RU2735375C1

RU2735375C1 - Способ определения фракций гидроксипролина в биологическом материале

Info

Publication number: RU2735375C1
Application number: RU2020113744A
Authority: RU
Inventors: Анна Николаевна Путятина; Галина Сергеевна Русских; Лена Борисовна Ким
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-10-30

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа определения фракций гидроксипролина в биологическом материале, включающего забор биологического материала, экстракцию из него гидроксипролина путем добавления этанола, центрифугирование, разделение супернатанта и осадка; их высушивание, последующее разведение в дистиллированной воде, разделение разведенного супернатанта на пробу 1 для определения фракции свободного гидроксипролина и пробу 2 для определения фракций свободного и пептидно-связанного гидроксипролина, разведение осадка для пробы 3 для определения фракции белково-связанного гидроксипролина, добавление во все пробы гидроксида натрия, проведение щелочного гидролиза пробы 1 при комнатной температуре и пробы 2 и 3 при нагревании, добавление хлорамина Т в качестве окислителя во все пробы, окрашивание реактивом Эрлиха, измерение оптической плотности во всех пробах, определение по показаниям оптической плотности содержания фракции свободного гидроксипролина в пробе 1, белково-связанного гидроксипролина в пробе 3, содержания фракции пептидно-связанного гидроксипролина как разности между содержанием гидроксипролина в пробах 2 и 1, где щелочной гидролиз проводят в течение 25-30 мин, для его проведения используют 4 N раствор гидроксида натрия, щелочной гидролиз проб 2 и 3 осуществляют при +120-125°С; во всех пробах после щелочного гидролиза дополнительно проводят реакцию нейтрализации путем добавления 4 N раствора соляной кислоты; в качестве биологического материала дополнительно используют сыворотку крови, или мочу, или гомогенат ткани легких или селезенки. Изобретение обеспечивает сокращение длительности осуществления способа, повышение чувствительности анализа, уменьшение объема биологического материала. 1 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности, лабораторной диагностике, клинической биохимии, и может быть использовано при оценке метаболизма коллагена во внеклеточном матриксе у человека и животных по содержанию отдельных фракций гидроксипролина (ГОП) - свободная, пептидно-связанная, белково-связанная.

Известно, что содержание пептидно-связанного ГОП отражает скорость биологического оборота коллагена, одновременно его синтез и деградацию, свободного ГОП - деградацию коллагена, а белково-связанного ГОП - синтез молодого, незрелого коллагена [Шараев П.Н., Стрелков Н.С., Кильдиярова P.P. и др. Соединительная ткань в детском возрасте / Под ред. проф. P.P. Кильдияровой. Ижевск: Ижевск, гос. мед. акад., 2005. 152 с].

В связи с этим определение отдельных фракций ГОП целесообразно при анализе физиологического и патологического ремоделирования внеклеточного матрикса, оценке адекватности проводимого лечения воспалительных и фиброзно-деструктивных процессов в соединительной ткани человека и животных на основе исследования метаболизма коллагена, а именно отдельных фракций ГОП, при диагностике дегенеративно-дистрофических и воспалительных процессов [Шараев П.Н., Стрелков Н.С., Кильдиярова P.P. и др. Соединительная ткань в детском возрасте / Под ред. проф. P.P. Кильдияровой. Ижевск: Ижевск, гос. мед. акад., 2005. 152 с; Туш Е.В., Елисеева Т.И., Халецкая О.В. и др. Маркеры состояния экстрацеллюлярного матрикса и методы их диагностики (Обзор) // Современные технологии в медицине. 2019. Т. 11, №2. С. 133-149. doi: 10.17691/stm2019.11.2.20].

В отечественной и зарубежной литературе описан большой спектр способов оценки содержания ГОП в биологическом материале. Однако в существующих способах, во-первых, не всегда в полной мере представлены все фракции ГОП, которые позволяют полноценно проанализировать метаболизм коллагена, во-вторых - имеются ограничения по исследуемому материалу, в третьих - некоторые способы лимитированы по объему расходуемого биологического материала и реактивов, поскольку в экспериментальных исследованиях не всегда доступно требуемое количество тканей для воспроизводства метода, в четвертых - требуется длительное время для пробоподготовки и проведения гидролиза (щелочного или кислотного), в пятых - в ряде способов используется дополнительное оборудование, которое не является обязательным для всех клинико-биохимических лабораторий.

