RU2732013C1

RU2732013C1 - Method for sensibilization of plate for enzyme immunoassay by insoluble protein antigens

Info

Publication number: RU2732013C1
Application number: RU2019140904A
Authority: RU
Inventors: Павел Христофорович Копылов; Екатерина Александровна Красильникова; Александра Сергеевна Трунякова; Светлана Владимировна Дентовская; Андрей Павлович Анисимов
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-09-10

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceuticals.

SUBSTANCE: invention relates to medicine and pharmaceutics, namely to a method for sensibilization of a plate for enzyme immunoassay by insoluble protein antigens of a plague microbe, involving destruction of bacterial mass by ultrasound followed by separation of subfractions, affinity chromatography of proteins, separation and dissolution of purified target protein precipitate with denaturation of urea and determination of their concentration in solutions, characterized by that a solution of denatured in purified urea fibres MetQ, OmpA, Fba and YapM is added to the wells of the plate and subsequent ten-fold dilution in the wells with a carbonate-bicarbonate buffer solution, accompanied by renaturation of proteins and their passive immobilisation in polystyrene plates.

EFFECT: technical effect consists in sensitizing polystyrene plates with protein antigens, insoluble in standard buffer systems used at the first stage of treatment, and performing ELISA for such protein antigens, thereby increasing sensitivity and specificity of the test.

1 cl, 5 dwg, 1 tbl, 5 ex

Description

Изобретение принадлежит области биотехнологии и представляет собой частный случай условий обеспечивающих пассивную иммобилизацию труднорастворимых белков, полученных генно-инженерным способом (например, мембранных), на поверхности полистирола, способствующий в итоге формированию иммунных комплексов при постановке твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).The invention belongs to the field of biotechnology and is a special case of conditions providing passive immobilization of sparingly soluble proteins obtained by a genetically engineered method (for example, membrane proteins) on the surface of polystyrene, which ultimately contributes to the formation of immune complexes when staging an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Иммуноферментный анализ прочно удерживает позиции в арсенале современных аналитических методов исследования благодаря высокой специфичности, чувствительности, универсальности, скорости и относительной простоты выполнения. Метод включает последовательное развитие иммунохимических взаимодействий, при этом начальные и последующие составляющие анализа иммобилизованы на твердой фазе, что позволяет легко удалять использованные реагенты, вводить новые и осуществлять накопление детектируемых продуктов в реакционных объемах растворов, кратно увеличивая тем самым чувствительность определения в широком динамическом диапазоне [EngvallE: 1977. Med Biol., 55 (4): 193-200, Kohl Т.О., Ascoli C.A: 2017(7). Cold Spring HarbProtoc, doi: 10.1101/pdb.prot093757, Kohl Т.О., Ascoli C.A: 2017(6). ColdSpringHarbProtoc., doi: 10.1101/pdb.prot093724.]. Базируясь поначалу на формате 96-луночного полистирольного микропланшета (далее в тексте - планшет) и отвечая возникающим задачам, физическая форма метода подверглась разнообразным изменениям трансформируясь в тест-полоски, мембраны биодатчиков, гелевые матрицы, микросуспензии частиц (полистирол, стекло, латекс, металл), при этом значительно увеличились масштабы тестов и автоматизация работ с жидкостями, чтением и обработкой результатов.The enzyme-linked immunosorbent assay firmly holds positions in the arsenal of modern analytical research methods due to its high specificity, sensitivity, versatility, speed and relative ease of implementation. The method includes the sequential development of immunochemical interactions, while the initial and subsequent components of the analysis are immobilized on the solid phase, which makes it easy to remove used reagents, introduce new ones and accumulate detectable products in the reaction volumes of solutions, thereby multiplying the detection sensitivity in a wide dynamic range [EngvallE : 1977. Med Biol., 55 (4): 193-200, Kohl T.O., Ascoli CA: 2017 (7). Cold Spring HarbProtoc, doi: 10.1101 / pdb.prot093757, Kohl T.O., Ascoli C.A: 2017 (6). ColdSpringHarbProtoc., Doi: 10.1101 / pdb.prot093724.]. Initially based on the format of a 96-well polystyrene microplate (hereinafter referred to as a plate) and responding to the emerging problems, the physical form of the method underwent various changes, transforming into test strips, biosensor membranes, gel matrices, microsuspensions of particles (polystyrene, glass, latex, metal) , at the same time the scale of tests and the automation of work with liquids, reading and processing of results have increased significantly.

Хорошо известные разнообразные тесты для серодиагностики инфекций, радиоиммунологические, иммунодиффузия, иммунофлуоресценция, иммунопреципитация, агглютинация, гемолиз, нейтрализация и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), включающие способы обнаружения антительных иммунных комплексов, этап усиления сигнала и детекцию различными методами, такими как оптические, по интенсивности цвета, флуоресценции, размеру частиц, альтернативно - путем измерения радиоактивности меток в иммунных комплексах. Диагностическим тестом, часто используемым в практике является иммуноферментный анализ (ИФА) с множеством вариантов проведения, типичным начальным шагом является иммобилизация антигенов или антител на твердой фазе, такой как лунки планшета [Патент РФ 2689143 С1], этап иммобилизации является критическим и, в целом, определяет чувствительность теста. На следующих стадиях возможно использование двух вариантов постановки анализа: так называемого теста с «захватом» или сэндвич-ИФА и конкурентнго ИФА (блокирующего, ингибирующего). При сэндвич-ИФА происходит последовательное введение компонентов тест-системы, вследствие иммунохимических взаимодействий молекулярные слои как бы наслаиваются один на другой. Во втором варианте, как полагают более специфичном, определенный компонент системы конкурирует за связывание с меченым антигеном или антителом и уменьшает максимальный регистрируемый сигнал, что фиксируется и выражается в виде доли ингибирования максимального сигнала ИФА. Естественным и необходимым условием является растворимость антигенов в рабочих буферах. В силу относительной простоты, доступности, универсальности и чувствительности ИФА широко используют не только в качестве метода лабораторной диагностики, но и в эпидемиологической практике, как инструмент массового обследования населения и отбора лиц для проведения вакцинации. В этом контексте критичным является чувствительность и специфичность ИФА-тестов.Well-known various tests for serodiagnosis of infections, radioimmunological, immunodiffusion, immunofluorescence, immunoprecipitation, agglutination, hemolysis, neutralization and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), including methods for detecting antibody immune complexes, the stage of signal amplification and detection by various methods such as optical color, fluorescence, particle size, alternatively - by measuring the radioactivity of labels in immune complexes. A diagnostic test often used in practice is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with a variety of options, a typical initial step is the immobilization of antigens or antibodies on a solid phase, such as the plate wells [RF Patent 2689143 C1], the immobilization stage is critical and, in general, determines the sensitivity of the test. At the next stages, it is possible to use two variants of the analysis: the so-called "capture" test or sandwich ELISA and competitive ELISA (blocking, inhibiting). With sandwich ELISA, the components of the test system are sequentially introduced; due to immunochemical interactions, the molecular layers seem to be layered one on top of the other. In the second variant, as it is believed to be more specific, a certain component of the system competes for binding with a labeled antigen or antibody and decreases the maximum recorded signal, which is fixed and expressed as a fraction of inhibition of the maximum ELISA signal. A natural and necessary condition is the solubility of antigens in working buffers. Due to its relative simplicity, availability, versatility and sensitivity, ELISA is widely used not only as a method of laboratory diagnostics, but also in epidemiological practice, as a tool for mass screening of the population and the selection of persons for vaccination. In this context, the sensitivity and specificity of ELISA tests is critical.

