RU2731290C1

RU2731290C1 - Method for screening of aggressive isolate of sunflower phomosis pathogen (phomamacdonaldii boerema)

Info

Publication number: RU2731290C1
Application number: RU2019124250A
Authority: RU
Inventors: Нина Михайловна Арасланова; Светлана Леонидовна Саукова; Татьяна Сергеевна Антонова
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2020-09-01

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Invention is a method involving collection of plant fragments and sunflower seeds with signs of phomosis damage in different phases of plant development, isolating cultures of a pathogen from collected objects, obtaining monospore cultures of isolates of a pathogen and determining their species, sowing in a greenhouse of seeds of several genotypes of sunflower, differing in tolerance to phomosis, and obtaining 10-day plants, sifting monosporic cultures of isolates into petri dishes with uniform distribution of pycnospore on the surface of nutrient medium in them, contamination with 14-day culture of each isolated isolate of cotyledons and fragments of hypocrisy 10-day sunflower plants, allowance for degree of defeat of cotyledon leaves and fragments of hypocotyls, use of a mixture of aggressive isolates as an inoculum in artificial infection of plants in selection of sunflower for resistance to phomosis.

EFFECT: invention enables selection of the most aggressive Phona isolates for artificial infection of sunflower with phomosis in selection for resistance to this pathogen.

5 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и фитопатологии и может быть использовано для получения инфекционного материала фитопатогенных грибов с целью искусственного заражения растений подсолнечника для получения высокоустойчивых к фомозу его генотипов.The invention relates to the field of agricultural microbiology and phytopathology and can be used to obtain an infectious material of phytopathogenic fungi for the purpose of artificial infection of sunflower plants to obtain highly resistant to phomosis genotypes.

Грибы рода Phoma относятся к факультативным паразитам, которые до середины прошлого столетия не привлекали особого внимания, как возбудители болезней растений из-за низкой вредоносности. Однако в 70-е годы XX века паразитические свойства некоторых представителей данного рода усилились и в настоящее время виды Phoma с выраженными паразитическими свойствами широко встречаются, как возбудители болезней многих сельскохозяйственных культур, в том числе и подсолнечника. Фомоз подсолнечника быстро и глобально распространился в последние 10-15 лет и перешел в разряд экономически значимых болезней этой культуры. В России фомоз на подсолнечнике занимает лидирующее положение по распространенности среди других болезней. Широкое распространение болезни может быть связано с ввозом инфицированных семян из стран импортеров.Fungi of the genus Phoma belong to facultative parasites, which until the middle of the last century did not attract much attention as pathogens of plant diseases due to their low harmfulness. However, in the 70s of the XX century, the parasitic properties of some representatives of this genus intensified, and now Phoma species with pronounced parasitic properties are widely found as pathogens of many agricultural crops, including sunflower. Phomosis of sunflower has rapidly and globally spread in the last 10-15 years and has become an economically significant disease of this crop. In Russia, phomosis on sunflower occupies a leading position in terms of prevalence among other diseases. The widespread spread of the disease may be associated with the importation of infected seeds from importing countries.

Болезнь вызывает угнетение роста растений, утончение стебля, почернение его сердцевины и преждевременное созревание. У сильно восприимчивых генотипов на поздних этапах развития растений поражается центральная часть стебля, что приводит к его перелому. Потери урожая при таком поражении составляют более 30%. Гибель растений при поражении корневой системы фомозом в полевых условиях учесть практически невозможно, т.к. подобные симптомы могут вызывать и другие возбудители болезней. Основным и наиболее эффективным способом контроля фомоза является селекция устойчивых и толерантных гибридов подсолнечника.The disease causes inhibition of plant growth, thinning of the stem, blackening of its core and premature ripening. In highly susceptible genotypes, at the later stages of plant development, the central part of the stem is affected, which leads to its fracture. The loss of yield with such a lesion is more than 30%. It is practically impossible to take into account the death of plants when the root system is damaged by phomosis in the field, because other pathogens can cause similar symptoms. The main and most effective way to control phomosis is the selection of resistant and tolerant sunflower hybrids.