Известен способ определения свободного ГОП в плазме крови путем внесения в нее трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с последующим отделением надосадочной жидкости и добавлением к ней окислителя, далее образующийся продукт окисления ГОП конденсируют с парадиметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) и измеряют его оптическую плотность (λ=560 нм), отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, плазму крови перед внесением ТХУ нагревают в течение 2,0-2,5 мин до +98-100°С, затем охлаждают до +18-22°С, ТХУ вносят в концентрации 20% совместно с 55% хлорной кислотой (HClO₄), конденсацию ведут при нагревании смеси до +98-100°С в течение 75-80 с, а продукт конденсации перед измерением оптической плотности экстрагируют смесью четыреххлористого углерода и н-бутанола, взятых в соотношении 1:3 [Способ определения свободного гидроксипролина в плазме крови. Авторское свидетельство на изобретение RU №834518, автор Шараев П.Н., МПК G01N 33/52, опубл. 30.05.1981]. Недостатком способа является невозможность определения белково-связанной и пептидно-связанной фракций ГОП, использования других видов биологического материала (моча, гомогенаты органов).

Известен способ определения фракций свободного, пептидно-связанного и белково-связанного ГОП в биологическом материале (сыворотка и плазма крови, моча, экссудат, серозная жидкость, гомогенаты органов), в котором образцы подвергают кислотному гидролизу (ТХУ и HClO₄) в кипящей водяной бане в течение от 40 мин до 6 ч в зависимости от исследуемой фракции ГОП, в качестве окислителя используют хлорамин Т, продукты окисления конденсируют с помощью реактива Эрлиха, при этом образующийся хромоген фотометририруют при λ=560 нм. [Шараев П.Н., Стрелков Н.С., Кильдиярова P.P. и др. Соединительная ткань в детском возрасте / Под ред. проф. P.P. Кильдияровой. Ижевск: Ижевск, гос. мед. акад., 2005. 152 с.]. Недостатком указанного способа является длительность его проведения (за счет проводимого кислотного гидролиза), большой объем биологического материала (2 мл).

Известен способ определения содержания фракций свободного, пептидно-связанного и белково-связанного гидроксипролина в сыворотке крови человека, где в зависимости от фракций ГОП первоначально проводят депротеинизацию 0,15-0,5 мл сыворотки крови с помощью этанола (+4°С), пробы оставляют на 15 мин в холодильнике, затем центрифугируют при 3000 об/мин - 15 мин, надосадочную жидкость выпаривают, а осадок растворяют в дистиллированной воде, полученный раствор используется в дальнейшем для определения фракций ГОП [Кузнецова Т.П., Прошина Л.Я., Приваленко М.Н. Модификация определения содержания оксипролина в сыворотке крови // Лабораторное дело. 1982, №8. С. 8-11]. В 1-й пробирке для определения фракции пептидно-связанного ГОП проводят кислотный гидролиз HClO₄ в кипящей водяной бане в течение 4 ч, после этого нейтрализуют гидроксидом калия по фенолфталеину, центрифугируют, надосадочную жидкость выпаривают и растворяют в дистиллированной воде. Во 2-й пробирке для определения фракции белково-связанного ГОП добавляют HClO₄ и гидролизуют в течение 6 ч, осадок после выпаривания растворяют в дистиллированной воде, элюируют на хроматографической колонке соляной кислотой (HCl). Содержимое 3-й пробирки для определения фракции свободного ГОП не подвергают гидролизу. Затем во все пробирки добавляют изопропанол и хлорамин Т, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин. После этого во все пробирки вносят реактив Эрлиха, встряхивают 30 с, инкубируют 20 мин при температуре +60°С, спектрофотометрируют при λ=550 нм и по показаниям оптической плотности определяют содержание фракций пептидно-связанного, белково-связанного и свободного ГОП. Недостатком указанного способа является ограничение вида биологического материала сывороткой крови и его большой объем, трудоемкость и длительность осуществления способа за счет применения кислотного гидролиза (4-6 ч), элюирования на хроматографической колонке.

