RU2723164C1 - Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage - Google Patents

Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage Download PDF

Info

Publication number
RU2723164C1
RU2723164C1 RU2019131652A RU2019131652A RU2723164C1 RU 2723164 C1 RU2723164 C1 RU 2723164C1 RU 2019131652 A RU2019131652 A RU 2019131652A RU 2019131652 A RU2019131652 A RU 2019131652A RU 2723164 C1 RU2723164 C1 RU 2723164C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
dose
leukocytapheresis
product
progenitor cells
Prior art date
Application number
RU2019131652A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Юлия Сергеевна Змеева
Наталья Васильевна Исаева
Наталья Викторовна Минаева
Филипп Сергеевич Шерстнев
Андрей Александрович Костяев
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"
Priority to RU2019131652A priority Critical patent/RU2723164C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2723164C1 publication Critical patent/RU2723164C1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely immunology, and can be used for calculating transplantation dose of CD34-positive progenitor cells in a donor leukocytapheresis product. Calculation method involves labeling cell material with fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies to CD34 and CD45 markers with simultaneous staining with fluorescent DNA-tropic dye 7-aminoactinomycin D. Further, CD34-positive haematopoiesis progenitors contents are determined by haemocytometry and laser flow cytofluorometry. When calculating a transplantation dose, factors of membrane integrity change of haemopoietic stem cells – 0.985, 0.971, 0.958, 0.947 and 0.930, respectively, for 1, 2, 3, 4 and 5days storage of cell material before transplantation to recipient at temperature plus 2 – plus 6 °C. Calculation is carried out by formulas 1 and 2:,,where CD34rel. – relative content of CD34progenitor cells of haematopoiesis in a leukocytapheresis product; CD34 abs. is number of progenitor cells, which is defined as the number of events with high CD34 antigen expression, low CD45 antigen expression and low granularity, calculated in the polygonal region "HSC 1"; kis the CD34cell membrane integrity change coefficient on the n-th storage day; CD45 abs. – number of leukocytes in the sample, which is determined as the number of CD45 antigen-positive events counted in the rectangular region "CD45"; Dose of CD34– transplant dose of CD34haematopoiesis progenitor cells in leukocytapheresis product; C (leuk.) – concentration of leukocytes in sample, cells/mcl; V – volume of leukocytapheresis product, mcl; m is body weight of recipient of CD34-positive hematopoiesis progenitor cells, kg.EFFECT: use of the given method allows calculating dose of CD34cells considering change of integrity of their membranes during storage in conditions of cooling before transplantation.1 cl, 7 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной иммунологии, и может быть использовано для расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза в донорском лейкоцитаферезном продукте (ЛП), предназначенном для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) взрослым и детям. При расчете дозы CD34+ клеток учитывается изменение целостности их мембран при хранении в условиях охлаждения до трансплантации.The invention relates to medicine, namely to cell immunology, and can be used to calculate the transplantation dose of hematopoietic progenitor cells in a donor leukocytapheresis product (LP) intended for transplantation of hematopoietic stem cells (HSC) for adults and children. When calculating the dose of CD34 + cells, the integrity of their membranes is taken into account during storage under cooling prior to transplantation.

Одним из эффективных методов лечения онкогематологических заболеваний является трансплантация клеток-предшественниц гемопоэза, которые обеспечивают восстановление всех ростков кроветворения [1]. Трансплантационная доза клеток-предшественниц считается ключевым фактором успеха трансплантации, она представляет собой расчетное значение этих клеток в трансплантационном материале.One of the effective methods of treating oncohematological diseases is the transplantation of hematopoietic progenitor cells, which ensure the restoration of all hematopoietic growths [1]. The transplant dose of the progenitor cells is considered a key factor in the success of the transplant; it represents the calculated value of these cells in the transplant material.

Проблема планирования и прогнозирования сохранения необходимой дозы клеток-предшественниц до пересадки стоит достаточно остро. При подготовке донорского ЛП в ряде случаев проходит несколько суток от момента его получения до трансплантации. Интервал времени, затраченный на этап получения клеток-предшественниц методом лейкоцитафереза, весьма варьирует. Центр получения клеточного продукта и трансплантационный центр могут быть территориально разобщены между собой, что требует затрат времени на логистику. Зачастую трансплантационный материал подвергается длительной высокотехнологичной обработке с очисткой от нежелательных клеточных фракций и, наоборот, с обогащением целевыми функционально-активными клетками. В обязательном порядке должны быть учтены временные затраты на так называемый входной количественный контроль материала.The problem of planning and predicting the preservation of the required dose of progenitor cells before transplantation is quite acute. In the preparation of a donor drug, in some cases several days pass from the moment of its receipt to transplantation. The time interval spent on the stage of obtaining progenitor cells by leukocytapheresis varies greatly. The cell product receiving center and the transplantation center can be geographically disconnected from each other, which requires time for logistics. Often the transplantation material is subjected to a long-term high-tech processing with purification from unwanted cell fractions and, conversely, with enrichment with target functionally active cells. The time costs for the so-called input quantitative control of the material must be taken into account.

