RU2739113C1

RU2739113C1 - Method for determining activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases in a fibrinogen coagulation test

Info

Publication number: RU2739113C1
Application number: RU2019131354A
Authority: RU
Inventors: Оксана Михайловна Драпкина; Батожаб Батожаргалович Шойбонов; Татьяна Павловна Баронец; Диана Викторовна Григорьева; Ольга Алексеевна Лебедева; Ольга Анатольевна Литинская; Наталья Юрьевна Серебрякова
Priority date: 2019-10-04
Filing date: 2019-10-04
Publication date: 2020-12-21

Abstract

FIELD: clinical immunology; haemostasiology.

SUBSTANCE: invention relates to determining the activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases-1 and 2 (MASP-1,2) in a fibrinogen coagulation test. A method for determining activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases-1 and 2 (MASP-1 and MASP-2) in a fibrinogen coagulation test, involving the use of EDTA plasma as a source of fibrinogen MASP-1 and MASP-2, and as the activator of the lectin pathway of the complement system used is yeast mannan, activation of MASP activation is started by adding 25 mcl of 10 % CaCl₂ diluted (1:31) solution to 25 mcl of the fused EDTA-blood plasma of healthy donors and 50 mcl of tris-imidazole buffer, pH 7.4, then degree of fibrinogen coagulation is determined as difference of change of turbidity of sample at 450 nm after 45 minute incubation at 37 °C, degree of coagulation is evaluated relative to sample, containing human thrombin in place of human blood plasma analyzed, maximum absorption of fibrin clot obtained with thrombin at 450 nm is taken as 100 % coagulation of fibrinogen, wherein coagulation to 25 % is considered low activity of MASP-1 and MASP-2 in fibrinogen coagulation test, from 26 % to 49 % as average activity of MASP-1 and MASP-2 and higher than 50 % as high activity of MASP-1 and MASP-2 in fibrinogen coagulation test.

EFFECT: invention provides extending the range of laboratory screening tests for diagnosing hypercoagulation and thrombosis threat caused by high functional activity of MASP-1,2 in fibrinogen coagulation test.

1 cl, 4 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к клинической иммунологии и гемостазиологии и касается определения активности маннан-связывающий лектин-ассоциированных сериновых протеаз-1 и 2 (МАСП-1,2) в тесте коагуляции фибриногена.The invention relates to clinical immunology and hemostasiology and relates to the determination of the activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases-1 and 2 (MASP-1,2) in the fibrinogen coagulation test.

Система комплемента представляет собой механизм раннего реагирования, служащий для инициации и усиления воспалительной реакции в ответ на микробную инфекцию и другие острые повреждения [1].The complement system is an early response mechanism that initiates and enhances the inflammatory response in response to microbial infection and other acute injuries [1].

Несмотря на то, что активация комплемента обеспечивает весьма эффективную первичную защиту от потенциальных патогенов, активность комплемента, которая вызывает защитную воспалительную реакцию, может также представлять потенциальную угрозу для организма хозяина [2,3]Although complement activation provides a very effective primary defense against potential pathogens, complement activity that elicits a protective inflammatory response may also pose a potential threat to the host organism [2,3]

Например, протеолитические продукты С3 и С5 мобилизуют и активируют полиморфноядерные нейтрофилы. Эти активированные клетки являются неспецифичными при выработке разрушающих ферментов и могут привести к поражению собственных органов. Кроме того, активация комплемента может привести к накоплению цитолитического комплекса, терминальных компонентов комплемента, как на микробных клетках-мишенях, так и на соседних клетках организма хозяина, что приводит к лизису клеток организма хозяина. Система комплемента принимает участие в патогенезе многочисленных острых и хронических заболеваний, включая: инфаркт миокарда, реваскуляризация вследствие нарушения мозгового кровообращения, респираторный дистресс-синдром у взрослых, поражение вследствие реперфузии, септический шок, капиллярное кровотечение вследствие термического ожога, воспаление вследствие кардио-легочного шунтирования, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, прогрессирующая миастения, и болезнь Альцгеймера. Почти во всех перечисленных случаях комплемент не является непосредственной причиной данных заболеваниях, но представляет собой один из серьезных факторов, вовлеченных в патогенез. Тем не менее, активация комплемента может быть главным патологическим механизмом и представлять собой эффективный показатель для клинического контроля при многих указанных выше заболеваниях. Растущее признание важности комплемент-опосредованных поражений тканей при множестве болезней подчеркивает необходимость создания эффективных медикаментов для ингибирования комплемента. В настоящее время не существует официально одобренных для использования человеком медикаментов, которые бы имели специфическую нацеленность и ингибировали бы активацию комплемента. For example, proteolytic products C3 and C5 mobilize and activate polymorphonuclear neutrophils. These activated cells are non-specific for the production of destructive enzymes and can lead to damage to their own organs. In addition, the activation of complement can lead to the accumulation of the cytolytic complex, terminal components of complement, both on microbial target cells and on neighboring cells of the host organism, which leads to the lysis of the host cells. The complement system is involved in the pathogenesis of numerous acute and chronic diseases, including: myocardial infarction, revascularization due to cerebrovascular accident, respiratory distress syndrome in adults, injury due to reperfusion, septic shock, capillary bleeding due to thermal burns, inflammation due to cardiopulmonary bypass grafting, graft rejection, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, progressive myasthenia gravis, and Alzheimer's disease. In almost all of these cases, complement is not the direct cause of these diseases, but is one of the serious factors involved in the pathogenesis. Nevertheless, complement activation may be a major pathological mechanism and an effective indicator for clinical control in many of the above diseases. The growing recognition of the importance of complement-mediated tissue damage in a variety of diseases underscores the need for effective drugs to inhibit complement. Currently, there are no drugs officially approved for human use that would have a specific targeting and would inhibit complement activation.

Известно, что система комплемента может быть активирована тремя различными путями: классическим, лектиновым и альтернативным. Классический путь активации системы комплемента инициируется при связывании антитела с инородной частицей (т.е., антигеном) и, таким образом, требует предварительного воздействия данного антигена для генерации специфического антитела. Поскольку активация классического пути связана с развитием иммунной реакции, классический путь активации является частью приобретенной иммунной системы. В отличие от этого, лектиновый и альтернативный пути не зависят от клонального иммунитета и являются частью врожденной иммунной системы. It is known that the complement system can be activated in three different ways: classical, lectin and alternative. The classic pathway of activation of the complement system is initiated when an antibody binds to a foreign particle (i.e., an antigen) and thus requires prior exposure to that antigen to generate a specific antibody. Since activation of the classical pathway is associated with the development of the immune response, the classical pathway is part of the acquired immune system. In contrast, the lectin and alternative pathways are independent of clonal immunity and are part of the innate immune system.

Первым шагом в активации классического пути является прикрепление специфической молекулы распознавания, C1q, к антигенно-нагруженным элементам IgG и IgM. Результатом активации системы комплемента является последовательная активация зимогенов сериновой протеазы. C1q связан с проферментами сериновой протеазы C1r и C1s в комплексе, известном как компонент C1, при связывании C1q с иммунным комплексом, аутопротеолитическое расщепление участка Arg-Ile субкомпонента C1r сопровождается активацией C1s, которая необходима для расщепления компонентов С4 и С2. Расщепление С4 на два фрагмента, обозначенных соответственно С4а и C4b, позволяет фрагментам C4b сформировать ковалентные связи с примыкающим гидроксильными или амино-группами на поверхности патогена посредством нековалентного взаимодействия с фрагментом C4b компонента С2, расщепления под действием С1sи последующей генерацией конвертазы С3 (C4b2а).The first step in activating the classic pathway is the attachment of a specific recognition molecule, C1q, to antigenically loaded IgG and IgM elements. The result of the activation of the complement system is the sequential activation of serine protease zymogens. C1q is associated with the proenzymes of the serine protease C1r and C1s in a complex known as the C1 component; when C1q binds to the immune complex, autoproteolytic cleavage of the Arg-Ile region of the C1r subcomponent is accompanied by C1s activation, which is necessary for the cleavage of the C4 and C2 components. Cleavage of C4 into two fragments, designated C4a and C4b, respectively, allows C4b fragments to form covalent bonds with adjacent hydroxyl or amino groups on the pathogen surface through non-covalent interaction with the C4b fragment of the C2 component, cleavage by C1s, and subsequent generation of C3 convertase (C4b2a).

С3-конвертаза (C4b2а) активирует компонент С3, который вызывает генерацию С5-конвертазы (C4b2а3b) и формирование мембрано-атакующего комплекса (C5b-9), что может спровоцировать микробный лизис. Активированные формы С3 и С4 (C3b и C4b) ковалентно связываются на чужеродных поверхностях и опсонизируют их для распознавания рецепторами комплемента-1 (CR-1) на фагоцитах. C3-convertase (C4b2a) activates component C3, which causes the generation of C5-convertase (C4b2a3b) and the formation of a membrane-attacking complex (C5b-9), which can provoke microbial lysis. The activated forms C3 and C4 (C3b and C4b) bind covalently on foreign surfaces and opsonize them for recognition by complement receptors-1 (CR-1) on phagocytes.

