RU2732915C1

RU2732915C1 - Fungal strain fusarium equiseti vkpm f-1455 for producing biopreparation which recovers soil for agricultural plants, biopreparation and method for production thereof

Info

Publication number: RU2732915C1
Application number: RU2019124933A
Authority: RU
Inventors: Святослав Петрович Феоктистов
Original assignee: Святослав Петрович Феоктистов
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2020-09-24
Also published as: WO2021025582A1

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions is proposed: Fusarium equiseti fungal strain VKPM F-1455 - producer of biologically active compounds, method for its cultivation of strain and biopreparation based on Fusarium equiseti strain VKPM F-1455 strain. Strain Fusarium equiseti VKPM F-1455, which is capable of producing biologically active compounds, is deposited under registration number VKPM F-1455 and can be used to produce an enzymatic biopreparation. Method for producing an enzymatic preparation involves growing a strain of fungus Fusarium equiseti VKPM F-1455 on a nutrient medium containing beet-roots molasses, glucose, ammonium nitrate, potassium phosphate, microelements and water at specified content of components. Culturing is carried out for 36–48 hours at temperature 22 ± 1 °C, pH 5.5–6.2 and content of reducing substances in the culture medium of 0.9–1.5 wt. % with subsequent filtration and thickening of native solution of culture medium to produce biopreparation. Biopreparation is a condensed filtrate of native solution of culture medium and can be used for soil restoration for agricultural plants.

EFFECT: group of inventions makes it possible to increase crop capacity of agricultural plants.

3 cl, 16 dwg, 13 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к полученному селекционным путем штамму гриба Fusarium equiseti Д -117, являющийся продуцентом широкого спектра активных соединений, оказывающих антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижающие содержание токсических веществ: гербицидов, пестицидов и солей тяжелых металлов в почве, устраняющие токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на популяцию почвенной микрофлоры и растения, повышающие рост и активность микрофлоры почвы в том числе после химической обработки почвы, повышающие образование и скорость накопления органических веществ в почве, повышающие концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, восстанавливающие и защищающие плодородный слой почвы от разрушения. И создание на основе его метаболитов ферментного препарата «Агрофлорин».The invention relates to a selectively obtained strain of the fungus Fusarium equiseti D -117, which is a producer of a wide range of active compounds that have an antagonistic effect on root rot pathogens, reducing the content of toxic substances: herbicides, pesticides and heavy metal salts in the soil, eliminating the toxic effect of herbicides, pesticides and other chemicals on the population of soil microflora and plants, increasing the growth and activity of soil microflora, including after chemical soil treatment, increasing the formation and rate of accumulation of organic substances in the soil, increasing the concentration and activity of soil enzymes in the soil, restoring and protecting the fertile layer soil from destruction. And the creation on the basis of its metabolites of the enzyme preparation "Agroflorin".

Штамм Fusarium equiseti Д - 117 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1455 и может быть использован для создания на основе его активных метаболитов биопрепаратов для сельского хозяйства.The Fusarium equiseti D - 117 strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms under the registration number VKPM F-1455 and can be used to create biological products for agriculture on the basis of its active metabolites.

Изобретение позволяет получать в процессе культивирования продуцента активные соединения метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды продуцента и создавать на их основе биопрепараты проявляющие антагонистическую активность против возбудителей корневой гнили, нейтрализующие токсическое действие пестицидов, гербицидов на почвенную микрофлору и растения, уменьшающие содержание солей тяжелых металлов в почве, повышающие образование и скорость накопления органических веществ, концентраций и активность почвенных ферментов в почве и восстанавливающие плодородный слой почвы.The invention makes it possible to obtain, during the cultivation of the producer, active compounds of metabolites in the native solution of the filtrate of the culture medium of the producer and to create, on their basis, biological preparations exhibiting antagonistic activity against pathogens of root rot, neutralizing the toxic effect of pesticides, herbicides on the soil microflora and plants, reducing the content of salts of heavy metals in the soil that increase the formation and rate of accumulation of organic matter, the concentration and activity of soil enzymes in the soil and restore the fertile soil layer.

Актуальность проблемыThe urgency of the problem

Ежегодно увеличивающийся рост использования пестицидов, минеральных удобрений и химических средств защиты растений в сельском хозяйстве в ущерб экологии и здравому смыслу ведет к антропогенным разрушительным последствиям (Добровольский Г.В. "Тихий кризис планеты", Вестник Российской академии наук, 1997, т. 67, №4, с. 313-320):The annually increasing growth in the use of pesticides, mineral fertilizers and plant protection chemicals in agriculture, to the detriment of ecology and common sense, leads to anthropogenic destructive consequences (Dobrovolsky G.V. "Quiet crisis of the planet", Bulletin of the Russian Academy of Sciences, 1997, vol. 67, No. 4, p. 313-320):

Разрушается почва и уничтожается гумусный (плодородный) слой.

The soil is destroyed and the humus (fertile) layer is destroyed.

В результате применения пестицидов и минеральных удобрений резко растет минерализация почв, снижается содержание углерода и питательных веществ, увеличивается подвижность почвообразующих элементов и их вымывание, что приводит к деградации и разрушению почвенного покрова и уничтожению гумусного (плодородного) слоя почвы.As a result of the use of pesticides and mineral fertilizers, soil mineralization sharply increases, the content of carbon and nutrients decreases, the mobility of soil-forming elements and their leaching increase, which leads to the degradation and destruction of the soil cover and the destruction of the humus (fertile) soil layer.

Разрушается естественная биоцинозная система почв.

The natural biocinous system of soils is destroyed.

Использование в сельском хозяйстве химических препаратов приводит к резкому снижению численности специфической сапротрофной почвенной микрофлоры. И как следствие этого к резкому снижению в почве концентраций и активности почвенных ферментов, ухудшению условий иммобилизации различных ферментов и резкому снижению содержания в почве органических соединений, таких как углеводы, фосфорорганические и азоторганические соединения, являющиеся основными носителями молекул внеклеточных ферментов, участвующих в почвенных биохимических обменных процессах. В результате этого резко замедляются процессы разложения растительных остатков, органических удобрений, пестицидов и других химических веществ, что приводит к накоплению в почве лигнина, фенолов, других фитотоксинов и солей тяжелых металлов.The use of chemicals in agriculture leads to a sharp decrease in the number of specific saprotrophic soil microflora. And as a consequence of this, to a sharp decrease in the concentration and activity of soil enzymes in the soil, a deterioration in the conditions for immobilization of various enzymes and a sharp decrease in the content of organic compounds in the soil, such as carbohydrates, organophosphorus and nitrogen organic compounds, which are the main carriers of extracellular enzyme molecules involved in soil biochemical metabolic processes. As a result, the processes of decomposition of plant residues, organic fertilizers, pesticides and other chemicals are sharply slowed down, which leads to the accumulation of lignin, phenols, other phytotoxins and heavy metal salts in the soil.

Увеличивается рост фитопатогенной флоры и накопление токсических веществ в почве и растениях.

The growth of phytopathogenic flora and the accumulation of toxic substances in soil and plants increase.

Нарушение равновесия, гибель и угнетение активности полезной почвенной микрофлоры приводят к утомлению и истощению почв, снижению активности биохимических обменных процессов, накоплению в почве токсических веществ, что создает благоприятные условия для роста и развития корневой гнили, патогенных грибов и других фитопатогенов. В результате чего растет поражаемость сельскохозяйственных культур и посевного материала фитопатогенами, фитотоксинами и корневой гнилью, резко падает урожайность сельскохозяйственных культур и снижается рентабельность сельскохозяйственного производства.Imbalance, death and suppression of the activity of beneficial soil microflora lead to fatigue and depletion of soils, a decrease in the activity of biochemical metabolic processes, the accumulation of toxic substances in the soil, which creates favorable conditions for the growth and development of root rot, pathogenic fungi and other phytopathogens. As a result, the susceptibility of crops and sowing material to phytopathogens, phytotoxins and root rot is increasing, the yield of agricultural crops is sharply falling and the profitability of agricultural production is decreasing.

Новизна изобретения.The novelty of the invention.