Известно несколько способов характеристики трансплантационного материала на предмет наличия в нем клеток-предшественниц, обладающих репопулирующими свойствами. Такую информацию в первую очередь дает определение способности клеток-предшественниц гемопоэза к образованию колоний в специально созданных лабораторных условиях [2]. Однако в результате культурального исследования получение заключения возможно не ранее чем через 10 суток, поэтому этот метод не может в полной мере соответствовать требованиям трансплантационных центров по оценке количественных характеристик клеточного материала.Several methods are known for characterizing a transplant material for the presence of progenitor cells having repopulating properties. Such information is primarily provided by determining the ability of hematopoietic progenitor cells to form colonies under specially created laboratory conditions [2]. However, as a result of a cultural study, obtaining a conclusion is possible no earlier than after 10 days, therefore this method cannot fully comply with the requirements of transplant centers for assessing the quantitative characteristics of cellular material.

Благодаря открытию иммунофенотипических характеристик клеток-предшественниц гемопоэза, а именно, высокой экспрессии на мембране маркера CD34, стала возможна их иммунологическая идентификация [3, 4]. Уточнение свойств клеток-предшественниц, широкое использование гибридомных технологий для производства моноклональных антител к клеточным маркерам, внедрение метода лазерной проточной цитофлуориметрии привело к разработке и совершенствованию методов учета CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза. Следует указать, что эти методы используют лазерную проточную цитофлуориметрию, как подход, позволяющий проанализировать тысячи клеток за несколько минут и получить достоверный результат [5].Due to the discovery of the immunophenotypic characteristics of hematopoietic progenitor cells, namely, high expression on the membrane of the CD34 marker, their immunological identification became possible [3, 4]. Clarification of the properties of progenitor cells, the widespread use of hybridoma technologies for the production of monoclonal antibodies to cell markers, and the introduction of laser flow cytofluorimetry have led to the development and improvement of methods for recording CD34-positive hematopoietic progenitor cells. It should be noted that these methods use laser flow cytofluorimetry as an approach that allows you to analyze thousands of cells in a few minutes and get a reliable result [5].

Известен способ количественного определения CD34+ клеток в кроветворной ткани с использованием тройного мечения клеток за счет связывания с моноклональными антитела к маркерам CD34 и CD45 и окрашивания флуоресцентным ДНК-тропным красителем 7-аминоактиномицином D (7-AAD) [6, 7]. Способ позволяет рассчитать процентное количество клеток-предшественниц как долю от всех клеток, помеченных по CD45 и негативных по 7-AAD. Поскольку 7-AAD проникает только через разрушенные мембраны, то способ позволяет исключить из анализа все нежизнеспособные лейкоциты. С помощью этого метода также возможно рассчитать абсолютное количество CD34-позитивных клеток-предшественниц и число CD45-позитивных клеток, относящихся к лейкоцитарному ростку. Способ предполагает использование только проточного цитофлуориметра (одноплатформенный метод), что достигается использованием искусственных флуоресцирующих частиц с известной концентрацией. Очевидным недостатком способа является возможная неточность расчета трансплантационной дозы, связанная с иммунофенотипической негативностью некоторых клеток-предшественниц гемопоэза по маркеру CD45. Внедрение этого метода невозможно без наличия высококвалифицированного персонала, прошедшего валидационное тестирование. Кроме того, расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза на основании оценки образца лейкоцитаферезного продукта сразу после его получения не учитывает возможное снижение жизнеспособности клеток при хранении. При использовании данного способа невозможно прогнозирование эффективной дозы жизнеспособных клеток-предшественниц гемопоэза [4, 8].A known method for the quantitative determination of CD34 + cells in hematopoietic tissue using triple labeling of cells by binding to monoclonal antibodies to markers CD34 and CD45 and staining with 7-aminoactinomycin D (7-AAD) fluorescent DNA tropic dye [6, 7]. The method allows to calculate the percentage of progenitor cells as a fraction of all cells labeled by CD45 and negative by 7-AAD. Since 7-AAD penetrates only through destroyed membranes, the method allows to exclude from analysis all non-viable white blood cells. Using this method, it is also possible to calculate the absolute number of CD34-positive progenitor cells and the number of CD45-positive cells related to the white blood cell. The method involves the use of a flow cytometer only (single-platform method), which is achieved by using artificial fluorescent particles with a known concentration. An obvious disadvantage of the method is the possible inaccuracy in the calculation of the transplant dose associated with immunophenotypic negativity of some hematopoietic progenitor cells by the CD45 marker. The introduction of this method is impossible without the presence of highly qualified personnel who have passed validation testing. In addition, the calculation of the transplant dose of hematopoietic progenitor cells based on the evaluation of a sample of the leukocytapheresis product immediately after its preparation does not take into account a possible decrease in cell viability during storage. Using this method, it is impossible to predict an effective dose of viable hematopoietic progenitor cells [4, 8].