Первым шагом в активации системы комплемента по лектиновому пути также является прикрепление специфической молекулы распознавания, за которым следует активация ассоциированных сериновых протеаз. Однако более верным, чем прикрепление к иммунным комплексам при помощи C1q, является то, что молекулы распознавания в лектиновом пути активации представляют собой белки, связывающие углеводы (маннан-связывающий лектин (MСЛ), Н-фиколин, М-фиколин, и L- фиколин) [4-6]. Икеда и соавторы первыми продемонстрировали, что подобно молекуле C1q, MСЛ может активировать систему комплемента С4-зависимым путем, прикрепляясь к эритроцитам, покрытыми маннанами дрожжей [7]. MСЛ, член семейства коллектиновых белков, представляет собой кальций-зависимый лектин, который связывает углеводы с гидроксильными группами в 3 и 4 положении, ориентированными в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Главными лигандами для MСЛ являются, таким образом, D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, в то время как для углеводов, не соответствующих подобному стерическому требованию, афинность по отношению к MСЛ не выявлена [8]. Взаимодействие между MСЛ и моновалентными сахарами является чрезвычайно слабым, с типичными константами диссоциации порядка 2 ммоль. MСЛ достигает стойкого специфичного связывания с полисахаридными лигандами в процессе одновременного взаимодействия с множественными остатками моносахаридов [9]. MСЛ распознает углеводные структуры, которые обычно покрывают микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и некоторые вирусы. Однако MСЛ не распознает D-галактозу и сиаловую кислоту, которые обычно покрывают «зрелый» гликоконъюгатный комплекс гликопротеинов, присутствующих в плазме млекопитающих и находящихся на поверхности их клеток. Данная специфичность связывания может помочь в защите от самопроизвольной активации. Однако MBL не образует высокоаффинных связей со скоплениями высокоразветвленныхманнозных предшественников гликанов на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, находящихся в эндоплазмическомретикулуме и звездчатых невроцитах (Гольджи) клеток млекопитающих [10]. Следовательно, поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для лектинового пути активации посредством MBL-связывания. The first step in activating the complement system along the lectin pathway is also the attachment of a specific recognition molecule, followed by the activation of associated serine proteases. However, it is more correct than attachment to immune complexes using C1q that recognition molecules in the lectin activation pathway are carbohydrate-binding proteins (mannan-binding lectin (MSL), N-ficolin, M-ficolin, and L-ficolin ) [4-6]. Ikeda et al. Were the first to demonstrate that, like the C1q molecule, MSL can activate the complement system in a C4-dependent way, attaching to erythrocytes coated with yeast mannans [7]. MSL, a member of the collection protein family, is a calcium-dependent lectin that binds carbohydrates to hydroxyl groups at positions 3 and 4, oriented in the equatorial plane of the pyranose ring. Thus, the main ligands for MSL are D-mannose and N-acetyl-D-glucosamine, while for carbohydrates that do not meet this steric requirement, no affinity for MSL has been revealed [8]. The interaction between MSL and monovalent sugars is extremely weak, with typical dissociation constants of the order of 2 mmol. MSL achieves stable specific binding to polysaccharide ligands in the process of simultaneous interaction with multiple monosaccharide residues [9]. MSL recognizes carbohydrate structures that are commonly coated by microorganisms such as bacteria, yeast, parasites and some viruses. However, MSL does not recognize D-galactose and sialic acid, which usually coat the "mature" glycoconjugate complex of glycoproteins present in mammalian plasma and on the surface of mammalian cells. This binding specificity can help protect against spontaneous activation. However, MBL does not form high-affinity bonds with clusters of highly branched mannose precursors of glycans on N-linked glycoproteins and glycolipids located in the endoplasmic reticulum and stellate neurocytes (Golgi) of mammalian cells [10]. Therefore, damaged cells are potential targets for the lectin pathway of activation through MBL binding.

Фиколины обладают отличным от MBL типом лектинового домена, известным как фибриноген-подобный домен. Фиколины связывают остатки сахара Са²⁺-независимым образом. У людей идентифицировано три типа фиколинов: L-фиколин, М-фиколин и Н-фиколин. Два сывороточных фиколина, L-фиколин и Н-фиколин имеют общность в специфичности к N-ацетил-D-глюкозамину; однако Н-фиколин также связывается с N-ацетил-D-галактозамином. Специфичность по отношению к различным сахарам у L-фиколина, Н-фиколина и MBL означает, что различные лектины могут быть комплементарны различным, хотя и частично перекрывающимся гликоконъюгатам. Данная концепция поддерживается недавним сообщением о том, что среди известных лектинов, принимающих участие в лектиновом пути активации, только L-фиколин специфическим образом связывается с липотейхоевой кислотой, гликоконъюгатом клеточной стенки, обнаруженным во всех грамм-положительных бактериях [11].Ficolins have a different type of lectin domain from MBL, known as a fibrinogen-like domain. Ficolins bind sugar residues in a Ca ²⁺ -independent manner. Three types of ficolins have been identified in humans: L-ficolin, M-ficolin, and N-ficolin. Two serum ficolins, L-ficolin and H-ficolin, share a common specificity for N-acetyl-D-glucosamine; however, N-ficolin also binds to N-acetyl-D-galactosamine. The specificity for different sugars in L-ficolin, H-ficolin and MBL means that different lectins can be complementary to different, although partially overlapping glycoconjugates. This concept is supported by the recent report that among the known lectins involved in the lectin activation pathway, only L-ficolin binds specifically to lipoteichoic acid, a cell wall glycoconjugate found in all gram-positive bacteria [11].

Коллектины, то есть, MBL и фиколины, не имеют значительного сходства в аминокислотной последовательности. Однако эти две группы белков имеют схожие организации доменов и, подобно Clq, собираются в олигомерные структуры, которые максимально увеличивают возможность многосайтового связывания. У здоровых людей концентрация MBL в сыворотке сильно варьирует в популяциях, и он генетически контролируется полиморфизмом или мутациями как в промоторе, так и в кодирующей области гена MBL. Так как белок MBL является белком острой фазы, то его дальнейшая экспрессия регулируется во время воспалительного процесса. L-фиколин присутствует в сыворотке в такой же концентрации, как и MBL. Поэтому, роль L-фиколина в лектиновом пути активации по значимости потенциально сравнима с ролью MBL. MBL и фиколины могут также выступать в роли опсонинов, которые требуют взаимодействия между данными белками и рецепторами фагоцитов [12,13]. Однако идентичность рецептора (ов) на клетках-фагоцитах не была установлена. MBL человека при помощи своего коллагено-подобного домена осуществляет высокоаффинное специфичное взаимодействие с уникальными Clr/Cls-подобными сериновыми протеазами, названными MBL-ассоциированными сериновыми протеазами (MAСП). К настоящему времени описано три типа MAСП. Сначала одиночный фермент «MAСП» был идентифицирован и охарактеризован как фермент, отвечающий за инициацию классического пути активации комплемента (т.е., расщепление С2 и С4) [14]. Позже выяснилось, что MAСП на самом деле представляет собой комбинацию двух протеаз: MAСП-1 и MAСП-2 [15]. Однако было продемонстрировано, что комплекс MBL-MASP-2 сам по себе является достаточным для активации комплемента [16]. Кроме того, только MASP-2 расщеплял С2 и С4 с высокой эффективностью [17]. Поэтому, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активацию С4 и С2 для генерации С3-конвертазы, C4b2а. В этом заключается его значительное отличие от комплекса С1, где скоординированная активность двух специфичных сериновых протеаз (C1r и C1s) приводит к активации системы комплемента. Недавно была выделена третья новая протеаза, MASP-3 [18].Collecins, that is, MBL and ficolins, do not have significant amino acid sequence similarities. However, these two groups of proteins have similar domain organizations and, like Clq, assemble into oligomeric structures that maximize the possibility of multisite binding. In healthy individuals, the serum MBL concentration varies greatly across populations, and is genetically controlled by polymorphisms or mutations in both the promoter and the coding region of the MBL gene. Since the MBL protein is an acute phase protein, its further expression is regulated during the inflammatory process. L-ficolin is present in serum at the same concentration as MBL. Therefore, the role of L-ficolin in the lectin activation pathway is potentially comparable in importance to the role of MBL. MBL and ficolins can also act as opsonins, which require interaction between these proteins and phagocyte receptors [12,13]. However, the identity of the receptor (s) on phagocytic cells has not been established. Human MBL, through its collagen-like domain, carries out high-affinity specific interactions with unique Clr / Cls-like serine proteases called MBL-associated serine proteases (MASPs). To date, three types of MASP have been described. First, a single MASP enzyme was identified and characterized as the enzyme responsible for initiating the classical pathway of complement activation (ie, cleavage of C2 and C4) [14]. Later it was found that MASP is actually a combination of two proteases: MASP-1 and MASP-2 [15]. However, it has been demonstrated that the MBL-MASP-2 complex alone is sufficient for complement activation [16]. Moreover, only MASP-2 cleaved C2 and C4 with high efficiency [17]. Therefore, MASP-2 is a protease responsible for the activation of C4 and C2 to generate the C3 convertase, C4b2a. This is its significant difference from the C1 complex, where the coordinated activity of two specific serine proteases (C1r and C1s) leads to the activation of the complement system. Recently, a third new protease, MASP-3, has been isolated [18].

MASP-1 и MASP-3 представляют собой продукты одного и того же гена, полученные в результате альтернативного сплайсинга. Их биологические функции до сих пор остаются невыясненными. MASPs имеют одинаковую доменную организацию с белками C1r и C1s, ферментными субкомпонентами комплекса С1, классического пути активации системы комплемента [19]. Как в протеазах С1, активация MASP-2 протекает при расщеплении связи Arg-Ile, примыкающей к домену сериновой протеазы, это приводит к расщеплению фермента на связанные дисульфидными связями цепочки А и В, последняя из которых состоит из домена сериновой протеазы. Генетически обусловленная неполноценность MASP-2 была описана в недавних исследованиях [20]. Мутация одного нуклеотида приводит к замене Аsр в домене CUB1, что в свою очередь лишает MASP-2 способности связываться с MBL. MBL также связывается с неферментным белком, обозначаемым как MBL-связанный белок 19 кДА (МАр19) [21] или малым MBL-связанным белком (sMAP) [22]. МАр19 формируется при альтернативном сплайсинге продукта гена MASP-2 и содержит два первых домена MASP-2, за которыми следует дополнительная последовательность четырех уникальных аминокислот. Гены MASP-1 и MASP-2 расположены на хромосомах 3 и 1, соответственно [23]. Ряд данных указывают на то, что существуют различные комплексы MBL-MASPs, a также на то, что значительная часть находящихся в сыворотке MASPs не связана с MBL [24]. Н- и L-фиколин также связываются с MASP и активируют лектиновый путь также, как MBL [25].MASP-1 and MASP-3 are products of the same gene obtained from alternative splicing. Their biological functions are still unclear. MASPs have the same domain organization with the C1r and C1s proteins, the enzymatic subcomponents of the C1 complex, the classical pathway for activating the complement system [19]. As in C1 proteases, MASP-2 activation occurs when the Arg-Ile bond adjacent to the serine protease domain is cleaved, which leads to the cleavage of the enzyme into disulfide-linked A and B chains, the latter of which consists of the serine protease domain. Genetically determined MASP-2 deficiency has been described in recent studies [20]. A single nucleotide mutation results in an Asp substitution in the CUB1 domain, which in turn deprives MASP-2 of its ability to bind to MBL. MBL also binds to a non-enzymatic protein designated as MBL-linked 19 kDa protein (MAp19) [21] or small MBL-linked protein (sMAP) [22]. MAP19 is formed by alternative splicing of the MASP-2 gene product and contains the first two domains of MASP-2, followed by an additional sequence of four unique amino acids. The MASP-1 and MASP-2 genes are located on chromosomes 3 and 1, respectively [23]. A number of data indicate that there are different MBL-MASPs complexes, and that a significant proportion of serum MASPs are not associated with MBL [24]. H- and L-ficolin also bind to MASP and activate the lectin pathway in the same way as MBL [25].