В сложившихся условиях для восстановления почв, повышения качества сельхозпродукции и борьбы с фитопатогенной флорой возникает необходимость создания и использования в сельскохозяйственном производстве биопрепаратов (биологических средств защиты, биоудобрений, ферментных препаратов) не наносящих вред растениям, животным и человеку, которые позволяют создать оптимальный баланс между показателями экологичности, экономичности и энергоэффективности агропроизводства. На данном этапе их основу в основном составляют биопрепараты на основе живых бактерий или продуктов их жизнедеятельности.In the current conditions, to restore soil, improve the quality of agricultural products and combat phytopathogenic flora, it becomes necessary to create and use biological products in agricultural production (biological remedies, biofertilizers, enzyme preparations) that do not harm plants, animals and humans, which allow you to create an optimal balance between indicators environmental friendliness, economy and energy efficiency of agricultural production. At this stage, they are mainly based on biological products based on live bacteria or products of their vital activity.

Однако данная группа биопрепаратов имеет ряд значительных недостатков: они не устойчивы и очень чувствительны к изменениям температур, влажности и состоянию почв и имеют короткий период действия (срок жизни колоний микроорганизмов составляет до 2 недель). Эффективность и спектр действия биопрепаратов на основе живых микроорганизмов очень мала, так как бактерии имеют узкий набор и малые концентрации продуцируемых метаболитов, что делает их малоэффективными и экономически не выгодными. Поэтому, для повышения эффективности действия биопрепаратов целесообразно использовать готовые активные метаболиты, а не живые микроорганизмы.However, this group of biological products has a number of significant disadvantages: they are not stable and very sensitive to changes in temperature, humidity and soil conditions and have a short period of action (the life of colonies of microorganisms is up to 2 weeks). The effectiveness and spectrum of action of biological products based on living microorganisms is very low, since bacteria have a narrow set and low concentrations of the metabolites produced, which makes them ineffective and economically unprofitable. Therefore, to increase the efficiency of biological products, it is advisable to use ready-made active metabolites, rather than living microorganisms.

Наиболее эффективными оказываются активные метаболиты грибов, так как метаболическая активность грибов, набор и концентрации синтезируемых ими метаболитов в десятки раз превышает возможности других микроорганизмов, в том числе бактерий. При этом, биологическая активность метаболитов практически не зависит от состояния почв и температуры окружающей среды. Что делает их более экономически выгодными, более эффективными и удобными для применения. Кроме того, по сравнению с бактериями, метаболиты грибов оказывают более широкий спектр биологического действия и способны подавлять рост и развитие фитопатогенной флоры, в том числе патогенных грибов. По данным ряда авторов: Зубейру (1995, 1997), Шкаликов (1995), Моисеева (1997), Хашим (2000), Дорофеев В.А (2001) была показана антагонистическая активность ряда грибов против корневой гнили.The most effective are the active metabolites of fungi, since the metabolic activity of fungi, the set and concentration of metabolites synthesized by them are tens of times higher than the capabilities of other microorganisms, including bacteria. At the same time, the biological activity of metabolites practically does not depend on the state of the soil and the ambient temperature. Which makes them more cost effective, more efficient and easier to use. In addition, compared to bacteria, fungal metabolites have a wider spectrum of biological effects and are able to suppress the growth and development of phytopathogenic flora, including pathogenic fungi. According to a number of authors: Zubeiru (1995, 1997), Shkalikov (1995), Moiseeva (1997), Khashim (2000), Dorofeev V.A. (2001), the antagonistic activity of a number of fungi against root rot was shown.

В последние годы опубликовано большое количество исследований, доказывающих эффективность использования в качестве компонентов биопрепаратов белки и аминокислоты. Внесение аминокислот в почву рассматривается как одно из наиболее перспективных направлений оптимизации минерального питания растений и повышения их устойчивости к действию стрессовых факторов внешней среды. Кроме того, растения способны так же усваивать такие сложные органические соединения, как полипептиды, полисахариды, витамины, сахара, органические кислоты, ферменты и др. (Пильщикова Н.В. "Физиология растений с основами микробиологии" 2004).In recent years, a large number of studies have been published proving the effectiveness of using proteins and amino acids as components of biological products. The introduction of amino acids into the soil is considered as one of the most promising directions for optimizing the mineral nutrition of plants and increasing their resistance to the action of stressful environmental factors. In addition, plants are also able to assimilate such complex organic compounds as polypeptides, polysaccharides, vitamins, sugars, organic acids, enzymes, etc. (Pil'shchikova N.V. "Plant physiology with the basics of microbiology" 2004).

В литературе имеются сведения об участии высокомолекулярных соединений (полипептидов, ферментов, полисахаридов) различных микроорганизмов во взаимоотношениях с растениями (Морозова 1990, Duijiff 1994, Фиофилова 1994, Nihei 1998). Из научных исследований известно, что белки, ферменты, полисахариды, фитогормоны и другие активные соединения, выделенные из микроорганизмов, в том числе из грибов положительно влияют на физиологию растений (Г.Н. Чупахина, А.Ю. Романчук. Возможный механизм стимулирования ростовых процессов янтарной кислотой. 1999, Емельянова Е.П. Влияние ауксинов на укоренение растений.)There is information in the literature on the participation of high molecular weight compounds (polypeptides, enzymes, polysaccharides) of various microorganisms in interactions with plants (Morozova 1990, Duijiff 1994, Fiofilova 1994, Nihei 1998). It is known from scientific research that proteins, enzymes, polysaccharides, phytohormones and other active compounds isolated from microorganisms, including fungi, have a positive effect on plant physiology (GN Chupakhina, A.Yu. Romanchuk. Possible mechanism of stimulating growth processes succinic acid. 1999, Yemelyanova E.P. The influence of auxins on plant rooting.)

Основываясь на научных данных и в ходе проведения научных работ, был получен селекционным путем новый штамм гриба Fusarium equiseti Д - 117. Данный селекционный штамм гриба обладает высокой ферментативной активностью и широким спектром продуцируемых активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов. Метаболиты нативного раствора фильтрата культуральной среды данного штамма гриба проявляют высокую биологическую активность на почвообразующие процессы, а также проявляют высокую антагонистическую активность в отношении корневой гнили и других фитопатогенных грибов, что было изучено и показано в ряде научных исследований, проведенных в ведущих научных центрах страны.Based on scientific data and in the course of scientific work, a new strain of the fungus Fusarium equiseti D - 117 was obtained by selection. This selection strain of the fungus has a high enzymatic activity and a wide range of produced active metabolites, including organic acids and gibberellins. The metabolites of the native solution of the filtrate of the culture medium of this strain of the fungus exhibit high biological activity on soil-forming processes, as well as exhibit high antagonistic activity against root rot and other phytopathogenic fungi, which has been studied and shown in a number of scientific studies conducted in the leading scientific centers of the country.

Для оценки продуктивности нового штамма, как продуцента биологически активных метаболитов нами был исследован химический состав нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента (таблица 1). Показано, что в его состав входят белки (полипептиды, ферменты), аминокислоты, углеводы (полисахариды), жиры, большое количество органических кислот, витамины группы В, комплекс микро- и макроэлементов в виде органических соединений (таблица 2-4).To assess the productivity of the new strain as a producer of biologically active metabolites, we investigated the chemical composition of the native solution of the producer's culture medium filtrate (Table 1). It has been shown that it contains proteins (polypeptides, enzymes), amino acids, carbohydrates (polysaccharides), fats, a large amount of organic acids, B vitamins, a complex of micro- and macroelements in the form of organic compounds (Table 2-4).

Таким образом, представленные данные лабораторных исследований нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента подтверждают, что штамм гриба Fusarium equiseti Д-117 в процессе своего роста продуцирует большое количество активных соединений: белков (полипептидов, ферментов), углеводов (полисахаридов), аминокислот, витаминов, органических кислот и гиббереллинов, а также микро и макроэлементов.Thus, the presented data of laboratory studies of the native solution of the producer's culture medium filtrate confirm that the strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 in the process of its growth produces a large number of active compounds: proteins (polypeptides, enzymes), carbohydrates (polysaccharides), amino acids, vitamins, organic acids and gibberellins, as well as micro and macro elements.

Нами впервые было изучено и показано эффективное положительное действие метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые новым селекционным штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 по защите популяции почвенной микрофлоры и восстановлении ее активности после токсического действия гербицидов, пестицидов и др. химических веществ, по снижению содержания в почве солей тяжелых металлов, на подавление роста и развития фитопатогенной флоры, в том числе корневых гнилей. А также, было показано их действие на повышение органической составляющей почвы, активацию биохимических реакций в почве и растениях и восстановления гумусного (плодородного) слой почвы. Что было показано в ряде научных исследований, проведенных в ведущих научных центрах страны.We were the first to study and show the effective positive effect of metabolites of the native solution of the culture medium filtrate produced by a new selection strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 to protect the population of soil microflora and restore its activity after the toxic effect of herbicides, pesticides and other chemicals, to reduce the content of soil salts of heavy metals, to suppress the growth and development of phytopathogenic flora, including root rot. And also, it was shown their effect on increasing the organic component of the soil, activating biochemical reactions in soil and plants and restoring the humus (fertile) soil layer. What has been shown in a number of scientific studies conducted in the leading scientific centers of the country.

