RU2727360C1 - Method of producing chitosan nanoparticles - Google Patents
Method of producing chitosan nanoparticles Download PDFInfo
- Publication number
- RU2727360C1 RU2727360C1 RU2019129512A RU2019129512A RU2727360C1 RU 2727360 C1 RU2727360 C1 RU 2727360C1 RU 2019129512 A RU2019129512 A RU 2019129512A RU 2019129512 A RU2019129512 A RU 2019129512A RU 2727360 C1 RU2727360 C1 RU 2727360C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chitosan
- nanoparticles
- acid
- powder
- solution
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области химии полимеров, нанотехнологии, фармацевтической промышленности, медицине и может быть использовано для получения полимерных наночастиц из высокомолекулярного хитозана, перспективного для создания новых, в том числе персонализированных лекарственных форм.The invention relates to the field of polymer chemistry, nanotechnology, pharmaceutical industry, medicine and can be used to obtain polymer nanoparticles from high molecular weight chitosan, promising for creating new, including personalized dosage forms.
Последнее четвертое поколение лекарственных средств на основе наночастиц - так называемых терапевтических систем - характеризуется высокой эффективностью, отсутствием побочных эффектов, пролонгированным действием, предполагает направленный транспорт лекарственного вещества и его векторное действие в зоне запланированной локализации, а также, и это самое главное, инициирование процесса саногенеза (восстановление механизмов саморегуляции) живого организма. Терапевтически активные наночастицы получают, как правило, инкапсулированием биологически активного вещества (БАВ) в липосомальную или липоплексовую оболочку, полиэлектролитные капсулы, наномицеллы амфифильных полимеров или циклодекстриновые нанополости, либо адсорбцией БАВ на поверхности наночастиц и др. В отличие от классических лекарственных форм, проникновение действующего вещества которых обеспечивается через эндотелий, проникновение наносистем происходит на уровне эндоцитоза.The last fourth generation of drugs based on nanoparticles - the so-called therapeutic systems - is characterized by high efficiency, no side effects, prolonged action, assumes directed transport of the drug and its vector action in the zone of planned localization, as well as, and most importantly, initiation of the process of sanogenesis (restoration of self-regulation mechanisms) of a living organism. Therapeutically active nanoparticles are obtained, as a rule, by encapsulating a biologically active substance (BAS) in a liposomal or lipoplex shell, polyelectrolyte capsules, nanomicelles of amphiphilic polymers or cyclodextrin nanocavities, or by adsorption of biologically active substances on the surface of nanoparticles, etc. In contrast to classical substances of medicinal forms, the penetration of the active substance is which is provided through the endothelium, the penetration of nanosystems occurs at the level of endocytosis.
Наибольшим потенциалом должны обладать наночастицы полностью построенные из БАВ. В качестве потенциального материала для создания таких частиц может рассматриваться аминополисахарид хитозан. Хитозан обладает антибактериальным, противовирусным и фунгицидным действием, проявляет антитоксическую, иммунотропную и противовоспалительную активности. Материалы на основе хитозана совместимы с живыми тканями, биорезорбируемы, способны стимулировать процессы ранозаживления, регенерации тканей, саногенеза.The greatest potential should be possessed by nanoparticles made entirely of biologically active substances. The aminopolysaccharide chitosan can be considered as a potential material for creating such particles. Chitosan possesses antibacterial, antiviral and fungicidal effects, exhibits antitoxic, immunotropic and anti-inflammatory activities. Chitosan-based materials are compatible with living tissues, bioresorbable, capable of stimulating the processes of wound healing, tissue regeneration, and sanogenesis.
В настоящее время для получения наночастиц хитозана используют методы сшивания полимерной эмульсии преимущественно глутаровым альдегидом, коацервации/осаждения с использованием растворов неорганических солей, распылительной сушки в присутствии сшивающих агентов или в среде сверхкритических жидкостей, ионотропного гелеобразования с применением натриевой соли триполифосфата и др. (Naskar S., Koutsu K., Sharma S. Chitosan-based nanoparticles as drug delivery systems: a review on two decades of research // Journal of Drug Targeting. 2019. Vol. 27. No 4. P 379-393).Currently, to obtain chitosan nanoparticles, methods of crosslinking a polymer emulsion with predominantly glutaraldehyde, coacervation / precipitation using solutions of inorganic salts, spray drying in the presence of crosslinking agents or in a medium of supercritical fluids, ionotropic gelation using sodium tripolyphosphate salt, etc. are used (Naskar). ., Koutsu K., Sharma S. Chitosan-based nanoparticles as drug delivery systems: a review on two decades of research // Journal of Drug Targeting. 2019. Vol. 27. No 4. P 379-393).