Известен способ количественного определения CD34+ клеток в кроветворной ткани с использованием двухплатформенного подхода, предполагающего применение проточного цитофлуориметра, в сочетании с гематологическим анализатором или микроскопом. Способ основан на одновременной окраске кроветворной ткани моноклональными антителами к маркеру CD34 и флуоресцирующим низкомолекулярным ДНК-тропным красителем Sytol6, который определяется на всех ядросодержащих клетках крови, окрашивая живые клетки с наибольшей интенсивностью, а некротические и позднеапоптотические - с наименьшей [9]. Способ позволяет с высокой точностью рассчитать процентное количество клеток-предшественниц как долю от всех Syto16-позитивных клеток [4]. Однако разграничение жизнеспособных клеток по степени флуоресценции Syto16 является весьма субъективным. Применение данного способа не дает убедительной информации о числе разрушенных клеток даже в день получения клеточного материала.A known method for the quantitative determination of CD34 + cells in the hematopoietic tissue using a two-platform approach, involving the use of a flow cytofluorimeter, in combination with a hematological analyzer or microscope. The method is based on the simultaneous staining of the hematopoietic tissue with monoclonal antibodies to the CD34 marker and the fluorescent low molecular weight DNA tropic dye Sytol6, which is determined on all nucleated blood cells, staining living cells with the highest intensity, and necrotic and late apoptotic ones with the lowest [9]. The method allows to calculate with high accuracy the percentage of progenitor cells as a fraction of all Syto16-positive cells [4]. However, the distinction between viable cells according to the degree of fluorescence of Syto16 is very subjective. The use of this method does not provide convincing information about the number of destroyed cells even on the day of receipt of the cellular material.

Все вышеперечисленные способы направлены на идентификацию и количественное определение клеток-предшественниц в продукте лейкоцитафереза сразу после его получения. Указанные подходы не позволяют прогнозировать трансплантационную дозу клеток-предшественниц с учетом изменения жизнеспособности клеток при хранении более 24 часов в условиях охлаждения. Прототип заявляемого способа отсутствует.All of the above methods are aimed at the identification and quantification of progenitor cells in the product of leukocytapheresis immediately after its receipt. These approaches do not allow to predict the transplantation dose of progenitor cells, taking into account changes in cell viability during storage for more than 24 hours under cooling conditions. The prototype of the proposed method is missing.

Задача заявляемого изобретения состоит в создании нового, более точного способа расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц, учитывающего изменение целостности мембран CD34-позитивных клеток ЛП, при хранении клеточного материала от 1 до 5 суток с момента получения до трансплантации в условиях охлаждения (плюс 2 ÷ плюс 6°C).The objective of the invention is to create a new, more accurate method for calculating the transplantation dose of progenitor cells, taking into account the change in the integrity of the membranes of CD34-positive PL cells, during storage of cellular material from 1 to 5 days from receipt to transplantation under cooling conditions (plus 2 ÷ plus 6 ° C).

Поставленная задача решается тем, что для расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц используют моноклональные антитела к антигенам CD34, CD45 и флуоресцентный ДНК-тропный краситель 7-AAD, который применяют для оценки целостности клеточных мембран в качестве самостоятельного предиктора нежизнеспособности клеток. Подсчет CD34+ клеток осуществляют в пределах CD45+7-AAD- клеток двухплатформенным методом с использованием проточного цитофлуориметра и гематологического анализатора. Количество CD34+ клеток в зависимости от времени хранения корректируется с помощью коэффициента kn. Данный коэффициент вывели экспериментально на основании изменения целостности мембран CD34+ клеток, которую определяли по проникновению витального флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD через поврежденные мембраны клеток. Для этого 50 продуктов лейкоцитафереза периферической крови доноров хранили в условиях, позволяющих сдерживать бактериальную контаминацию - при охлаждении до плюс 2 ÷ плюс 6°C в течение 5 дней. Окрашивание кроветворной ткани проводили с использованием тройного мечения клеток за счет связывания с моноклональными антитела к маркерам CD34 и CD45 и красителем 7-AAD. Снижение жизнеспособности клеток фиксировали методом проточной цитофлуориметрии через каждые 24 часа в течение 5 дней. На протяжении всего эксперимента не изменяли клоны антител к CD45 и CD34 и поддерживали идентичные условия для проведения иммунологических реакций и окрашивания клеток.The problem is solved in that, to calculate the transplantation dose of the progenitor cells, monoclonal antibodies to the CD34, CD45 antigens and 7-AAD fluorescent DNA-tropic dye are used, which is used to assess the integrity of cell membranes as an independent predictor of cell viability. Counting of CD34 + cells is carried out within CD45 + 7-AAD - cells by the two-platform method using a flow cytometer and a hematological analyzer. The number of CD34 + cells depending on the storage time is adjusted using the coefficient k n . This coefficient was derived experimentally on the basis of changes in the integrity of the membranes of CD34 + cells, which was determined by the penetration of the vital fluorescent DNA-tropic dye 7-AAD through damaged cell membranes. To do this, 50 donor peripheral blood leukocytapheresis products were stored under conditions that prevented bacterial contamination - when cooled to plus 2 ÷ plus 6 ° C for 5 days. Hematopoietic tissue was stained using triple labeling of cells by binding to monoclonal antibodies to the markers CD34 and CD45 and dye 7-AAD. The decrease in cell viability was recorded by flow cytofluorimetry every 24 hours for 5 days. Throughout the experiment, clones of antibodies to CD45 and CD34 were not changed and identical conditions were maintained for immunological reactions and staining of cells.