Из материалов научного исследования, проведенного во Всероссийском Научно-Исследовательском Институте Биологической Защиты Растений: фиг. 1.From the materials of a scientific study carried out at the All-Russian Scientific Research Institute for Biological Protection of Plants: fig. 1.

«При исследовании образцов почв, обработанных гербицидным препаратом, наибольшее количество полезной почвенной микрофлоры было выделено в образцах почв, с применением активных метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды штамма гриба Fusarium equiseti Д-117 и составило 65,5%. В первом контрольном варианте почвенных образцов (не обработанных гербицидом препаратом) данный показатель составил 13,4%, а во втором контрольном варианте почвенных образцов (обработанных гербицидом) данный показатель составил 7,2%. В то же время максимальное количество патогенных грибов, свидетельствующих об утомленности почв (Penicillium и Aspergillus), было отмечено в варианте с применением гербицида - 84,5%. В контрольном, варианте с применением метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды количество указанных грибов было на уровне 23%».“When studying soil samples treated with a herbicidal preparation, the largest amount of useful soil microflora was isolated in soil samples using active metabolites of the native solution of the culture medium filtrate of the Fusarium equiseti D-117 fungus strain and amounted to 65.5%. In the first control variant of soil samples (not treated with the herbicide preparation) this indicator was 13.4%, and in the second control variant of soil samples (treated with herbicide) this indicator was 7.2%. At the same time, the maximum amount of pathogenic fungi indicating soil fatigue (Penicillium and Aspergillus) was observed in the variant with the use of herbicide - 84.5%. In the control variant with the use of metabolites of the native solution of the culture medium filtrate, the amount of these fungi was at the level of 23%.

Полученные результаты исследования состояния микрофлоры почвенных образцов, обработанные метаболитами нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117, достоверно указывают на восстановление (сохранение) и активацию почвенной микрофлоры после обработки гербицидом и свидетельствует об отсутствии токсического и угнетающего действия гербицида на почвенную микрофлору и биологическое состояние почвы в целом. А также, достоверно показывают угнетающее действие метаболитов, продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 на рост и развитие патогенных грибов.The obtained results of the study of the state of the microflora of soil samples, treated with metabolites of the native solution of the culture medium filtrate, produced by the fungus strain Fusarium equiseti D-117, reliably indicate the restoration (preservation) and activation of soil microflora after treatment with herbicide and indicate the absence of the toxic and inhibitory effect of the herbicide on the soil microflora and the biological state of the soil in general. And also, they reliably show the inhibitory effect of metabolites produced by the fungus strain Fusarium equiseti D-117 on the growth and development of pathogenic fungi.

Из материалов научно-лабораторных исследований, проведенного в Мадридском Политехническом Университете и Центральной Испытательной лаборатории ФГБУ ГЦАС: «Так однократное внесение активных метаболитов продуцента в почвенные образцы позволило повысить концентрацию органических веществ в почве в 2,3 раза по отношению к контролю и значительно снизить концентрации солей свинца и кадмия в почве (фиг. 2 и 3).From the materials of scientific and laboratory research carried out at the Madrid Polytechnic University and the Central Testing Laboratory of the FGBU GCAS: “Thus, a single introduction of the active metabolites of the producer into soil samples made it possible to increase the concentration of organic substances in the soil by 2.3 times in relation to the control and significantly reduce the concentration of salts lead and cadmium in the soil (Figs. 2 and 3).

Данные анализа почвенных образцов, полученных под действием метаболитов (ферментов) продуцируемых штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 достоверно свидетельствуют об их существенной роли на трансформацию и снижение содержания солей тяжелых металлов в почве и повышению концентрации органического вещества в почвенных образцах.The data of the analysis of soil samples obtained under the action of metabolites (enzymes) produced by the strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 reliably indicate their significant role in the transformation and decrease in the content of salts of heavy metals in the soil and an increase in the concentration of organic matter in soil samples.

Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина: фиг. 4From materials of scientific field research carried out at the All-Russian Research Institute of Plant Industry named after V.I. I.V. Michurina: Fig. 4

«Так спустя 15 дней после внесения метаболитов продуцента в почву все элементы качества (Р, K, Mg, Са), отвечающие за полноценное развитие растений оказались выше, чем перед внесением. Так внесенные метаболиты способствовали увеличению содержания в листьях фосфора на 32 пункта, калия - на 192, кальция - на 84, магния - на 51. Анализ проведен на сертифицированном экспресс оборудовании «Аквадонис».“So 15 days after the introduction of the producer's metabolites into the soil, all the quality elements (P, K, Mg, Ca), which are responsible for the full development of plants, turned out to be higher than before the introduction. Thus, the introduced metabolites contributed to an increase in the content of phosphorus in the leaves by 32 points, potassium - by 192, calcium - by 84, magnesium - by 51. The analysis was carried out on certified express equipment "Aquadonis".

Данные анализа растительных образцов, полученные под действием метаболитов продуцента на трансформацию элементов питания в почве, свидетельствуют о существенной роли ферментов нативного фильтрата культуральной среды, продуцируемые данным штаммом гриба в активации биохимических реакций в почве и растениях и оптимизации минерального питания растений.The data of the analysis of plant samples obtained under the influence of the producer's metabolites on the transformation of nutrients in the soil indicate a significant role of the enzymes of the native filtrate of the culture medium, produced by this fungus strain in the activation of biochemical reactions in the soil and plants and the optimization of the mineral nutrition of plants.

«Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение метаболитов продуцента в почву: повышает образование и скорость накопления (концентрации) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях. Значительно повышается концентрация и активность почвенных ферментов, увеличивается способность иммобилизовать молекулы внеклеточных ферментов, тем самым существенно увеличивается скорость течения биохимических реакций и процессов в почве и растениях и значительно повышается биодоступность и усвояемость питательных веществ растениями».“The data obtained in the course of scientific research reliably indicate that the introduction of the producer's metabolites into the soil: increases the formation and rate of accumulation (concentration) of useful organic substances and microelements in the soil and plants. The concentration and activity of soil enzymes increases significantly, the ability to immobilize molecules of extracellular enzymes increases, thereby significantly increasing the rate of biochemical reactions and processes in soil and plants and significantly increasing the bioavailability and assimilation of nutrients by plants. "

Таким образом, представленные данные проведенных научных и лабораторных исследований достоверно подтверждают заявляемые биологические эффекты и действия метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117, заключающиеся в том, что метаболиты нативного фильтрата культуральной среды продуцента, оказывают антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижают содержание солей тяжелых металлов в почве, устраняют токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на состояние и активность почвенной микрофлоры и растения, повышают образование и скорость накопления органических веществ, повышают концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, усиливают биохимические реакции протекающие в почве и растениях, улучшают биодоступность и усвояемость питательных веществ растениями.Thus, the presented data of scientific and laboratory studies reliably confirm the claimed biological effects and actions of the metabolites of the native solution of the culture medium filtrate produced by the Fusarium equiseti D-117 fungus strain, which consists in the fact that the metabolites of the native filtrate of the producer's culture medium have an antagonistic effect on root pathogens. rot, reduce the content of salts of heavy metals in the soil, eliminate the toxic effect of herbicides, pesticides and other chemicals on the state and activity of soil microflora and plants, increase the formation and rate of accumulation of organic matter, increase the concentration and activity of soil enzymes in the soil, enhance biochemical reactions flowing in the soil and plants, improve the bioavailability and assimilation of nutrients by plants.