Известно, что необходимой первичной составляющей ИФА является наличие подготовленной подложки с иммобилизованными компонентами иммунохимической системы, в частности белковыми антигенами. В настоящее время используют три разновидности иммобилизации белков: пассивную, ковалентную и аффинную. Пассивное связывание адекватно отвечает разнообразным задачам как исследований макромолекул, так и рутинных анализов и наиболее широко используется в практике. Степень пассивного связывания определяется соотношением гидрофильных и гидрофобных компартментов макромолекулы и соответствующим этому параметру характерам сорбирующих поверхностей полистирола, от гидрофобных до преимущественно гидрофильных. При оптимальном соотношении этих параметров количество сорбированного белка на поверхности полистирола может превосходить величину 600 нг/см². Ковалентные поверхности для ИФА представляют собой химически модифицированный полистирол, введенные активные группы которого способны образовывать прочные ковалентные связи с NH₂-, СООН- группами гаптенов, пептидов или 5'-производными олигонуклеотидов. Такие планшеты преимущественно используют для фиксации небольших молекул [Rasmussen S.R., Larsen M.R., Rasmussen S.E: 1991. AnalBiochem 198 (1): 138-142]. Различают псевдоковалентную иммобилизацию, когда на полистирольных поверхностях различными методами создают специальные подложки, на которые уже прикрепляют антигены. Известны примеры модификации полистирола с целью иммобилизации «нетипичных» белков, а именно глутаровым альдегидом [Morissette C., Goulet J., LamoureuxG: 1991. ApplEnvironMicrobiol. 57 (3): 836-842, GallD., NielsenK: 1994. JImmunoassay. 15 (3): 277-291], полилизином, поливинилбензил-лактониламидом [Suzuki N., Quesenberry M.S., Wang J.K., Lee R.T., Kobayashi K., Lee Y.C: 1997. AnalBiochem. 247 (2): 412-416] и 3-аминопропилртиэтоксисиланом [Kaur J., Boro R.C, Wangoo N., Singh K.R., Suri C.R: 2008. AnalChimActa, 607 (1): 92-99], дегидратацией проб, когда в лунки вносят раствор антигена в хлороформ-спиртовой смеси с последующим полным упариванием [Bantroch S.,

, Lam J.S: 1994. ClinDiagnLablmmunol. 1 (1): 55-62], малеимид-активированным БСА [Cuccuru M.A., Dessi D., RappelliP., FioriP.L: 2012. JImmunolMethods. 382 (1-2): 216-219]. Аффинные поверхности можно рассматривать как разновидность ковалентных, у которых функцию связывающих активных групп выполняют привитые аффинные лиганды. специфически взаимодействующие со стрептавидином, либо ионами двухвалентных металлов. Область применения аффинных планшетов ограничена анализом биотинилированных, либо генно-инженерных белков, первичные последовательности которых дополнены специальными якорными фрагментами, обеспечивающими высокоспецифичное взаимодействие с аффиными лигандами.It is known that the necessary primary component of ELISA is the presence of a prepared substrate with immobilized components of the immunochemical system, in particular, protein antigens. Currently, three types of protein immobilization are used: passive, covalent, and affinity. Passive binding adequately meets various tasks of both macromolecule studies and routine analyzes and is most widely used in practice. The degree of passive binding is determined by the ratio of hydrophilic and hydrophobic compartments of the macromolecule and the nature of the sorbing surfaces of polystyrene corresponding to this parameter, from hydrophobic to predominantly hydrophilic. With an optimal ratio of these parameters, the amount of sorbed protein on the polystyrene surface can exceed 600 ng / cm ² . Covalent surfaces for ELISA are chemically modified polystyrene, the introduced active groups of which are capable of forming strong covalent bonds with NH ₂ -, COOH groups of haptens, peptides or 5'-derivatives of oligonucleotides. Such plates are advantageously used for fixing small molecules [Rasmussen SR, Larsen MR, Rasmussen SE: 1991. AnalBiochem 198 (1): 138-142]. A distinction is made between pseudo-covalent immobilization, when special substrates are created on polystyrene surfaces by various methods, on which antigens are already attached. Known examples of modification of polystyrene in order to immobilize "atypical" proteins, namely glutaraldehyde [Morissette C., Goulet J., Lamoureux G: 1991. ApplEnvironMicrobiol. 57 (3): 836-842, Gall D., Nielsen K: 1994. J Immunoassay. 15 (3): 277-291], polylysine, polyvinylbenzyl-lactonylamide [Suzuki N., Quesenberry MS, Wang JK, Lee RT, Kobayashi K., Lee YC: 1997. AnalBiochem. 247 (2): 412-416] and 3-aminopropylrthiethoxysilane [Kaur J., Boro RC, Wangoo N., Singh KR, Suri CR: 2008. AnalChimActa, 607 (1): 92-99], by dehydrating the samples when in wells make a solution of antigen in a chloroform-alcohol mixture, followed by complete evaporation [Bantroch S.,

, Lam JS: 1994. ClinDiagnLablmmunol. 1 (1): 55-62], maleimide-activated BSA [Cuccuru MA, Dessi D., Rappelli P., Fiori P. L: 2012. JImmunol Methods. 382 (1-2): 216-219]. Affinity surfaces can be considered as a kind of covalent surfaces in which the function of binding active groups is performed by grafted affinity ligands. specifically interacting with streptavidin, or divalent metal ions. The scope of application of affinity plates is limited to the analysis of biotinylated or genetically engineered proteins, the primary sequences of which are supplemented with special anchor fragments that provide highly specific interaction with affinity ligands.

Для пассивного связывания макромолекул с различными типами поверхностей пластика необходимо, чтобы белок растворялся в буферах, которые контактируют с поверхностью, так как именно в водной среде возможно проявление сил, ведущих к образованию ионных, координационных, гидрофобных и вандерваальсовских связей [Nieto A.,

A., Moreno C.,

М., VivesJ: 1986. AnnlnstPasteurlmmunol, 137C (2): 161-172]. В настоящее время в подавляющем числе работ используют пассивное связывание и иммуноферментный анализ начинают с продолжительной инкубации белков, растворенных в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6 в течение 18-20 ч при температуре 4-6°C. При этих условиях происходит пассивное насыщение поверхности полистирольных лунок макромолекулами. Показано также, что сорбция происходит и при нейтральных значениях рН в фосфатно-солевой буферной системе [Chang L.S., Lin J., Chang C.С: 1994. BiochemMolBiolInt, 34 (2): 403-408], при этом необходимым условием является растворимость белка. Между тем, на практике в области генноинженерных исследований, многие рекомбинантные белки в процессе роста микробных клеток накапливаются в составе телец включения и не способны в этой форме переходить в буферы воспроизводящие физиологические условия.For passive binding of macromolecules to various types of plastic surfaces, it is necessary that the protein dissolves in buffers that contact the surface, since it is in an aqueous medium that the manifestation of forces leading to the formation of ionic, coordination, hydrophobic and Van der Waals bonds is possible [Nieto A.,

A., Moreno C.,

M., Vives J: 1986. AnnlnstPasteurlmmunol, 137C (2): 161-172]. Currently, the overwhelming majority of works use passive binding and enzyme-linked immunosorbent assay begins with prolonged incubation of proteins dissolved in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6 for 18-20 hours at a temperature of 4-6 ° C. Under these conditions, the surface of polystyrene wells is passively saturated with macromolecules. It has also been shown that sorption occurs at neutral pH values in a phosphate-saline buffer system [Chang LS, Lin J., Chang C. C: 1994. BiochemMolBiolInt, 34 (2): 403-408], while solubility is a prerequisite squirrel. Meanwhile, in practice in the field of genetic engineering research, many recombinant proteins during the growth of microbial cells accumulate in the inclusion bodies and are not able in this form to pass into buffers that reproduce physiological conditions.

