radiofrequency exposure, etc. [Thomas ZM, Thomas KJ. Foot Ankle Spec. 2017 Jun; 10 (3): 240-241. Technique Tip: Single-Incision Endoscopic Plantar Fasciotomy. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27885102]. But, since the number of cases of plantar heel pain resistant to conservative treatment remains stable, there remains a need for a scientific search for new methods of surgical treatment. Modeling plantar fasciopathy in experimental animals will allow evaluating the effectiveness of surgical methods of treatment, based on the study of the pathogenesis and pathological anatomy of the affected aponeurosis. At the moment, in the available scientific literature, models of the formation of plantar fasciopathy in experimental animals are not presented.

Известен способ моделирования тендинопатии ахиллова сухожилия у крыс с использованием беговых дорожек и оценкой состояния сухожилия на 4, 8 и 16 неделе [Silva RD, Glazebrook MA, Campos VC, Vasconcelos AC, 2011; Kim BS, Joo YC, Choi BH, Kim KH, Kang JS, Park SR, 2015]. Хроническая перегрузка вызывала изменения в матриксе сухожилия и составе коллагена лабораторных животных, а также микроповреждения ткани сухожилия, выявляемые при морфометрической оценке гистологического материала. Недостатками этого способа являются сложная воспроизводимость метода, длительность формирования (4 месяца) и недостаточная эффективность модели – у 25% лабораторных животных не достигались выраженные клинические и морфологические проявления тендинопатии.A known method for modeling Achilles tendinopathy in rats using treadmills and assessing the condition of the tendon at 4, 8 and 16 weeks [Silva RD, Glazebrook MA, Campos VC, Vasconcelos AC, 2011; Kim BS, Joo YC, Choi BH, Kim KH, Kang JS, Park SR, 2015]. Chronic overload caused changes in the tendon matrix and collagen composition of laboratory animals, as well as microdamage to the tendon tissue, revealed by morphometric assessment of the histological material. The disadvantages of this method are the complex reproducibility of the method, the duration of formation (4 months) and the insufficient efficiency of the model - in 25% of laboratory animals, pronounced clinical and morphological manifestations of tendinopathy were not achieved.