Оба - лектиновый и классический, - пути активации комплемента формируют общую С3-конвертазу (C4b2а) и оба пути активации сходятся в этом пункте. Считается, что лектиновому пути активации комплемента принадлежит ведущая роль в иммунной защите организма против инфекции. Доказательства вовлеченности MBL в иммунную реакцию были получены в результате наблюдений за субъектами, имеющими пониженный уровень функционального MBL в сыворотке [26]. Такие субъекты демонстрируют восприимчивость к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям. Данные симптомы обычно проявляются в раннем возрасте, во время определенного промежутка времени, когда титр производных от материнских антител снижается, а собственные антитела еще не вырабатываются в полном объеме. Данный синдром часто является следствием мутаций некоторых сайтов в коллагеновой части MBL, которая препятствует непосредственному образованию олигомеров MBL. MBL способен функционировать в качестве независимого от комплемента опсонина, остается невыясненным, до какого предела повышенная восприимчивость к инфекции обусловлена нарушениями в активации комплемента. Несмотря на исчерпывающие доказательства участия всех путей активации классического и альтернативных - в патогенезе неинфекционных человеческих заболеваний, роль лектинового пути активации только начинают оценивать. Недавние исследования показали, что активация лектинового пути может провоцировать активацию комплемента и воспаление, связанное с реперфузионным повреждением после ишемии. Коллард и соавт. (2000) показали, что культивируемые эндотелиальные клетки, подвергнутые окислительному стрессу, связываются с MBL и демонстрируют отложение С3b в присутствии человеческой сыворотки [27]. Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими анти-MBL моноклональными антителами ингибирует связывание MBL и активацию комплемента. Данные открытия были проверены опытным путем на лабораторных крысах с ишемией-реперфузией миокарда, в процессе чего у крыс, подвергшихся лечению с использованием блокирующих крысиных моноклональных антител к MBL, наблюдали значительно меньше случаев поражения миокарда вследствие закупорки коронарной артерии, чем у крыс, подвергнутых лечению контрольными антителами [28]. Both - lectin and classical - complement activation pathways form a common C3-convertase (C4b2a) and both pathways converge at this point. It is believed that the lectin pathway of complement activation plays a leading role in the body's immune defense against infection. Evidence for the involvement of MBL in the immune response came from observation of subjects with decreased levels of functional MBL in serum [26]. Such subjects exhibit susceptibility to recurrent bacterial and fungal infections. These symptoms usually appear at an early age, during a certain period of time, when the titer of derivatives from maternal antibodies decreases, and their own antibodies are not yet fully produced. This syndrome is often the result of mutations at certain sites in the collagen portion of the MBL, which prevents the direct formation of MBL oligomers. MBL is able to function as a complement-independent opsonin, it remains unclear to what extent the increased susceptibility to infection is due to impaired complement activation. Despite extensive evidence of the participation of all activation pathways of the classical and alternative - in the pathogenesis of non-infectious human diseases, the role of the lectin activation pathway is only beginning to be assessed. Recent research has shown that activation of the lectin pathway can trigger complement activation and inflammation associated with reperfusion injury after ischemia. Collard et al. (2000) showed that cultured endothelial cells exposed to oxidative stress bind to MBL and exhibit C3b deposition in the presence of human serum [27]. In addition, treatment of human serum with anti-MBL blocking monoclonal antibodies inhibits MBL binding and complement activation. These findings were tested empirically in laboratory rats with myocardial ischemia-reperfusion, during which rats treated with blocking rat monoclonal antibodies to MBL showed significantly fewer cases of myocardial damage due to occlusion of the coronary artery than in rats treated with control antibodies [28].

Все три пути активации (т.е., классический, лектиновый и альтернативный) сходятся на компоненте С5, который расщепляется на С5а и С5b. С5а является самым сильным анафилатоксином, индуцирующим изменения как в гладкой мускулатуре и сосудистом тонусе, так и в проницаемости сосудов. Он также представляет собой эффективный хемотаксин и активатор как нейтрофилов, так и моноцитов. С5а-опосредованная клеточная активация может значительным образом усиливать воспалительные реакции путем индуцирования секреции дополнительных воспалительных медиаторов, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и активные формы кислорода. Расщепленный С5b приводит к формированию C5b-9, также известного как мембрано-атакующий комплекс (MAК). В настоящее время имеются веские доказательства того, что сублитическое отложение MAК может играть важную роль в воспалительном процессе в дополнение к роли литического, поро-формирующего комплекса при активации системы комплемента.All three activation pathways (i.e., classical, lectin, and alternative) converge on the C5 component, which is cleaved into C5a and C5b. C5a is the most potent anaphylatoxin, inducing changes in both smooth muscle and vascular tone and vascular permeability. It is also an effective chemotaxin and activator of both neutrophils and monocytes. C5a-mediated cellular activation can significantly enhance inflammatory responses by inducing the secretion of additional inflammatory mediators, including cytokines, hydrolytic enzymes, arachidonic acid metabolites, and reactive oxygen species. The cleaved C5b results in the formation of C5b-9, also known as the membrane attack complex (MAC). There is now strong evidence that sublimate deposition of MAK may play an important role in the inflammatory process in addition to the role of the lytic, pore-forming complex in the activation of the complement system.

В дополнение к клеточным и сосудистым эффектам вышеописанного активированного компонента комплемента, который может объяснить связь между травмой и ДВС, появляются новые данные, которые подтверждают прямые молекулярные взаимодействия между системами комплемента и коагуляции. Экспериментальные данные были получены при исследованиях на мышах нокаутных по компоненту С3 комплемента. Поскольку С3 является общим компонентом для всех трех путей активации комплемента, у мышей с дефицитом компонента С3 нарушена функция комплемента. Однако мыши с С3-дефицитом могут превосходно активировать терминальные компоненты комплемента [29]. Детальные исследования выявили, что С3-независимая активация терминальных компонентов комплемента опосредована тромбином, ключевым ферментом коагуляционного каскада [30]. Молекулярные компоненты, опосредующие активацию тромбина после начальной активации комплемента, остались пока невыясненными. Авторы показали молекулярную основу связи между комплементом и коагуляционными каскадами и идентифицировали MASP-2 в качестве центральной молекулы, связывающей две системы. Биохимические исследования о субстратной специфичности MASP-2 идентифицировали протромбин в качестве возможного субстрата в дополнение к широко известным белкам комплемента С2 и С4. MASP-2 специфически расщепляет протромбин, генерируя тромбин, ключевой фермент, регулирующий скорость коагуляционного каскада плазмы крови [31]. Тромбин, генерированный MASP-2, стимулировал отложение фибрина в условиях in vitro, демонстрируя специфичность расщепления протромбина MASP-2 [32]. Авторы подтвердили физиологическую значимость данного открытия in vivo посредством определения активации тромбина в нормальной сыворотке грызунов после активации лектинового пути, а также продемонстрировали, что данный процесс блокируется нейтрализующими MASP-2 моноклональными антителами. MASP-2 может представлять центральную точку разветвления в лектиновом пути, способную стимулировать активацию как системы комплемента, так и коагуляцию плазмы. Поскольку активация лектинового пути представляет собой физиологическую реакцию на многие виды травматических повреждений, авторы полагают, что сопутствующее системное воспаление (опосредованное компонентами комплемента) и диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) (опосредованное через коагуляционный путь) можно объяснить способностью MASP-2 активировать оба пути. Данный факт подтверждает роль MASP-2 в развитии ДВС синдрома и терапевтическую целесообразность ингибирования MASP-2 при лечении или предупреждении ДВС синдрома. MASP-2 может обеспечить молекулярную связь между комплементом и коагуляционной системой, и активация лектинового пути, возникающая при разных травмах, может непосредственно инициировать активацию коагуляционной системы через ось «MASP-2-тромбин», обеспечивая механизм связи между травмой и ДВС. In addition to the cellular and vascular effects of the above-described activated complement component, which may explain the link between trauma and DIC, new data are emerging that support direct molecular interactions between the complement and coagulation systems. Experimental data were obtained in studies on mice knockout for the C3 complement component. Since C3 is a common component for all three pathways of complement activation, complement function is impaired in C3-deficient mice. However, C3-deficient mice can excellently activate terminal complement components [29]. Detailed studies have revealed that C3-independent activation of terminal complement components is mediated by thrombin, a key enzyme of the coagulation cascade [30]. Molecular components mediating thrombin activation after initial complement activation remain unclear. The authors showed the molecular basis of the link between complement and coagulation cascades and identified MASP-2 as the central molecule linking the two systems. Biochemical studies on the substrate specificity of MASP-2 have identified prothrombin as a possible substrate in addition to the well-known C2 and C4 complement proteins. MASP-2 specifically cleaves prothrombin, generating thrombin, a key enzyme that regulates the rate of the blood plasma coagulation cascade [31]. The thrombin generated by MASP-2 stimulated the deposition of fibrin in vitro, demonstrating the specificity of prothrombin cleavage by MASP-2 [32]. The authors confirmed the physiological significance of this discovery in vivo by determining the activation of thrombin in normal rodent serum after activation of the lectin pathway, and also demonstrated that this process is blocked by neutralizing MASP-2 monoclonal antibodies. MASP-2 may represent a central branch point in the lectin pathway, capable of stimulating both the activation of the complement system and plasma coagulation. Since the activation of the lectin pathway is a physiological response to many types of traumatic injury, the authors believe that concomitant systemic inflammation (mediated by complement components) and disseminated intravascular coagulation (DIC) (mediated through the coagulation pathway) can be explained by the ability of MASP-2 to activate both pathways. This fact confirms the role of MASP-2 in the development of DIC syndrome and the therapeutic feasibility of inhibiting MASP-2 in the treatment or prevention of DIC syndrome. MASP-2 can provide a molecular link between complement and the coagulation system, and activation of the lectin pathway that occurs in different injuries can directly initiate the activation of the coagulation system through the MASP-2-thrombin axis, providing a mechanism of communication between trauma and DIC.