Результативность селекции на устойчивость зависит от подбора инокулята для искусственного заражения растений. В качестве инокулята необходимо использовать изоляты с высокой агрессивностью. Поэтому скрининг наиболее агрессивных изолятов возбудителя этой болезни для использования их в качестве инфекционного фона при селекции устойчивых к фомозу форм подсолнечника - очень актуальная задача.The effectiveness of selection for resistance depends on the selection of an inoculum for artificial infection of plants. Highly aggressive isolates should be used as inoculum. Therefore, screening of the most aggressive isolates of the causative agent of this disease for use as an infectious background in the selection of forms of sunflower that are resistant to phomosis is a very urgent task.

Известны способы получения инфекционного материала грибов на твердом субстрате, на зерновом материале, например на пшене (гриб Thielaviopsisbasicola), пропитанном в соотношении 1:1 раствором, содержащим ферментативные гидролизаты казеина, дрожжей и/или крови в количестве 100-150 мг% аминного азота и дрожжевой экстракт в количестве 0,05-0,1% к весу пшена (а.с. СССР №676610, C12K 1/01, опубл. 1979 г.) - с целью искусственного заражения с/х растений для получения высокоустойчивых сортов путем создания инфекционного фона.There are known methods of obtaining an infectious material of fungi on a solid substrate, on grain material, for example, on millet (Thielaviopsisbasicola mushroom), impregnated in a 1: 1 ratio with a solution containing enzymatic hydrolysates of casein, yeast and / or blood in an amount of 100-150 mg% of amine nitrogen and yeast extract in an amount of 0.05-0.1% by weight of millet (USSR AS No. 676610, C12K 1/01, publ. 1979) - for the purpose of artificial infection of agricultural plants to obtain highly resistant varieties by creating infectious background.

Известен способ получения препарата для оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили (а.с. СССР №1691392, C12N 1/14, А 01N 63/04, опубл. 1991 г.), с целью создания искусственного инфекционного фона при селекции хлопчатника на устойчивость к этому патогену. Известный способ включает выращивание гриба Thielaviopsisbasicola на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, картофель, капусту, глицерин, щавелевокислый калий, фосфорнокислый однозамещенный калий, сернокислый магний, воду. Питательную среду засеивают культурой гриба Т. Basicola - возбудителя черной корневой гнили хлопчатника - и культивируют при 26°С в течение 4 суток. Биомассу отделяют и смешивают с двуокисью кремния и каолином. Полученным препаратом обрабатывают семена хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили.A known method of obtaining a preparation for assessing cotton for resistance to black root rot (USSR AS No. 1691392, C12N 1/14, A 01N 63/04, publ. 1991), in order to create an artificial infectious background in the selection of cotton on resistance to this pathogen. The known method involves growing the mushroom Thielaviopsisbasicola on a nutrient medium containing yeast extract, potatoes, cabbage, glycerin, potassium oxalate, monosubstituted potassium phosphate, magnesium sulfate, water. The nutrient medium is inoculated with a culture of the fungus T. Basicola - the causative agent of black root rot of cotton - and cultivated at 26 ° C for 4 days. The biomass is separated and mixed with silica and kaolin. The resulting preparation is used to treat cotton seeds before sowing in order to evaluate cotton for resistance to black root rot.

Недостаток известных способов состоит в том, что они не эффективны для гриба PhomamacdonaldiiBoerema.A disadvantage of the known methods is that they are not effective for the Phomamacdonaldii Boerema fungus.

Задачей заявляемого изобретения является создание эффективного способа подбора инокулята для искусственного заражения подсолнечника фомозом для использования в селекции на устойчивость к этому патогену.The objective of the claimed invention is to create an effective method for selecting an inoculum for artificial infection of sunflower with phomosis for use in breeding for resistance to this pathogen.