Практическая ценность работыThe practical value of the work

Изобретение относится к способу и технологии культивирования продуцента активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов, нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д-117 и заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде, в которой с целью повышения синтеза гиббереллинов, увеличения скорости фильтрации культуральной жидкости и снижения себестоимости среды, в качестве основного источника глюкозы используют комбинацию глюкозы и свекловичной мелассы, являющуюся одновременно стимулятором синтеза гиббереллинов, а в качестве основного источника органического азота - аммоний азотнокислый, при следующих соотношениях: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л, глюкоза 4,0-7,0 г/л аммоний азотнокислый 0,6-0,8 г/л; фосфат калия 3,0-6,0 г/л, микроэлементы 0,25-1,0 мг/л, балансное количество воды. При этом процесс культивирования осуществляется в течении 36-48 часов при температуре 22+1 С и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9-1,5%, что позволяет получить значимые концентрации активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллиновой кислоты в нативном фильтрате культуральной среды, значительно увеличить скорость фильтрации культуральной жидкости и как следствие этого, значительно снизить себестоимость производства препарата.The invention relates to a method and technology for the cultivation of a producer of active metabolites, including organic acids and gibberellins, of a new selection strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 and consists in growing the producer on a liquid nutrient medium, in which, in order to increase the synthesis of gibberellins, increase the filtration rate of the culture liquid and reducing the cost of the medium, a combination of glucose and beet molasses is used as the main source of glucose, which simultaneously stimulates the synthesis of gibberellins, and ammonium nitrate is the main source of organic nitrogen, with the following ratios: beet molasses 40.0-60.0 g / l, glucose 4.0-7.0 g / l ammonium nitrate 0.6-0.8 g / l; potassium phosphate 3.0-6.0 g / l, trace elements 0.25-1.0 mg / l, balanced amount of water. At the same time, the cultivation process is carried out for 36-48 hours at a temperature of 22 + 1 C and until the content of reducing substances in the culture medium is 0.9-1.5%, which makes it possible to obtain significant concentrations of active metabolites, including organic acids and gibberellic acid. in the native filtrate of the culture medium, significantly increase the rate of filtration of the culture fluid and, as a consequence, significantly reduce the production cost of the drug.

Известно, что вегетативный рост грибов и их продуктивность можно эффективно регулировать источниками питания. В любой питательной среде для грибов значительную роль играют источник углерода и азота, а также их концентрации. В ходе изучения вегетативных особенностей нового штамма гриба, был определен наиболее эффективный источник углерода и азота, и их оптимальные концентрации, обеспечивающие максимальный рост биомассы мицелия гриба и высокий синтеза активных метаболитов, (таблица 5 и 6).It is known that the vegetative growth of fungi and their productivity can be effectively regulated by food sources. In any nutrient medium for fungi, the source of carbon and nitrogen, as well as their concentration, play a significant role. In the course of studying the vegetative characteristics of the new strain of the fungus, the most effective source of carbon and nitrogen, and their optimal concentrations, ensuring the maximum growth of the biomass of the fungus mycelium and high synthesis of active metabolites, were determined (tables 5 and 6).

Анализ полученных данных показал, что наиболее эффективным источником углеводов для максимального роста грибного мицелия является комбинация мелассы свекловичной и глюкозы. Оптимальными для роста мицелия гриба оказались соотношения концентраций мелассы 40,0-60,0 г/л и глюкозы - 4,0-7,0 г/л и органического азота - 0,6-0,8 г/л. При этом было отмечено, что, максимальный рост мицелия (набор биомассы мицелия) наблюдался на 2 сутки. А интенсивность лизиса мицелия наблюдалась на 4-6 сутки культивирования и находилась в прямой зависимости от времени и температуры культивирования. В других вариантах мицелий гриба находился в стадии активного роста до конца эксперимента.Analysis of the data obtained showed that the most effective source of carbohydrates for maximum growth of mushroom mycelium is a combination of beet molasses and glucose. Optimal for the growth of fungal mycelium were the ratios of the concentrations of molasses 40.0-60.0 g / l and glucose - 4.0-7.0 g / l and organic nitrogen - 0.6-0.8 g / l. It was noted that the maximum growth of mycelium (mycelium biomass gain) was observed on the 2nd day. And the intensity of mycelium lysis was observed on days 4-6 of cultivation and was in direct proportion to the time and temperature of cultivation. In other variants, the fungal mycelium was in the stage of active growth until the end of the experiment.

Таким образом, проведенные исследования питательной потребности культуры селекционного штамма гриба позволили определить оптимальные концентрации компонентов питательной среды, определить оптимальные сроки и температуру культивации штамма, с достижением значимых концентраций активных метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды и увеличением скорости фильтрации культуральной жидкости до 110 мл в минуту по сравнению с другими питательными средами. Что позволяет значительно снизить себестоимость производства препаратов.Thus, the conducted studies of the nutritional needs of the culture of the selection strain of the fungus made it possible to determine the optimal concentrations of the components of the nutrient medium, to determine the optimal timing and temperature of the cultivation of the strain, with the achievement of significant concentrations of active metabolites in the native filtrate of the culture medium and an increase in the filtration rate of the culture fluid to 110 ml per minute by compared with other nutrient media. This allows you to significantly reduce the cost of production of drugs.

Анализируя результаты научных исследований вегетативных особенностей штамм гриба Fusarium equiseti Д - 117, было отмечено, что штамм гриба Fusarium equiseti Д-117 на всех стадиях своего развития продуцировал активные метаболиты и гиббереллины, однако в фазу активного роста мицелия, гриб накапливает полипептиды в мицелии и практически не выделяет их в культуральную среду, зато выделял большое количество ферментов, углеводов (полисахаридов), витаминов и органических кислот. А в фазу активного лизиса мицелий выделял в культуральную среду большое количество полипептидов, но при этом его ферментативная активность резко снижалась. Исходя из полученных данных было определено оптимальное время культивации гриба, которое составило 36-48 часов и обеспечивало достижения максимальных концентраций и соотношение метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды, что было подтверждено в ряде научных экспериментов, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина.Analyzing the results of scientific studies of the vegetative characteristics of the strain of the fungus Fusarium equiseti D-117, it was noted that the strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 at all stages of its development produced active metabolites and gibberellins, however, in the phase of active growth of the mycelium, the fungus accumulates polypeptides in the mycelium and practically does not release them into the culture medium, but it does release a large amount of enzymes, carbohydrates (polysaccharides), vitamins and organic acids. And in the phase of active lysis, the mycelium released a large amount of polypeptides into the culture medium, but at the same time its enzymatic activity sharply decreased. Based on the data obtained, the optimal cultivation time of the fungus was determined, which was 36-48 hours and ensured the achievement of maximum concentrations and the ratio of metabolites in the native filtrate of the culture medium, which was confirmed in a number of scientific experiments carried out at the All-Russian Research Institute of Plant Industry named after V.I. I.V. Michurina.

В первую очередь была проведена оценка эффективности действия метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента в зависимости от времени культивирования гриба. В результате проведенного исследования была достоверно показана прямая зависимость эффективности действия различных концентраций метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды на растения, подвергнутые воздействию моделированных стрессоров от времени культивирования продуцента. В ходе научного эксперимента было установлено, что не все концентрации метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды продуцента в зависимости от времени культивирования продуцента были одинаково эффективны. Так изучение фотосинтетической активности и интенсивности фотосинтеза показало, что наиболее эффективны были варианты концентраций метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды при культивировании продуцента в интервале 36-48 часов (фиг. 5 и 6).First of all, the effectiveness of the action of metabolites of the native solution of the filtrate of the producer's culture medium was assessed depending on the time of cultivation of the fungus. As a result of the study, a direct dependence of the effectiveness of the action of various concentrations of metabolites in the native filtrate of the culture medium on plants exposed to the simulated stressors on the time of cultivation of the producer was reliably shown. In the course of a scientific experiment, it was found that not all concentrations of metabolites in the native solution of the filtrate of the producer's culture medium, depending on the cultivation time of the producer, were equally effective. Thus, the study of photosynthetic activity and the intensity of photosynthesis showed that the most effective options for the concentration of metabolites in the native solution of the culture medium filtrate during the cultivation of the producer in the interval of 36-48 hours (Fig. 5 and 6).

Фиг. 5 Фотосинтетическая активность листьев подвоев яблони при воздействии стрессоров.FIG. 5 Photosynthetic activity of apple rootstocks leaves under the influence of stressors.

Фиг. 6 Интенсивность фотосинтеза листьев подвоев яблони при воздействии стрессоров.FIG. 6 Intensity of photosynthesis of leaves of apple tree rootstocks when exposed to stressors.