МАСП-1 похожа с тромбином в том, что она расщепляет фактор XIII, фибриноген и тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (ТАИФ), в то время как МАСП-2 расщепляет только протромбин [33-35]MASP-1 is similar to thrombin in that it cleaves factor XIII, fibrinogen and thrombin-activated fibrinolysis inhibitor (TAIF), while MASP-2 only cleaves prothrombin [33-35]

Гулла и соавт. (2010) показали, что MСЛ-MAСП и L-фиколин-МАСП комплексы активируют коагуляционную систему при связывании к их соответствующими лигандами с образованием фибринового сгустка. Образовавшийся фибриновый сгусток фиксирует микробы и ингибирует их распространение [36].Gulla et al. (2010) showed that MSL-MASP and L-ficolin-MASP complexes activate the coagulation system upon binding to their respective ligands with the formation of a fibrin clot. The formed fibrin clot fixes microbes and inhibits their spread [36].

Также как тромбин, МАСП-1 способен активировать протеазо-активируемый рецептор 4, который является медиатором тромбоцитарной активации и воспаления [37]. МАСП-3 расщепляет инсулино-подобный ростовой фактор-связывающий белок 5 (ИПРФСБ-5), который связывает к инсулино-подобному фактору роста (ИПФР) и модулирует его действие на клеточную пролиферацию, дифференциацию, выживание [38]. ИПРФСБ-5 также регулирует эти клеточные события через ИПФР-независимые механизмы. Недавно было показано, что дефицит МАСП-3 у человека обусловлен мутацией гена МАСП-1 и связан с нарушениями эмбрионального развития, одним из синдромов которого является лицевая расщелина - «волчья пасть». Данный факт предполагает, что МАСП-3 выполняет критическую роль в эмбриональном развитии плода [39].Like thrombin, MASP-1 is capable of activating protease-activated receptor 4, which mediates platelet activation and inflammation [37]. MASP-3 cleaves insulin-like growth factor-binding protein 5 (IPRPSB-5), which binds to insulin-like growth factor (IPGF) and modulates its effect on cell proliferation, differentiation, and survival [38]. IPRFSB-5 also regulates these cellular events through IPFR-independent mechanisms. Recently, it was shown that the deficiency of MASP-3 in humans is due to a mutation of the MASP-1 gene and is associated with disorders of embryonic development, one of the syndromes of which is the cleft palate. This fact suggests that MASP-3 plays a critical role in the embryonic development of the fetus [39].

Таким образом, в настоящее время не существует доступных тест-систем определения функциональной активности МАСП в тесте коагуляции фибриногена для рутинных исследований. Thus, at present there are no available test systems for determining the functional activity of MASP in the fibrinogen coagulation test for routine studies.

Из уровня техники известен способ определения активности МСЛ-ассоциированных сериновых протеаз-2 (MAСП-2) по коагуляции фибриногена. Для этого предварительно 96-ти луночные иммунологические планшеты сорбируют маннаном в течение 18 часов при 4°С, отмывают активирующим буфером. Параллельно в другой 96-ти луночной планшете собирают тестовую систему, включающую крысиные рекомбинантные маннан-связывающий лектин (рМСЛ) и рекомбинантный МАСП-2 (рМАСП-2), инкубируют их в течение 1 часа при 4°С и переносят в первую планшету с иммобилизованным маннаном. Повторно инкубируют собранную систему из двух очищенных белков в течение ночи при 4°С для того, чтобы комплексы рМСЛ/рМАСП-2 связались с маннаном. На следующий день после отмывки добавляют очищенные из плазмы протромбин и фибриноген в соответствующих количествах. Далее пробы инкубируют при 37°С и фотометрируют при длине волны 405 нм для определения полимеризации фибрина. За 100% коагуляцию фибриногена при данной концентрации принимают максимальную абсорбцию фибринового сгустка, которая была получена при инкубации фибриногена с активным человеческим тромбином [32].A method for determining the activity of MSL-associated serine proteases-2 (MASP-2) by coagulation of fibrinogen is known from the prior art. For this, 96-well immunological plates are preliminarily sorbed with mannan for 18 hours at 4 ° C, washed with an activating buffer. In parallel, in another 96-well plate, a test system is collected, including rat recombinant mannan-binding lectin (rMSL) and recombinant MASP-2 (rMASP-2), incubated for 1 hour at 4 ° C and transferred to the first plate with immobilized mannan. Re-incubate the assembled system of two purified proteins overnight at 4 ° C in order for the pMSL / pMASP-2 complexes to bind to mannan. The next day after washing, plasma-purified prothrombin and fibrinogen are added in appropriate amounts. Next, the samples are incubated at 37 ° C and photometric at a wavelength of 405 nm to determine the fibrin polymerization. The maximum absorption of the fibrin clot, which was obtained during incubation of fibrinogen with active human thrombin, is taken as 100% coagulation of fibrinogen at a given concentration [32].

Недостатком известного способа определения активности МАСП-2 в тесте коагуляции фибриногена с одной стороны является использование очищенных белков из плазмы крови человека (протромбина и фибриногена) и рекомбинантных белков (рМСЛ и рМАСП-2), что делает тест не доступным для рутинных исследований. The disadvantage of the known method for determining the activity of MASP-2 in the fibrinogen coagulation test, on the one hand, is the use of purified proteins from human blood plasma (prothrombin and fibrinogen) and recombinant proteins (pMSL and rMASP-2), which makes the test unavailable for routine research.

Задачей настоящего изобретения является создание скриниг-теста для определения активности маннан-связывающий лектин-ассоциированных сериновых протеаз в тесте коагуляции фибриногена для диагностики гиперкоагуляции и угрозы тромбоза, обусловленных высокой функциональной активностью лектинового пути системы комплемента.The object of the present invention is to provide a screening test for determining the activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases in a fibrinogen coagulation test for the diagnosis of hypercoagulation and threat of thrombosis due to the high functional activity of the lectin pathway of the complement system.

Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала лабораторных скрининг-тестов для диагностики гиперкоагуляции и угрозы тромбоза, обусловленных высокой функциональной активностью МАСП-1,2 в тесте коагуляции фибриногена.The technical result of the proposed method is to expand the arsenal of laboratory screening tests for the diagnosis of hypercoagulation and the threat of thrombosis, due to the high functional activity of MASP-1,2 in the fibrinogen coagulation test.

Указанный результат достигается тем, что определение функциональной активности МАСП в тесте коагуляции фибриногена проводят с использованием ЭДТА-плазмы в качестве источника фибриногена и МАСП-1,2, а в качестве активатора лектинового пути системы комплемента используют дрожжевой маннан. Реакцию активации МАСП запускают добавлением оптимальной концентрации кальция. Степень коагуляции фибриногена определяют как разность изменения мутности пробы при 450 нм после 45 минутной инкубации при 37°С. Степень коагуляции оценивают относительно пробы, содержащей человеческий тромбин вместо исследуемой плазмы крови человека. Максимальную абсорбцию фибринового сгустка, полученного с тромбином, при 450 нм принимают за 100% коагуляцию фибриногена. Коагуляция до 25% считают низкой активностью МАСП-1/2 в тесте коагуляции фибриногена, от 26% до 49% - средняя активность МАСП-1/2 и выше 50% - как высокую активность МАСП-1/2 в тесте коагуляции фибриногена.This result is achieved by the fact that the determination of the functional activity of MASP in the fibrinogen coagulation test is carried out using EDTA plasma as a source of fibrinogen and MASP-1,2, and yeast mannan is used as an activator of the lectin pathway of the complement system. The MASP activation reaction is started by adding the optimal calcium concentration. The degree of fibrinogen coagulation is defined as the difference in the change in the turbidity of the sample at 450 nm after 45 minutes of incubation at 37 ° C. The degree of coagulation is assessed relative to a sample containing human thrombin instead of the tested human blood plasma. The maximum absorption of the fibrin clot obtained with thrombin at 450 nm is taken as 100% fibrinogen coagulation. Coagulation up to 25% is considered low activity of MASP-1/2 in the fibrinogen coagulation test, from 26% to 49% - the average activity of MASP-1/2 and above 50% - as high activity of MASP-1/2 in the fibrinogen coagulation test.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови в вакутейнер, содержащий ЭДТА, готовят тромбоцит обедненную плазму. Проведение теста коагуляции фибриногена с использованием ЭДТА-плазмы, маннана в качестве активатора лектинового пути системы комплемента, и СaCl₂ для рекальцификации ЭДТА-плазмы. Время проведения теста составляет 60 мин. The method is carried out as follows. Blood is taken into a vacutainer containing EDTA, platelet-depleted plasma is prepared. Conducting a fibrinogen coagulation test using EDTA plasma, mannan as an activator of the lectin pathway of the complement system, and CaCl ₂ for the recalcification of EDTA plasma. The test time is 60 minutes.

Определение оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска коагуляции ЭДТА-плазмы. С этой целью предварительно в 96-ти луночных плоскодонных планшетах 25 мкл 10% раствор хлорида кальция был прогрессивно раститрован начиная со второй лунки по восьмую лунку. После добавляют по 50 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и 25 мкл пулированной ЭДТА-плазмы относительно здоровых доноров. Тщательно перемешивают и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для ИФА анализа (0 мин), далее ставят на 60-минутную инкубацию при 37°С. Измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят каждые 10 мин инкубации (10, 20, и 30 мин). Полученные данные представлены в таблице 1. Determination of the optimal concentration of calcium chloride to trigger EDTA plasma coagulation. For this purpose, a 10% calcium chloride solution was progressively titrated from the second well to the eighth well in 96-well flat-bottomed plates with 25 μl. Then add 50 μl of tris-imidazole buffer, pH 7.4 and 25 μl of pooled EDTA plasma relative to healthy donors. Mix thoroughly and measure the absorbance in samples at 450 nm on a photometer for ELISA analysis (0 min), then put on a 60-minute incubation at 37 ° C. Measurement of the absorption of samples to control coagulation is carried out every 10 minutes of incubation (10, 20, and 30 minutes). The data obtained are presented in table 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, максимальная коагуляция ЭДТА-плазмы наблюдается при добавлении 25 мкл 10% раствора CaCl₂, разведенного (1:31), к 25 мкл пулированной ЭДТА-плазмы крови здоровых доноров и 50 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4.As can be seen from the data presented in Table 1, the maximum coagulation of EDTA plasma is observed when 25 μl of 10% CaCl ₂ solution diluted (1:31) is added to 25 μl of pooled EDTA plasma from healthy donors and 50 μl of tris-imidazole buffer , pH 7.4.