Зависимость изменения целостности мембран CD34+ клеток от времени хранения и коэффициенты изменения целостности мембран этих клеток представлены в таблице 1. Коэффициенты изменения целостности мембран CD34+ клеток, необходимые для определения процента жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток на n-й день хранения, вычисляли по формуле:The dependence of changes in the integrity of the CD34 + cell membranes on the storage time and the coefficients of changes in the integrity of the membranes of these cells are presented in table 1. The coefficients of changes in the integrity of the membranes of CD34 + cells, necessary to determine the percentage of viable hematopoietic stem cells on the n-th day of storage, were calculated by the formula:

Figure 00000001
Figure 00000001

где kn - коэффициент изменения целостности мембран клеток;where k n is the coefficient of change in the integrity of cell membranes;

an - увеличение проницаемости мембран клеток для красителя 7-AAD, %.a n - increase in cell membrane permeability for dye 7-AAD,%.

Значимое снижение жизнеспособности CD34+ клеток наблюдалось через 1 сутки хранения в среднем на 1,53% (р < 0,05). Выявили, что при продолжении хранения проницаемость мембран клеток ЛП для флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD увеличивалась.A significant decrease in the viability of CD34 + cells was observed after 1 day of storage by an average of 1.53% (p <0.05). It was found that, with continued storage, the permeability of LP cell membranes for the 7-AAD fluorescent DNA-tropic dye increased.

Изобретение иллюстрировано фигурами 1-7.The invention is illustrated by figures 1-7.

Способ осуществляется следующим образом:The method is as follows:

Этап 1. Иммунологическое мечение клеток с одновременной окраской флуоресцентным ДНК-тропным красителем. Для этого определяют концентрацию лейкоцитов образца, используя гематологический анализатор, и готовят клеточную суспензию с концентрацией клеток 5×103 кл / мкл методом разведения. В цитометрическую пробирку вносят 50 мкл клеточного образца, затем добавляют по 5 мкл моноклональных антител к маркерам CD45 и CD34, которые были конъюгированы с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) соответственно, и 5 мкл флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD. Пробирку встряхивают на медицинском вихревом смесителе и осуществляют инкубацию при температуре плюс 20 ÷ плюс 25°C в темноте для предотвращения разрушения FITC и РЕ под воздействием света. В пробирку добавляют 1 мл лизирующего раствора на основе хлорида аммония, не содержащего фиксирующих компонентов, встряхивают, проводят лизирование в течение 5 минут в темноте при температуре плюс 20 ÷ плюс 25°C.Stage 1. Immunological labeling of cells with simultaneous staining with fluorescent DNA-tropic dye. To do this, determine the concentration of leukocytes of the sample using a hematological analyzer, and prepare a cell suspension with a cell concentration of 5 × 10 3 cells / μl by dilution. 50 μl of the cell sample was added to the cytometric tube, then 5 μl of monoclonal antibodies to the CD45 and CD34 markers, which were conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) and phycoerythrin (PE), respectively, and 5 μl of 7-AAD fluorescence dye were added. The tube is shaken on a medical vortex mixer and incubated at a temperature of plus 20 ÷ plus 25 ° C in the dark to prevent the destruction of FITC and PE under the influence of light. 1 ml of a lysing solution based on ammonium chloride that does not contain fixing components is added to the test tube, shaken, lysed for 5 minutes in the dark at a temperature of + 20 ÷ + 25 ° C.

Этап 2. Оценка результатов иммунологической реакции и ДНК-окрашивания на лазерном проточном цитофлуориметре. Анализ реакции осуществляют непосредственно после ее окончания не позднее 1 часа с момента постановки. Пробирки помещают в пробозаборник лазерного проточного цитофлуориметра. Каждая частица образца, пересекающая луч лазера, анализируется прибором, как отдельное событие. Учитывают прямое светорассеяние (FSC), боковое светорассеяние (SSC) и флуоресценцию с длинами волн для FITC, РЕ и 7-AAD. Используют протокол по гейтированию и логическим ограничениям, рекомендованный Международным обществом по гематотерапии и тканевой инженерии (ISHAGE - International Society for Hematotherapy and Graft Engineering) [4] (фиг. 1-7). Определяют абсолютное число CD45+ и CD34+ клеток, процент CD34-позитивных клеток-предшественниц.Stage 2. Evaluation of the results of the immunological reaction and DNA staining on a laser flow cytometer. The reaction analysis is carried out immediately after its completion no later than 1 hour from the moment of formulation. The tubes are placed in the sample chamber of a laser flow cytometer. Each particle of the sample crossing the laser beam is analyzed by the device as a separate event. Direct light scattering (FSC), side light scattering (SSC) and fluorescence with wavelengths for FITC, PE and 7-AAD are taken into account. Use the protocol for gating and logical restrictions recommended by the International Society for Hematotherapy and Tissue Engineering (ISHAGE - International Society for Hematotherapy and Graft Engineering) [4] (Fig. 1-7). The absolute number of CD45 + and CD34 + cells and the percentage of CD34-positive progenitor cells are determined.