Широко распространены протоколы получения генно-инженерных белков под контролем сильных промоторов в клетках кишечной палочки, что позволяет наработать биомассу с высоким содержанием целевого белка, достигающего 30-40%. высокий выход ценного целевого продукта как раз является биотехнологической целью этого подхода [П.Х. Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Иванов С.А., Комбарова Т.И., Перовская О.Н., Титарева Г.М., Анисимов А.П: 2019. Прикладная биохимия и микробиология, 55 (5): 471-480]. Сильные промоторы вызывают дисбаланс биосинтеза и структурообразования гетерологичных полипептидов, так что даже небольшие гидрофильные новосинтезированные белки приобретают разупорядоченную структуру и сбрасываются микробной клеткой в тельца включения, нерастворимые впоследствии в буферных системах воспроизводящие условия, близкие к физиологическим (обычно, 10 мМ фосфатно-солевой буфер, рН 7,2). Сложности, обусловленные растворимостью, возникающие, например, при очистке рекомбинантных белков аффинной хроматографией, снимаются применением сильных денатурирующих агентов (концентрированные растворы мочевины или хлористого гуанидина), которые разупорядочевают структуру белков телец включения и растворяют их, но не подавляют полностью координационные взаимодействия встроенной в полипептидную цепь полигистидиновой последовательности и аффинной матрицы. Однако, восстановление устойчивых и растворимых при физиологических условиях молекулярных форм белков, пригодных для пассивной иммобилизации в лунки планшетов, обусловлено предварительным сложением нативной третичной структуры (ренатурацией) полипептидов при удалении сильных денатурирующих веществ.There are widespread protocols for the production of genetically engineered proteins under the control of strong promoters in E. coli cells, which makes it possible to generate biomass with a high content of the target protein, reaching 30-40%. a high yield of a valuable target product is precisely the biotechnological goal of this approach [P.Kh. Kopylov P.Kh., Svetoch T.E., Ivanov S.A., Kombarova T.I., Perovskaya O.N., Titareva G.M., Anisimov A.P .: 2019. Applied Biochemistry and Microbiology, 55 ( 5): 471-480]. Strong promoters cause an imbalance in the biosynthesis and structure formation of heterologous polypeptides, so that even small hydrophilic newly synthesized proteins acquire a disordered structure and are dumped by a microbial cell into inclusion bodies, which are subsequently insoluble in buffer systems and reproduce conditions close to physiological (usually 10 mM phosphate buffer, pH-salt 7.2). Difficulties caused by solubility, arising, for example, during the purification of recombinant proteins by affinity chromatography, are removed by the use of strong denaturing agents (concentrated solutions of urea or guanidine chloride), which disordered the structure of inclusion body proteins and dissolve them, but do not completely suppress coordination interactions built into the polypeptide chain polyhistidine sequence and affine matrix. However, the restoration of stable and soluble under physiological conditions molecular forms of proteins suitable for passive immobilization in the wells of plates is due to the preliminary addition of the native tertiary structure (renaturation) of polypeptides upon removal of strong denaturing substances.

Известно, что вопросы ренатурации белков являются одними из самых актуальных и сложных в рамках современных биотехнологических наук. Способы ренатурации белков обладают одним базовым сходством, заключающимся в том, что происходит удаление тем, или иным образом, концентрированного раствора денатурирующего агента, что побуждает образование, восстановление нативной, биологически-активной структуры полипептидов, определяемой их первичной аминокислотной последовательностью [Burgess R.R: 2009. MethodsEnzymol, 463: 259-282]. Сложение нативной структуры белка последовательно проходит через астрономическое число промежуточных конформационных вариантов с очень высокой вероятностью неправильного завершения укладки полипептидной цепи, при этом флуктуации гидрофобных участков усиливают межмолекулярные взаимодействия, вызывая агрегацию макромолекул и образование нерастворимых осадков. Для получения растворимых белков с нативной конформацией существует множество протоколов ренатурации с использованием самых различных экспериментальных приемов, самым простым из которых является разведение ренатурационных растворов различными буферными растворами [Cabrita L.D., Bottomley S.P: 2004. BiotechnolAnnuRev, 10: 31-50]. Известны альтернативные методы перевода белков в растворы с низкой ионной силой диализом или ультрафильтрацией [Yoshii H., Furuta T., Yonehara T., ItoD., Linko Y.Y., LinkoP: 2000. BiosciBiotechnolBiochem, 64 (6): 1159-1165]. Все они в разной степени противостоят агрегации, но часто сопровождаются низким выходом и сильным разбавлением конечных растворов белка. Разработан ряд методических подходов, имеющих целью обойти концентрационный барьер агрегации ренатурирующих белков путем их иммобилизации на твердой фазе [LiM., PoliakovA., Danielson U.H., Su Z., Janson J.C: 2003. BiotechnolLett, 25 (20): 1729-1734]. Подобным образом для нескольких классов белков восстановление третичной структуры и функциональности возможно только при наличии соответствующих смежных структурных компонентов, например, липополисахаридов, детергентов [Korhonen T.K., Haiko J., Laakkonen L.,

2013. FrontCelllnfectMicrobiol, 3: 35. doi: 10.3389/fcimb.2013.00035.]. Растворимые формы таких белковых комплексов были получены, однако сопутствующие детергенты конкурируют с полипептидами при пассивной сорбции и практически блокируют поверхность полистирольных лунок при концентрациях обуславливающих мицеллообразование (CMC) [Gardas A., LewartowskaA: 1988. JImmunolMethods, 106 (2): 251-255]. Кроме способа удержания полипептидных цепей координационными или ковалентными «пришивками», сохраняющимися в окружении жестких денатурантов в лунках планшетов, исследователями в пептидных библиотеках были найдены додекапептиды с высоким специфическим сродством к полистирольной поверхности [Kumada Y., Tokunaga Y., Imanaka H., Imamura K., Sakiyama T., Katoh S., NakanishiK: 2006. BiotechnolProg, 22 (2): 401-405], которое сохранялось в растворах мочевины в интервале концентраций до 2 М [Kumada Y., Hamasaki K., Nakagawa A., Sasaki Е., Shirai Т., Okumura М., Inoue М., Kishimoto М: 2013. JImmunolMethods, 400-401: 70-77]. Иммобилизованные при этих условиях фрагменты антител, содержащие соответствующие додекапептиды восстанавливали структуру и обретали специфическую связывающую активность.It is known that the issues of protein renaturation are one of the most urgent and complex in the framework of modern biotechnological sciences. The methods of renaturation of proteins have one basic similarity, which is the removal in one way or another, of a concentrated solution of a denaturing agent, which induces the formation, restoration of the native, biologically active structure of polypeptides, determined by their primary amino acid sequence [Burgess RR: 2009. MethodsEnzymol, 463: 259-282]. The folding of the native protein structure sequentially passes through an astronomical number of intermediate conformational variants with a very high probability of incorrect completion of the polypeptide chain folding, while fluctuations of hydrophobic regions enhance intermolecular interactions, causing aggregation of macromolecules and the formation of insoluble precipitates. To obtain soluble proteins with native conformation, there are many renaturation protocols using a variety of experimental techniques, the simplest of which is the dilution of renaturation solutions with various buffer solutions [Cabrita LD, Bottomley SP: 2004. Biotechnol AnnuRev, 10: 31-50]. Alternative methods of transferring proteins into solutions with low ionic strength by dialysis or ultrafiltration are known [Yoshii H., Furuta T., Yonehara T., ItoD., Linko YY, LinkoP: 2000. BiosciBiotechnol Biochem, 64 (6): 1159-1165]. All of them resist aggregation to varying degrees, but are often accompanied by low yield and strong dilution of the final protein solutions. A number of methodological approaches have been developed to bypass the concentration barrier of aggregation of renaturating proteins by immobilizing them on a solid phase [LiM., Poliakov A., Danielson UH, Su Z., Janson JC: 2003. Biotechnol Lett, 25 (20): 1729-1734]. Similarly, for several classes of proteins, restoration of the tertiary structure and functionality is possible only in the presence of appropriate adjacent structural components, for example, lipopolysaccharides, detergents [Korhonen TK, Haiko J., Laakkonen L.,

2013. FrontCelllnfect Microbiol, 3:35. Doi: 10.3389 / fcimb.2013.00035.]. Soluble forms of such protein complexes have been obtained, however, accompanying detergents compete with polypeptides during passive sorption and practically block the surface of polystyrene wells at concentrations that cause micelle formation (CMC) [Gardas A., Lewartowska A: 1988. JImmunol Methods, 106 (2): 251-255] ... In addition to the method of retention of polypeptide chains by coordination or covalent "attachments", which are preserved surrounded by rigid denaturants in the wells of the plates, researchers in peptide libraries have found dodecapeptides with high specific affinity to the polystyrene surface [Kumada Y., Tokunaga Y., Imanaka H., Imamura K ., Sakiyama T., Katoh S., NakanishiK: 2006. BiotechnolProg, 22 (2): 401-405], which remained in urea solutions in the concentration range up to 2 M [Kumada Y., Hamasaki K., Nakagawa A., Sasaki E, Shirai T, Okumura M, Inoue M, Kishimoto M: 2013. JImmunol Methods 400-401: 70-77]. Fragments of antibodies immobilized under these conditions containing the corresponding dodecapeptides restored the structure and acquired specific binding activity.