Таблица 1Table 1

Влияние концентрации 0,25 М раствора хлорида кальция на коагуляцию 25% пулированной ЭДТА-плазмы доноровEffect of 0.25 M calcium chloride solution concentration on coagulation of 25% pooled EDTA plasma of donors

10% СаСl₂, мкл в 100 мкл 25% ЭДТА-плазмы10% CaCl ₂ , μl in 100 μl 25% EDTA plasma 2525 12,512.5 6,256.25 3,1253.125 1,561.56 0,780.78 0,390.39 0,1950.195 А₄₅₀ A ₄₅₀ 0 мин0 minutes 0,1050.105 0,1070.107 0,1010.101 0,1030.103 0,1000.100 0,1000.100 0,1020.102 0,1030.103 10 мин10 min 0,1160.116 0,1150.115 0,1030.103 0,1030.103 0,1010.101 0,1010.101 0,1020.102 0,1040.104 20 мин20 minutes 0,120.12 0,1190.119 0,1010.101 0,1020.102 0,1010.101 0,1870.187 0,1010.101 0,1030.103 30 мин30 minutes 0,1250.125 0,1220.122 0,1050.105 0,1020.102 0,3820.382 0,3830.383 0,1000.100 0,1030.103

Определение коагуляции ЭДТА-плазмы при рекальцификации. К 25 мкл ЭДТА-плазмы добавляли 50 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и 25 мкл 10% раствора СаCl₂, разведенного (1:31). Пробы тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность проб при длине волны 450 нм (0 мин). Затем пробы инкубировали в течение 45 и 60 мин при 37°С. В качестве контроля 100% коагуляции ЭДТА-плазмы использовали пробы с тромбином (к 25 мкл ЭДТА-плазмы добавляли 65 мкл трис-имидазолового буфера и 10 мкл тромбина с активностью 10 NIH). Полученные результаты представлены в таблице 2. Determination of EDTA plasma coagulation during recalcification. To 25 μl of EDTA plasma, 50 μl of Tris-imidazole buffer, pH 7.4 and 25 μl of 10% CaCl ₂ solution diluted (1:31) were added. The samples were thoroughly mixed and the optical density of the samples was measured at a wavelength of 450 nm (0 min). Then the samples were incubated for 45 and 60 min at 37 ° C. Samples with thrombin were used as a control for 100% EDTA plasma coagulation (65 μl of tris-imidazole buffer and 10 μl of thrombin with 10 NIH activity were added to 25 μl of EDTA plasma). The results are shown in Table 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в ЭДТА-плазмах при рекальцификации и последующей 60-ти минутной инкубации коагулируют фибриноген от 0 до 54,7%. При рекальцификации цитратных плазм в отличие от ЭДТА-плазмы и инкубации в течение 30 мин наблюдается коагуляция 100% фибриногена. Отсутствие коагуляции в некоторых ЭДТА-плазмах при рекальцификации, возможно, связано с ингибированием протромбиназного комплекса, вследствии чего не образуется активный тромбин и не коагулирует фибриноген. В 9 пробах ЭДТА-плазмы при рекальцификации наблюдается коагуляция от 14,4 до 54,7%. В остальных же 15 пробах ЭДТА-плазмы коагуляция фибриногена либо полностью отсутствует, либо не превышает 10% от фибриногена в этих пробах. As can be seen from the data presented in Table 2, in EDTA-plasmas during recalcification and subsequent 60-minute incubation fibrinogen is coagulated from 0 to 54.7%. During recalcification of citrated plasmas, in contrast to EDTA plasma and incubation for 30 minutes, coagulation of 100% fibrinogen is observed. The lack of coagulation in some EDTA plasmas during recalcification is possibly associated with inhibition of the prothrombinase complex, as a result of which active thrombin is not formed and does not coagulate fibrinogen. In 9 samples of EDTA-plasma during recalcification, coagulation from 14.4 to 54.7% is observed. In the remaining 15 EDTA plasma samples, fibrinogen coagulation is either completely absent or does not exceed 10% of fibrinogen in these samples.

Таким образом, 45 минутная инкубация нами выбрана как оптимальная для определения активности мананан-связывающий лектин-ассоциированных сериновых протеаз (МАСП) в тесте коагуляции фибриногена, а в качестве специфического активатора лектинового пути системы комплемента нами использован маннан из Saccharomyces cerevisiae (Sigma).Thus, we chose 45 min incubation as optimal for determining the activity of mananan-binding lectin-associated serine proteases (MASP) in the fibrinogen coagulation test, and we used mannan from Saccharomyces cerevisiae (Sigma) as a specific activator of the lectin pathway of the complement system.

Таблица 2table 2

Влияние рекальцификации ЭДТА-плазмы на коагуляцию фибриногенаEffect of EDTA Plasma Recalcification on Fibrinogen Coagulation

№ пробыSample No. 0 мин А₄₅₀ 0 min A ₄₅₀ 45 мин А₄₅₀ 45 min A ₄₅₀ 60 мин А₄₅₀ 60 min A ₄₅₀ ΔА₄₅₀(60 мин)ΔA ₄₅₀ (60 min) % коагуляции (60 мин)% coagulation (60 min) ΔА₄₅₀тромбин/ (100% коагуляции)ΔA ₄₅₀ thrombin / (100% coagulation) 1one 0,1220.122 0,1240.124 0,1250.125 0,0030.003 0,60.6 0,5370.537 22 0,1070.107 0,110.11 0,2220.222 0,1150.115 39,039.0 0,2950.295 33 0,1670.167 0,2160.216 0,3470.347 0,180.18 50,350.3 0,3580.358 44 0,1320.132 0,1330.133 0,140.14 0,0080.008 1,71.7 0,470.47 55 0,0990.099 0,1070.107 0,2360.236 0,1370.137 43,843.8 0,3130.313 66 0,1060.106 0,1060.106 0,3260.326 0,220.22 44,944.9 0,490.49 77 0,1060.106 0,1080.108 0,1230.123 0,0170.017 3,63.6 0,4770.477 88 0,0960.096 0,0970.097 0,0970.097 0,0010.001 0,20.2 0,4060.406 9nine 0,1360.136 0,1380.138 0,1660.166 0,030.03 8,28.2 0,3680.368 10 ten 0,1130.113 0,1160.116 0,1370.137 0,0240.024 4,84.8 0,5000.500 11 eleven 0,0990.099 0,1010.101 0,1780.178 0,0790.079 14,414.4 0,5480.548 12 12 0,1130.113 0,1150.115 0,160.16 0,0470.047 9,99.9 0,4760.476 1313 0,1360.136 0,1330.133 0,1370.137 0,0010.001 0,20.2 0,4960.496 1414 0,1110.111 0,1140.114 0,2850.285 0,1740.174 43,843.8 0,3970.397 1515 0,0870.087 0,0880.088 0,1030.103 0,0160.016 3,03.0 0,5270.527 1616 0,1020.102 0,1030.103 0,1050.105 0,0030.003 0,60.6 0,4740.474 17 17 0,0990.099 0,1010.101 0,1020.102 0,0030.003 0,80.8 0,3820.382 18eighteen 0,1130.113 0,1660.166 0,3150.315 0,2020.202 38,338.3 0,5280.528 1919 0,1040.104 0,1010.101 0,1010.101 -0,003-0.003 00 0,4940.494 20twenty 0,0970.097 0,0980.098 0,0970.097 00 00 0,520.52 2121 0,1110.111 0,1120.112 0,1120.112 0,0010.001 0,20.2 0,4540.454 2222 0,0940.094 0,3170.317 0,3370.337 0,2430.243 54,754,7 0,4440.444 2323 0,1010.101 0,1020.102 0,3110.311 0,210.21 45,945.9 0,4580.458 2424 0,1110.111 0,1090.109 0,110.11 -0,001-0.001 00 0,6540.654

Пример осуществления изобретения.An example of implementation of the invention.

Пример 1.Example 1.

Определения активности маннан-связывающий лектин-ассоциированных сериновых протеаз в тесте коагуляции фибриногена.Determination of the activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases in the fibrinogen coagulation test.

К 25 мкл ЭДТА-плазмы добавляли 40 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и 10 мкл препарата маннана из Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich) с концентрацией 10 мг/мл. Реакцию активации лектинового пути системы комплемента запускали добавлением 25 мкл 10% раствора СаCl₂, разведенного (1:31). Пробы тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность проб при длине волны 450 нм (0 мин). Затем пробы инкубировали в течение 45 при 37°С. В качестве контроля на остаточную коагуляцию использовали пробы ЭДТА-плазмы без маннана, контроль на полную коагуляцию фибриногена в ЭДТА-плазме представлял собой пробы с избытком тромбина c активностью 10 NIH в пробе (25 мкл ЭДТА-плазмы, 65 мкл трис-имидазолового буфера и 10 мкл тромбина). Полученные результаты представлены в таблице 3.To 25 μl of EDTA plasma, 40 μl of tris-imidazole buffer, pH 7.4 and 10 μl of mannan preparation from Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich) with a concentration of 10 mg / ml were added. The reaction of activation of the lectin pathway of the complement system was started by adding 25 μl of 10% CaCl ₂ solution diluted (1:31). The samples were thoroughly mixed and the optical density of the samples was measured at a wavelength of 450 nm (0 min). Then the samples were incubated for 45 at 37 ° C. As a control for residual coagulation, EDTA plasma samples without mannan were used, the control for complete coagulation of fibrinogen in EDTA plasma consisted of samples with an excess of thrombin with an activity of 10 NIH in the sample (25 μl EDTA plasma, 65 μl tris-imidazole buffer and 10 μL of thrombin). The results are shown in Table 3.