На фигуре 1 представлен прямоугольный регион «CD45+», который ограничивает CD45-позитивные клетки среди всех событий, пересекающих луч лазера, исключая ядросодержащие эритроидные элементы, нелизированные эритроциты, разрушенные клетки. Среди CD45-позитивных клеток выделен полигональный регион лимфоцитов - «Lympho», который включает клетки с высокой экспрессией антигена CD45 и низкими значениями гранулярности.The figure 1 shows the rectangular region "CD45 + ", which limits the CD45-positive cells among all events crossing the laser beam, excluding nucleated erythroid cells, non-erythrocytes, destroyed cells. Among the CD45-positive cells, the polygonal region of lymphocytes - “Lympho”, which includes cells with high expression of the CD45 antigen and low granularity values, was distinguished.

На фигуре 2 представлен полигональный регион «CD34+», характеризующийся высокой экспрессией маркера CD34. Этот график ограничивается событиями, попадающими в регион CD45-позитивных 7-AAD-негативных клеток.The figure 2 presents the polygonal region "CD34 + ", characterized by high expression of the marker CD34. This schedule is limited to events falling into the region of CD45-positive 7-AAD-negative cells.

На фигуре 3 представлен полигональный регион «CD45dim», исключающий события с высокой и средней экспрессией маркера CD45, ограниченный событиями, экспрессирующими антиген CD34 на высоком уровне.The figure 3 presents the polygonal region "CD45dim", excluding events with high and medium expression of the marker CD45, limited to events expressing the CD34 antigen at a high level.

На фигуре 4 представлен полигональный регион «HSC 1», состоящий из клеток с высокой экспрессией CD34, низкой экспрессией CD45 и по иммунофенотипу соответствующий клеткам-предшественницам гемопоэза. Этот график ограничивается событиями, попадающими в регион «CD45dim».The figure 4 presents the polygonal region "HSC 1", consisting of cells with high expression of CD34, low expression of CD45 and the immunophenotype corresponding to the progenitor cells of hematopoiesis. This schedule is limited to events falling into the CD45dim region.

На фигуре 5 представлен полигональный регион «HSC 2», который включает только события из региона «Lympho». В процессе измерения образца проводят визуальный контроль и корректировку регионов «Lympho» и «HSC 2», не допуская попадания в регионы клеток со средней гранулярностью. При помощи средств программного обеспечения прибора производят копирование формы региона «HSC 2» на график фигуры 4 в виде региона «HSC 1», что контролирует попадание в данный регион только низкогранулярных недифференцированных клеток.The figure 5 presents the polygonal region "HSC 2", which includes only events from the region "Lympho". In the process of measuring the sample, visual control and adjustment of the Lympho and HSC 2 regions is carried out, preventing cells with medium granularity from entering the regions. Using the instrument software, the shape of the “HSC 2” region is copied onto the graph of figure 4 in the form of the “HSC 1” region, which controls the entry into the region of only low-granular undifferentiated cells.

На фигуре 6 представлен полигональный регион «Debris», который отражает события, относящиеся к разрушенным клеткам и клеточным обломкам.The figure 6 presents the polygonal region "Debris", which reflects the events related to the destroyed cells and cell debris.

На фигуре 7 представлен прямоугольный регион «7-AAD+», в который попадают все нежизнеспособные клетки образца, информацию о данных событиях учитывают при формировании количества CD34-позитивных предшественников гемопоэза.The figure 7 presents the rectangular region "7-AAD + ", which includes all non-viable cells of the sample, information about these events is taken into account when forming the number of CD34-positive hematopoietic precursors.

Анализируют по 100 тысяч событий в каждой пробе, что обеспечивает высокую достоверность получаемых результатов. Настройки прибора сохраняют на протяжении всего эксперимента.Analyze 100 thousand events in each sample, which ensures high reliability of the results. Instrument settings are maintained throughout the experiment.

Этап 3. Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза. Для этого подсчитывают относительное содержание CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза (CD34+ относ.) по формуле 2, которые выделены при последовательном гейтировании из региона CD45-позитивных клеток.Stage 3. Calculation of the transplant dose of hematopoietic progenitor cells. For this, the relative content of CD34-positive hematopoietic progenitor cells (CD34 + rel.) Is calculated according to formula 2, which are isolated by sequential gating from the region of CD45-positive cells.