Известен способ определения фракций свободного и белково-связанного ГОП в желудочном соке человека [Осадчук Т.К., Мотин Ю.К., Осадчук М.А. Исследование оксипролина в желудочном соке и его диагностическое значение // Лабораторное дело. 1982, №4. С. 16-18], где 6-7 мл желудочного сока центрифугируют, добавляют абсолютный этанол, в пробе с выпаренным супернатантом для определения свободного ГОП и в пробе с осадком для определения белково-связанного ГОП проводят кислотный гидролиз путем добавления концентрированной HCl, перемешивания и прогревания при температуре +100°С в течение 4 ч, затем проводят нейтрализацию 6 N гидроксидом натрия (NaOH), элюируют на хроматографической колонке с помощью 1 N HCl. В пробы добавляют изопропанол и хлорамин Т, через 4 мин приливают реактив Эрлиха и на 30 мин помещают на водяную баню при температуре +60°С, изопропанолом доводят объем до 10 мл, перемешивают, спектрофотометрируют при λ=558 нм, по оптической плотности определяют содержание свободного и белково-связанного ГОП. Недостатком указанного способа является невозможность определения пептидно-связанного ГОП, ограничение биологического материала желудочным соком. Другими недостатками являются длительное время осуществления способа, требуемое для проведения кислотного гидролиза (4 ч), расход большого объема реактивов и биологического материала (6-7 мл).

Известен способ определения фракции свободного ГОП [Тетянец С.С.Метод определения свободного оксипролина в сыворотке крови // Лабораторное дело. 1985, №1. С. 62-62], включающий забор сыворотки крови человека, добавление 4 мл охлажденного абсолютного этанола, центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 мин, добавление к надосадочной жидкости окислителя и изопропанола, через 4 мин приливают реактив Эрлиха и доводят объем изопропанолом до 10 мл, перемешивают, затем пробирки помещают в водяную баню (+60°С) на 30 мин, спектрофотометрируют при λ=558 нм и определяют содержание фракции свободного ГОП. Недостатком указанного способа является невозможность определения других фракций ГОП (пептидно- и белково-связанная) и невозможность использования другого биологического материала кроме сыворотки крови. Другими недостатками являются расход большого объема реактивов и биологического материал (1 мл) для определения исключительно одной фракции ГОП (свободная).

Известен способ определения фракций свободного и белково-связанного ГОП в слюне человека [Подковкин В.Г., Бондаренко Л.М., Власов М.Ю., Аввакумова Н.П., Грибкова О.В. Способ оценки метаболизма коллагена. Патент RU 2214596, кл. G01N 33/48, G01N 33/52, опубл. 20.10.2003], включающий забор биологической жидкости, выделение из нее свободного и белково-связанного ГОП экстракцией этанолом и центрифугированием, где свободный ГОП выделяют из надосадочной жидкости, которую выпаривают на водяной бане, разводят в воде, добавляют изопропанол, окислитель, затем окрашивают с помощью реактива Эрлиха и фотометрируют; для определения белково-связанного ГОП проводят щелочной гидролиз осадка гидроксидом бария в течение 20 ч при температуре +124°С, далее гидролизат нейтрализуют серной кислотой, подвергают его ионообменной хроматографии, элюируют ГОП с помощью HCl, нейтрализуют NaOH, добавляют изопропанол, затем окислитель, перемешивают, окрашивают с помощью реактива Эрлиха, фотометрируют при λ-540 нм. Недостатком данного способа является невозможность определения пептидно-связанного ГОП, использование большого количества слюны человека, длительность проведения гидролиза (20 ч) с последующей ионообменной хроматографией.