Представленные выше многочисленные и разнообразные способы связывания белковых антигенов и полистирольных поверхностей лунок планшетов направлены в первую очередь на модификацию твердой фазы, а именно, полистирольных поверхностей таким образом, чтобы между растворенными антигенами и модифицированным полистиролом возникли различные типы связей, обеспечивающие пассивную, ковалентную или аффинную иммобилизацию.The numerous and varied methods of binding protein antigens and polystyrene surfaces of plate wells presented above are primarily aimed at modifying the solid phase, namely, polystyrene surfaces so that different types of bonds arise between the dissolved antigens and the modified polystyrene, providing passive, covalent or affinity immobilization. ...

Технический результат предлагаемого изобретения прежде всего состоит в том, что оно делает возможным сенсибилизировать полистирольные планшеты белковыми антигенами, нерастворимыми ранее в стандартных буферных системах, используемых на первом этапе обработки и позволяет осуществлять постановку ELISA для большого числа труднорастворимых белковых антигенов, повышая чувствительность и специфичность теста.The technical result of the proposed invention primarily consists in the fact that it makes it possible to sensitize polystyrene plates with protein antigens that were previously insoluble in standard buffer systems used at the first stage of processing and allows an ELISA to be performed for a large number of poorly soluble protein antigens, increasing the sensitivity and specificity of the test.

Достижение технического результата показано на полипептидах чумного микроба не являющихся гомологами по первичным аминокислотным последовательностям, клонированным в клетках кишечной палочки, которые после выделения аффинной хроматографией образовали осадки, нерастворимые в буферных растворах, используемых для пассивной иммобилизации белков в лунках полистирольных планшетов. Используют полипептиды чумного микроба: субстрат связывающий белок ABC транспортера метионина (MetQ), белок наружной мембраны (OmpA), фруктозо-бисфосфатальдолаза (Fba), passenger-доменбелка-автотранспортера YapM, для которых результаты, полученные предлагаемым способом, идентичны.Achievement of the technical result is shown on polypeptides of the plague microbe that are not homologous in the primary amino acid sequences cloned in E. coli cells, which, after isolation by affinity chromatography, formed precipitates insoluble in buffer solutions used for passive immobilization of proteins in the wells of polystyrene plates. Plague microbe polypeptides are used: substrate binding protein ABC of the methionine transporter (MetQ), outer membrane protein (OmpA), fructose bisphosphate aldolase (Fba), passenger domain of the YapM autotransporter protein, for which the results obtained by the proposed method are identical.

Подготовительные этапы для получения технического результата состоят в том, что лизированные бактериальные культуры, продуцировавшие один из представленных здесь чумных полипептидов преимущественно в составе телец включения, центрифугируют в течение 20 мин при 15000×g и 10°C, полученный осадок переосаждают еще раз в тех же условиях. Растворимую часть удаляют, а осадок длительное время растворяют в двадцатикратном (вес/объем) избытке буферного раствора, содержащего 8 М мочевину, 5 мМ имидазол и 20 мМ Трис-HCl, рН 8, после чего снижают концентрацию мочевины до 6 М и перемешивают еще 2 часа. Падосадочную часть осторожно отделяют после центрифугирования и используют для выделения белка. Выделение полипептидов, несущих последовательность His₆ проводят аффинной хроматографией носителем AF-ChelateToyopearl 650М, насыщенным ионами Ni++. Полученные фракции очищенных белков анализируют электрофорезом и диализуют значимые фракции против 20 мМ, рН 7,4 фосфатного буферного раствора в течение 18 час при 10°C. Образовавшийся осадки целевых белков Ме10 собирают центрифугированием, тщательно суспензируют в 5 мл фосфатного буфера, содержащего 5% трегалозы, и подвергают быстрой заморозке в низкотемпературном морозильнике по аликвотам. В аликвотах суспензии после размораживания определяют концентрацию белка при помощи ДСН электрофореза в восстанавливающих условиях. Количественное маркирование геля проводят при помощи бычьего сывороточного альбумина (БСА), внося соответственно по 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,4 мкг в разные лунки, при этом, пробы анализируемых очищенных белков разводят таким образом, чтобы количество белка, нагруженное в лунки геля, попало в интервал от 0,2 до 1,4 мкг. Гели окрашивают Кумасси ярко голубым G-250, концентрации белков в исходных суспензиях вычисляют по числовым изображениям гелей, используя значения площадей отдельных пиков БСА. искомых белков на электрофореграммах, степень разведения образцов и количество внесенных в лунки полипептидов.The preparatory steps for obtaining the technical result consist in the fact that lysed bacterial cultures, which produced one of the plague polypeptides presented here, mainly in the composition of inclusion bodies, are centrifuged for 20 min at 15000 × g and 10 ° C, the resulting precipitate is reprecipitated again in the same conditions. The soluble part is removed, and the precipitate is dissolved for a long time in a twenty-fold (w / v) excess of a buffer solution containing 8 M urea, 5 mM imidazole and 20 mM Tris-HCl, pH 8, after which the concentration of urea is reduced to 6 M and another 2 hours. The sediment is carefully separated after centrifugation and used for protein isolation. Isolation of polypeptides carrying the His ₆ sequence is carried out by affinity chromatography with an AF-Chelate Toyopearl 650M carrier saturated with Ni ++ ions. The obtained fractions of the purified proteins are analyzed by electrophoresis and the significant fractions are dialyzed against 20 mM, pH 7.4, phosphate buffer solution for 18 hours at 10 ° C. The resulting precipitates of the target proteins Me10 are collected by centrifugation, carefully suspended in 5 ml of phosphate buffer containing 5% trehalose, and subjected to rapid freezing in aliquots in a low-temperature freezer. In aliquots of the suspension after thawing, the protein concentration is determined by SDS electrophoresis under reducing conditions. Quantitative labeling of the gel is carried out using bovine serum albumin (BSA), making, respectively, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 and 1.4 μg in different wells, while samples of the analyzed purified proteins are diluted in such a way that the amount of protein loaded into the wells of the gel falls in the range from 0.2 to 1.4 μg. The gels are stained with Coomassie blue G-250, the protein concentrations in the initial suspensions are calculated from the numerical images of the gels using the values of the individual BSA peak areas. the desired proteins on electrophoregrams, the degree of dilution of the samples and the amount of polypeptides introduced into the wells.