Цель изобретения - отобрать из изолятов PhomamacdonaldiiBoerema. наиболее агрессивные и использовать их смесь в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу.The purpose of the invention is to select from Phomamacdonaldii Boerema isolates. the most aggressive ones and use their mixture as an inoculum for artificial infection of plants in sunflower breeding for resistance to phomosis.

Технический результат достигается тем, что способ скрининга агрессивного изолята фомоза подсолнечника (PhomamacdonaldiiBoerema) включает: сбор фрагментов растений и семянок подсолнечника с признаками поражения фомозом в разные фазы развития растений и выделение культур возбудителя фомоза, получение моноспоровых культур изолятов возбудителя фомоза и определение их видовой принадлежности, посев семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, рассев культур моноспоровых изолятов в чашки Петри с обеспечением равномерного распределения пикноспор по поверхности питательной среды, заражение отсеченных семядолей и фрагментов гипокотилей 10-дневных растений подсолнечника 14-дневной культурой каждого изолята в чашках Петри, учет степени поражения семядольных листьев и фрагментов гипокотиля через 2 суток совместного культивирования, выделение агрессивных изолятов по большему проценту пораженной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотиля, использование смеси агрессивных изолятов в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу, при этом в качестве фрагментов растений подсолнечника с признаками поражения фомозом используют корни, стебли, черешки, листья, выделение возбудителя фомоза из них осуществляют по общепринятой методике экспериментальной микологии на овсяной агаризированной среде, видовую принадлежность моноспоровых культур изолятов определяют по систематике Boeremaet.al на такой же среде, а для получения 10-дневных растений подсолнечника используют семена его нескольких линий, сортов и гибридов.The technical result is achieved by the fact that the method of screening an aggressive isolate of phomosis of sunflower (Phomamacdonaldii Boerema) includes: collecting plant fragments and achenes of sunflower with signs of phomosis in different phases of plant development and isolating cultures of the pathogen of phomosis, obtaining monospore cultures of isolates of the causative agent of phomosis and determining their species, sowing seeds of several genotypes of sunflower differing in tolerance to phomosis, sowing cultures of monosporous isolates in Petri dishes to ensure uniform distribution of pycnospores over the surface of the nutrient medium, infecting excised cotyledons and hypocotyl fragments of 10-day-old sunflower plants with a 14-day culture of each isolate in Petri dishes, taking into account the degree of damage to cotyledon leaves and hypocotyl fragments after 2 days of co-cultivation, isolation of aggressive isolates for a greater percentage of the affected surface of cotyledon leaves and hypocotyl fragments, was used a mixture of aggressive isolates as an inoculum for artificial infection of plants in the selection of sunflower for resistance to phomosis, while roots, stems, petioles, leaves are used as fragments of sunflower plants with signs of phomosis, isolation of the causative agent of phomosis from them is carried out according to the generally accepted method of experimental mycology on an oat agar medium, the species belonging of monosporous cultures of isolates is determined according to the Boeremaet.al taxonomy on the same medium, and seeds of several lines, varieties and hybrids are used to obtain 10-day-old sunflower plants.

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не выявили технических решений, имеющих существенные признаки заявляемого способа, касающиеся определения видовой принадлежности моноспоровых культур изолятов, использования для посева семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, и др. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности «НОВИЗНА» и «ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ». Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности «ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ», т.к. оно может быть использовано в сельском хозяйстве для получения высокоустойчивых к фомозу генотипов подсолнечника. Сущность заявляемого технического решения достаточно раскрыта в описании изобретения.Exploring the state of the art in the process of conducting a patent search for all types of information publicly available in the press, we did not identify technical solutions that have essential features of the proposed method regarding the determination of the species of monospore cultures of isolates, the use of several sunflower genotypes for sowing seeds, differing in tolerance to phomosis , etc. Thus, the claimed technical solution meets the criteria of patentability "NOVELTY" and "INVENTIVE LEVEL". The claimed technical solution also meets the criterion of patentability "INDUSTRIAL APPLICABILITY", since it can be used in agriculture to obtain genotypes of sunflower highly resistant to phomosis. The essence of the proposed technical solution is sufficiently disclosed in the description of the invention.