Данные методы получения наночастиц хитозана многостадийны, сложны в аппаратурном оформлении и требуют дорогостоящего оборудования. Некоторые методы предполагают использование органических растворителей, сшивающих реагентов и поверхностно-активных веществ, большинство из которых не разрешено к применению в медико-фармацевтических приложениях и образует токсичные побочные продукты. Все это может оказывать негативное действие на биосовместимость и другие биохимические свойства готового материала, и соответственно, ограничивать его применение в медицинской практике.These methods for the preparation of chitosan nanoparticles are multistage, complex in hardware, and require expensive equipment. Some methods involve the use of organic solvents, cross-linking reagents, and surfactants, most of which are not approved for pharmaceutical applications and generate toxic by-products. All this can have a negative effect on biocompatibility and other biochemical properties of the finished material, and, accordingly, limit its use in medical practice.
Известен способ получения наночастиц низкомолекулярного хитозана (см. Патент РФ. №2428432 по кл. МПК С08В 37/08, опуб. 10.09.2011). Способ предусматривает растворение предварительно очищенного низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой ММ~10 кДа в водном растворе уксусной кислоты концентрации 1-2 мас.%, медленное (0.1-0.2 мл/мин) введение раствора гидроксидов щелочных металлов или аммония до рН среды 6.9-7.0 при перемешивании на магнитной мешалке в течение 2-х час. Полученную дисперсию центрифугируют со скоростью 10000 об/мин, твердый остаток редиспергируют в бидистиллированной воде при механическом перемешивании со скоростью 200-300 об/мин и температуре 20°С. По данным динамического светорассеяния способ позволяет получить наночастицы низкомолекулярного хитозана с размером от 30 до 85 нм.A known method of producing nanoparticles of low molecular weight chitosan (see RF Patent. No. 2428432 on class IPC S08B 37/08, publ. 09/10/2011). The method involves dissolving pre-purified low-molecular-weight chitosan with a molecular weight of ~ 10 kDa in an aqueous solution of acetic acid with a concentration of 1-2 wt.%, Slow (0.1-0.2 ml / min) introduction of a solution of alkali metal or ammonium hydroxides to a pH of 6.9-7.0 at stirring on a magnetic stirrer for 2 hours. The resulting dispersion is centrifuged at a speed of 10000 rpm, the solid residue is redispersed in bidistilled water with mechanical stirring at a speed of 200-300 rpm and a temperature of 20 ° C. According to the data of dynamic light scattering, the method allows one to obtain nanoparticles of low molecular weight chitosan with a size from 30 to 85 nm.
Однако, в предложенном способе получения наночастиц хитозана используют только низкомолекулярные образцы хитозана. Кроме того, образец необходимо предварительно очистить. Способ отличается многостадийностью, трудоемкостью, длительностью процесса формирования наночастиц хитозана. Процесс диспергирования используют на двух этапах: сначала в процессе депротонирования ацетата хитозана в течение двух часов, затем в процессе редиспергирования осадка депротонированного хитозана. Цель - получение биологически активных наночастиц хитозана - в способе не ставилась.However, in the proposed method for producing chitosan nanoparticles, only low molecular weight chitosan samples are used. In addition, the sample must be pre-cleaned. The method is distinguished by its multistage, laboriousness, and duration of the formation of chitosan nanoparticles. The dispersion process is used in two stages: first, in the process of deprotonation of chitosan acetate for two hours, then in the process of redispersion of the precipitate of deprotonated chitosan. The goal of obtaining biologically active nanoparticles of chitosan was not set in the method.