Технический результат непосредственно достигается тем, что перед этапом сенсибилизации планшетов предварительно полностью растворяют гомогенную суспензию препаратов целевых белков в 8 М мочевине таким образом, чтобы в 10 мкл полученного раствора содержалось 800 нг белка. Сенсибилизацию планшетов проводят внесением в каждую лунку 10 мкл таких растворов с последующим 10-кратным разбавлением в лунках 0,1 М раствором карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,6, после чего планшеты герметизируют специальной пленкой и инкубируют 18 час при 6°C. Инкубационные растворы удаляют и промывают 4 раза сенсибилизированные планшеты 10 мМ фосфатно-солевым буфером, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20 (ФСБТ), после чего вносят в лунки по 120 мкл 1% раствора БСА в ФСБТ, герметизируют и инкубируют 3 час при 37°C. На последней стадии сенсибилизированные планшеты промывают 3 раза ФСБТ, удаляют буфер, герметизируют, замораживают и хранят при -20°C. Полученные таким образом планшеты несут на поверхности лунок пассивно иммобилизованные белковые антигены, обладающие присущими им иммунохимическими свойствами, способные связываться со специфическими антителами, выработанными животными (мыши) в ответ на иммунизацию этими антигенами, что позволяет определять титры специфических антител в сыворотках крови мышей отражающих протективные свойства исследуемых антигенов. Таким же образом была проведена пассивная иммобилизация всех перечисленных белковых антигенов чумного микроба, значительно отличающихся первичными аминокислотными последовательностями, но труднорастворимых в физиологических буферах.The technical result is directly achieved by the fact that before the stage of sensitization of the plates, a homogeneous suspension of the target protein preparations is completely dissolved in 8 M urea so that 10 μl of the resulting solution contains 800 ng of protein. The plates are sensitized by adding 10 μl of such solutions to each well, followed by 10-fold dilution in the wells with 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer solution, pH 9.6, after which the plates are sealed with a special film and incubated for 18 hours at 6 ° C. The incubation solutions are removed and the sensitized plates are washed 4 times with 10 mM phosphate-buffered saline, pH 7.4, containing 0.05% tween-20 (FSBT), after which 120 μl of 1% BSA solution in FSBT are added to the wells, sealed and incubated for 3 hours at 37 ° C. In the last step, the coated plates are washed 3 times with PBS, the buffer is removed, sealed, frozen and stored at -20 ° C. The plates thus obtained bear passively immobilized protein antigens on the surface of the wells, possessing their inherent immunochemical properties, capable of binding to specific antibodies produced by animals (mice) in response to immunization with these antigens, which makes it possible to determine the titers of specific antibodies in the blood sera of mice reflecting protective properties investigated antigens. In the same way, passive immobilization of all the listed protein antigens of the plague microbe was carried out, significantly differing in primary amino acid sequences, but hardly soluble in physiological buffers.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:

Фиг. 1. Электрофорез и иммуноблот препаратов различных белков на этапе подготовки клеточных лизатов.FIG. 1. Electrophoresis and immunoblot of preparations of various proteins at the stage of preparation of cell lysates.

Фиг. 2. Электрофорез хроматографических фракций, полученных в результате аффинной хроматографии белков на колонке с AF-ChelateToyopearl 650М, нагруженной ионами Ni²⁺.FIG. 2. Electrophoresis of chromatographic fractions obtained by affinity chromatography of proteins on a column with AF-ChelateToyopearl 650M, loaded with Ni ^{2+ ions} .

Фиг. 3. Электрофорез хроматографических фракций, полученных в результате аффинной хроматографии белка Fba на колонке с AF-ChelateToyopearl 650М, нагруженной ионами Ni²⁺.FIG. 3. Electrophoresis of chromatographic fractions obtained by affinity chromatography of the Fba protein on a column with AF-ChelateToyopearl 650M, loaded with Ni ^{2+ ions} .

Фиг. 4. Анализ цифрового изображения геля с белком Fba программой «GelAnalyzer®».FIG. 4. Analysis of a digital image of a gel with Fba protein using the GelAnalyzer® software.

Фиг. 5. Определения пассивного связывания антигенов в растворах мочевины.FIG. 5. Determination of passive binding of antigens in urea solutions.

Пример 1. Подготовка лизатов клеток кишечной палочки для выделения белковых антигенов.Example 1. Preparation of Escherichia coli cell lysates for isolation of protein antigens.

Для выделения белков чумного микроба, клонированных в составе вектора pET32b(+) в клетках штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3), используют культуры, продуцирующие соответствующие целевые белки после индукции ИПТГ. Этапы подготовки материала для аффинной хроматографии одинаковы для всех целевых белков, приведенных в этой работе. На фиг. 1 в качестве примера представлены результаты подготовки лизатов, содержащие белки OmpA и YapM Y. pestis. Осадки влажной биомассы (10-12 г) суспензируют в десятикратном избытке (вес/объем) буферном растворе, содержащем 5 мМ имидазол и 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Лизис клеток проводят в стакане, который охлаждают непрерывно на ледяной бане, наконечником ультразвукового дезинтегратора Bandelin (ЕС) при мощности 50% от максимальной циклами по 15 сек с равновеликими паузами до тех пор, пока величина затраченной энергии не составит 60 кДж. Клеточные лизаты центрифугируют в течение 20 мин при 15000×g и 10°C и отделяют растворимую часть от осадка, фракции хранят в замороженном состоянии до появления результатов электрофореза и иммуноблота. Каждую фракцию анализируют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (ДСН-ПААГ), подтверждая присутствие целевых белков во фракциях осадка, то есть в тельцах включения. (Фиг. 1. Числами в верхней части рисунка обозначены линии: 1, 2, 3, 4 - электрофорез белка OmpA; 9, 10, 11, 12, 13 - электрофорез белка YapM; 5, 6, 7, 8 - иммуноблот белка OmpA; 14, 15, 16, 17, 18, 19 - иммуноблот белка YapM. Клеточные лизаты, линии 2, 5, 6, 9, 14, 17; надосадочные фракции, линии 3, 8, 10, 15; осадки, линии 4, 7, 11, 18. Линии: 5, 12, 17 - отрицательный контроль; 13, 18 - положительный контроль; 1,19 - маркеры молекулярных масс.) Осадки растворяют при непрерывном перемешивании в двадцатикратном (вес/объем) избытке буферного раствора, содержащего 8 М мочевину, 5 мМ имидазол, 500 мМ натрий хлористый и 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, в течение 20 ч на магнитной мешалке при 10°C, после чего разбавляют растворы этим же буфером, но без мочевины, таким образом, чтобы уменьшить ее концентрацию до 6 М. После разбавления раствор перемешивают еще 2 ч и центрифугируют 30 мин при 18000×g и 20°C, прозрачную надосадочную часть осторожно отделяют и используют для выделения белков MetQ, OmpA, Fba и YapM.To isolate the proteins of the plague microbe cloned as part of the pET32b (+) vector in the cells of the E. coli BL21 (DE3) producer strain, cultures are used that produce the corresponding target proteins after induction with IPTG. The stages of material preparation for affinity chromatography are the same for all target proteins given in this work. FIG. 1 as an example, the results of the preparation of lysates containing the OmpA and YapM proteins of Y. pestis are presented. Wet biomass precipitates (10-12 g) are suspended in a tenfold excess (w / v) buffer solution containing 5 mM imidazole and 20 mM Tris-HCl, pH 8.0. Cell lysis is carried out in a glass, which is cooled continuously in an ice bath, with a Bandelin (EC) ultrasonic disintegrator tip at a power of 50% of the maximum for 15 sec cycles with equal pauses until the energy expended reaches 60 kJ. Cell lysates are centrifuged for 20 min at 15000 × g and 10 ° C and the soluble part is separated from the sediment, the fractions are stored frozen until the results of electrophoresis and immunoblot appear. Each fraction is analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gel under reducing conditions (SDS-PAGE), confirming the presence of the target proteins in the fractions of the sediment, i.e. in the inclusion bodies. (Fig. 1. Numbers in the upper part of the figure denote lines: 1, 2, 3, 4 - electrophoresis of OmpA protein; 9, 10, 11, 12, 13 - electrophoresis of YapM protein; 5, 6, 7, 8 - immunoblot of OmpA protein ; 14, 15, 16, 17, 18, 19 - immunoblot of the YapM protein. Cell lysates, lines 2, 5, 6, 9, 14, 17; supernatants, lines 3, 8, 10, 15; sediments, lines 4, 7, 11, 18. Lines: 5, 12, 17 - negative control; 13, 18 - positive control; 1.19 - molecular weight markers.) The precipitates are dissolved with continuous stirring in a twenty-fold (w / v) excess of a buffer solution containing 8 M urea, 5 mM imidazole, 500 mM sodium chloride and 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, for 20 h on a magnetic stirrer at 10 ° C, after which the solutions are diluted with the same buffer, but without urea, thus to reduce its concentration to 6 M. After dilution, the solution is stirred for another 2 h and centrifuged for 30 min at 18000 × g and 20 ° C, the transparent supernatant is carefully separated and used to isolate MetQ, OmpA proteins, Fba and YapM.