Известна модель дегенерации ткани ахиллова сухожилия у крыс путем перитендинозного введения эластазы [Wu YT, Wu PT, Jou IM, 2016], после чего авторы выявляли утолщение сухожилия, повышение клеточности и появление очаговых дегенеративных изменений в тканях, что соответствовало изменениям в сухожилиях при тендинопатии. Также известен способ формирования тендинопатии ахиллова сухожилия у кроликов при помощи введения коллагеназы [Novel animal model for Achilles tendinopathy: Controlled experimental study of serial injections of collagenase in rabbits / de Cesar Netto C et al. //PLoS One, 2018 13;13(2): e0192769.]. Наличие тендинопатии было подтверждено гистологически с использованием шкалы Bonar [Movin and Bonar scores a ssess the sa me chara cteristics of tendon histology / N. Maffulli [et al.] // Clin. Orthop. Relat. Res. – 2008. – Vol. 466. – P. 1605–1611.]. Недостатками этих моделей являются опасность развития глубоких некротических изменений в сухожилиях при интратендинозном введении, а также недоступность препаратов эластазы/коллагеназы в ампулах, необходимых для приготовления вводимого раствора.There is a known model of degeneration of the Achilles tendon tissue in rats by peritendinous administration of elastase [Wu YT, Wu PT, Jou IM, 2016], after which the authors identified tendon thickening, increased cellularity and the appearance of focal degenerative changes in tissues, which corresponded to changes in tendons in tendinopathy. Also known is a method for the formation of tendinopathy of the Achilles tendon in rabbits using collagenase [Novel animal model for Achilles tendinopathy: Controlled experimental study of serial injections of collagenase in rabbits / de Cesar Netto C et al. // PLoS One, 2018 13; 13 (2): e0192769.]. The presence of tendinopathy was confirmed histologically using the Bonar scale [Movin and Bonar scores a ssess the sa me chara cteristics of tendon histology / N. Maffulli [et al.] // Clin. Orthop. Relat. Res. - 2008. - Vol. 466. - P. 1605-1611.]. The disadvantages of these models are the danger of the development of deep necrotic changes in the tendons after intratendinous administration, as well as the inaccessibility of elastase / collagenase preparations in ampoules necessary for the preparation of the injected solution.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому способу (прототипом) является способ моделирования тендинопатии ахиллова сухожилия у крыс при помощи перитендинозных инъекций синтетического простагландина Е1 (PGE1) в дозе 5000 нг в 1 мл один раз в неделю в течение 4 недель [А. Sullo, N. Maffulli, G. Capasso, V. Testa, 2001]. По сообщению авторов, первоначально перитендинозные инъекции PGE1 вызывали острое воспаление в сухожилии и окружающих его тканях. На 7-й день показатели среднего содержания воды и средней массы влажных сухожилий были значительно выше в сухожилиях крыс, получающих PGE1, нежели в контрлатеральных контрольных сухожилиях (анализ рассеивания ANOVA; P 5 = 0, 02). На 21-й день около половины сухожилий, обработанных PGE1, демонстрировали фиброз паратенона с адгезией и внутрисухожильной (внутриствольной) дегенерацией, а другая половина по-прежнему демонстрировала картину острого воспаления. На 35-й день, во всех сухожилиях, обработанных PGE1, отмечались фиброз паратенона с адгезией и внутрисухожильной дегенерацией. На всех трех этапах забора материала не было доказательств наличия патологических изменений в сухожилиях, необрабатываемых PGE1. Авторы пришли к однозначному мнению, что длительное введение PGE1 вызывало пери- и интратендинозную дегенерацию, обеспечивая стабильное получение модели тендинопатии ахиллова сухожилия.The closest analogue to the proposed method (prototype) is a method for modeling Achilles tendinopathy in rats using peritendinous injections of synthetic prostaglandin E1 (PGE1) at a dose of 5000 ng in 1 ml once a week for 4 weeks [A. Sullo, N. Maffulli, G. Capasso, V. Testa, 2001]. According to the authors, initially, peritendinous injections of PGE1 caused acute inflammation in the tendon and surrounding tissues. On day 7, mean water content and mean wet tendon weights were significantly higher in the tendons of the PGE1-treated rats than in the contralateral control tendons (ANOVA scatter analysis; P 5 = 0.02). On day 21, about half of the tendons treated with PGE1 showed paratenon fibrosis with adhesion and intra-tendon (intra-trunk) degeneration, while the other half still showed a pattern of acute inflammation. On day 35, all tendons treated with PGE1 showed paratenon fibrosis with adhesion and intra-tendon degeneration. There was no evidence of pathological changes in tendons untreated by PGE1 at all three stages of material collection. The authors came to the unequivocal opinion that long-term administration of PGE1 caused peri- and intratendinous degeneration, providing a stable model of Achilles tendinopathy.

Однако, несмотря на схожие изменения, возникающие в тканях сухожилия при тендинопатии и в фасции при подошвенной фасциопатии, различия в биомеханике, физических параметрах и структуре сравниваемых анатомических образований делает некорректным изучение патологических изменений и ограничивает возможность изучения эффективности лечения фасциопатии на экспериментальной модели тендинопатии. Это является принципиальным препятствием использования всех вышеперечисленных моделей в изучении подошвенной фасциопатии и служит основанием для разработки экспериментальной модели.However, despite the similar changes occurring in the tendon tissues in tendinopathy and in the fascia in plantar fasciopathy, the differences in biomechanics, physical parameters and structure of the compared anatomical structures makes the study of pathological changes incorrect and limits the possibility of studying the effectiveness of fasciopathy treatment on an experimental model of tendinopathy. This is a fundamental obstacle to the use of all of the above models in the study of plantar fasciopathy and serves as the basis for the development of an experimental model.

Целью изобретения является создание доступной, воспроизводимой модели формирования подошвенной фасциопатии у половозрелых собак.The aim of the invention is to create an accessible, reproducible model of the formation of plantar fasciopathy in mature dogs.