Таблица 3Table 3

Активность МАСП в тесте коагуляции фибриногенаMASP activity in fibrinogen coagulation test

№ пробыSample No. Контр ΔА₄₅₀ Control ΔA ₄₅₀ Опыт ΔА₄₅₀ Experiment ΔA ₄₅₀ Контр % коагулControl% coagulum Опыт % коагулExperience% coagulum Активность МАСП в % относит. коагуляции тромбиномMASP activity in% rel. thrombin coagulation ΔА₄₅₀(тромбин) 100% коагуляцияΔA ₄₅₀ (thrombin) 100% coagulation 1one 0,0020.002 0,0070.007 0,40,4 1,31.3 0,90.9 0,5370.537 22 0,0030.003 0,1020.102 1,01.0 34,634.6 33,633.6 0,2950.295 33 0,0490.049 0,10.1 13,713,7 27,927.9 14,214.2 0,3580.358 44 0,0010.001 0,0060.006 0,20.2 1,31.3 1,11.1 0,470.47 55 0,0080.008 0,1040.104 2,62.6 33,233.2 30,630.6 0,3130.313 66 00 0,0030.003 00 0,60.6 0,60.6 0,490.49 77 0,0020.002 0,1180.118 0,40,4 24,724.7 24,324.3 0,4770.477 88 0,0010.001 0,0610.061 0,20.2 15,015.0 14,814.8 0,4060.406 9nine 0,0020.002 0,0050.005 0,50.5 1,41.4 0,90.9 0,3680.368 10 ten 0,0030.003 -0,001-0.001 00 00 00 0,5000.500 11 eleven 0,0020.002 0,0010.001 0,40,4 0,20.2 00 0,5480.548 12 12 0,0020.002 0,0030.003 0,40,4 0,60.6 0,20.2 0,4760.476 1313 -0,003-0.003 0,010.01 00 2,02.0 2,02.0 0,4960.496 1414 0,0030.003 0,030.03 0,80.8 0,80.8 00 0,3970.397 1515 0,0010.001 0,0170.017 0,20.2 3,23.2 33 0,5270.527 1616 0,0010.001 0,0640.064 0,20.2 13,513.5 13,313.3 0,4740.474 17 17 0,0020.002 0,0030.003 0,50.5 0,80.8 0,30.3 0,3820.382 18eighteen 0,0530.053 0,1080.108 10,010.0 20,520.5 10,510.5 0,5280.528 1919 -0,003-0.003 00 00 00 00 0,4940.494 20twenty 0,0010.001 0,0050.005 0,20.2 1,01.0 0,80.8 0,520.52

2121 0,0010.001 0,0020.002 0,20.2 0,40,4 0,20.2 0,4540.454 2222 0,2230.223 0,2590.259 50,250.2 58,358.3 8,18.1 0,4440.444 2323 0,0010.001 -0,001-0.001 0,20.2 00 00 0,4580.458 2424 0,0230.023 0,3890.389 4,84.8 81,681.6 76,876.8 0,4770.477

Как видно из данных, представленных в таблице 3, рекальцификация ЭДТА-плазмы в присутствии 1 мг/мл препарата маннана вызывает активацию лектинового пути системы комплемента, который приводит к большей степени коагуляции фибриногена при инкубации в течение 45 мин по сравнению с контрольной пробой (без маннана). Как было показано выше, инкубация проб в течение 45 мин не вызывает существенной коагуляции ЭДТА-плазмы при рекальцификации (фоновая коагуляция контрольной пробы). Только в двух контрольных пробах (без маннана) (пробы №3 и 22) фибриноген коагулировал более 10%. As can be seen from the data presented in Table 3, the recalcification of EDTA-plasma in the presence of 1 mg / ml of mannan preparation causes activation of the lectin pathway of the complement system, which leads to a greater degree of fibrinogen coagulation upon incubation for 45 min compared to the control sample (without mannan ). As shown above, incubation of samples for 45 min does not cause significant coagulation of EDTA plasma during recalcification (background coagulation of the control sample). Only in two control samples (without mannan) (samples No. 3 and 22) fibrinogen coagulated more than 10%.

Таким образом, при рекальцификации ЭДТА-плазмы в присутствии маннана, активируется лектиновый путь системы комплемента, который вызывает коагуляции фибриногена.Thus, upon recalcification of EDTA plasma in the presence of mannan, the lectin pathway of the complement system is activated, which induces coagulation of fibrinogen.

Пример 2.Example 2.

Сравнительные исследования активности лектинового пути системы комплемента методами иммуноферментного анализа, теста коагуляции фибриногена и содержание С-реактивного белка (высокочувствительный иммуноферментный анализ). Comparative studies of the activity of the lectin pathway of the complement system by enzyme immunoassay, fibrinogen coagulation test and the content of C-reactive protein (highly sensitive enzyme immunoassay).

Проведены сравнительные исследования функциональной активности лектинового пути системы комплемента предлагаемым методом и методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора «EuroDiagnostica» (Швеция). Тест определения функциональной активности лектинового пути комплемента проводили как описано выше. Тест ИФА проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору WIESLAB Complement system Lectin pathway. В ИФА тесте используются меченные моноклональные антитела к неоантигену (С5b-9), появляющемуся при активации системы комплемента по лектиновому пути. Количество неоантигена пропорционально функциональной активности системы комплемента. В качестве активатора лектинового пути системы комплемента служит иммобилизованный маннан из Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich) на подложках 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшет. На первом этапе разведенная 1:99 сыворотка инкубируется в течение 60 мин при 37°С. После инкубации планшета отмывается 4 раза промывочным буфером и повторно инкубируются с конъюгатом моноклональных антител к неоантигену С5b-9 с щелочной фосфататазой. Повторно инкубируют в течение 30 мин и промывают планшету 4 раза. После, на 3 этапе, добавляют субстратный буфер и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Результаты теста измеряют при 405 нм на фотометре для ИФА. Рассчитывают функциональную активность лектинового пути системы комплемента относительно контрольной сыворотки в процентах. Нормальным значением функциональной активности лектинового пути комплемента производителем предлагается величина относительной функциональной активности комплемента иммуноферментным методом на уровне 50% при колебании от 0 до 125% (n=120). Также определяли маркер воспалительной реакции, СРБ, с использованием набора реагентов (АО «Вектор-Бест», Россия) для высокочувствительного (вч) иммуноферментного определения СРБ в сыворотке крови лиц с абдоминальным ожирением. Полученные результаты представлены в таблице 4. Comparative studies of the functional activity of the lectin pathway of the complement system were carried out by the proposed method and by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the EuroDiagnostica kit (Sweden). The test for determining the functional activity of the lectin complement pathway was performed as described above. The ELISA test was performed according to the instructions supplied with the WIESLAB Complement system Lectin pathway. The ELISA test uses labeled monoclonal antibodies to the neoantigen (C5b-9), which appears when the complement system is activated along the lectin pathway. The amount of neoantigen is proportional to the functional activity of the complement system. Immobilized mannan from Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich) on 96-well flat-bottomed immunological plates serves as an activator of the lectin pathway of the complement system. At the first stage, diluted 1:99 serum is incubated for 60 min at 37 ° C. After incubation, the plates are washed 4 times with washing buffer and re-incubated with an alkaline phosphatase conjugate of monoclonal antibodies to neoantigen C5b-9. Re-incubate for 30 min and wash the plate 4 times. Then, at stage 3, a substrate buffer is added and incubated for 30 minutes at room temperature. The test results are measured at 405 nm with an ELISA photometer. The functional activity of the lectin pathway of the complement system is calculated relative to the control serum in percent. The manufacturer proposes the normal value of the functional activity of the lectin complement pathway by the enzyme immunoassay at the level of 50%, ranging from 0 to 125% (n = 120). Also, a marker of the inflammatory response, CRP, was determined using a set of reagents (AO Vector-Best, Russia) for a highly sensitive (hf) enzyme-linked immunosorbent assay for CRP in the blood serum of persons with abdominal obesity. The results are shown in Table 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, повышенная функциональная активность лектинового пути системы комплемента в тесте иммуноферментного анализа выявлена в 24 пробах, что составляет 55%. В то время как высокая активность лектинового пути комплемента в тесте коагуляции ФГ только в 12 пробах превышает 50%, в 13 пробах (30%) средняя активность колеблется в пределах от 26 до 49% и в 16 пробах (36%) низкая активность лектинового пути определяется менее 25%. В трех пробах наблюдается ингибирование фоновой коагуляции контрольной пробы в присутствии маннана. Данный факт свидетельствует о высоком ингибиторном (антикоагулянтном) потенциале при рекальцификации ЭДТА плазмы в присутствии маннана. Определение вчСРБ показало повышенный уровень (более 3МЕ/л) в 21 пробе (48%). Из них только в 12 пробах (57% от всех проб с высоким уровнем вчСРБ) была связана с повышенной активностью лектинового пути, выявленной иммуноферментным анализом. Повышенный уровень всех трех показателей, представленных в таблице №4, определяется только в 4 пробах. Наибольшее совпадение наблюдается в 10 пробах (23%) повышенных активностей функциональной активности лектинового пути системы комплемента и вчСРБ.As can be seen from the data presented in table 4, the increased functional activity of the lectin pathway of the complement system in the enzyme immunoassay test was detected in 24 samples, which is 55%. While the high activity of the lectin pathway of complement in the FG coagulation test only in 12 samples exceeds 50%, in 13 samples (30%) the average activity ranges from 26 to 49% and in 16 samples (36%) the low activity of the lectin pathway determined by less than 25%. In three samples, inhibition of background coagulation of the control sample in the presence of mannan was observed. This fact indicates a high inhibitory (anticoagulant) potential during the recalcification of plasma EDTA in the presence of mannan. Determination of hsCRP showed an increased level (more than 3 IU / L) in 21 samples (48%). Of these, only 12 samples (57% of all samples with a high level of hsCRP) were associated with increased activity of the lectin pathway, revealed by enzyme immunoassay. The increased level of all three indicators presented in Table 4 is determined only in 4 samples. The greatest coincidence is observed in 10 samples (23%) of increased activities of the functional activity of the lectin pathway of the complement system and hsCRP.

Таким образом, повышенная активность лектинового пути активации системы комплемента в тесте коагуляции ФГ не связана с литической активностью ЛПСК и с маркером системной воспалительной реакции, вчСРБ. Повышенная активности ЛПСК в тесте коагуляции ФГ свидетельствует о высокой прокоагулянтной активности комплемента по лектиновому пути активации. Скриниг-тест для определения активности МАСП-1,2 в тесте коагуляции фибриногена может быть использован для диагностики гиперкоагуляции и угрозы тромбоза, обусловленных высокой функциональной активностью лектинового пути системы комплемента.Thus, the increased activity of the lectin pathway for activating the complement system in the FG coagulation test is not associated with the lytic activity of LPSA and with a marker of the systemic inflammatory response, hsCRP. The increased activity of LPSA in the FG coagulation test indicates a high procoagulant activity of complement along the lectin activation pathway. A screening test to determine the activity of MASP-1,2 in the fibrinogen coagulation test can be used to diagnose hypercoagulation and the threat of thrombosis due to the high functional activity of the lectin pathway of the complement system.