Пример 2. Очистка белковых антигенов аффинной хроматографией из подготовленных фракций лизатов клеток кишечной палочки.Example 2. Purification of protein antigens by affinity chromatography from prepared fractions of Escherichia coli cell lysates.

Используют хроматографический носитель AF-ChelateToyopearl 650М, стационарная фаза которого объемом 25 мл упакована в колонку ХК-26 и предварительно насыщена ионами Ni²⁺. Колонку уравновешивают буферным раствором, содержащим 6 М мочевину, 5 мМ имидазол, 500 мМ натрий хлористый и 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 и пропускают прозрачную надосадочную фракцию центрифугата, полученную, как описано в примере 1. Такие же фракции, подготовленные из лизатов других штаммов Е. coli несущие, соответственно, белки MetQ, OmpA, Fba и YapM используют для их выделения аффинной хроматографией в одинаковых условиях. Колонку промывают и элюируют белки буферными растворами с увеличивающейся концентрацией имидазола, сначала буфер содержит 20 мМ имидазол и удаляет примеси с умеренным сродством к ионам Ni²⁺, затем элюируют целевые белки буферным раствором, содержащим 300 мМ имидазол. В некоторых случаях целевые белки элюируют вместе с буферным раствором, содержащим 20 мМ имидазол. Для белка MetQ наблюдали элюцию изоформ, различающихся сродством к аффинной матрице, причем, изоформы обладали различными молекулярными массами. (Фиг. 2. Белки, линии: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 - OmpA; 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 - MetQ. Надосадочные фракции центрифугата, нанесенные на колонку, линии: 1, 14; фракции, прошедшие через колонку, линии: 2, 15; фракции элюированные 20 мМ имидазолом, линии: 3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19; фракции элюированные 300 мМ имидазолом, линии: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23. Маркеры молекулярных масс, линия 13). Белок OmpA элюируют преимущественно буферным раствором, содержащим 300 мМ имидазола, в то время, как белок Fba - 20 мМ имидазола. (Фиг. 3. Надосадочная фракция центрифугата, нанесенная на колонку, линия 1; фракция, прошедшая через колонку, линия 2; фракции элюированные 20 мМ имидазолом, линии: 3, 4, 5, 6; фракции элюированные 300 мМ имидазолом, линии: 7, 8, 9, 10, 11. Маркеры молекулярных масс, линия 12). Элюаты получают фракциями по 6 мл и анализируют их ДСН-ПААГ.A chromatographic carrier AF-ChelateToyopearl 650M is used, the stationary phase of which is 25 ml in volume packed in a XK-26 column and pre-saturated with Ni ^{2+ ions} . The column is equilibrated with a buffer solution containing 6 M urea, 5 mM imidazole, 500 mM sodium chloride and 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, and pass the clear supernatant fraction of the centrifugate obtained as described in example 1. The same fractions prepared from lysates of other E. coli strains carrying, respectively, the proteins MetQ, OmpA, Fba and YapM are used for their isolation by affinity chromatography under the same conditions. The column is washed and proteins are eluted with buffer solutions with increasing concentration of imidazole, first the buffer contains 20 mM imidazole and removes impurities with moderate affinity for Ni ^{2+ ions} , then the target proteins are eluted with a buffer solution containing 300 mM imidazole. In some cases, target proteins are eluted with a buffer solution containing 20 mM imidazole. For the MetQ protein, the elution of isoforms with different affinity for the affinity matrix was observed, with the isoforms having different molecular weights. (Fig. 2. Proteins, lines: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 - OmpA; 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 - MetQ. The supernatants of the centrifugate applied to the column, lines: 1, 14; fractions that passed through the column, lines: 2, 15; fractions eluted with 20 mM imidazole, lines: 3, 4, 5, 6, 16 , 17, 18, 19; fractions eluted with 300 mM imidazole, lines: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23. Molecular weight markers, line 13). The OmpA protein is eluted predominantly with a buffer solution containing 300 mM imidazole, while the Fba protein is eluted with 20 mM imidazole. (Fig. 3. The supernatant fraction of the centrifugate applied to the column, line 1; the fraction that passed through the column, line 2; fractions eluted with 20 mM imidazole, lines: 3, 4, 5, 6; fractions eluted with 300 mM imidazole, lines: 7 , 8, 9, 10, 11. Molecular weight markers, line 12). Eluates were obtained in 6 ml fractions and analyzed by SDS-PAGE.

Пример 3. Замена буфера диализом и определение содержания целевых белков в суспензиях полученных препаратов.Example 3. Replacement of the buffer by dialysis and determination of the content of target proteins in suspensions of the obtained preparations.

Фракции, содержащие очищенные белки объединяют и диализуют против 100-кратного избытка 20 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7,4 в течение 18 ч при 10°C. Буферный раствор меняют три раза. При диализе по мере уменьшения концентрации мочевины целевые белки теряют растворимость и образуют осадки, которые собирают центрифугированием проб в течение 3,5 мин при 15000×g и 10°C. К осадкам прибавляют по 5 мл фосфатного буфера, содержащего 5% трегалозы и тщательно суспензируют, после чего подвергают аликвоты проб быстрой заморозке с использованием низкотемпературного морозильного оборудования (хранение) или жидкого азота. Определение концентрации белка в пробах проводят после разморажвания единичных образцов; к суспензиям добавляют эквивалентные объемы «буферного раствора для приготовления электрофоретических образцов (буфер Лэммли)», перемешивают и выдерживают пробы при 95°C в течение 10 мин на водяной бане. Охлажденные до комнатной температуры пробы центрифугируют 15 мин при 16000×g и 20°C и для электрофореза используют образцы, осадки которых полностью растворены в буфере Лэммли. Пробы разводят таким образом, чтобы количество белка, нагружаемого в лунки концентрирующего геля, находилось в интервале от 0,3 мкг до 1,2 мкг. Каждый гель несет калибровочные пробы альбумина, количество которого лежит в этом же интервале нагруженного количества белка. Электрофорез проводят в режиме постоянного напряжения 200 в и прекращают, когда полоса лидерного красителя достигает нижнего края геля, после чего проводят окраску Кумасси ярко-голубым G-250 в течение 50 мин на качалке со скоростью вращения 60 об/мин. Отмывку избытков красителя также проводят на качалке при температуре 50°C 7,5% раствором уксусной кислоты, содержащей 5% этанола, с трехкратной заменой раствора, после чего гель фотографируют в проходящем свете с разрешением 300 dpi. Цифровые изображения гелей обрабатывают программами обработки гелей, например, «GelAnalyzer®», или эквивалентными. При анализе цифровых изображений следуют инструкциям разработчика программы. После маркирования искомых полос, построения базовых линий и определения площадей пиков, получают числовые параметры, характеризующие отдельные белковые полосы. Концентрацию белков в исходных образцах вычисляют по результатам оцифровки электрофоретических полос, с учетом примененных разведений и рабочих объемов анализируемых проб. (Фиг. 4. Линии на электрофореграмме: 1, 2 - диализованный белок Fba; 4, 5, 6 - БСА, соответственно, в линиях по 1,4 мкг, 0,6 мкг и 0,8 мкг; 3 - маркеры молекулярных масс; прямоугольниками выделены анализируемые белки. Денситограммой представлен анализируемый фрагмент линии 4, выделенный красным прямоугольником; синяя линия денситограммы - базовая линия).Fractions containing purified proteins are pooled and dialyzed against a 100-fold excess of 20 mM phosphate buffered saline, pH 7.4 for 18 h at 10 ° C. The buffer solution is changed three times. During dialysis, as the concentration of urea decreases, the target proteins lose solubility and form precipitates, which are collected by centrifuging the samples for 3.5 minutes at 15000 × g and 10 ° C. 5 ml of phosphate buffer containing 5% trehalose is added to the sediments and thoroughly suspended, after which the samples are aliquoted by rapid freezing using low-temperature freezing equipment (storage) or liquid nitrogen. Determination of protein concentration in samples is carried out after thawing of single samples; to the suspensions add equivalent volumes of "buffer solution for the preparation of electrophoretic samples (Laemmli buffer)", mix and incubate the samples at 95 ° C for 10 minutes in a water bath. Samples cooled to room temperature are centrifuged for 15 min at 16000 × g and 20 ° C, and samples are used for electrophoresis, the precipitates of which are completely dissolved in Laemmli's buffer. Samples are diluted so that the amount of protein loaded into the wells of the concentration gel is in the range of 0.3 μg to 1.2 μg. Each gel carries calibration samples of albumin, the amount of which lies in the same range of the loaded amount of protein. Electrophoresis is carried out in a constant voltage mode of 200 V and is stopped when the leader dye strip reaches the lower edge of the gel, after which Coomassie staining with bright blue G-250 is carried out for 50 minutes on a rocking chair with a rotation speed of 60 rpm. Washing off excess dye is also carried out on a shaker at a temperature of 50 ° C with a 7.5% solution of acetic acid containing 5% ethanol, with a three-fold change of the solution, after which the gel is photographed in transmitted light with a resolution of 300 dpi. Digital images of gels are processed with gel processing programs such as "GelAnalyzer®" or equivalent. When analyzing digital images, follow the instructions of the software developer. After marking the desired bands, constructing baselines and determining the peak areas, numerical parameters characterizing individual protein bands are obtained. The concentration of proteins in the initial samples is calculated from the results of digitizing the electrophoretic bands, taking into account the applied dilutions and the working volumes of the analyzed samples. (Fig. 4. Lines on the electrophoregram: 1, 2 - dialyzed Fba protein; 4, 5, 6 - BSA, respectively, in lines of 1.4 μg, 0.6 μg and 0.8 μg; 3 - molecular weight markers The analyzed proteins are marked with rectangles.Densitogram represents the analyzed fragment of line 4, marked with a red rectangle; the blue line of the densitogram is the baseline).