Известен способ определения общего содержания ГОП в суставном хряще с использованием щелочного гидролиза и последующей нейтрализацией [Athanasiou K.А., Darling Е.М., Hu J.C., Reddi А.Н. Articular cartilage / 2nd Ed, CRC Press, 2017. 585-588 p.], где к лиофилизированным образцам добавляли раствор папаина и деионизированную воду до конечного объема (200 мкл), затем добавляли 200 мкл 4 N NaOH и автоклавировали. В последующем пробирки охлаждали, вносили 200 мкл 4 N HCl, перемешивали и добавляли 1,25 мл раствора хлорамина Т, оставляли при комнатной температуре - 20 мин, затем добавляли 1,25 мл реактива Эрлиха, перемешивали, помещали в водяную баню (+65°С -20 мин), охлаждали и спектрофотометрировали при λ=550 нм. Недостатком данного способа является невозможность определения отдельных фракций ГОП, что не позволяет оценить обмен коллагена в суставном хряще.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ определения фракций свободного, пептидно-связанного и белково-связанного ГОП [Siddiqi N.J. Effect of sodium fluoride and magnesium chloride on different hydroxyproline fractions in rat liver // Indian. J. Biochem. Biophys. 2012. Vol. 49, №2. P. 130-133], включающий забор образцов печени, необходимого для приготовления 500 мкл 10% гомогената печени на физиологическом растворе (NaCl), проведение трехкратного экстрагирования 2 мл абсолютным этанолом, центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 мин, разведение в 500 мкл дистиллированной воды отдельно супернатанта и осадка. Из пробирки с супернатантом отбирают по 50 мкл образца в 1-ю пробирку для определения фракции свободного ГОП (проба 1) и во 2-ю пробирку для определения фракций свободного и пептидно-связанного ГОП (проба 2), а в 3-ю пробирку отбирают 50 мкл образца из пробирки с осадком для определения фракции белково-связанного ГОП (проба 3). Добавляют во все пробирки NaOH до конечной концентрации 2 N, проводят щелочной гидролиз во 2-й и 3-й пробирках в кипящей водяной бане около 3-4 ч, затем во все пробирки добавляют 900 мкл 56 мМ раствора хлорамина Т, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 25 мин, после чего добавляют 1 мл 1 М реактива Эрлиха, инкубируют при температуре +65°С в течение 20 мин, затем спектрофотометрируют при λ=550 нм и определяют содержаний фракций свободного ГОП (проба 1), белково-связанного ГОП (проба 3). Содержание фракции пептидно-связанного ГОП рассчитывают как разность между полученным результатом определения фракций свободного и пептидно-связанного ГОП во 2-й пробирке и содержанием фракции свободного ГОП в 1-й пробирке. Недостатком этого способа является то, что способ ограничен использованием гомогената печени и не предполагает анализа других видов биологического материала (сыворотка крови, моча). Другими недостатками является длительность осуществления способа, обусловленная проведением щелочного гидролиза в течение 3-4 ч, использование большого объема биологического материала, недостаточная чувствительность анализа при оценке содержания фракций ГОП в пробах, подвергнутых щелочному гидролизу.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является сокращение длительности осуществления способа, расширение его функциональных возможностей.

Техническим результатом является сокращение длительности осуществления способа, объема используемого биологического материала, расширение видов биологического материала, повышение чувствительности анализа при оценке содержания фракций ГОП.

Поставленная задача достигается тем, что щелочной гидролиз проводят в течение 25-30 мин при температуре +120-125°С, для его проведения используют 4 N раствор гидроксида натрия, во всех пробах после щелочного гидролиза дополнительно проводят реакцию нейтрализации путем добавления 4 N раствора соляной кислоты; в качестве биологического материала дополнительно используют сыворотку крови или мочу, или гомогенат ткани легких, или селезенки.