Так анализ работы фотосистемы листьев показал, что показатель Fv/Fm в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (переувлажнение) в среднем за период исследований составил 0,6 и 0,63 отн. ед. соответственно, тогда как в контроле он был 0,42 отн. ед. (что соответствует состоянию близкому к гибели). Подобные показатели, но несколько ниже (0,57 и 0,52 отн. ед. соответственно) отмечены в данных вариантах при воздействии засухи.Thus, the analysis of the leaf photosystem operation showed that the Fv / Fm index in the cultivation variants of the producer for 48 and 36 hours (waterlogging) on average for the period of research was 0.6 and 0.63 rel. units respectively, while in the control it was 0.42 rel. units (which corresponds to a state close to death). Similar indicators, but slightly lower (0.57 and 0.52 rel. Units, respectively), were noted in these variants under the influence of drought.

Аналогичные результаты были получены и при анализе интенсивности фотосинтеза листьев, однако в данном случае различия с контролем были более существенны - в вариантах 48 и 36 часов искомый показатель превышал контроль более чем в 2 раза.Similar results were obtained when analyzing the intensity of leaf photosynthesis, however, in this case, the differences with the control were more significant - in the 48 and 36 hours options, the desired indicator was more than 2 times higher than the control.

Устьичная проводимость листьев так же в значительной степени зависела от воздействия стрессовых факторов высокой влажности почвы и засухи. Помимо этого известно, что высокая температура листовой пластинки, также, отрицательно сказывается на всех физиологических процессах в связи с чем на были проведены замеры данного показателя.The stomatal conductivity of leaves also largely depended on the impact of stress factors of high soil moisture and drought. In addition, it is known that the high temperature of the leaf blade also negatively affects all physiological processes, and therefore this indicator was not measured.

На основании проведенных анализов выявлено положительное влияние на растения всех видов обработок. Так температура листовой пластинки обработанных растений была на 1-1,5°С ниже контрольных в варианте «переувлажнение» и на 1,7-2,2°С - в варианте «засуха» (рис. 3). Устьичная проводимость листьев обработанных растений превышала контроль в 3,2-4,7 раза в варианте «переувлажнение» ив 1,1-1,5 раз в варианте «засуха». По данным показателям, также, наиболее эффективным были концентрации метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (Фиг. 7).Based on the analyzes carried out, a positive effect on plants of all types of treatments was revealed. Thus, the temperature of the leaf blade of the treated plants was 1-1.5 ° C lower than the control ones in the “waterlogging” variant and by 1.7-2.2 ° C in the “drought” variant (Fig. 3). The stomatal conductance of the leaves of the treated plants exceeded the control by 3.2-4.7 times in the “waterlogged” variant and 1.1-1.5 times in the “drought” variant. According to these indicators, also, the most effective were the concentrations of metabolites in the native solution of the culture medium filtrate in the variants of the producer's cultivation for 48 and 36 hours (Fig. 7).

Фиг. 7. Устьичная проводимость и температура листовой пластинки подвоев яблони при воздействии стрессоровFIG. 7. Stomatal conductivity and temperature of the leaf blade of apple rootstocks under stress

Значимым показателями состояния растения являются анатомические характеристики листовой пластинки.Anatomical characteristics of the leaf blade are significant indicators of the state of the plant.

Применение активных метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды во всех вариантах оказал положительное воздействие и на анатомическую структуру листовой пластинки в опыте с моделированием как переувлажнения, так и засухи. По результатам анализов наиболее эффективными в варианте «переувлажнение» были обработки с концентрациями метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (фиг. 8).The use of active metabolites of the native solution of the culture medium filtrate in all variants had a positive effect on the anatomical structure of the leaf blade in the experiment with the modeling of both waterlogging and drought. According to the results of the analyzes, the most effective in the variant "waterlogging" were treatments with the concentrations of metabolites of the native solution of the filtrate of the culture medium in the variants of cultivating the producer for 48 and 36 hours (Fig. 8).

Фиг. 8. Анатомическая структура листовой пластинки подвоев яблони при воздействии стрессоров.FIG. 8. Anatomical structure of the leaf blade of apple rootstocks when exposed to stressors.

Так же, было отмечено увеличение площади листовой пластинки, в варианте переувлажнение при обработке растения концентрациями метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды с культивацией продуцента в течении 36 и 48 часов, величина данного показателя превысила контроль почти в 2 раза общей площади листовой поверхности, (фиг 10).Also, an increase in the area of the leaf blade was noted, in the case of waterlogging when the plant was treated with the concentrations of metabolites of the native solution of the culture medium filtrate with the cultivation of the producer for 36 and 48 hours, the value of this indicator exceeded the control by almost 2 times the total area of the leaf surface, (Fig. 10 ).

Исходя из полученных данных было показано и еще раз подтверждено, что максимальные концентрации и соотношение метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды и их положительное влияние на биохимические процессы, протекающие в растения, достигаются при культивировании продуцента в течении 36-48 часов.Based on the data obtained, it was shown and once again confirmed that the maximum concentrations and ratio of metabolites in the native solution of the culture medium filtrate and their positive effect on the biochemical processes occurring in plants are achieved during the cultivation of the producer for 36-48 hours.

Технический регламент производства.Technical production regulations.

Предлагаемый способ культивирования продуцента активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов, селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д-117, заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде содержащей основные компоненты при следующем оптимальном соотношении: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л; глюкоза 4,0-7,0 г/л; аммоний азотнокислый 0,6-0,8 г/л; фосфат калия 0,3-0,5 г/л; микроэлементы 0,25-1,0 иг/л, балансовое количество воды, рН 5,5-6,2. При этом содержание активных метаболитов в нативном фильтрате культуральной жидкости составляет: массовая доля сухого остатка 1,5-1,7; массовая доля белка 2,5-3,5; массовая доля углеводов 13,0-15,0; массовая доля жиров 0,05; балансовое количество воды до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в культуральном растворе составляет соответственно 9,0-10,9 г/л и 2850-3650 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 95- 110 мл/мин. Оптимальное время культивации продуцента составляет 36 - 48 часов.The proposed method of cultivating a producer of active metabolites, including organic acids and gibberellins, a selection strain of the fungus Fusarium equiseti D-117, consists in growing the producer on a liquid nutrient medium containing the main components with the following optimal ratio: beet molasses 40.0-60.0 g / l; glucose 4.0-7.0 g / l; ammonium nitrate 0.6-0.8 g / l; potassium phosphate 0.3-0.5 g / l; microelements 0.25-1.0 needles / l, balance amount of water, pH 5.5-6.2. The content of active metabolites in the native filtrate of the culture fluid is: mass fraction of dry residue 1.5-1.7; mass fraction of protein 2.5-3.5; mass fraction of carbohydrates 13.0-15.0; mass fraction of fat 0.05; balance amount of water up to 100.0. The concentration of organic acids and gibberellins in the culture solution is 9.0-10.9 g / l and 2850-3650 μg / ml, respectively. The filterability of the culture liquid (by the amount of the resulting native solution) per unit time is 95-110 ml / min. The optimal cultivation time for the producer is 36 - 48 hours.

Возможность получения препарата указанного состава промышленным способом иллюстрируются следующими примерами.The possibility of obtaining a preparation of the specified composition by an industrial method is illustrated by the following examples.

Пример 1.Example 1.

Посевной мицелий для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; рН 5,5-6,2; аэрация 1 м3/м3/мин.The seed mycelium for the working fermentation apparatus is grown first in test tubes on a solid nutrient medium (wort agar), then in flasks on a rocking chair in a liquid nutrient medium and then in an inoculator under the following technological regime: temperature 24 ± 2 С; pH 5.5-6.2; aeration 1 m3 / m3 / min.

Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: меласса свеклосахарная 4,0 г.; глюкоза 0,4 г.; аммоний азотнокислый 0,3 г.; фосфат калия однозамещенный 0,2 г.; рН 6,0, засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Посевной материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает 12-15 г/л. 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.For the preparation of the seed culture, rocking flasks with a capacity of 550 ml with 100 ml of sterile nutrient medium of the following composition: sugar beet molasses 4.0 g; glucose 0.4 g; ammonium nitrate 0.3 g; monosubstituted potassium phosphate 0.2 g; pH 6.0, inoculated with agar culture blocks from test tubes. The seed culture is grown on a rocking chair at a temperature of 24-26 C for 20-24 hours and is used for seeding a production seeding apparatus. The seed is considered ready when the concentration of dry matter of the mycelium in the culture medium reaches 12-15 g / l. 5-10 volume percent of such a medium serves as inoculum, which is transferred aseptically into a working fermentation apparatus.