Пример 4. Сенсибилизация планшетов антигенами MetQ, OmpA и Fba.Example 4. Sensitization of plates with MetQ, OmpA and Fba antigens.

Перед сенсибилизацией планшетов, суспензии исследуемых антигенов продолжительное время инкубируют в концентрированных растворах мочевины или хлористого гуанидина, создающих жесткие условия растворения белков, сопровождающееся денатурацией полипептидной цепи, что обеспечивает исчерпывающее растворение белков. На практике, к определенному объему суспензии белка, размороженной после хранения в низкотемпературном морозильнике, добавляют постепенно при перемешивании расчетное количество мочевины таким образом, чтобы ее конечная концентрация составила 8 М, растворение реактива ведут при непрерывном перемешивании и комнатной температуре в течение 2 ч. Если белок не растворяется в мочевине, его растворение начинают с добавления хлористого гуанидина до конечной концентрации соли 7 М. С учетом количества белка в суспензии, определенного ранее по результатам электрофореза, из полученного раствора, или некоторой его части готовят сенсибилизирующий раствор для нанесения в лунки планшетов, путем его разбавления раствором 8М мочевины таким образом, чтобы в 10 мкл полученного сенсибилизирующего раствора содержалось 800 нг белка. Сенсибилизацию планшетов (пассивное связывание антигена) начинают внесением в лунки 10 мкл раствора антигенов в 8 М мочевине имея ввиду, что в этих условиях пассивная иммобилизация растворенных антигенов на поверхностях полистирольных лунок блокирована. Пассивное связывание белков запускается разбавлением содержимого лунок 90 мкл 0,1 М раствора карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,6, после чего планшеты герметизируют специальной пленкой и инкубируют 18 ч при 6°C для завершения процесса. Планшеты приводят в рабочее состояние удалением сенсибилизирующего раствора антигенов и четырехкратной промывкой 10 мМ фосфатно-солевым буфером, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20 (ФСБТ). После этого вносят в лунки по 120 мкл 1% раствора БСА в ФСБТ. герметизируют и инкубируют 3 ч при 37°C. На последнем этапе сенсибилизированные планшеты промывают 3 раза ФСБТ, удаляют буфер, герметизируют пленкой, замораживают и хранят пригодные для работы планшеты при -20°C.Before sensitizing the plates, suspensions of the studied antigens are incubated for a long time in concentrated solutions of urea or guanidine chloride, which create severe conditions for the dissolution of proteins, accompanied by denaturation of the polypeptide chain, which ensures the exhaustive dissolution of proteins. In practice, to a certain volume of protein suspension thawed after storage in a low-temperature freezer, a calculated amount of urea is gradually added with stirring so that its final concentration is 8 M, the reagent is dissolved with continuous stirring and room temperature for 2 hours. does not dissolve in urea, its dissolution begins with the addition of guanidine chloride to a final salt concentration of 7 M. Taking into account the amount of protein in the suspension, determined earlier from the results of electrophoresis, a sensitizing solution is prepared from the resulting solution, or some of its part for application to the wells of the plates, by its dilution with a solution of 8M urea so that 10 μl of the obtained sensitizing solution contained 800 ng of protein. The sensitization of the plates (passive antigen binding) begins by introducing 10 μl of antigen solution in 8 M urea into the wells, bearing in mind that under these conditions, passive immobilization of dissolved antigens on the surfaces of polystyrene wells is blocked. Passive protein binding is triggered by diluting the contents of the wells with 90 μl of 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6, after which the plates are sealed with a special film and incubated for 18 h at 6 ° C to complete the process. The plates are brought into working condition by removing the sensitizing solution of antigens and washing four times with 10 mM phosphate-buffered saline, pH 7.4, containing 0.05% tween-20 (FSBT). After that, 120 μl of 1% BSA solution in FSBT is added to the wells. sealed and incubated for 3 h at 37 ° C. In the last step, the coated plates are washed 3 times with PBS, the buffer is removed, sealed with a foil, frozen and the workable plates are stored at -20 ° C.

Для определения пассивного связывания антигенов в присутствии концентрированных растворов мочевины готовили специальные планшеты. Растворы белка в 8 М мочевине разводили таким образом, чтобы конечные сенсибилизирующие растворы содержали одинаковое количество белка (8 мкг в 1000 мкл таких растворов), но различные концентрации мочевины, соответственно от 7 М до 1 М. Приготовленные разведения сразу же наносили по 100 мкл (800 нг) в лунки планшетов и инкубировали, как описано выше, включая этапы промывки, блокировки БСА, повторной промывки и хранения при -20°C.To determine the passive binding of antigens in the presence of concentrated urea solutions, special plates were prepared. Protein solutions in 8 M urea were diluted so that the final sensitizing solutions contained the same amount of protein (8 μg in 1000 μl of such solutions), but different concentrations of urea, respectively, from 7 M to 1 M. The prepared dilutions were immediately applied in 100 μl ( 800 ng) into the wells of the plates and incubated as described above, including the steps of washing, blocking BSA, re-washing, and storage at -20 ° C.