Figure 00000002
Figure 00000002

где CD34 абс. - количество клеток-предшественниц, которое определяется, как число событий с высокой экспрессией антигена CD34, низкой экспрессией антигена CD45 и низкой гранулярностью, подсчитанное в полигональном регионе «HSC 1»;where CD34 abs. - the number of progenitor cells, which is defined as the number of events with high expression of CD34 antigen, low expression of CD45 antigen and low granularity, calculated in the polygonal region "HSC 1";

kn - коэффициент изменения целостности мембран CD34+ клеток на n-ый день хранения (Таблица 1);k n - coefficient of change in the integrity of the membranes of CD34 + cells on the n-th day of storage (table 1);

CD45 абс. - количество лейкоцитов в образце, которое определяется, как число событий позитивных по антигену CD45, подсчитанное в прямоугольном регионе «CD45+».CD45 abs. - the number of leukocytes in the sample, which is determined as the number of positive events for the CD45 antigen, calculated in the rectangular region "CD45 + ".

Вычисляют трансплантационную дозу CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза {Доза CD34+) по формуле 3.The transplant dose of the CD34-positive hematopoietic progenitor cells (CD34 + dose) is calculated by formula 3.

Figure 00000003
Figure 00000003

где CD34+ относ. - относительное содержание CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, %;where CD34 + rel. the relative content of CD34-positive hematopoietic progenitor cells,%;

С (лейк.) - концентрация лейкоцитов в образце, кл / мкл;C (leuk.) - the concentration of leukocytes in the sample, cells / µl;

V - объем ЛП, мкл;V is the volume of the drug, µl;

m - масса тела больного - реципиента CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, кг.m - body weight of the patient - recipient of CD34-positive hematopoietic progenitor cells, kg

Представленные ниже клинические примеры подтверждают возможность использования заявляемого способа при количественном определении гемопоэтических стволовых клеток в ЛП и расчете трансплантационной дозы клеток-предшественниц.The following clinical examples confirm the possibility of using the proposed method for the quantitative determination of hematopoietic stem cells in LP and the calculation of the transplant dose of progenitor cells.

Пример 1Example 1

ЛП, полученный от донора М. за одну процедуру афереза, имеет следующие характеристики: CD34 абс. = 337 событий, CD45 абс. = 68133 событий, С (лейк.) = 201000 кл / мкл, V=200000 мкл, m=35 кг, время хранения 4 суток при температуре плюс 2 ÷ плюс 6°C, k4=0,947.The drug received from donor M. for one apheresis procedure has the following characteristics: CD34 abs. = 337 events, CD45 abs. = 68133 events, C (lake.) = 201000 cells / μl, V = 200000 μl, m = 35 kg, storage time 4 days at a temperature of plus 2 ÷ plus 6 ° C, k 4 = 0.947.

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце без учета поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:Calculation of the transplantation dose of progenitor cells in the sample without taking into account correction factors according to formulas 2, 3:

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце по заявляемому способу с учетом поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:The calculation of the transplantation dose of the precursor cells in the sample according to the claimed method, taking into account correction factors according to formulas 2, 3:

Figure 00000006
Figure 00000006

Figure 00000007
Figure 00000007

Пример 2Example 2

ЛП, полученный от донора П. за одну процедуру афереза, имеет следующие характеристики: CD34 абс. = 580 события, CD45 абс. = 99069 событий, С {лейк.)=194000 клеток/мкл, V=390000 мкл, m=90 кг, время хранения 3 суток при температуре плюс 2 плюс 6°C, k3=0,958.The LP received from donor P. for one apheresis procedure has the following characteristics: CD34 abs. = 580 events, CD45 abs. = 99069 events, C {lake.) = 194000 cells / μl, V = 390000 μl, m = 90 kg, storage time 3 days at a temperature of plus 2 plus 6 ° C, k 3 = 0.958.

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце без учета поправочных коэффициентов (коэффициент сокращается, так как равен единице) по формулам 2, 3:Calculation of the transplantation dose of progenitor cells in the sample without taking into account correction factors (the coefficient is reduced, since it is equal to unity) according to formulas 2, 3:

Figure 00000008
Figure 00000008

Figure 00000009
Figure 00000009

Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце по заявляемому способу с учетом поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:The calculation of the transplantation dose of the precursor cells in the sample according to the claimed method, taking into account correction factors according to formulas 2, 3:

Figure 00000010
Figure 00000010

Figure 00000011
Figure 00000011

При расчете по заявляемому способу содержание CD34+ клеток в образце характеризуется более точно с учетом изменения целостности мембран целевых клеток. Приведенные примеры подтверждают актуальность использования заявляемого способа для расчета трансплантационный дозы клеток-предшественниц в ЛП при хранении клеточного материала более 24 часов.When calculating by the claimed method, the content of CD34 + cells in the sample is characterized more accurately taking into account changes in the integrity of the membranes of the target cells. The above examples confirm the relevance of using the proposed method for calculating the transplantation dose of progenitor cells in the drug during storage of cellular material for more than 24 hours.

Неочевидность предложенного решения вытекает из недостаточности современных представлений об изменении целостности клеточных мембран разных популяций ядросодержащих клеток крови при длительном хранении в условиях охлаждения.The non-obviousness of the proposed solution stems from the lack of modern ideas about the change in the integrity of cell membranes of different populations of nucleated blood cells during prolonged storage under cooling conditions.