Таблица 4Table 4

Активности лектинового пути системы комплемента (иммуноферментный анализ, тест коагуляции фибриногена) и содержание СРБ (высокочувствительный тест) Lectin pathway activities of the complement system (enzyme immunoassay, fibrinogen coagulation test) and CRP content (highly sensitive test)

№ пробSample no. Активность ЛПСК, % ИФАLPSA activity,% ELISA Активность ЛПСК (%) в тесте коагуляции ФГLPSA activity (%) in the FG coagulation test СРБ (вч), МЕ/лCRB (high frequency), IU / l № пробSample no. Активность ЛПСК, % ИФАLPSA activity,% ELISA Активность ЛПСК (%) в тесте коагуляции ФГLPSA activity (%) in the FG coagulation test СРБ (вч), МЕ/лCRB (high frequency), IU / l 1one 116116 7777 10ten 2323 6767 2626 6,06.0 22 6767 7676 0,750.75 2424 176176 77 6,26.2 33 6565 00 4,24.2 2525 6969 4646 10ten 44 126126 66 4,24.2 2626 113113 8080 3,53.5 55 158158 8383 3,83.8 2727 4747 6464 2,62.6 66 100one hundred 4444 2,92.9 2828 4545 7575 6,46.4 77 2525 9nine 5,05.0 2929 152152 -22 !!!-22 !!! 10ten 88 2525 5151 1,71.7 30thirty 1313 1313 1,31.3 9nine 6565 1414 0,50.5 3131 88 50fifty 4,94.9 10ten 4545 3232 0,80.8 3232 00 4747 4,154.15 11eleven 00 3232 1,61.6 3333 9nine -28 !!!-28 !!! 2,32,3 1212 111111 00 2,32,3 3434 2121 30thirty 1,71.7 1313 11eleven 11eleven 0,50.5 3535 6161 2121 2,92.9 1414 1212 4545 5,05.0 3636 5858 4444 1,01.0 1515 66 4848 5,65.6 3737 157157 2121 7,07.0 1616 3434 9nine 0,80.8 3838 30thirty - 25 !!!- 25 !!! 3,53.5 1717 103103 1515 1,11.1 3939 00 -1-one 4,14.1 18eighteen 00 6363 6,66.6 4040 00 6868 2,32,3 1919 104104 33 3,23.2 4141 118118 2525 1,11.1 20twenty 138138 7575 1,41.4 4242 216216 22 3,83.8 2121 3535 6262 2,32,3 4343 142142 3232 8,18.1 2222 112112 1313 1,41.4 4444 6363 3939 2,02.0

ЛитератураLiterature

1. Liszewski М.K. and.Atkinson J.P., 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E.Paul, Raven Press, Ltd., NewYork).1. Liszewski M.K. and. Atkinson J.P., 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., NewYork).

2. Kalli K.R., Hsu P., Fearon D.T. Therapeutic uses of recombinant complement protein inhibitors // Springer Semin Immunopathol. - 1994. - V. 15, № 4. - P.417-31.2. Kalli K.R., Hsu P., Fearon D.T. Therapeutic uses of recombinant complement protein inhibitors // Springer Semin Immunopathol. - 1994. - V. 15, No. 4. - P.417-31.

3. Morgan B.P. Clinical complementology: recent progress and future trends // Eur J Clin Invest. - 1994. - V. 24, № 4. - P. 219-228.3. Morgan B.P. Clinical complementology: recent progress and future trends // Eur J Clin Invest. - 1994. - V. 24, No. 4. - P. 219-228.

4. Lu J., Teh C., Kishore U., Reid K.B. Collectins and ficolins: sugar pattern recognition molecules of the mammalian innate immune system // Biochim Biophys Acta. - 2002. - V. 1572, №(2-3). - P.387-400. 4. Lu J., Teh C., Kishore U., Reid K.B. Collectins and ficolins: sugar pattern recognition molecules of the mammalian innate immune system // Biochim Biophys Acta. - 2002. - V. 1572, No. (2-3). - P.387-400.

5. Holmskov U., Thiel S., Jensenius J.C. Collections and ficolins: humoral lectins of the innate immune defense // Annu Rev Immunol. - 2003. - V. 21. - P.547-78.5. Holmskov U., Thiel S., Jensenius J.C. Collections and ficolins: humoral lectins of the innate immune defense // Annu Rev Immunol. - 2003. - V. 21. - P.547-78.

6. The C., Le Y., Lee S.H., Lu J.. M-ficolin is expressed on monocytes and is a lectin binding to N-acetyl-D-glucosamine and mediates monocyte adhesion and phagocytosis of Escherichia coli // Immunology. - 2000. - V. 101, №2. - P. 225-232.6. The C., Le Y., Lee S.H., Lu J .. M-ficolin is expressed on monocytes and is a lectin binding to N-acetyl-D-glucosamine and mediates monocyte adhesion and phagocytosis of Escherichia coli // Immunology. - 2000. - V. 101, No. 2. - P. 225-232.

7. Ikeda K., Sannoh T., Kawasaki N., Kawasaki T., Yamashina I. Serum lectin with known structure activates complement through the classical pathway // J Biol Chem. - 1987. - V. 262, №16. - P.7451-4.7. Ikeda K., Sannoh T., Kawasaki N., Kawasaki T., Yamashina I. Serum lectin with known structure activates complement through the classical pathway // J Biol Chem. - 1987. - V. 262, No. 16. - P.7451-4.

8. Weis W.I., Drickamer K., Hendrickson W.A. Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide // Nature. - 1992. - V. 360, №6400. - P.127-34.8. Weis W.I., Drickamer K., Hendrickson W.A. Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide // Nature. - 1992. - V. 360, No. 6400. - P.127-34.

9. Lee R.T., IchikawaY., Kawasaki T., Drickamer K., Lee Y.C. Multivalent ligand binding by serum mannose-binding protein // Arch Biochem Biophys. - 1992. - V. 299, № 1.-V. 129-36.9. Lee R. T., Ichikawa Y., Kawasaki T., Drickamer K., Lee Y.C. Multivalent ligand binding by serum mannose-binding protein // Arch Biochem Biophys. - 1992. - V. 299, No. 1.-V. 129-36.

10. Maynard Y., Baenziger J.U. Characterization of a mannose and N-acetylglucosamine-specific lectin present in rat hepatocytes // J Biol Chem. - 1982. - V. 257, № 7. - P. 3788-94.10. Maynard Y., Baenziger J.U. Characterization of a mannose and N-acetylglucosamine-specific lectin present in rat hepatocytes // J Biol Chem. - 1982. - V. 257, No. 7. - P. 3788-94.

11. Lynch N.J., Roscher S., Hartung T., Morath S., Matsushita M., Maennel D.N., Kuraya M., Fujita T., Schwaeble W.J. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement // J Immunol. - 2004. - V.172, №2. - P.1198-202.11. Lynch N.J., Roscher S., Hartung T., Morath S., Matsushita M., Maennel D.N., Kuraya M., Fujita T., Schwaeble W.J. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement // J Immunol. - 2004. - V.172, No. 2. - P.1198-202.

12. Kuhlman M., Joiner K., Ezekowitz R.A. The human mannose-binding protein functions as an opsonin // J Exp Med. - 1989. - V. 169, № 5. - P.1733-45. 12. Kuhlman M., Joiner K., Ezekowitz R.A. The human mannose-binding protein functions as an opsonin // J Exp Med. - 1989. - V. 169, No. 5. - P.1733-45.

13. Matsushita M., Endo Y., Taira S., Sato Y., Fujita T., Ichikawa N., Nakata M., Mizuochi T. A novel human serum lectin with collagen- and fibrinogen-like domains that functions as an opsonin // J Biol Chem. - 1996. - V.271, №5 - P.2448-54. 13. Matsushita M., Endo Y., Taira S., Sato Y., Fujita T., Ichikawa N., Nakata M., Mizuochi T. A novel human serum lectin with collagen- and fibrinogen-like domains that functions as an opsonin // J Biol Chem. - 1996. - V.271, No. 5 - P.2448-54.

14. Ji Y.Н., Fujita T., Hatsuse H., Takahashi A., Matsushita M., Kawakami M. Activation of the C4 and C2 components of complement by a proteinase in serum bactericidal factor, Ra reactive factor. J. Immunol. 150:571-578, 1993.14. Ji Y. H., Fujita T., Hatsuse H., Takahashi A., Matsushita M., Kawakami M. Activation of the C4 and C2 components of complement by a proteinase in serum bactericidal factor, Ra reactive factor. J. Immunol. 150: 571-578,1993.

15. Thiel S., Vorup-Jensen T., Stover C.M., Schwaeble W., Laursen S.B., Poulsen K., Willis A.C., Eggleton P., Hansen S., Holmskov U., Reid K.B., Jensenius J.C. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement Nature. 1997 Apr 3;386(6624):506-10. 15. Thiel S., Vorup-Jensen T., Stover C.M., Schwaeble W., Laursen S.B., Poulsen K., Willis A.C., Eggleton P., Hansen S., Holmskov U., Reid K.B., Jensenius J.C. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement Nature. 1997 Apr 3; 386 (6624): 506-10.

16. Vorup-Jensen T., Petersen S.V., Hansen A.G., Poulsen K., Schwaeble W., Sim R.B, Reid K.B., Davis S.J., Thiel S., Jensenius J.C. Distinct pathways of mannan-binding lectin (MBL)- and C1-complex autoactivation revealed by reconstitution of MBL with recombinant MBL-associated serine protease-2. J Immunol. 2000 Aug 15;165(4):2093-100.16. Vorup-Jensen T., Petersen S.V., Hansen A.G., Poulsen K., Schwaeble W., Sim R.B, Reid K.B., Davis S.J., Thiel S., Jensenius J.C. Distinct pathways of mannan-binding lectin (MBL) - and C1-complex autoactivation revealed by reconstitution of MBL with recombinant MBL-associated serine protease-2. J Immunol. 2000 Aug 15; 165 (4): 2093-100.

17. Ambrus G.,

Kojima M.,

Balczer J., Antal J.,

Laich A., Moffatt B.E., Schwaeble W., Sim R.B.,

Natural substrates and inhibitors of mannan-binding lectin-associated serine protease-1 and -2: a study on recombinant catalytic fragments. J Immunol. 2003 Feb 1;170(3):1374-82.17. Ambrus G.,

Kojima M.,

Balczer J., Antal J.,

Laich A., Moffatt BE, Schwaeble W., Sim RB,

Natural substrates and inhibitors of mannan-binding lectin-associated serine protease-1 and -2: a study on recombinant catalytic fragments. J Immunol. 2003 Feb 1; 170 (3): 1374-82.

18. Dahl MR., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T.,18. Dahl MR., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T.,

Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15(1): 127-35.Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15 (1): 127-35.

19. Sim R.B., Laich A. Serine proteases of the complement system. Biochem Soc Trans. 2000; 28(5): 545-50. 19. Sim R.B., Laich A. Serine proteases of the complement system. Biochem Soc Trans. 2000; 28 (5): 545-50.