Лунки сенсибилизировали белковыми антигенами в обычных условиях, используемых для их пассивной сорбции. Использованные антигены нерастворимы в стандартных буферных растворах, используемыми на этапе начальной обработки планшетов. Для этого, к размороженной суспензии, содержащей определенное количество белка добавляли 10 мМ фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,4, или 0,1 М карбонат-бикарбонатный буферный раствор, рН 9,6 и перемешивали полученные суспензии на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 2 ч. Объемы буферных растворов рассчитывали исходя из того, что 1000 мкл такого раствора должно содержать 8 мкг белка. По истечении 2 час полученными растворами сенсибилизировали планшеты, внося по 100 мкл в каждую лунку и инкубировали в течение 18 ч при 6°C. После инкубации проводили этапы промывки ФСБТ, блокировки БСА, повторной промывки ФСБТ, замораживали и хранили при -20°C. (Фиг. 5. Планшеты сенсибилизировали добавлением в лунки по 800 нг белков MetQ и Fba в растворах мочевины различных концентраций, обозначенных на оси абсцисс. По оси ординат отложены значения А450. измеренные после обработки планшетов суммарными сыворотками 5 мышей, иммунизированных, соответственно, белками MetQ и Fba, разведенными 1:1000 и специфическими антимышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена).The wells were sensitized with protein antigens under the usual conditions used for their passive sorption. The antigens used are insoluble in standard buffers used at the stage of initial plate processing. For this, 10 mM phosphate-buffered saline, pH 7.4, or 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer solution, pH 9.6 was added to the thawed suspension containing a certain amount of protein, and the resulting suspensions were stirred on a magnetic stirrer at room temperature within 2 hours. The volumes of buffer solutions were calculated on the basis that 1000 μl of such a solution should contain 8 μg of protein. After 2 hours, the resulting solutions were sensitized to the plates by adding 100 μl to each well and incubated for 18 hours at 6 ° C. After incubation, the steps of washing with PSBT, blocking BSA, and repeated washing with PSBT were carried out, frozen and stored at -20 ° C. (Fig. 5. The plates were sensitized by adding 800 ng of MetQ and Fba proteins in urea solutions of various concentrations indicated on the abscissa to the wells. The ordinate shows the A450 values measured after treatment of the plates with the total sera of 5 mice immunized, respectively, with MetQ proteins and Fba diluted 1: 1000 and specific anti-mouse antibodies conjugated with horseradish peroxidase).

Пример 5. Определение титров специфических антител в сыворотке крови мышей против антигенов использованных для пассивной иммобилизации планшетов.Example 5. Determination of titers of specific antibodies in the blood serum of mice against antigens used for passive immobilization of plates.

Для иммунизации мышей с целью получения «антительного» ответа белки сорбировали стерильно на геле гидроокиси алюминия и иммунизировали группы (n=5) мышей подкожно препаратом, в 0,2 мл суспензии которого находилось 10 мкг белка. Контрольные группы иммунизировали гелем гидроокиси алюминия без антигенов. Повторную иммунизацию проводили через 21 день, так же, как и забор крови. Для определения титров антител используют твердофазный иммуноферментный анализ на предварительно сенсибилизированных планшетах, хранившихся при температуре -20°C. Серию последовательных разведений каждой антисыворотки, состоящей из 8 ступеней начинают с пробы разведенной 1:1000 с последующим шагом 2,5 до пробы с разведением 1:610350, таким же образом разводят и контрольные сыворотки используя ФСБТ как для разведения антисывороток, так и в дальнейшем для конъюгированных антивидовых антител. После низкотемпературной камеры планшеты выдерживают при комнатной температуре 5 мин, удаляют пленку и вносят в лунки мультиканальной пипеткой по 100 мкл каждого разведения антисывороток и контролей. Планшеты заклеивают и инкубируют в течение 18 ч при 6°C, после чего удаляют пленку и промывают 4 раза ФСБТ, после чего вносят в лунки немедленно по 100 мкл раствора разведенных (1:6000) антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и инкубируют заклеенные планшеты в течение 1,5 ч при 37°C. Промывку и фотометрирование планшетов при длине волны 450 нм проводят роботизированной системой для ИФА «EvolisTwinPlus», фирмы Bio-Rad. На последнем этапе в лунки промытых планшетов вносят по 100 мкл раствора субстрата. Развитие цветной реакции происходит за счет донорно-акцепторной пары: перекись водорода - о-фенилендиамин в составе субстратного раствора. Реакцию останавливают через 15 мин добавлением в лунки по 100 мкл 1 М раствора серной кислоты. Строят кривые изменения оптической плотности растворов в лунках от степени разведения антисывороток и вычисляют значения титров, которые определяют, как величину наибольшего разведения антисыворотки, измеренная оптическая плотность которой в два раза превышает оптическую плотность раствора соответствующего контроля. Титры специфических антител наглядно представляют обратными величинами разведений антисыворотокTo immunize mice in order to obtain an "antibody" response, proteins were sterile sorbed on an aluminum hydroxide gel and groups (n = 5) of mice were immunized subcutaneously with a preparation containing 10 μg of protein in 0.2 ml of suspension. Control groups were immunized with antigen-free aluminum hydroxide gel. Re-immunization was performed 21 days later, as well as blood sampling. To determine antibody titers, enzyme-linked immunosorbent assay is used on pre-sensitized plates stored at -20 ° C. A series of serial dilutions of each antiserum, consisting of 8 steps, begin with a sample diluted 1: 1000 followed by a 2.5 step to a sample with a dilution of 1: 610350, in the same way the control sera are diluted using FSBT both for diluting the antisera and subsequently for conjugated anti-species antibodies. After the low-temperature chamber, the plates are kept at room temperature for 5 min, the film is removed, and 100 μl of each dilution of antisera and controls are added to the wells with a multichannel pipette. The plates are sealed and incubated for 18 h at 6 ° C, after which the film is removed and washed 4 times with PSBT, after which 100 μl of a solution of diluted (1: 6000) anti-mouse antibodies conjugated with horseradish peroxidase is immediately added to the wells and the sealed plates are incubated for 1.5 hours at 37 ° C. Washing and photometry of the plates at a wavelength of 450 nm is carried out with a robotic system for ELISA "EvolisTwinPlus" from Bio-Rad. At the last stage, 100 μl of the substrate solution is added to the wells of the washed plates. The development of the color reaction occurs due to the donor-acceptor pair: hydrogen peroxide - o-phenylenediamine in the composition of the substrate solution. The reaction is stopped after 15 minutes by adding 100 μl of 1 M sulfuric acid solution to the wells. Curves of changes in the optical density of solutions in the wells are plotted on the degree of dilution of antisera and titers are calculated, which are determined as the value of the highest dilution of the antiserum, the measured optical density of which is twice the optical density of the solution of the corresponding control. Specific antibody titers are graphically represented by the reciprocal of antisera dilutions

Табл. 1.Tab. 1.

Эффективность достигнутого технического результата изобретения проявляется прежде всего в том, что делает ненужным необходимый ранее сложный эмпирический этап ренатурации белков, в результате которого исследователи получали интересующие их объекты в растворимой форме. Исчезла необходимость воспроизводить или создавать методы ренатурации белков, цель которых, в данном случае заключалась бы в получении растворимого белкового продукта, пригодного для иммобилизации в лунки полистирольных планшетов. Кроме того, технический результат изобретения не предполагает использовать ковалентную, псевдоковалентную и аффинную иммобилизацию генноинженерных белков.The effectiveness of the achieved technical result of the invention is manifested primarily in the fact that it makes unnecessary the previously necessary complex empirical stage of renaturation of proteins, as a result of which researchers obtained objects of interest in a soluble form. The need to reproduce or create methods of protein renaturation has disappeared, the purpose of which, in this case, would be to obtain a soluble protein product suitable for immobilization in the wells of polystyrene plates. In addition, the technical result of the invention does not imply the use of covalent, pseudo-covalent and affinity immobilization of genetically engineered proteins.

Claims

A method of sensitizing a plate for enzyme-linked immunosorbent assay with insoluble protein antigens of the plague microbe, including the destruction of the bacterial mass by ultrasound, followed by separation of subfractions by centrifugation, reprecipitation, resuspension, dissolution of the precipitate, affinity chromatography of proteins, isolation of target proteins, insoluble, used in buffer plates dissolution of the precipitate of purified target proteins with denaturation of 8 M urea and determination of their concentration in solutions after SDS electrophoresis under reducing conditions, characterized in that 10 μl of a solution of each purified protein MetQ, OmpA, Fba and YapM with a concentration of 0, denatured in 8 M urea, 08 mg / ml is added to the wells of the plate and a subsequent tenfold dilution is carried out in the wells with 0.1 M solution of carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6, accompanied by renaturation of proteins and their simultaneous passive immobilization in polystyrene wells x tablets for 18 hours at 6 ° C.