Известен способ получения наночастиц хитозана размером 10-20 нм, в том числе флуоресцентных, парамагнитных (см. заявку WO 2009/009469 по кл. МПК А61В5/055, опуб. 15.01.2009). Способ заключается в следующем: хитозан растворяют в 1% растворе уксусной кислоты и получают эмульсию введением эффективных количеств неионогенного поверхностно-активного вещества (Тритон Х-100), циклогексана и гексанола-1. Одновременно получают вторую эмульсию на основе эффективных количеств циклогексана, гексанола-1, водного раствора винной кислоты, 1-этил-3-(3-диметиламинопропилкарбодиимида), н-гидроксисукцинимида и неионогенного поверхностно-активного вещества. К эмульсии, содержащей хитозан, по каплям добавляют вторую эмульсию, перемешивают в течение 24 час, добавляют этанол, осадок суспендирут в воде, подвергают диализу и центрифугируют со скоростью 8000 об/мин в течение 15 мин. К центрифугату снова добавляют этанол и обрабатывают ультразвуком в течение 10 с. Процедуру повторяют не менее 5 раз. Полученный центрифугат ресуспендируют в воде и фильтруют для получения монодисперсных наночастиц. По данным просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния способ позволяет получить наночастицы хитозана с размером от 10 до 20 нм. В других вариантах осуществления способа уксуснокислый хитозан дополнительно ковалентно сшивают с флуоресцентным красителем изотиоцианатом флуоресцеина. Полученные таким образом наночастицы проявляют флуоресценцию. Альтернативно, уксуснокислый хитозан сшивают с органическим макроциклом, содержащим хелатные парамагнитные ионы, такие как гадолиний, диспрозий, европий или их комбинацию. Выделенные наночастицы парамагнины и могут быть использованы в качестве контрастной среды магнитно-резонансной томографии. A known method of producing chitosan nanoparticles with a size of 10-20 nm, including fluorescent, paramagnetic (see application WO 2009/009469 on class IPC A61B5 / 055, publ. 15.01.2009). The method consists in the following: chitosan is dissolved in 1% acetic acid solution and an emulsion is obtained by introducing effective amounts of a nonionic surfactant (Triton X-100), cyclohexane and hexanol-1. At the same time, a second emulsion is obtained based on effective amounts of cyclohexane, hexanol-1, an aqueous solution of tartaric acid, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbodiimide), n-hydroxysuccinimide and a nonionic surfactant. The second emulsion is added dropwise to the emulsion containing chitosan, stirred for 24 hours, ethanol is added, the precipitate is suspended in water, dialyzed and centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes. Ethanol is added to the centrifugate again and sonicated for 10 seconds. The procedure is repeated at least 5 times. The resulting centrifugate is resuspended in water and filtered to obtain monodisperse nanoparticles. According to the data of transmission electron microscopy and dynamic light scattering, the method allows one to obtain chitosan nanoparticles with a size of 10 to 20 nm. In other embodiments of the method, chitosan acetic acid is additionally covalently crosslinked with a fluorescent dye, fluorescein isothiocyanate. The nanoparticles thus obtained exhibit fluorescence. Alternatively, chitosan acetic acid is crosslinked with an organic macrocycle containing chelated paramagnetic ions such as gadolinium, dysprosium, europium, or a combination thereof. The isolated nanoparticles are paramagnets and can be used as a contrast medium for magnetic resonance imaging.
Однако, предложенный способ отличается многокомпонентностью (более девяти компонентов), сложностью аппаратурного оформления и условий проведения процесса формирования наночастиц хитозана, многостадийностью, многократностью процесса отмывки полученных наночастиц, трудоемкостью. Полученные наночастицы хитозана могут выполнять лишь функцию контрастирующего вещества при зондировании биотканей и впоследствии должны быстро выводиться из зоны локализации. О фармацевтическом применении наночастиц в способе не указывается.However, the proposed method is distinguished by its multicomponent (more than nine components), the complexity of the hardware design and the conditions for the process of forming chitosan nanoparticles, the multistage, multiple process of washing the obtained nanoparticles, and laboriousness. The obtained chitosan nanoparticles can only perform the function of a contrast agent when probing biological tissues and must subsequently be quickly removed from the localization zone. The method does not indicate the pharmaceutical use of nanoparticles.
Наиболее близким к заявленному является способ получения наночастиц глутамата хитозана (см. Патент РФ №2562723 по кл. МПК С08В37/08, опуб. 10.09.2015). Способ предусматривает растворение порошка хитозана с ММ=3, 9 или 30 кДа в водном растворе глутаминовой кислоты концентрации 0.0050-0.1375% в соотношении [хитозан] : [глутаминовая кислота] = 1 : 0.864 при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 2 час. По первому варианту способа реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре, затем в систему вводят этанол и центрифугируют. Твердый осадок фильтруют и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С. По второму варианту способа реакционную смесь перемешивают при температуре 70°С. По окончании реакции полученный раствор вакуумируют на роторном испарителе при 70-75°С и при -0.8-0.9 атм, а затем при той же температуре в вакууме 0.5-1 мм рт.ст. По данным динамического светорассеяния водной дисперсии способ позволяет получить наночастицы глутамата хитозана размером от 165 до 340 нм.The closest to the claimed is a method for producing chitosan glutamate nanoparticles (see RF Patent No. 2562723 according to class MPK S08B37 / 08, publ. 09/10/2015). The method involves dissolving chitosan powder with MM = 3, 9 or 30 kDa in an aqueous solution of glutamic acid with a concentration of 0.0050-0.1375% in the ratio [chitosan]: [glutamic acid] = 1: 0.864 with stirring at 200 rpm for 2 hours ... According to the first variant of the method, the reaction mixture is stirred at room temperature, then ethanol is introduced into the system and centrifuged. The solid precipitate is filtered and dried in a vacuum drying oven at a temperature of 30 ° C. According to the second variant of the method, the reaction mixture is stirred at a temperature of 70 ° C. Upon completion of the reaction, the resulting solution is evacuated on a rotary evaporator at 70-75 ° C and at -0.8-0.9 atm, and then at the same temperature in a vacuum of 0.5-1 mm Hg. According to the data of dynamic light scattering of an aqueous dispersion, the method makes it possible to obtain nanoparticles of chitosan glutamate with a size of 165 to 340 nm.