В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): меласса свеклосахарная 40,0; глюкоза 4,0; аммоний азотнокислый 0,6; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 25,0, рН 6,0, из инокулятора вносят 5-10 объемных процентов культуральной среды, являющейся посевным материалом.In a sowing apparatus with a capacity of 1500 l with 1000 l of sterile nutrient medium of the following composition (g / l): sugar beet molasses 40.0; glucose 4.0; ammonium nitrate 0.6; potassium phosphate monobasic 3.0; microelements 25.0, pH 6.0, 5-10 volume percent of the culture medium, which is the seed material, is introduced from the inoculator.

Процесс ферментации осуществляют методом глубинного культивирования при температуре 22±1 С без механического перемешивания и при аэрации 600 куб. м/ч в течение 36 часов. По окончании ферментации культуральную жидкость подают на фильтр-пресс для отделения биомассы. Следующей стадией технологического процесса является сгущение культуральной среды с помощью вакуумных фильтрующих аппаратов. Количество полученного готового ферментного препарата составляет 1000 л. При этом содержание активных метаболитов в готовом препарате составляет (масс %): массовая доля сухого остатка 1,5; массовая доля белка 2,5; массовая доля углеводов 15,0; массовая доля жиров 0,05; остальное вода до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в нативном растворе составляет соответственно 9,5 г/л и 2850 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 95 мл/мин. Время культивации 36 часов.The fermentation process is carried out by the method of submerged cultivation at a temperature of 22 ± 1 C without mechanical stirring and with aeration of 600 cubic meters. m / h for 36 hours. At the end of the fermentation, the culture liquid is fed to a filter press to separate the biomass. The next stage of the technological process is the thickening of the culture medium using vacuum filtering devices. The amount of the finished enzyme preparation obtained is 1000 liters. The content of active metabolites in the finished product is (wt%): mass fraction of dry residue 1.5; mass fraction of protein 2.5; mass fraction of carbohydrates 15.0; mass fraction of fat 0.05; the rest is water up to 100.0. The concentration of organic acids and gibberellins in the native solution is 9.5 g / l and 2850 μg / ml, respectively. The filterability of the culture liquid (by the amount of the resulting native solution) per unit time is 95 ml / min. The cultivation time is 36 hours.

Пример 2.Example 2.

Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: мальтоза 2,6 г.; аммоний азотнокислый 0,5 г.; фосфат калия однозамещенный 0,3 г.; рН 5,8,-6,2 засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Далее 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.For the preparation of the seed culture, rocking flasks with a capacity of 550 ml with 100 ml of sterile nutrient medium of the following composition: maltose 2.6 g; ammonium nitrate 0.5 g; monosubstituted potassium phosphate 0.3 g; pH 5.8, -6.2 inoculated with agar culture blocks from test tubes. The seed culture is grown on a rocking chair at a temperature of 24-26 C for 20-24 hours and is used for seeding a production seeding apparatus. Further, 5-10 volume percent of such a medium serves as inoculum, which, in compliance with the rules of asepsis, is transferred into a working fermentation apparatus.

Мицелий гриба выращивали в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате объемом 1500 л, с использованием 1000 л следующей питательной среды (г/л): меласса свеклосахарная 60,0; глюкоза 7,0; аммоний азотнокислый 0,5; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 28,0; рН 6,2. Посевной материал вносили в количестве 5 объемных процентов. Температура культивирования 22±1оС, продолжительность культивирования 48 часов. Полученный таким образом препарат имел следующий состав (масс %): массовая доля сухого остатка 1,7; массовая доля белка 3,5; массовая доля углеводов 13,0; массовая доля жиров 0,05; остальное водя до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в нативном растворе составляет соответственно 10,9 г/л и 3650 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 110 мл/мин.The mycelium of the fungus was grown under submerged cultivation in a fermentation apparatus with a volume of 1500 l, using 1000 l of the following nutrient medium (g / l): sugar beet molasses 60.0; glucose 7.0; ammonium nitrate 0.5; potassium phosphate monobasic 3.0; microelements 28.0; pH 6.2. The seed was applied in an amount of 5 percent by volume. The cultivation temperature is 22 ± 1 ° C, the cultivation time is 48 hours. The preparation thus obtained had the following composition (wt%): mass fraction of dry residue 1.7; mass fraction of protein 3.5; mass fraction of carbohydrates 13.0; mass fraction of fat 0.05; the rest leading to 100.0. The concentration of organic acids and gibberellins in the native solution is 10.9 g / l and 3650 μg / ml, respectively. The filterability of the culture fluid (by the amount of the resulting native solution) per unit time is 110 ml / min.

Ферментный препарат «Агрофлорин»Enzyme preparation "Agroflorin"

Основываясь на проведенных научных работах по изучению нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д -117, и его активных метаболитов, оказывающих антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижающие содержание токсических веществ: гербицидов, пестицидов и солей тяжелых металлов в почве, устраняющие токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на популяцию почвенной микрофлоры и растения, повышающие рост и активность микрофлоры почвы в том числе после химической обработки почвы, повышающие образование и скорость накопления органических веществ в почве, повышающих активность и скорость биохимических реакций протекающих в почве и растениях, восстанавливающие и защищающие плодородный слой почвы от разрушения был создан ферментный препарат «Агрофлорин».Based on the research carried out on the study of a new breeding strain of the fungus Fusarium equiseti D -117, and its active metabolites, which have an antagonistic effect on root rot pathogens, reducing the content of toxic substances: herbicides, pesticides and heavy metal salts in the soil, eliminating the toxic effect of herbicides, pesticides and other chemicals on the population of soil microflora and plants, increasing the growth and activity of soil microflora, including after chemical soil treatment, increasing the formation and rate of accumulation of organic substances in the soil, increasing the activity and rate of biochemical reactions occurring in the soil and plants, restoring and protecting the fertile soil layer from destruction, the enzyme preparation "Agroflorin" was created.

Ферментный препарат «Агрофлорин» характеризуется высоким для природных соединений содержанием и уникальным соотношением биологически активных соединений: белков (полипептидов, ферментов), углеводов (полисахаридов), жиров и органических кислот (таблица 7 и 9). Ферментный препарат «Агрофлорин» содержит большое количество аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты (таблица 8). В состав препарата «Агрофлорин» входят витамины группы В, фолиевая и никотиновая кислоты (таблица 11). Минеральный состав ферментного препарата «Агрофлорин» представлен важными для растений макро- и микроэлементами (таблица 10).The enzyme preparation "Agroflorin" is characterized by a high content for natural compounds and a unique ratio of biologically active compounds: proteins (polypeptides, enzymes), carbohydrates (polysaccharides), fats and organic acids (tables 7 and 9). The enzyme preparation "Agroflorin" contains a large number of amino acids, including essential amino acids (table 8). The composition of the preparation "Agroflorin" includes vitamins of group B, folic and niacin (table 11). The mineral composition of the enzyme preparation "Agroflorin" is represented by macro- and microelements important for plants (table 10).

Ферментный препарат «Агрофлорин» является катализатором биохимических реакций протекающих в почве и растениях и предназначен для защиты и восстановления активности популяции полезной почвенной микрофлоры после химической обработки почв (например, применения нематицидов, почвенных гербицидов и др.), для нейтрализации токсического действия пестицидов, гербицидов, для уменьшения концентраций токсических химических веществ и солей тяжелых металлов в почве, для восстановления плодородного (гумусного) слоя почв, для предупреждения развития корневых гнилей и других фитопатогенов, для ускорения процессов разложения растительных остатков в поверхностном слое почвы, для защиты и восстановления мульчирующего слоя почвы, для предохранения почвы от образования почвенной корки; для улучшения структуры почвы и повышения устойчивости почвы к засолению и очистки почв от солей тяжелых металлов. Для восстановления и активации обменных процессов в семенах и растениях. Для улучшения развития корневой и вегетативной частей растения.The enzyme preparation "Agroflorin" is a catalyst for biochemical reactions occurring in soil and plants and is intended to protect and restore the activity of a population of useful soil microflora after chemical soil treatment (for example, the use of nematicides, soil herbicides, etc.), to neutralize the toxic effects of pesticides, herbicides, to reduce the concentration of toxic chemicals and salts of heavy metals in the soil, to restore the fertile (humus) soil layer, to prevent the development of root rot and other phytopathogens, to accelerate the decomposition of plant residues in the surface soil layer, to protect and restore the mulching soil layer, to protect the soil from the formation of a soil crust; to improve the structure of the soil and increase the resistance of the soil to salinization and cleaning the soil from salts of heavy metals. To restore and activate metabolic processes in seeds and plants. To improve the development of the root and vegetative parts of the plant.