Способ осуществляется следующим образом. В течение вегетационного периода на полях подсолнечника осуществляют сбор фрагментов растений и семянок подсолнечника с признаками поражения фомозом, из них выделяют изоляты возбудителя фомоза, получают моноспоровые культуры изолятов и определяют их видовую принадлежность, осуществляют посев семян нескольких генотипов подсолнечника, различающихся по толерантности к фомозу, осуществляют рассев моноспоровых культур изолятов в чашки Петри с обеспечением равномерного распределения пикноспор по поверхности питательной среды в них, заражают 14-дневной культурой каждого изолята отсеченные семядольные листья и фрагменты гипокотилей 10-дневных растений подсолнечника, учитывают степень поражения семядольных листьев и фрагментов гипокотилей через 2 суток после заражения, выделяют агрессивные изоляты по большему проценту пораженной поверхности, используют смесь агрессивных изолятов в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции на устойчивость к фомозу, при этом при сборе фрагментов растений подсолнечника с признаками поражения фомозом используют пораженные корни, стебли черешки, листья, выделение возбудителя фомоза из фрагментов растений и семянок подсолнечника осуществляют с использованием общепринятой методики экспериментальной микологии, определение видовой принадлежности моноспоровых культур изолятов проводят на овсяной агаризованной (OA) среде по систематике Boeremaet.al, а для получения 10-дневных растений подсолнечника используют совместный посев семян нескольких его линий, сортов и гибридов.The method is carried out as follows. During the growing season in the fields of sunflower, fragments of plants and seeds of sunflower with signs of phomosis are collected, isolates of the pathogen of phomosis are isolated from them, monospore cultures of isolates are obtained and their species is determined, seeds of several genotypes of sunflower are sown, differing in tolerance to phomosis, sieving monospore cultures of isolates into Petri dishes ensuring uniform distribution of pycnospores over the surface of the nutrient medium in them, infecting with a 14-day culture of each isolate cut-off cotyledon leaves and hypocotyl fragments of 10-day-old sunflower plants, take into account the degree of damage to cotyledon leaves and hypocotyl fragments 2 days after infection, isolate aggressive isolates over a greater percentage of the affected surface, use a mixture of aggressive isolates as an inoculum for artificial infection of plants in breeding for resistance to phomosis, while collecting fra of sunflower plants with signs of phomosis damage, the affected roots, stalks of petioles, leaves are used, the isolation of the pathogen of phomosis from plant fragments and achenes of sunflower is carried out using the generally accepted method of experimental mycology, the species identification of monospore cultures of isolates is carried out on oat agar (OA) medium according to the Boeremaet taxonomy .al, and to obtain 10-day-old sunflower plants, joint sowing of seeds of several of its lines, varieties and hybrids is used.

Пример.Example.