Однако, в предложенном способе получения наночастиц глутамата хитозана используются только низкомолекулярные образцы хитозана. Реализация способа требует специального дорогостоящего оборудования (термостат, вакуумный сушильный шкаф, роторный испаритель), высоких температур, низких давлений (вакуум), достаточно длительного времени проведения эксперимента. Введение этилового спирта в объем реакционной смеси может вызвать агрегацию нанодисперсий и укрупнение наночастиц. Кроме того, при высаживании частиц этиловым спиртом протекает депротонирование солевой формы хитозана, так что в способе получают частицы не глутамата хитозана, а хитозана в основной форме. Получение биологически активных наночастиц хитозана в способе не ставилось.However, in the proposed method for producing chitosan glutamate nanoparticles, only low molecular weight chitosan samples are used. The implementation of the method requires special expensive equipment (thermostat, vacuum drying oven, rotary evaporator), high temperatures, low pressures (vacuum), a fairly long time for the experiment. The introduction of ethyl alcohol into the volume of the reaction mixture can cause aggregation of nanodispersions and coarsening of nanoparticles. In addition, when the particles are planted with ethyl alcohol, the salt form of chitosan is deprotonated, so that the method produces particles of not chitosan glutamate, but chitosan in the basic form. Obtaining biologically active nanoparticles of chitosan in the method was not set.
Технической проблемой заявляемого изобретения является разработка способа получения биологически активных, устойчивых к агрегации наночастиц на основе высокомолекулярного хитозана.The technical problem of the claimed invention is the development of a method for producing biologically active nanoparticles resistant to aggregation based on high molecular weight chitosan.
Техническим результатом является получение биологически активных, кинетически стабильных наночастиц хитозана размером 50-80 нм при упрощении способа получения и сохранении высокой биологической активности полимерной системы. The technical result is to obtain biologically active, kinetically stable chitosan nanoparticles with a size of 50-80 nm while simplifying the production method and maintaining a high biological activity of the polymer system.
Техническая проблема достигается тем, что в способе получения наночастиц хитозана, заключающемся в смешивании хитозана с кислотой и получении целевого продукта, согласно изобретению, используют порошок высокомолекулярного хитозана, в качестве кислоты используют порошок L-аспарагиновой кислоты, которые смешивают и диспергируют в воде для получения раствора аспарагината хитозана с концентрацией в нём хитозана (1.8-3.5)⋅10-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты (1.5-3.0)⋅10-2 М при мольном соотношении [хитозан(-NH2)] : [кислота] = 0.6-2.3, полученный раствор аспарагината хитозана фильтруют, формируют тонкую плёнку этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1 и оставляют для испарения жидкости при температуре 20±2°С не более 1 часа для получения наночастиц в виде порошка.The technical problem is achieved by the fact that in the method for producing chitosan nanoparticles, which consists in mixing chitosan with an acid and obtaining the target product, according to the invention, a powder of high molecular weight chitosan is used, as an acid powder of L- aspartic acid is used, which are mixed and dispersed in water to obtain a solution chitosan aspartate with a concentration of chitosan (1.8-3.5) ⋅10 -2 M and a concentration of L- aspartic acid (1.5-3.0) ⋅10 -2 M at a molar ratio [chitosan (-NH 2 )]: [acid] = 0.6 -2.3, the obtained solution of chitosan asparaginate is filtered, a thin film of ethyl alcohol is formed, on the surface of which a solution of chitosan aspartate is sprayed in a volume ratio [chitosan aspartate]: [alcohol] = 1: 1 and left for evaporation of the liquid at a temperature of 20 ± 2 ° C not more than 1 hour to obtain nanoparticles in powder form.