Список литературыBibliography

1. Трансфузиология: Клиническое руководство / под ред. М.Ф. Заривчацкого. - Пермь: ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России, 2014. - 900 с.1. Transfusiology: Clinical Guide / Ed. M.F. Zarivchatsky. - Perm: GBOU VPO PGMA them. ac. E.A. Wagner Ministry of Health of Russia, 2014 .-- 900 p.

2. Цырлова А.И. Функциональная гетерогенность стволовых кроветворных клеток: выявление методами колониеобразования in vitro. Автореф. дисс. … канд. биол. наук. Новосибирск, 2000. - 19 с.2. Tsyrlova A.I. Functional heterogeneity of hematopoietic stem cells: in vitro colony detection. Abstract. diss. ... cand. biol. sciences. Novosibirsk, 2000 .-- 19 p.

3. Civin С.I., Strauss L.S. J. Immunol. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1 a cell. 1984, 133:157-164.3. Civin C. I., Strauss L. S. J. Immunol. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1 a cell. 1984, 133: 157-164.

4. Пат. 2513511 РФ, G01N 33/533, C12N 5/0789. Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани / Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. (Россия). - №2012154857/15; Заявлено 19.12.2012; Опубл. 20.04.2014; Бюл. №11.4. Pat. 2513511 RF, G01N 33/533, C12N 5/0789. A method for the quantitative determination of progenitor cells (cd34 +) in the hematopoietic tissue / Grivtsova L.Yu., Tupitsyn NN (Russia). - No. 2012154857/15; Announced on 12/19/2012; Publ. 04/20/2014; Bull. No. 11.

5. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, et. al. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematotherapy. 1996, 5:213-226.5. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, et. al. The ISHAGE guidelines for CD34 + cell determination by flow cytometry. J Hematotherapy. 1996, 5: 213-226.

6. Dauber K., et al. Enumeration of viable CD34+ cells by flow cytometry in blood, bone marrow and cord blood: results of a study of the novel BD™ stem cell enumeration kit. Cytotherapy. 2011, 13:449-458.6. Dauber K., et al. Enumeration of viable CD34 + cells by flow cytometry in blood, bone marrow and cord blood: results of a study of the novel BD ™ stem cell enumeration kit. Cytotherapy. 2011, 13: 449-458.

7. Keeney M, Chin-Yee I, Weir J, et. al. Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry. 1998, 34:61-70.7. Keeney M, Chin-Yee I, Weir J, et. al. Single platform flow cytometric absolute CD34 + cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry 1998, 34: 61-70.

8. Gratama J.W., Kraan J., Keeney M, and al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34+ hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy. 2003, 5 (1) 55-65;8. Gratama J.W., Kraan J., Keeney M, and al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34 + hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy. 2003, 5 (1) 55-65;

9. Методическое пособие к лабораторным занятиям по специальному курсу «Патология клетки» для студентов биологического факультета / авт.-сост.: С.В. Глушен, Т.В. Романовская, В.В. Гринев. - Минск, 2009. - 43 с.9. The methodological manual for laboratory studies in the special course "Cell Pathology" for students of the Faculty of Biology / ed.-Comp .: S.V. Glush, T.V. Romanovskaya, V.V. Grinev. - Minsk, 2009 .-- 43 p.

Figure 00000012
Figure 00000012

Claims (11)

Способ расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза в донорском лекоцитаферезном продукте, включающий мечение клеточного материала флуорохром-конъюгированными моноклональными антителами к маркерам CD34 и CD45 с одновременным окрашиванием флуоресцентным ДНК-тропным красителем 7-аминоактиномицином D и определение содержания CD34-позитивных предшественниц гемопоэза методами гемоцитометрии и лазерной проточной цитофлуориметрии, отличающийся тем, что при расчете трансплантационной дозы учитывают коэффициенты изменения целостности мембран гемопоэтических стволовых клеток - 0,985, 0,971, 0,958, 0,947 и 0,930, соответственно, для 1, 2, 3, 4 и 5-ых суток хранения клеточного материала до трансплантации реципиенту при температуре плюс 2 ÷ плюс 6°C, осуществляется по формулам 1 и 2:A method for calculating the transplantation dose of hematopoietic precursor cells in a donor leukocytapheresis product, comprising labeling the cell material with fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies to CD34 and CD45 markers with simultaneous staining with 7-aminoactinomycin D fluorescence dye tropic dye and determining the content of hematopoietic hematopoietic positive and hematocytosis CD34-positive laser flow cytofluorimetry, characterized in that when calculating the transplant dose, the coefficients of the integrity of the membranes of hematopoietic stem cells are taken into account - 0.985, 0.971, 0.958, 0.947 and 0.930, respectively, for 1, 2, 3, 4 and 5 days of storage of cellular material up to transplantation to the recipient at a temperature of plus 2 ÷ plus 6 ° C, is carried out according to formulas 1 and 2:
Figure 00000013
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000014
 где CD34+ относ. - относительное содержание CD34+ клеток-предшественниц гемопоэза в лекоцитаферезном продукте;where CD34 + rel. - the relative content of CD34 + hematopoietic progenitor cells in the lecocytapheresis product; CD34 абс. - количество клеток-предшественниц, которое определяется как число событий с высокой экспрессией антигена CD34, низкой экспрессией антигена CD45 и низкой гранулярностью, подсчитанное в полигональном регионе «HSC 1»;CD34 abs. - the number of progenitor cells, which is defined as the number of events with high expression of CD34 antigen, low expression of CD45 antigen and low granularity, calculated in the polygonal region "HSC 1"; kn - коэффициент изменения целостности мембран CD34+ клеток на n-ый день хранения;k n is the coefficient of change in the integrity of the membranes of CD34 + cells on the n-th day of storage; CD45 абс. - количество лейкоцитов в образце, которое определяется как число событий позитивных по антигену CD45, подсчитанное в прямоугольном регионе «CD45+»;CD45 abs. - the number of leukocytes in the sample, which is defined as the number of positive events for the CD45 antigen, calculated in the rectangular region "CD45 + "; Доза CD34+ - трансплантационная доза CD34+ клеток-предшественниц гемопоэза в лекоцитаферезном продукте;Dose CD34 + - transplantation dose of CD34 + hematopoietic progenitor cells in a leukocytapheresis product; С (лейк.) - концентрация лейкоцитов в образце, кл / мкл;C (leuk.) - the concentration of leukocytes in the sample, cells / µl; V - объем лекоцитаферезного продукта, мкл;V is the volume of leukocytapheresis product, µl; m - масса тела реципиента CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, кг.m is the body weight of the recipient of CD34-positive hematopoietic progenitor cells, kg
RU2019131652A 2019-10-07 2019-10-07 Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage RU2723164C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019131652A RU2723164C1 (en) 2019-10-07 2019-10-07 Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019131652A RU2723164C1 (en) 2019-10-07 2019-10-07 Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2723164C1 true RU2723164C1 (en) 2020-06-09