Для осуществления заявляемого способа скрининга агрессивного изолята фомоза подсолнечника поступали так. В течение вегетационного периода на селекционных полях ВНИИМК (Краснодарский край) с посевами подсолнечника осуществляли сбор пораженных фомозом корней, листьев, черешков, стеблей вегетирующих растений этой культуры (всего 600 образцов) и выделяли изоляты возбудителя фомоза по общепринятой методике. Согласно ей для поверхностной стерилизации пораженных фрагментов растений объект выдерживали в 2%-ном растворе марганцевокислого калия в течение 1-5 мин и многократно промывали стерильной водой. Пораженные части растения до 1,0 см стерилизовали в 96% спирте, обжигали и высевали на питательную среду. Первичное выделение культур возбудителя фомоза, как и посевы исследуемых грибов, производили на питательной среде «овсяной агар»(ОА) с рН 6,0 с добавлением антибиотиков с широким спектром противобактериального действия (стрептомицина, биомицина и др.). Питательную среду OA готовили следующим образом: 150 г овсяных зерен варили в 1 л воды в течение 20 мин, сцеживали отвар, добавляли в него 20 г глюкозы и 20 г агара. Автоклавировали 30 мин при 1,2 атм и разливали в чашки Петри. Выращивали культуры возбудителя фомоза при температуре 20-25°С. Изучали морфологокультуральные характеристики выделенных изолятов на питательной среде OA на 3,5,7,10 и 14-й день. Идентификацию гриба проводили по систематике Boerema. Изоляты были идентифицированы как Phomamacdonaldii. Для определения агрессивности поступали так: изоляты гриба выращивали на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Питательную среду готовили следующим образом: 200 г очищенного картофеля варили в 1 л воды в течение 20 мин, сцеживали отвар, добавляли в него 20 г глюкозы и 20 г агара. Автоклавировали 30 мин при 1,2 атм и разливали в чашки Петри. Посев моноспоровых культур изолятов проводили следующим образом. Отделяли одну пикниду с вышедшим эксудатом стерильной иглой и помещали в стаканчик со стерильной водой объемом 25 мл, тщательно размешивали и наносили 2 капли на поверхность 9 см чашки Петри, равномерно распределяли шпателем. Выращивали культуры гриба 5 суток при оптимальной для гриба температуре 23-25°С. Через это время образуются равномерно распределенные по всей поверхности пикниды. Осуществляли посев семян подсолнечника двух линий ВК 653 и ВК 680, одного сорта ВНИИМК 8883 и одного гибрида Альтаир в сосуды и выращивали в теплице при оптимальных режимах освещения, температуры и влажности. Для заражения брали 10-дневные растения восприимчивых к фомозу линий ВК 653 и ВК 680, сорта ВНИИМК 8883 и гибрида Альтаир подсолнечника, отсекали семядольные листья и фрагменты гипокотилей и раскладывали их на культуры гриба по 9-10 шт в чашки с 14-дневной культурой каждого изолята. Через 2 суток контакта совместного культивирования учитывали размер пораженной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотилей. Об агрессивности изолятов гриба судили по размеру колонизированной поверхности семядольных листьев и фрагментов гипокотилей. По большему проценту пораженной поверхности семядолей и гипокотилей двух линий, сорта и гибрида подсолнечника были выделены 4 изолята. Смесь этих изолятов можно использовать в качестве инокулята при искусственном заражении растений в селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу.To implement the proposed method for screening an aggressive isolate of sunflower phomosis, we did the following. During the growing season, on the selection fields of VNIIMK (Krasnodar Territory) with sunflower crops, the roots, leaves, petioles, and stems of vegetative plants of this culture (600 samples in total) were collected and isolates of the pathogen of phomosis were isolated according to the generally accepted method. According to it, for surface sterilization of the affected plant fragments, the object was kept in a 2% solution of potassium permanganate for 1-5 min and repeatedly washed with sterile water. The affected plant parts up to 1.0 cm were sterilized in 96% alcohol, burned and sown on a nutrient medium. The primary isolation of the cultures of the pathogen of phomosis, as well as the inoculation of the studied fungi, was carried out on a nutrient medium "oat agar" (OA) with pH 6.0 with the addition of antibiotics with a wide spectrum of antibacterial action (streptomycin, biomycin, etc.). Nutrient medium OA was prepared as follows: 150 g of oat grains were boiled in 1 L of water for 20 min, the broth was decanted, 20 g of glucose and 20 g of agar were added to it. Autoclave for 30 min at 1.2 ATM and poured into Petri dishes. Cultures of the causative agent of phomosis were grown at a temperature of 20-25 ° C. We studied the morphological and cultural characteristics of the isolated isolates on OA nutrient medium on days 3,5,7,10 and 14. The fungus was identified according to the Boerema taxonomy. The isolates were identified as Phomamacdonaldii. To determine the aggressiveness, we proceeded as follows: the isolates of the fungus were grown on potato-glucose agar (CHA). The nutrient medium was prepared as follows: 200 g of peeled potatoes were boiled in 1 l of water for 20 min, the broth was decanted, 20 g of glucose and 20 g of agar were added to it. Autoclave for 30 min at 1.2 ATM and poured into Petri dishes. Sowing of monosporous cultures of isolates was carried out as follows. One pycnidium with exudated exudate was separated with a sterile needle and placed in a 25 ml glass of sterile water, mixed thoroughly and 2 drops were applied to the surface of a 9 cm Petri dish, evenly distributed with a spatula. Cultures of the fungus were grown for 5 days at an optimum temperature for the fungus of 23-25 ° C. After this time, pycnidia evenly distributed over the entire surface are formed. Sunflower seeds of two lines VK 653 and VK 680, one variety VNIIMK 8883 and one hybrid Altair were sown into vessels and grown in a greenhouse under optimal lighting, temperature and humidity conditions. For infection, we took 10-day-old plants of lines VK 653 and VK 680 susceptible to phomosis, varieties VNIIMK 8883 and hybrid Altair of sunflower, cut off cotyledon leaves and hypocotyl fragments and laid them on fungus cultures, 9-10 pcs in cups with 14-day culture of each isolate. After 2 days of co-cultivation contact, the size of the affected surface of cotyledon leaves and hypocotyl fragments was taken into account. The aggressiveness of fungal isolates was judged by the size of the colonized surface of cotyledon leaves and hypocotyl fragments. 4 isolates were isolated for the greater percentage of the affected surface of the cotyledons and hypocotyls of two lines, cultivar and hybrid of sunflower. A mixture of these isolates can be used as an inoculum for artificial infection of plants in sunflower breeding for resistance to phomosis.