Раскрытие сущности изобретения

Способ определения фракций гидроксипролина в биологическом материале включает забор биологического материала, экстракцию из него гидроксипролина путем добавления этанола, центрифугирование, разделение супернатанта и осадка; их высушивание, последующее разведение в дистиллированной воде супернатанта, разделение разведенного супернатанта на пробу 1 для определения фракции свободного гидроксипролина и пробу 2 для определения фракций свободного и пептидно-связанного гидроксипролина, разведение осадка дистиллированной водой для пробы 3 для определения фракции белково-связанного гидроксипролина, добавление во все пробы 4 N раствора гидроксида натрия, проведение щелочного гидролиза при температуре +120-125°С в течение 25-30 мин. Во всех пробах после щелочного гидролиза проводят реакцию нейтрализации путем добавления 4 N раствора соляной кислоты, затем проводят термическую обработку содержимого проб 2 и 3, после чего добавляют хлорамин Т в качестве окислителя во все пробы, проводят окрашивание реактивом Эрлиха, измеряют оптическую плотность, определяют содержание фракции свободного гидроксипролина в пробе 1, свободного и пептидно-связанного гидроксипролина в пробе 2. Содержание фракции пептидно-связанного гидроксипролина определяют как разность между содержанием фракций гидроксипролина в пробах 2 и 1.

В качестве биологического материала используют сыворотку крови или мочу объемом 50 мкл или гомогенат ткани легких, или селезенки, или печени объемом 50 мкл 10% раствора гомогената..

Для достижения температуры +120-125°С щелочной гидролиз проводят в сушильном шкафу, например, сушильном шкафу марки ШС-80-01 СПУ.

Измерение оптической плотности содержимого проб проводят спектрофотометре, например, на спектрофотометре PD-303S (Apel, Япония) при λ=550 нм. Содержание фракций ГОП рассчитывают с помощью стандартной кривой [Шараев П.Н., Стрелков Н.С., Кильдиярова P.P. и др. Соединительная ткань в детском возрасте / Под ред. проф. P.P. Кильдияровой. Ижевск: Ижевск, гос. мед. акад., 2005. 152 с.].

Содержание пептидно-связанного ГОП рассчитывают по формуле: Пептидно-связанный ГОП (мкг/мл) = проба 2 (свободный ГОП и пептидно-связанный ГОП) - проба 1 (свободный ГОП).

Перечень фигур

Фиг. Влияние нейтрализации 4 N HCl после щелочного гидролиза на содержание общего гидроксипролина в контрольной пробе после проведения щелочного гидролиза. Обозначение: линия с ромбами - содержание общего гидроксипролина в контрольной пробе после щелочного гидролиза и последующей нейтрализации 4N HCl; линия с квадратами - содержание общего гидроксипролина в контрольной пробе после щелочного гидролиза без последующей нейтрализации 4N HCl.

Осуществление изобретения

I. Пробоподготовка биологического материала: у человека, пребывающего в течение 2 суток на бесколлагеновой диете (все, кроме мяса, рыбы, желатина), в утренние часы собирают мочу после ночного голодания, отбирают в объеме 50 мкл.

Животных (мыши) содержат на лабораторной диете со свободным доступом к воде и пище, в день забоя под легким эфирным наркозом выводят из эксперимента путем дислокации шейных позвонков с последующей декапитацией, кровь собирают в пробирки типа Eppendorf и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, затем центрифугируют (3000 об/мин - 10 мин), сыворотку крови в объеме 50 мкл отбирают в пробирки типа Eppendorf, немедленно замораживают и хранят при температуре -70°С до момента использования.

Образцы органов мышей (печень, легкие, селезенка) массой достаточной для получения 50 мкл 10% раствора гомогената, тщательно промывают в 0,9% растворе NaCl (+4°С), взвешивают, измельчают в гомогенизаторе Ultra Turrax Т 10 Standart (20500 об/мин, Германия) и готовят 10% раствор гомогената на 0,9% растворе NaCl на льду, после чего фильтруют через капроновую ткань, отбирают аликвоту гомогената (250 мкл), к ней добавляют 250 мкл 0,1% раствора Тритона Х-100, перемешивают, центрифугируют (3000 об/мин - 10 мин), отобранные аликвоты супернатанта замораживают и хранят при температуре -70°С до момента использования.

Все процедуры осуществляют с соблюдением требований документов «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» и «Правила клинической практики в РФ», а так же с принципами гуманности, изложенными в директиве Европейского общества (86/609/ЕЕС) и в правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.081977 г.).