Изобретение направлено на разработку способа моделирования подошвенной фасциопатии с гистологической оценкой полученных изменений, в том числе и в соответствии с полуколичественной шкалой T. Movin и S. Bonar при окраске гематоксилином-эозином. Данная шкала основана на оценке соотношения коллагеновых волокон разных типов, состояния ядер теноцитов, межклеточного пространства, а также на наличии зон мукоидного набухания и количества новообразованных сосудов.The invention is directed to the development of a method for modeling plantar fasciopathy with a histological assessment of the resulting changes, including in accordance with the semi-quantitative scale of T. Movin and S. Bonar when stained with hematoxylin-eosin. This scale is based on the assessment of the ratio of collagen fibers of different types, the state of the nuclei of tenocytes, the intercellular space, as well as the presence of zones of mucoid swelling and the number of newly formed vessels.

Сущностью заявляемого изобретения является то, что моделирование подошвенной фасциопатии проводится путем интра- и параапоневротического введения алпростадила – синтетического аналога естественного простагландина Е1, разведенного до концентрации 5000 нг в 1 мл конечного раствора, с периодичностью 1 раз в 7 дней на протяжении 28 дней. В результате у животных развивается медикаментозная фасциопатия, которая подтверждается гистологически с подсчетом по шкале T. Movin и S. Bonar после взятия биоптатов через 7 дней после последней инъекции (на 35 день от начала эксперимента).The essence of the claimed invention is that the modeling of plantar fasciopathy is carried out by intra- and paraaponeurotic administration of alprostadil, a synthetic analogue of natural prostaglandin E1, diluted to a concentration of 5000 ng in 1 ml of the final solution, with a frequency of 1 every 7 days for 28 days. As a result, the animals develop drug-induced fasciopathy, which is confirmed histologically with a T. Movin and S. Bonar score after taking biopsy samples 7 days after the last injection (35 days from the start of the experiment).

Для технического решения поставленной задачи были использованы беспородные половозрелые собаки, массой 7,7 ± 2,1 кг, возрастом от 10 до 16 месяцев, препарат «Алпростан» (Alprostan®, ZENTIVA k.s. (Чешская Республика), действующее вещество: алпростадил (Alprostadil) в дозировке 5000 нг на каждое введение.For the technical solution of the problem posed, outbred sexually mature dogs were used, weighing 7.7 ± 2.1 kg, aged 10 to 16 months, the drug "Alprostan" (Alprostan®, ZENTIVA ks (Czech Republic), the active ingredient: alprostadil (Alprostadil) at a dosage of 5000 ng for each injection.

Предлагаемый способ моделирования подошвенной фасциопатии у собак осуществляли следующим образом. Препарат «Алпростан» разводили физиологическим раствором до концентрации 5000 нг в 1 мл конечного раствора. Раствор вводили в тазовую конечность на 1 см дистальнее места прикрепления апоневроза к пяточной кости пери- и интраапоневротически один раз в неделю в течение 4 недель. Суммарная доза алпростадила, введенная в апоневроз составила 20000 нг. Для обезболивания использовали только поверхностный наркоз препаратом «Пропофол», вводимый дробно внутривенно.The proposed method for modeling plantar fasciopathy in dogs was carried out as follows. The drug "Alprostan" was diluted with saline to a concentration of 5000 ng in 1 ml of the final solution. The solution was injected into the pelvic limb 1 cm distal to the site of attachment of the aponeurosis to the heel bone peri- and intraaponeurotic once a week for 4 weeks. The total dose of alprostadil injected into the aponeurosis was 20,000 ng. For anesthesia, only superficial anesthesia was used with the drug "Propofol", administered fractionally intravenously.