Используют хитозан со степенью дезацетилирования ≥ 75-80 мольн.% и молекулярной массой 200 кДа.Chitosan with a degree of deacetylation of ≥ 75-80 mol% and a molecular weight of 200 kDa is used.
L-аспарагиновая кислота (Asp) - двухосновная, биполярная алифатическая аминокислота, одна из 20 протеиногенных аминокислот организма, выполняет роль нейромедиатора в центральной нервной системе. Данная кислота и её соли широко используются как компоненты лекарственных средств. L- aspartic acid (Asp) is a dibasic, bipolar aliphatic amino acid, one of the body's 20 proteinogenic amino acids, which acts as a neurotransmitter in the central nervous system. This acid and its salts are widely used as components of medicines.
Изобретение поясняется иллюстрацией, где на фиг. 1 представлены РЭМ-фотографии наночастиц хитозана: на фиг. 1 а - с размером частиц 50-80 нм, на фиг. 1 б - с размером частиц 60-80 нм.The invention is illustrated by illustration, where FIG. 1 shows SEM photographs of chitosan nanoparticles: in Fig. 1 a - with a particle size of 50-80 nm, in Fig. 1 b - with a particle size of 60-80 nm.
В основе способа получения наночастиц хитозана лежит нанофазовое разделение раствора аспарагината хитозана с одновременным депротонированием полимера (воздушно-сухие наночастицы).The method for producing chitosan nanoparticles is based on nanophase separation of a chitosan aspartate solution with simultaneous deprotonation of the polymer (air-dry nanoparticles).
Таким образом, наночастицы представляют собой высушенные порошки наночастиц хитозана. Частицы агрегативно устойчивы более трех лет.Thus, nanoparticles are dried powders of chitosan nanoparticles. The particles are aggregatively stable for more than three years.
Для визуализации и определения размера воздушно-сухих наночастиц используют растровый электронный микроскоп РЭМ MIRA II LMU («TESCAN»), снабженный энерго-дисперсионным анализатором EDX INCA ENERGY 350. На образцы предварительно напыляют 5-10 нм золота на приборе Ermitech K 4. To visualize and determine the size of air-dry nanoparticles, a scanning electron microscope SEM MIRA II LMU ("TESCAN") is used, equipped with an EDX INCA ENERGY 350 energy-dispersive analyzer. Samples are preliminarily sprayed with 5-10 nm gold on an Ermitech K 4 device.
В качестве исходных реагентов для получения наночастиц используют хитозан со степенью дезацетилирования ≥ 75-80 мольн.% и ММ = 200 кДа, L-аспарагиновую кислоту, бидистиллированную воду, дегазированную от СО2 и О2 кипячением при 100°С в течение 1 час.Chitosan with a degree of deacetylation ≥ 75-80 mol% and MW = 200 kDa, L- aspartic acid, bidistilled water degassed from CO 2 and O 2 by boiling at 100 ° C for 1 hour are used as starting reagents for the preparation of nanoparticles.
Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.
Готовят водный раствор аспарагината хитозана из расчета концентрации в нём хитозана С ХТЗ = (1.8-3.5)⋅10-2 М и концентрации L-аспарагиновой кислоты C Asp = (1.5-3.0) ⋅10-2 М при соблюдении мольного соотношения [хитозан(-NH2)] : [кислота] = 0.6-2.3. Процесс растворения компонентов проводят по стандартной методике при комнатной температуре. Для этого навески порошка хитозана и порошка аспарагиновой кислоты помещают в колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения компонентов (формирования аспарагината хитозана) не более 2 часов и фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤ 0.45 мкм. Хранят при +4°С не более двух суток.Prepare an aqueous solution of chitosan aspartate based on the concentration of chitosan C XTZ = (1.8-3.5) ⋅10 -2 M and the concentration of L- aspartic acid C Asp = (1.5-3.0) ⋅10 -2 M while observing the molar ratio [chitosan ( -NH 2 )]: [acid] = 0.6-2.3. The process of dissolving the components is carried out according to the standard procedure at room temperature. For this, weighed portions of chitosan powder and aspartic acid powder are placed in a flask of a given volume, the calculated amount of bidistilled water is added, stirred until the components are completely dissolved (chitosan aspartate formation) for no more than 2 hours and filtered through a Millipore filter with a pore diameter of ≤ 0.45 μm. Store at + 4 ° С for no more than two days.