Нами в первые была изучена и оценена перспективность и эффективность действия ферментного препарата «Агрофлорин» на основе активных метаболитов нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д - 117 на восстановления почвенной микрофлоры и состояния почв после обработки (гербицидом) и подавлению роста и активности патогенных грибов родов: Cephalosporium, Rizopus, Alternaria, Mucor, Penicillium и Aspergillus, поражающих большинство семян и растений сельскохозяйственных культур и подавляющих полезную почвенную микрофлору (таблица 12-13).We were the first to study and evaluate the prospects and effectiveness of the enzyme preparation "Agroflorin" based on active metabolites of the new selection strain of the fungus Fusarium equiseti D - 117 on the restoration of soil microflora and soil condition after treatment (herbicide) and suppression of the growth and activity of pathogenic fungi of the genera: Cephalosporium, Rizopus, Alternaria, Mucor, Penicillium and Aspergillus, affecting most seeds and plants of agricultural crops and suppressing beneficial soil microflora (Table 12-13).

Анализ данных, приведенных данных в таблице 12, свидетельствует о том, что наибольшее процентное количество грибов рода Trichoderma, которые относятся к супрессивной, т.е. полезной, микрофлоре почв было отмечено в вариантах с применением ферментного препарата «Агрофлорин» на основе метаболитов нового штамма в различных концентрациях. Максимальное количество грибов рода Penicillium, которые свидетельствуют об утомленности почв, было выделено в варианте с обработкой почв гербицидом - вариант 1а. Грибы рода Aspergillus выделялись только в варианте с применением гербицида - вариант 1а. Во всех вариантах, где почва обрабатывалась гербицидом (вариант 1а, 1б и 1в), были выделены одиночные колонии грибов рода Mucor. В некоторых отмечались представители других родов, относящихся к патогенной группе: Cephalosporium, Rizopus, Alternaria. Таким образом было показано, что среди исследуемых образцов наибольшее количество супрессивной, т.е. полезной, микробиоты (грибов р. Trichoderma) выделено в вариантах с применением ферментного препарата «Агрофлорин», что свидетельствует об отсутствии токсического действия гербицида на почвенную микрофлору и биологическое состояние почвы в целом. А также, достоверно показано угнетающее действие ферментного препарата Агрофлорин на рост и развитие патогенных грибов.Analysis of the data shown in Table 12 indicates that the largest percentage of fungi of the genus Trichoderma, which are suppressive, i.e. useful, soil microflora was noted in variants with the use of the enzyme preparation "Agroflorin" based on the metabolites of the new strain in various concentrations. The maximum number of fungi of the genus Penicillium, which indicate soil fatigue, was isolated in the variant with the treatment of soils with a herbicide - variant 1a. Fungi of the genus Aspergillus were isolated only in the variant with the use of the herbicide - variant 1a. In all variants, where the soil was treated with herbicide (variant 1a, 1b, and 1c), single colonies of fungi of the genus Mucor were isolated. In some, representatives of other genera belonging to the pathogenic group were noted: Cephalosporium, Rizopus, Alternaria. Thus, it was shown that among the studied samples the greatest number of suppressive ones, i.e. useful, microbiota (fungi of the R. Trichoderma) was isolated in variants with the use of the enzyme preparation "Agroflorin", which indicates the absence of the toxic effect of the herbicide on the soil microflora and the biological state of the soil as a whole. And also, the inhibitory effect of the enzyme Agroflorin on the growth and development of pathogenic fungi has been reliably shown.

Нами впервые было изучено и показано действие ферментного препарата «Агрофлорин» на восстановления и активацию почвенных процессов: повышение образования и скорость накопления (концентрацию) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях, в результате чего значительно повышается скорость и активность биохимических реакций в почве и растениях, увеличивается усвояемость растениями питательных веществ и микроэлементов.We were the first to study and show the effect of the enzyme preparation "Agroflorin" on the restoration and activation of soil processes: an increase in the formation and accumulation rate (concentration) of useful organic substances and trace elements in soil and plants, as a result of which the rate and activity of biochemical reactions in the soil and plants, the assimilation of nutrients and microelements by plants increases.

Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина: «Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в почву: повышает образование и скорость накопления (концентрации) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях. Значительно повышается концентрация и активность почвенных ферментов, увеличивается способность иммобилизовать молекулы внеклеточных ферментов, тем самым существенно увеличивается скорость течения биохимических реакций и процессов в почве и растениях. Так однократное внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в прикорневую зону растений позволило повысить содержания в листьях растений калия - на 192 пункта, а также кальция - на 84 и магния - на 51, по отношению к контрольным образцам».From materials of scientific field research carried out at the All-Russian Research Institute of Plant Industry named after V.I. I.V. Michurina: “The data obtained in the course of scientific research provide reliable evidence that the introduction of the enzyme preparation“ Agroflorin ”into the soil: increases the formation and rate of accumulation (concentration) of useful organic substances and microelements in the soil and plants. The concentration and activity of soil enzymes increases significantly, the ability to immobilize molecules of extracellular enzymes increases, thereby significantly increasing the rate of biochemical reactions and processes in soil and plants. Thus, a single application of the enzyme preparation "Agroflorin" in the root zone of plants made it possible to increase the content of potassium in the leaves of plants - by 192 points, as well as calcium - by 84 and magnesium - by 51, in relation to the control samples. "

Увеличение калия, являющегося важнейшим элементом, регулирующим поступление влаги в растения и ее транспирацию, позволило растениям сохранить активность физиологических процессов в условиях засухи. Данные анализа растительных образцов, полученные под действием ферментного препарата «Агрофлорин» на трансформацию элементов питания в почве, свидетельствуют о существенной роли ферментов в оптимизации минерального питания растений и увеличении биодоступности и усвояемости питательных веществ и микроэлементов растениями. На всех культурах, где препарат вносился с капельным поливом, отмечалась повышенная устойчивость к засухе, интенсивное цветение и плодоношение, увеличение размеров плодов и их вкусовых качеств.An increase in potassium, which is the most important element that regulates the flow of moisture into plants and its transpiration, allowed plants to maintain the activity of physiological processes in drought conditions. The data of the analysis of plant samples obtained under the action of the enzyme preparation "Agroflorin" on the transformation of nutrients in the soil testify to the essential role of enzymes in the optimization of the mineral nutrition of plants and an increase in the bioavailability and assimilation of nutrients and microelements by plants. All crops, where the drug was applied with drip irrigation, showed increased resistance to drought, intense flowering and fruiting, an increase in the size of fruits and their taste.

Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина: «Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в прикорневую зону растений позволило значительно увеличить скорость течения биохимических процессов в растениях: развитие вторичной корневой системы превысило контроль в 2 раза, работа интенсивности фотосинтеза листьев превысила контроль более чем в 2, 5 раза, суммарный прирост, общий вес растений по отношению к контрольным образцам составил 75%, увеличение массы и количества плодов по отношению к контролю превысило 1,5 раза», (см. фиг. 10 и 11)».From materials of scientific field research carried out at the All-Russian Research Institute of Plant Industry named after V.I. I.V. Michurina: “The data obtained in the course of scientific research reliably indicate that the introduction of the enzyme preparation“ Agroflorin ”into the root zone of plants made it possible to significantly increase the rate of biochemical processes in plants: the development of the secondary root system exceeded the control by 2 times, the work of the intensity of leaf photosynthesis exceeded the control by more than 2, 5 times, the total increase, the total weight of plants in relation to the control samples was 75%, the increase in the weight and number of fruits in relation to the control exceeded 1.5 times ", (see Fig. 10 and 11) ".