Таким образом, совокупность существенных признаков заявляемого способа скрининга агрессивного изолята фомоза подсолнечника необходима и достаточна для достижения поставленной цели и решения поставленной задачи.Thus, the set of essential features of the proposed method for screening an aggressive isolate of phomosis of sunflower is necessary and sufficient to achieve the goal and solve the problem.

Claims

A method for screening aggressive isolates of the causative agent of phomosis of sunflower (Phoma macdonaldii Boerema), including the collection of parts of sunflower plants affected by phomaosis, isolation of the causative agent of phomosis according to the generally accepted method of experimental mycology, obtaining monospore cultures of isolates of the causative agent of phomosis, determination of the species environment of isolates on the taxonomy of Boerema , sowing seeds of several genotypes of sunflower seeds in a greenhouse, differing in tolerance to phomosis, and growing them, infecting each genotype of sunflower with each isolated isolate of the causative agent of phomosis, taking into account the degree of damage, selecting the most aggressive isolates of the causative agent of phomosis, characterized in that obtaining monosporous cultures of isolates of the causative agent of phomosis carried out by sieving isolates into Petri dishes to ensure uniform distribution of pycnospores over the surface of the CHA nutrient medium, infecting each sunflower genotype with each isolated phomosis isolate a is carried out by cutting off cotyledon leaves and hypocotyl fragments from healthy 10-day-old sunflower plants and laying them out on fungus cultures in Petri dishes with a 14-day culture of each isolate, the degree of damage is recorded after 2 days of their joint contact, the aggressiveness of the phomosis isolates is judged by the size of the colonized surface of cotyledon leaves and hypocotyl fragments, the selection of the most aggressive isolates of the causative agent of phomosis is carried out according to a greater percentage of the surface of cotyledon leaves and hypocotyl fragments of sunflower genotypes affected by them.