Для получения наночастиц хитозана используют принципы нанопреципитации (соосаждения). Для этого на инертной зеркальной подложке формируют тонкую пленку из этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1 и оставляют для испарения жидкости не более 1 час. Размер выделенных частиц определяют с использованием РЭМ-микроскопии. Наночастицы хитозана представляют собой воздушно-сухой порошок.To obtain chitosan nanoparticles, the principles of nanoprecipitation (coprecipitation) are used. To do this, a thin film of ethyl alcohol is formed on an inert mirror substrate, on the surface of which a solution of chitosan aspartate is sprayed in a volume ratio [chitosan aspartate]: [alcohol] = 1: 1 and the liquid is left to evaporate for no more than 1 hour. The size of the isolated particles is determined using SEM microscopy. Chitosan nanoparticles are air-dry powder.
Использование для получения наночастиц водного раствора аспарагината хитозана с концентрацией хитозана более 3.5⋅10-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты более 3.0⋅10-2 М нецелесообразно вследствие ограниченной растворимости компонентов. При использовании растворов аспарагината хитозана с С ХТЗ < 1.8·10-2 М и C Asp < 1.5⋅10-2 М получается незначительное количество наночастиц.Use for the preparation of nanoparticles of chitosan aqueous solution at a concentration asparaginata chitosan more 3.5⋅10 -2 M and L -asparaginovoy acid concentration more 3.0⋅10 -2 M impractical due to the limited solubility of the components. When using solutions of chitosan asparaginate with C ChTS <1.8 · 10-2 M and C Asp <1.5 · 10 -2 M, a small amount of nanoparticles is obtained.
Пример 1. Готовят водный раствор аспарагината хитозана из расчета в нём концентраци хитозана 1.8⋅10-2 М и концентрации L-аспарагиновой кислоты 3.0⋅10-2 М. Для этого навески порошка хитозана и порошка L-аспарагиновой кислоты помещают в колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают в течение 2-х час. Полученный раствор аспарагината хитозана фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤ 0.45 мкм. Далее на инертной зеркальной подложке формируют тонкую пленку из этилового спирта, на поверхность которой напыляют раствор аспарагината хитозана в объемном соотношении [аспарагинат хитозана] : [спирт] = 1 : 1 и оставляют для испарения жидкости при температуре 20±2°С не более 1 час. Example 1. An aqueous solution of chitosan asparaginate is prepared based on the concentration of chitosan 1.8⋅10-2 M and concentration L-aspartic acid 3.0⋅10-2 M. For this, weighed portions of chitosan powder and L-aspartic acid powder are placed in a flask of a predetermined volume, a calculated amount of bidistilled water is added, and mixed for 2 hours. The resulting solution of chitosan aspartate is filtered through a Millipore filter with a pore diameter of ≤ 0.45 μm. Next, on an inert mirror substrate, a thin film of ethyl alcohol is formed, on the surface of which a solution of chitosan aspartate is sprayed in a volume ratio [chitosan aspartate]: [alcohol] = 1: 1 and left to evaporate the liquid at a temperature of 20 ± 2 ° C for no more than 1 hour ...
По данным РЭМ-микроскопии размер выделенных наночастиц хитозана составляет 50-80 нм. According to SEM microscopy, the size of the isolated chitosan nanoparticles is 50-80 nm.
Пример выделенных наночастиц хитозана приведен на фиг. 1 а. An example of isolated chitosan nanoparticles is shown in FIG. 1 a.
Пример 2. Все этапы получения наночастиц хитозана аналогичны примеру 1. Отличие в том, что концентрация хитозана в растворе составляет С ХТЗ = 3.5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 60-80 нм. Пример выделенных наночастиц хитозана приведен на фиг. 1 б. Example 2 All steps of the preparation of nanoparticles of chitosan similar to Example 1. The difference is that the concentration of chitosan in the solution is HTZ C = 3.5⋅10 -2 M. particle size allocated 60-80 nm. An example of isolated chitosan nanoparticles is shown in FIG. 1 b.
Пример 3. Все этапы получения наночастиц хитозана аналогичны примеру 2. Отличие в том, что концентрация L-аспарагиновой кислоты в растворе составляет C Asp = 1.5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 50-70 нм. Example 3. All stages of obtaining chitosan nanoparticles are similar to example 2. The difference is that the concentration of L- aspartic acid in the solution is C Asp = 1.5⋅10 -2 M. The size of the isolated particles is 50-70 nm.