На основании полученных данных проведенных полномасштабных полевых исследований эффективности действия препарата «Агрофлорин» в различных климатических зонах (Брянская обл., Псковская обл., Астраханская обл., Кабардино-Балкарская Республика, Чеченская Республика, Самарская обл., Республика Татарстан и ряд других) и на различных культурах (озимые и яровые зерновые, картофель, подсолнечник, кукуруза, рапс, горчица, хлопчатник, кормовые культуры и т.д.) было достоверно показано, положительное влияние ферментного препарата «Агрофлорин» на развитие растений, увеличение роста и развития корневой и вегетативной системы растений, увеличение и суммарный прирост зеленой части и общего веса растений, увеличения прироста по урожайности. Увеличение устойчивости растений к засухе. Восстановление биоактивности почвы после химических обработок, увеличение интенсивность вовлечения пожнивных остатков в процесс гумусообразования. (Фиг. 9, 12-15).Based on the data obtained from full-scale field studies of the effectiveness of the drug "Agroflorin" in various climatic zones (Bryansk region, Pskov region, Astrakhan region, Kabardino-Balkar Republic, Chechen Republic, Samara region, Republic of Tatarstan and a number of others) and on various crops (winter and spring grains, potatoes, sunflowers, corn, rapeseed, mustard, cotton, forage crops, etc.) it was reliably shown that the positive effect of the enzyme preparation "Agroflorin" on the development of plants, an increase in the growth and development of root and the vegetative system of plants, an increase and total increase in the green part and the total weight of plants, an increase in the increase in yield. Increase plant resistance to drought. Restoration of soil bioactivity after chemical treatments, an increase in the intensity of the involvement of crop residues in the process of humus formation. (Fig. 9, 12-15).

Фиг. 1. Влияние ферментного препарата «Агрофлорин» на урожайностьFIG. 1. Influence of the enzyme preparation "Agroflorin" on the yield

Преимущества и отличия ферментного препарата «Агрофлорин» от биопрепаратов на основе живых микроорганизмов.Advantages and differences of the enzyme preparation "Agroflorin" from biological products based on live microorganisms.

• Ферментный препарат «Агрофлорин» в отличие от биопрепаратов, содержащие живые бактерии, устойчив к перепадам температур, состоянию и химическому загрязнению почв. Действие препарата продолжается 4-6 месяцев в широком диапазоне температур - +1…+50°С. Тогда, как биопрепараты не устойчивы и очень чувствительны к изменениям температур, влажности и состоянию почв. Продолжительность действия биопрепаратов короткое (срок жизни колоний микроорганизмов составляет до 2 недель).• The enzyme preparation "Agroflorin", in contrast to biological preparations containing live bacteria, is resistant to temperature extremes, the state and chemical pollution of soils. The effect of the drug lasts 4-6 months in a wide temperature range - + 1 ... + 50 ° C. While biological products are not stable and very sensitive to changes in temperature, humidity and soil conditions. The duration of action of biological products is short (the life of colonies of microorganisms is up to 2 weeks).

• Действия ферментного препарата «Агрофлорин» начинается сразу при внесении в почву, тогда как, для начала действия биопрепаратов требуется определенное время и оптимальные условия среды (колонии живых микроорганизмов должны адаптироваться в новой среде, должны иметь достаточно питания для начала активной работы. Что при современном состоянии почв практически не реально).• The action of the enzyme preparation "Agroflorin" begins immediately when it is introduced into the soil, whereas, for the start of the action of biological products, a certain time and optimal environmental conditions are required (colonies of living microorganisms must adapt in a new environment, must have enough nutrition to start active work. the state of the soil is practically unreal).

• Эффективность и спектр действия ферментного препарата «Агрофлорин» в десятки раз превышает эффективность и спектр действия биопрепаратов. Причиной тому служат, количество, высокие концентрации и особенности ферментов, в частности их способность сохранять активность в большом диапазоне температурного режима от минусовых до +70°С. При этом каждая молекула фермента способна вступать в реакцию с более чем ста молекулами субстрата в течение одной секунды, что делает ферментный биопрепарат особенно ценными для сельскохозяйственного производства, как в условиях низких температур, так и при засухе.• The effectiveness and spectrum of action of the enzyme preparation "Agroflorin" is dozens of times higher than the efficiency and spectrum of action of biological products. The reason for this is the number, high concentrations and characteristics of enzymes, in particular, their ability to remain active in a wide temperature range from minus to + 70 ° C. Moreover, each enzyme molecule is capable of reacting with more than one hundred substrate molecules within one second, which makes the enzyme biological product especially valuable for agricultural production, both in low temperatures and in drought conditions.

• Очень низкий расход ферментного препарата на единицу площади, в отличие от биопрепаратов. Причиной тому служат, количества и очень высокие концентрации ферментов, питательных веществ и микроэлементов в ферментном препарате. 1 литр ферментного препарата обрабатывает 3 гектара почвы.• Very low consumption of enzyme preparation per unit area, in contrast to biological preparations. The reason for this is the amount and very high concentration of enzymes, nutrients and trace elements in the enzyme preparation. 1 liter of enzyme preparation processes 3 hectares of soil.

Регламент производства ферментного препарата «Агрофлорин»Regulations for the production of the enzyme preparation "Agroflorin"

Посевной мицелий селекционного штамма гриба для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; рН 6,0; аэрация 1 м3/м3/мин.The seed mycelium of the selection strain of the fungus for the working fermentation apparatus is grown first in test tubes on a solid nutrient medium (wort agar), then in flasks on a rocking chair in a liquid nutrient medium and then in an inoculator under the following technological regime: temperature 24 ± 2 С; pH 6.0; aeration 1 m3 / m3 / min.

В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): меласса свеклосахарная 40,0; глюкоза 4,0; аммоний азотнокислый 0,6; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 25,0; рН 6,0, из инокулятора вносят 5-10 объемных процентов культуральной среды, являющейся посевным материалом.In a sowing apparatus with a capacity of 1500 l with 1000 l of sterile nutrient medium of the following composition (g / l): sugar beet molasses 40.0; glucose 4.0; ammonium nitrate 0.6; potassium phosphate monobasic 3.0; microelements 25.0; pH 6.0, 5-10 volume percent of the culture medium, which is the seed material, is introduced from the inoculator.

Процесс ферментации осуществляют методом глубинного культивирования при 22±1 С без механического перемешивания и при аэрации 600 куб. м/ч в течение 36 часов. По окончании ферментации нативный раствор культуральной жидкости подают на фильтр-пресс для отделения биомассы. Следующей стадией технологического процесса является добавление в нативный раствор фильтрата культуральной среды борной кислоты из расчета 2-4 мг/л. и сгущение нативного раствора фильтрата культуральной среды с помощью вакуумных фильтрующих аппаратов. Нативный раствор фильтрата культуральной среды характеризуют по содержанию органических кислот, сухих веществ, величине рН. Количество полученного готового ферментного препарата составляет 1000 л. При этом содержание активных метаболитов в готовом препарате составляет (масс %): массовая доля сухого остатка 1,5; массовая доля белка 2,5; массовая доля углеводов 15,0; массовая доля жиров 0,05; остальное вода до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в готовом препарате составляет соответственно 9,5 г/л и 2850 мкг/мл. Время культивации 36 часов.The fermentation process is carried out by the method of submerged cultivation at 22 ± 1 C without mechanical stirring and with aeration of 600 cubic meters. m / h for 36 hours. At the end of fermentation, the native solution of the culture liquid is fed to a filter press to separate the biomass. The next stage of the technological process is the addition of boric acid to the native solution of the filtrate of the culture medium at the rate of 2-4 mg / l. and thickening the native culture medium filtrate solution using vacuum filtering apparatus. The native solution of the culture medium filtrate is characterized by the content of organic acids, dry substances, pH value. The amount of the finished enzyme preparation obtained is 1000 liters. In this case, the content of active metabolites in the finished product is (wt%): mass fraction of dry residue 1.5; mass fraction of protein 2.5; mass fraction of carbohydrates 15.0; mass fraction of fat 0.05; the rest is water up to 100.0. The concentration of organic acids and gibberellins in the finished product is 9.5 g / l and 2850 μg / ml, respectively. The cultivation time is 36 hours.

Claims

1. The strain of the fungus Fusarium equiseti VKPM F-1455 for obtaining a biological product that restores soil for agricultural plants.

2. A method of obtaining an enzyme biological product based on a strain of the fungus Fusarium equiseti VKPM F-1455, including growing on a liquid nutrient medium containing components at the following ratios: beet molasses - 40.0-60.0 g / l, glucose - 4.0- 7.0 g / l, ammonium nitrate - 0.6-0.8 g / l, potassium phosphate - 3.0-6.0 g / l, trace elements - 1.0 mg / l (manganese sulfate is used as trace elements 0.25, zinc sulfate 0.25 and boric acid 0.5), a balanced amount of water, while the cultivation process is carried out for 36-48 hours at a temperature of 22 ± 1 ° C, pH 5.5-6.2 and up to the content of reducing substances in the culture medium 0.9-1.5 wt. % followed by filtration and concentration of the native culture medium solution.

3. Biological product, which is a thickened filtrate of the native solution of the culture medium, to restore soil for agricultural plants.