И. Подготовка реактивов: 1) 4 N NaOH; 2) 4 N HCl; 3) 97° этанол; 4) раствор хлорамина Т (ex tempore): 705 мг хлорамина Т, 10,35 мл дистиллированной воды, 13 мл изопропанола, 26,65 мл основного буферного раствора хлорамина Т (2,73 г лимонной кислоты (моногидрат), 3,5 г ацетата натрия, 1,7 г NaOH, 0,6 мл ледяной уксусной кислоты довести общий объем раствора до 50 мл дистиллированной водой); 5) реактив Эрлиха (ех tempore): 7,5 г реактива Эрлиха, 30 мл изопропанола, 13 мл HClO₄; 6) стандартный раствор ГОП: 100 мкг ГОП / мл дистиллированной воды (0-50 мкг ГОП / мл).

III. Ход определения:

1. К 50 мкл пробы трижды добавляют по 200 мкл 97° этанола и каждый раз центрифугируют при 3000 об/мин - 10 мин. Полученные супернатант и осадок высушивают, затем растворяют в 200 мкл дистиллированной воды.

2. Из пробирки с растворенным «высушенным супернатантом» отбирают по 80 мкл в две пробирки типа SCT-5ML (Axygen, Мексика): в 1-ю пробу (свободный ГОП) и во 2-ю пробу (свободный ГОП и пептидно-связанный ГОП); из пробирки с растворенным «высушенным осадком» - 3-ю пробу (белково-связанный ГОП) добавляют по 80 мкл 4 N NaOH. Содержимое 2-й, 3-й проб и проб со стандартами подвергают гидролизу при +120-125°С в течение 25-30 мин, а после пробирки охлаждают до комнатной температуры.

3. Для нейтрализации щелочной среды во все пробирки добавляют по 80 мкл 4 N HCl. Как следует из графиков, приведенных на фиг., эта процедура позволяет повысить чувствительность анализа на содержание ГОП по сравнению с данными без нейтрализации и создать одинаковые стандартизованные условия для анализа всех проб.

4. Во все пробирки добавляют по 500 мкл раствора хлорамина Т в качестве окислителя, осторожно смешивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

5. В пробирки добавляют по 500 мкл реактива Эрлиха и сразу перемешивают во избежание расслоения реактивов, затем пробирки помещают на водяную баню при температуре +65°С на 20 мин, затем охлаждают до комнатной температуры.

6. Измеряют оптическую плотность содержимого проб на спектрофотометре PD-303S спектрофотометре (Apel, Япония) при λ=550 нм.

7. Определяют содержание фракций ГОП согласно указанному выше.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Пациент К., практически здоров.

После соблюдения в течение 2 суток на бесколлагеновой диете (все, кроме мяса, рыбы, желатина), в утренние часы после ночного голодания отобрали мочу в объеме 50 мкл. Определение содержания фракций ГОП осуществляли согласно заявленному способу, при этом щелочной гидролиз осуществляли в сушильном шкафу при +120°С в течение 30 мин.

По данным анализа содержание ГОП в утренней порции мочи составило: свободный ГОП - 1,15 мкг/мл, пептидно-связанный ГОП - 2,05 мкг/мл, белково-связанный ГОП - 0,24 мкг/мл.

Пример 2. Определение содержания фракций ГОП в сыворотке крови и гомогенате органов (печень, легкие, селезенка) у практически здоровой мыши линии BALB/c согласно заявленному способу и приведенному выше описанию его осуществления у животных. Для этого отбирали 50 мкл сыворотки крови и по 50 мкл 10% раствора гомогената печени, легких, селезенки. Щелочной гидролиз проводили при +125°С в течение 25 мин в сушильном шкафу.

Содержание фракций ГОП в биологических образцах составило:

в сыворотке крови: свободный ГОП - 1,52 мкг/мл, пептидно-связанный ГОП - 0,14 мкг/мл, белково-связанный ГОП - 1,42 мкг/мл;

в печени: свободный ГОП - 128,28 мкг/мг сухой ткани, пептидно-связанный ГОП - 106,90 мкг/мг сухой ткани, белково-связанный ГОП - 80,18 мкг/мг сухой ткани;

в легких: свободный ГОП - 11,60 мкг/мг сухой ткани, пептидно-связанный ГОП - 9,02 мкг/мг сухой ткани, белково-связанный ГОП - 14,18 мкг/мг сухой ткани;

в селезенке: свободный ГОП - 4,35 мкг/мг сухой ткани, пептидно-связанный ГОП - 21,20 мкг/мг сухой ткани, белково-связанный ГОП - 9,79 мкг/мг сухой ткани.