Таким образом, примеры показывают возможность получения кинетически стабильных наночастиц хитозана размером 50-80 нм сравнительно простым способом получения с использованием принципов соосаждения.Thus, the examples show the possibility of obtaining kinetically stable chitosan nanoparticles with a size of 50-80 nm in a relatively simple production method using the principles of coprecipitation.
Пример 4. Оценка цитотоксичности и биосовместимости наночастиц хитозана. Используют порошок наночастиц хитозана, полученный по примерам 1 - 3. Оценку цитотоксичности и биосовместимости проводят с использованием культуры человеческих дермальных фибробластов, полученных из биоптатов кожи здоровых взрослых доноров после косметической операции. Example 4. Evaluation of cytotoxicity and biocompatibility of chitosan nanoparticles. Use the powder of nanoparticles of chitosan obtained in examples 1 to 3. Evaluation of cytotoxicity and biocompatibility is carried out using a culture of human dermal fibroblasts obtained from skin biopsies of healthy adult donors after cosmetic surgery.
В стерильные чашки Петри вносят ростовую среду DMEM (Sigma), дополненную 10% FBS (Hyclone) и 1% антибиотиков (Sigma), суспензию наночастиц хитозана, полученную диспергинованием порошка наночастиц в бидистиллированной воде в течение 10 мин, в объемном соотношении [суспензия наночастиц] : [ростовая среда] = 1 : 5, а затем суспензию человеческих дермальных фибробластов из расчета 200 тыс.кл./мл и культивируют 72 час в условиях насыщающей влажности в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Оценивают время формирования зрелого монослоя клеток, которое сравнивают с временем формирования монослоя культуры клеток, выросшей в такой же питательной среде в отсутствие суспензии наночастиц хитозана.In sterile Petri dishes, a growth medium DMEM (Sigma), supplemented with 10% FBS (Hyclone) and 1% antibiotics (Sigma), a suspension of chitosan nanoparticles obtained by dispersing the nanoparticle powder in bidistilled water for 10 min, in a volume ratio [nanoparticle suspension] : [growth medium] = 1: 5, and then a suspension of human dermal fibroblasts at the rate of 200 thousand cells / ml and cultured for 72 hours under saturating humidity in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C. The time of formation of a mature cell monolayer is estimated, which is compared with the time of formation of a monolayer of a cell culture grown in the same nutrient medium in the absence of a suspension of chitosan nanoparticles.
Тестирование показало, что время формирования зрелого монослоя человеческих дермальных фибробластов в присутствии наночастиц хитозана и в контроле одинаковое и составляет 60 час. Таким образом, наночастицы хитозана не цитотоксичны и биосовместимы.Testing has shown that the formation time of a mature monolayer of human dermal fibroblasts in the presence of chitosan nanoparticles and in the control is the same and amounts to 60 hours. Thus, chitosan nanoparticles are not cytotoxic and biocompatible.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129512A RU2727360C1 (en) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Method of producing chitosan nanoparticles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129512A RU2727360C1 (en) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Method of producing chitosan nanoparticles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2727360C1 true RU2727360C1 (en) | 2020-07-21 |
Family
ID=71741112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019129512A RU2727360C1 (en) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Method of producing chitosan nanoparticles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2727360C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111961095A (en) * | 2020-09-04 | 2020-11-20 | 山东科大创业生物有限公司 | Ionic liquid compound for preventing and treating plant virus diseases and preparation and application thereof |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060105049A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Valorisation Recherche Hscm & Universite De Montreal | Folic acid-chitosan-DNA nanoparticles |
| US7740883B2 (en) * | 2004-03-28 | 2010-06-22 | University Of Debrecen | Nanoparticles from chitosan |
| US20110021745A1 (en) * | 2007-07-06 | 2011-01-27 | Swadeshmukul Santra | Ultra-small chitosan nanoparticles useful as bioimaging agents and methods of making same |
| US7883723B2 (en) * | 2004-07-16 | 2011-02-08 | Jae-Woon Nah | Water soluble chitosan nanoparticle for delivering an anticancer agent and preparing method thereof |
| RU2428432C1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing nanoparticles of low-molecular chitosan |
| JP2012191932A (en) * | 2011-03-03 | 2012-10-11 | Asahi Kasei Corp | Method for producing 11-sugar sialyloligosaccharide-asparagine |
| RU2554804C1 (en) * | 2014-05-27 | 2015-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук (ИМЕТ РАН) | Method for preparing calcium phosphate composite |