После первого введения препарата собаки начинали щадить эту лапу, прихрамывать; после последнего – четвертого – практически не наступали на нее. Забор материала для морфологического исследования, с целью подтверждения наличия фасциопатии у экспериментальных животных производился на 35-е сутки от начала эксперимента (через 7 суток после последнего введения препарата) из конечности, куда вводился препарат в стерильных условиях. Размер резецируемого участка апоневроза составлял 2х0,5 см, что не нарушало функционирования сохранившихся тканей (Фиг.1). Рана после забора материала ушивалась наглухо, собаки помещались в стандартные лабораторные условия. В процессе исследования все животные остались живыми, не отмечалось ни одного случая инфекции в области инъекций препарата в подошвенный апоневроз. Эвтаназия после окончания эксперимента либо после вывода животного из эксперимента не производилась.After the first injection of the drug, the dogs began to spare this paw, limp; after the last - the fourth - they practically did not step on it. The sampling of material for morphological study, in order to confirm the presence of fasciopathy in experimental animals was carried out on the 35th day from the beginning of the experiment (7 days after the last injection of the drug) from the limb, where the drug was injected under sterile conditions. The size of the resected area of the aponeurosis was 2x0.5 cm, which did not disrupt the functioning of the preserved tissues (Fig. 1). After taking the material, the wound was sutured tightly, the dogs were placed in standard laboratory conditions. During the study, all the animals remained alive, there was not a single case of infection in the area of injections of the drug into the plantar aponeurosis. Euthanasia after the end of the experiment or after the animal was withdrawn from the experiment was not performed.

После серии инъекций алпростадила подошвенный апоневроз макроскопически выглядел отечным, с диффузными участками размягчения, гиперемии, а также расширенными поверхностными сосудами. При гистологическом исследовании (на 35-е сутки от первого введения алпростадила) у всех животных в апоневрозе была получена картина фасциопатии, заключающаяся в диффузной дегенерации соединительной ткани с небольшим количеством воспалительных клеток, повышенной волнистостью и разделением коллагеновых волокон, неравномерным гофрированием, разной степенью потери ими упорядоченности и параллельной ориентации (Фиг.2). Кроме того, отмечалось снижение общей плотности коллагена в волокнах, уменьшение диаметра, микроразрывы и очаговая потеря структурности самих волокон, приводящие в ряде случаев к их гиалинизации. Изменялся и клеточный состав апоневроза: при общем увеличении васкуляризации и клеточности апоневроза, массово определялись пикнотически измененные ядра фибробластов. Полученные микроскопические данные при оценке по шкале Bonar составили 7,1±1,97 баллов, достигая в отдельных полях зрения 11 баллов. В 95% всех измерений этот показатель варьировался в большинстве полей зрения в пределах 5–9 баллов, что объективизировало патологические изменения. Таким образом, введение алпростандила обеспечивало развитие клинической модели подошвенной фасциопатии, подтвержденной морфологическими изменениями при гистологической верификации дегенеративного процесса, отличающейся репрезентативностью, доступностью, воспроизводимостью, технической простотой, не требующей применения сложного оборудования и длительной анестезии животных.After a series of injections of alprostadil, the plantar aponeurosis looked macroscopically edematous, with diffuse areas of softening, hyperemia, and dilated superficial vessels. Histological examination (on the 35th day from the first injection of alprostadil) in all animals in the aponeurosis showed a picture of fasciopathy, consisting in diffuse degeneration of connective tissue with a small number of inflammatory cells, increased waviness and separation of collagen fibers, uneven corrugation, and varying degrees of loss by them orderliness and parallel orientation (Fig. 2). In addition, there was a decrease in the total density of collagen in the fibers, a decrease in diameter, microbreaks and focal loss of the structure of the fibers themselves, leading in some cases to their hyalinization. The cellular composition of the aponeurosis also changed: with a general increase in vascularization and cellularity of the aponeurosis, pyknotically altered nuclei of fibroblasts were massively determined. The obtained microscopic data when assessed on the Bonar scale were 7.1 ± 1.97 points, reaching 11 points in separate fields of view. In 95% of all measurements, this indicator varied in most fields of vision within 5–9 points, which objectified pathological changes. Thus, the introduction of alprostandil ensured the development of a clinical model of plantar fasciopathy, confirmed by morphological changes during histological verification of the degenerative process, which is representative, affordable, reproducible, technical simplicity, which does not require the use of complex equipment and long-term anesthesia of animals.

Claims

A method for modeling plantar fasciopathy in experimental animals, including the introduction into the plantar aponeurosis of the pelvic limb of dogs of the drug alprostadil, diluted to a concentration of 5000 ng in 1 ml of the final solution, characterized in that the solution of alprostadil is injected intra- and paraaponeurotically 1 cm distal to the place of attachment of the plantar aponeurosis to calcaneus once a week for 4 weeks in a total dose of 20,000 ng.