Family

ID=71067805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019131652A RU2723164C1 (en) 2019-10-07 2019-10-07 Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2723164C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2513511C1 (en) * 2012-12-19 2014-04-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) Method for precursor cell (cd34+) measurement in blood-forming tissue
RU2657758C2 (en) * 2011-12-22 2018-06-15 Иеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Combination therapy for stable and long-term transplant engraftment

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2657758C2 (en) * 2011-12-22 2018-06-15 Иеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Combination therapy for stable and long-term transplant engraftment
RU2513511C1 (en) * 2012-12-19 2014-04-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) Method for precursor cell (cd34+) measurement in blood-forming tissue

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ИСАЕВА Н.В. и др. Особенности получения и хранения гемопоэтических стволовых клеток для аутотрансплантации при онкогематологических заболеваниях // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины, 2015, стр.278-280. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pasut et al. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry
Jones et al. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis
Case et al. Human CD34+ AC133+ VEGFR-2+ cells are not endothelial progenitor cells but distinct, primitive hematopoietic progenitors
Goodell Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP)
Gao et al. Functional effects of TGF-β1 on mesenchymal stem cell mobilization in cockroach allergen–induced asthma
Markey et al. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells
Halim et al. Isolation and characterization of mouse innate lymphoid cells
Sargenti et al. Physical characterization of colorectal cancer spheroids and evaluation of NK cell infiltration through a flow-based analysis
Kobayashi et al. Canine hair‐follicle keratinocytes enriched with bulge cells have the highly proliferative characteristic of stem cells
Thieme et al. The TreaT-assay: a novel urine-derived donor kidney cell-based assay for prediction of kidney transplantation outcome
Schubbert et al. Methods for PTEN in stem cells and cancer stem cells
RU2723164C1 (en) Method for calculating the dose of haematopoiesis precursor cells in a leukocytapheresis product by taking into account the change in the integrity of cell membranes during storage
Medvinsky et al. Analysis and manipulation of hematopoietic progenitor and stem cells from murine embryonic tissues
Blancas et al. Identifying behavioral phenotypes and heterogeneity in heart valve surface endothelium
Barreto-Durán et al. Impact of donor characteristics on the quality of bone marrow as a source of mesenchymal stromal cells
Li et al. G‐CSF Indirectly Induces Apoptosis of Osteoblasts During Hematopoietic Stem Cell Mobilization
Szardien et al. Bone marrow-derived cells contribute to cell turnover in aging murine hearts
AU2006329837B2 (en) Microaggregates including endothelial cells
Rimac et al. Role of flow cytometry in evaluation of the cellular therapy products used in haematopoietic stem cell transplantation
Preti et al. Multi-site evaluation of the BD Stem Cell Enumeration Kit for CD34+ cell enumeration on the BD FACSCanto II and BD FACSCalibur flow cytometers
Shams et al. The satellite cell colony forming cell assay as a tool to measure self-renewal and differentiation potential
Fricke Measurement and illustration of immune interaction after stem cell transplantation
Tierney et al. Engraftment of FACS isolated muscle stem cells into injured skeletal muscle
Del Rio et al. Impaired repair properties of endothelial colony‐forming cells in patients with granulomatosis with polyangiitis
Greier et al. Optimizing culturing conditions in patient derived 3D primary slice cultures of head and neck cancer