| RU2562723C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan glutamate nanoparticles |
| RU2562721C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan succinate nanoparticles |
-
2019
- 2019-09-19 RU RU2019129512A patent/RU2727360C1/en active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7740883B2 (en) * | 2004-03-28 | 2010-06-22 | University Of Debrecen | Nanoparticles from chitosan |
| US7883723B2 (en) * | 2004-07-16 | 2011-02-08 | Jae-Woon Nah | Water soluble chitosan nanoparticle for delivering an anticancer agent and preparing method thereof |
| US20060105049A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Valorisation Recherche Hscm & Universite De Montreal | Folic acid-chitosan-DNA nanoparticles |
| US20110021745A1 (en) * | 2007-07-06 | 2011-01-27 | Swadeshmukul Santra | Ultra-small chitosan nanoparticles useful as bioimaging agents and methods of making same |
| RU2428432C1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing nanoparticles of low-molecular chitosan |
| JP2012191932A (en) * | 2011-03-03 | 2012-10-11 | Asahi Kasei Corp | Method for producing 11-sugar sialyloligosaccharide-asparagine |
| RU2562723C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan glutamate nanoparticles |
| RU2562721C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan succinate nanoparticles |
| RU2554804C1 (en) * | 2014-05-27 | 2015-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук (ИМЕТ РАН) | Method for preparing calcium phosphate composite |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111961095A (en) * | 2020-09-04 | 2020-11-20 | 山东科大创业生物有限公司 | Ionic liquid compound for preventing and treating plant virus diseases and preparation and application thereof |
| CN111961095B (en) * | 2020-09-04 | 2023-08-22 | 山东科大创业生物有限公司 | Ionic liquid compound for preventing and treating plant virus diseases, and preparation and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104321051B (en) | Non-woven membrane as drug delivery system | |
| Dhanka et al. | Injectable methotrexate loaded polycaprolactone microspheres: physicochemical characterization, biocompatibility, and hemocompatibility evaluation | |
| CN107095859B (en) | Drug-loaded nanocapsule with tumor cell bioreductive microenvironment sensitivity and preparation method thereof | |
| Lozano-Pérez et al. | Antitumor properties of platinum (iv) prodrug-loaded silk fibroin nanoparticles | |
| Marin et al. | Encapsulation of manganese dioxide nanoparticles into layer-by-layer polymer capsules for the fabrication of antioxidant microreactors | |
| Sivaraman et al. | Porous polysulfone coatings for enhanced drug delivery | |
| CN101984958B (en) | Nanoscale albendazole micropowder and preparation method thereof | |
| RU2727360C1 (en) | Method of producing chitosan nanoparticles | |
| CN108926567A (en) | Nano medication and preparation based on fibroin albumen for breast cancer targeting combined chemotherapy | |
| CN111407740A (en) | Albumin nanoparticles capable of activating and releasing drugs by ultrasound, and preparation method and application thereof | |
| Wang et al. | Tunable Zeolitic Imidazolate Framework‐8 Nanoparticles for Biomedical Applications | |
| JP6998008B2 (en) | Dispersible calcium phosphate nanoparticles, method for producing dispersible calcium phosphate nanoparticles, pharmaceuticals and dispersible calcium phosphate nanoparticles preparation kit pharmaceuticals | |
| Han et al. | Synthesis and evaluation of hydroxycamptothecin-encapsulated chitosan nanospheres for the treatment of liver cancer | |
| CN108478542B (en) | Preparation method and application of hyaluronic acid coated tripterine nano-drug | |
| CN110859820A (en) | Biocompatible alkaline earth metal peroxide nano preparation, preparation method and application thereof | |
| CN103524639A (en) | Synthesis method and application of chitosan oligosaccharide/indometacin graft | |
| Shrestha et al. | Versatile use of nanosponge in the pharmaceutical arena: a mini-review | |
| CN105709232B (en) | Core-shell type slow-release nanosphere and preparation method thereof | |
| CN108653239A (en) | A kind of Epigallo-catechin gallate (EGCG) nano controlled-release preparation and preparation method thereof | |
| WO2018222840A1 (en) | Poly(amine-co-disulfide ester) nanoparticles and methods of use | |
| RU2713138C1 (en) | Method of producing chitosan aspartate nanoparticles | |
| CN110123765B (en) | Preparation method and application of moleplant seed sterol magnetic targeting microsphere preparation | |
| Ganesh et al. | Controlled release formulation and evaluation of idarubicin microsphere using biodegradable hydrophilic and hydrophobic polymer mixtures | |
| CN107115297B (en) | Double-drug-loaded hybrid prodrug nano composition and preparation method and application thereof | |
| CN102010527B (en) | Chitosan nano particle and preparation method thereof |