Пример 3. Определение содержания ГОП согласно заявленному способу и приведенному выше описанию его осуществления у животных в сыворотке крови и гомогенате органов (печень, легкие, селезенка) у мыши линии BALB/c, инфицированной вакциной микобактерии БЦЖ. Щелочной гидролиз проводили при +120°С в течение 30 мин в сушильном шкафу.

в сыворотке крови: свободный ГОП - 1,33 мкг/мл, пептидно-связанный ГОП - 0,34 мкг/мл, белково-связанный ГОП - 2,75 мкг/мл;

в печени: свободный ГОП - 194,12 мкг/мг сухой ткани, пептидно-связанный ГОП - 514,16 мкг/мг сухой ткани, белково-связанный ГОП - 577,12 мкг/мг сухой ткани;

в легких: свободный ГОП - 20,26 мкг/мг сухой ткани, пептидно-связанный ГОП - 25,90 мкг/мг сухой ткани, белково-связанный ГОП - 57,27 мкг/мг сухой ткани;

в селезенке: свободный ГОП - 69,85 мкг/мг сухой ткани, пептидно-связанный ГОП - 27,09 мкг/мг сухой ткани, белково-связанный ГОП - 86,96 мкг/мг сухой ткани.

Таким образом, реализация заявленного способа позволяет сократить время его осуществления за счет уменьшения длительности щелочного гидролиза с 3-4 час в прототипе до 25-30 мин за счет увеличения концентрации щелочи и повышения температуры до 120-125°С, уменьшить объем биологического материала с 500 мкл до 50 мкл. Заявленный технический результат достигается за счет сочетанного использования двух признаков - более высокой концентрации щелочи (увеличивает скорость гидролиза и полноту извлечения фракций ГОП) и введение реакции нейтрализации после щелочного гидролиза (повышает чувствительность анализа). Уменьшение объема биологического материала открывает перспективы для использования биопсии органов у человека и животных, что существенно расширяет функциональные возможности заявленного способа, как по объектам применения, так и для анализа обмена коллагена при оценке его в различных биологических материалах (сыворотка крови, моча, органы), как у человека, так и животных. Кроме того, заявленный способ позволяет снизить расходы биологического материала и реактивов, а также существенно сократить время исследования. Указанный способ может быть использован для оценки степени фиброза в клинико-биохимических исследованиях.

Claims

Способ определения фракций гидроксипролина в биологическом материале, включающий забор биологического материала, экстракцию из него гидроксипролина путем добавления этанола, центрифугирование, разделение супернатанта и осадка; их высушивание, последующее разведение в дистиллированной воде, разделение разведенного супернатанта на пробу 1 для определения фракции свободного гидроксипролина и пробу 2 для определения фракций свободного и пептидно-связанного гидроксипролина, разведение осадка для пробы 3 для определения фракции белково-связанного гидроксипролина, добавление во все пробы гидроксида натрия, проведение щелочного гидролиза пробы 1 при комнатной температуре и пробы 2 и 3 при нагревании, добавление хлорамина Т в качестве окислителя во все пробы, окрашивание реактивом Эрлиха, измерение оптической плотности во всех пробах, определение по показаниям оптической плотности содержания фракции свободного гидроксипролина в пробе 1, белково-связанного гидроксипролина в пробе 3, содержания фракции пептидно-связанного гидроксипролина как разности между содержанием гидроксипролина в пробах 2 и 1, отличающийся тем, что щелочной гидролиз проводят в течение 25-30 мин, для его проведения используют 4 N раствор гидроксида натрия, щелочной гидролиз проб 2 и 3 осуществляют при +120-125°С; во всех пробах после щелочного гидролиза дополнительно проводят реакцию нейтрализации путем добавления 4 N раствора соляной кислоты; в качестве биологического материала дополнительно используют сыворотку крови, или мочу, или гомогенат ткани легких или селезенки.