20. Stengaard-Pedersen K., Thiel S., Gadjeva M.,

Jensen L.T.,

Fugger L., Jensenius J.C. Inherited deficiency of mannan-binding lectin-associated serine protease 2. N Engl J Med. 2003; 349(6): 554-60.20. Stengaard-Pedersen K., Thiel S., Gadjeva M.,

Jensen LT,

Fugger L., Jensenius JC Inherited deficiency of mannan-binding lectin-associated serine protease 2. N Engl J Med. 2003; 349 (6): 554-60.

21. Stover CM(1), Thiel S, Thelen M, Lynch NJ, Vorup-Jensen T, Jensenius JC, Schwaeble WJ. Two constituents of the initiation complex of the mannan-binding lectin activation pathway of complement are encoded by a single structural gene. J Immunol. 1999; 162(6): 3481-90.21. Stover CM (1), Thiel S, Thelen M, Lynch NJ, Vorup-Jensen T, Jensenius JC, Schwaeble WJ. Two constituents of the initiation complex of the mannan-binding lectin activation pathway of complement are encoded by a single structural gene. J Immunol. 1999; 162 (6): 3481-90.

22. Takahashi M., Endo Y., Fujita T., Matsushita M. A truncated form of mannose-binding lectin-associated serine protease (MASP)-2 expressed by alternative polyadenylation is a component of the lectin complement pathway. Int Immunol. 1999; 11(5): 859-63.22. Takahashi M., Endo Y., Fujita T., Matsushita M. A truncated form of mannose-binding lectin-associated serine protease (MASP) -2 expressed by alternative polyadenylation is a component of the lectin complement pathway. Int Immunol. 1999; 11 (5): 859-63.

23. Schwaeble W., Dahl M.R., Thiel S., Stover C., Jensenius J.C. The mannan-binding lectin-associated serine proteases (MASPs) and MAp19: four components of the lectin pathway activation complex encoded by two genes. Immunobiology. 2002; 205(4-5): 455-66.23. Schwaeble W., Dahl M.R., Thiel S., Stover C., Jensenius J.C. The mannan-binding lectin-associated serine proteases (MASPs) and MAp19: four components of the lectin pathway activation complex encoded by two genes. Immunobiology. 2002; 205 (4-5): 455-66.

24. Thiel S., Petersen S.V., Vorup-Jensen T., Matsushita M., Fujita T., Stover C.M., Schwaeble W.J., Jensenius J.C. Interaction of C1q and mannan-binding lectin (MBL) with C1r, C1s, MBL-associated serine proteases 1 and 2, and the MBL-associated protein MAp19. J Immunol. 2000; 165(2): 878-87.24. Thiel S., Petersen S.V., Vorup-Jensen T., Matsushita M., Fujita T., Stover C.M., Schwaeble W.J., Jensenius J.C. Interaction of C1q and mannan-binding lectin (MBL) with C1r, C1s, MBL-associated serine proteases 1 and 2, and the MBL-associated protein MAp19. J Immunol. 2000; 165 (2): 878-87.

25. Dahl M.R., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T,25. Dahl M.R., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T,

26. Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15(1):127-35.26. Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15 (1): 127-35.

27. Matsushita M., Kuraya M., Hamasaki N., Tsujimura M., Shiraki H., Fujita T. Activation of the lectin complement pathway by H-ficolin (Hakata antigen). J Immunol. 2002; 168(7): 3502-6.27. Matsushita M., Kuraya M., Hamasaki N., Tsujimura M., Shiraki H., Fujita T. Activation of the lectin complement pathway by H-ficolin (Hakata antigen). J Immunol. 2002; 168 (7): 3502-6.

28. Kilpatrick D.C. Mannan-binding lectin: clinical significance and applications. Biochim Biophys Acta. 2002; 1572(2-3): 401-13. 28. Kilpatrick D.C. Mannan-binding lectin: clinical significance and applications. Biochim Biophys Acta. 2002; 1572 (2-3): 401-13.

29. Collard C.D.,

Morrissey M.A., Agah A., Rollins S.A., Reenstra W.R., et al. Complement activation after oxidative stress: role of the lectin complement pathway. Am J Pathol. 2000; 156(5): 1549-56. 29. Collard CD,

Morrissey MA, Agah A, Rollins SA, Reenstra WR, et al. Complement activation after oxidative stress: role of the lectin complement pathway. Am J Pathol. 2000; 156 (5): 1549-56.

30. Jordan J.E., Montalto M.C., Stahl G.L. Inhibition of mannose-binding lectin reduces postischemic myocardial reperfusion injury. Circulation. 2001; 104(12): 1413-8.30. Jordan J.E., Montalto M.C., Stahl G.L. Inhibition of mannose-binding lectin reduces postischemic myocardial reperfusion injury. Circulation. 2001; 104 (12): 1413-8.

31. Huber-Lang., Sarma J.V., Zetoune F.S., Rittirsch D., Neff T.A., McGuire S.R., et al. Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nat Med. 2006; 12(6): 682-7.31. Huber-Lang., Sarma J. V., Zetoune F.S., Rittirsch D., Neff T. A., McGuire S. R., et al. Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nat Med. 2006; 12 (6): 682-7.

32. Krarup, A., Wallis R., Presanis J.S., Gal P., Sim R.B. Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2. // PLoS. ONE. (2007) 2(7): e623. DOI:10.1371/journal.pone.0000623. 32. Krarup, A., Wallis R., Presanis J. S., Gal P., Sim R.B. Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2. // PLoS. ONE. (2007) 2 (7): e623. DOI: 10.1371 / journal.pone.0000623.

33. Krarup, A., WallisR., PresanisJ.S., GalP., SimR.B. Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2. // PLoS. ONE. (2007) 2(7): e623. Doi:10.1371/journal.pone.0000623.33. Krarup, A., Wallis R., Presanis J. S., Gal P., Sim R. B. Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2. // PLoS. ONE. (2007) 2 (7): e623. Doi: 10.1371 / journal.pone.0000623.

34. Hess K., Ajjan R., Phoenix F.,

Schroeder V. Effects of MASP-1 of the complement system on activation of coagulation factors and plasma clot formation. PLoS One. 2012; 7(4): e35690. doi: 10.1371/journal.pone.0035690. 34. Hess K., Ajjan R., Phoenix F.,

Schroeder V. Effects of MASP-1 of the complement system on activation of coagulation factors and plasma clot formation. PLoS One. 2012; 7 (4): e35690. doi: 10.1371 / journal.pone.0035690.

35. Krarup A., Gulla K.C.,

Hajela K., Sim R.B. The action of MBL-associated serine protease 1 (MASP1) on factor XIII and fibrinogen. Biochim Biophys Acta. 2008; 1784(9): 1294-300. doi: 10.1016/j.bbapap.2008.03.020. 35. Krarup A., Gulla KC,

Hajela K., Sim RB The action of MBL-associated serine protease 1 (MASP1) on factor XIII and fibrinogen. Biochim Biophys Acta. 2008; 1784 (9): 1294-300. doi: 10.1016 / j.bbapap.2008.03.020.

36. Krarup A(1), Mitchell DA, Sim RB. Recognition of acetylated oligosaccharides by human L-ficolin. Immunol Lett. 2008; 118(2): 152-6. doi: 10.1016/j.imlet.2008.03.014. 36. Krarup A (1), Mitchell DA, Sim RB. Recognition of acetylated oligosaccharides by human L-ficolin. Immunol Lett. 2008; 118 (2): 152-6. doi: 10.1016 / j.imlet.2008.03.014.

37. Gulla K.C., Gupta K., Krarup A., Gal P., Schwaeble W.J., Sim R.B., O'Connor C.D., Hajela K. Activation of mannan-binding lectin-associated serine proteases leads to generation of a fibrin clot. Immunology. 2010; 129(4):482-95. doi: 10.1111/j.1365-2567.2009.03200.x. 37. Gulla K.C., Gupta K., Krarup A., Gal P., Schwaeble W.J., Sim R.B., O'Connor C.D., Hajela K. Activation of mannan-binding lectin-associated serine proteases leads to generation of a fibrin clot. Immunology. 2010; 129 (4): 482-95. doi: 10.1111 / j.1365-2567.2009.03200.x.

38. Megyeri M.,

Beinrohr L., Doleschall Z.,

Cervenak L.,

Complement protease MASP-1 activates human endothelial cells: PAR4 activation is a link between complement and endothelial function. J Immunol. 2009; 183(5): 3409-16. doi: 10.4049/jimmunol.0900879.38. Megyeri M.,

Beinrohr L., Doleschall Z.,

Cervenak L.,

Complement protease MASP-1 activates human endothelial cells: PAR4 activation is a link between complement and endothelial function. J Immunol. 2009; 183 (5): 3409-16. doi: 10.4049 / jimmunol.0900879.

39. Cortesio C.L., Jiang W. Mannan-binding lectin-associated serine protease 3 cleaves synthetic peptides and insulin-like growth factor-binding protein 5. Arch Biochem Biophys. 2006; 449 (1-2): 164-70.39. Cortesio C.L., Jiang W. Mannan-binding lectin-associated serine protease 3 cleaves synthetic peptides and insulin-like growth factor-binding protein 5. Arch Biochem Biophys. 2006; 449 (1-2): 164-70.

Claims

A method for determining the activity of mannan-binding lectin-associated serine proteases-1 and 2 (MASP-1 and MASP-2) in the fibrinogen coagulation test, including the use of EDTA plasma as a source of fibrinogen MASP-1 and MASP-2, and as an activator yeast mannan is used for the lectin pathway of the complement system, the MASP activation reaction is started by adding 25 μl of 10% CaCl ₂ solution diluted (1:31) to 25 μl of pooled EDTA blood plasma from healthy donors and 50 μl of tris-imidazole buffer, pH 7.4, then the degree of coagulation of fibrinogen is determined as the difference in the change in the turbidity of the sample at 450 nm after 45 minutes of incubation at 37 ° C, the degree of coagulation is assessed relative to a sample containing human thrombin instead of the studied human blood plasma, the maximum absorption of a fibrin clot obtained with thrombin at 450 nm is taken as 100% coagulation of fibrinogen, while coagulation up to 25% is considered low activity of MASP-1 and MASP-2 in the fibrinogen coagulation test, from 26% to 49% - as the average activity of MASP-1 and MASP-2 and above 50% - as high activity of MASP-1 and MASP-2 in the fibrinogen coagulation test.