RU2722745C1 - Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs - Google Patents

Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs Download PDF

Info

Publication number
RU2722745C1
RU2722745C1 RU2018147070A RU2018147070A RU2722745C1 RU 2722745 C1 RU2722745 C1 RU 2722745C1 RU 2018147070 A RU2018147070 A RU 2018147070A RU 2018147070 A RU2018147070 A RU 2018147070A RU 2722745 C1 RU2722745 C1 RU 2722745C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nanoparticles
mesoporous silicon
nanocontainers
salinomycin
silicon
Prior art date
Application number
RU2018147070A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Виктор Юрьевич Тимошенко
Михаил Анатольевич Коноплянников
Ирина Михайловна Ле-Дейген
Иван Константинович Фесенко
Татьяна Юрьевна Базыленко
Юлия Валерьевна Каргина
Анастасия Викторовна Кондакова
Анатолий Георгиевич Коноплянников
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority to RU2018147070A priority Critical patent/RU2722745C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2722745C1 publication Critical patent/RU2722745C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Abstract

FIELD: chemistry; medicine.SUBSTANCE: invention relates to a method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs, comprising obtaining nanoparticles of mesoporous silicon by electrochemical etching of crystalline silicon plates with further mechanical grinding of the obtained porous layers, wherein plates of crystalline silicon of hole-type conductivity are used with specific resistance from 1 to 50 mOhm⋅cm, electrochemical etching of plates is performed with formation of mesoporous silicon film on its surface with thickness of 10 to 100 mcm and porosity from 50 to 80 %, for which electrochemical etching of plate is carried out in a solution containing an aqueous solution of hydrofluoric acid with volume concentration of 40–50 % and ethyl alcohol in ratio from 1:1 to 1:5 by volume, during period of time from 10 to 60 minutes with current density from 20 to 60 mA/cm, after which obtained mesoporous silicon films are separated from plate, washed in distilled water, dried in air at room temperature, then poured with water in ratio from 1:2 to 1:3 by weight and subjected to mechanical grinding in a ball planetary mill using balls with diameter from 1 to 5 mm of solid materials, including zirconium oxide, stainless steel, tungsten carbide and similar grinding jars for 15 to 30 minutes at rotation speeds of 900 to 1100 rpm to obtain a concentrated aqueous suspension of mesoporous silicon nanoparticles with cross dimensions of 50 to 100 nm and pore size of 2 to 10 nm. Invention also relates to a method of producing nanocontainers with a chemotherapeutic anticancer preparation for combined cancer therapy.EFFECT: technical result is the disclosed method of producing nanoparticles of mesoporous silicon with given dimensions, morphology and chemical composition of the coating of the inner surface of pores, allowing complete loading thereof with anti-tumour preparations with sustained release in an aqueous medium.5 cl, 5 dwg, 2 tbl

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области фармакологии и медицины. Более конкретно настоящее изобретение относится к биомедицинским применениям наночастиц, конкретнее к методу приготовления и загрузки наночастиц противоопухолевыми препаратами с низкой степенью растворимости в водной среде, такими как салиномицин.The invention relates to the field of pharmacology and medicine. More specifically, the present invention relates to biomedical applications of nanoparticles, and more particularly, to a method for preparing and loading nanoparticles with antitumor drugs with a low degree of solubility in an aqueous medium, such as salinomycin.

Уровень техникиState of the art

Из современного уровня развития биологии и медицины хорошо известны технические решения, основанные на применении различных видов наночастиц.From the current level of development of biology and medicine, technical solutions based on the use of various types of nanoparticles are well known.

Использование наночастиц в терапии обосновано их способностью перемещаться внутри живых организмов даже по самым тонким капиллярам и проникать в клетки путем эндоцитоза, а также возможностью прикрепления к ним молекул различных веществ и созданием, таким образом, нанокомпозитов «наночастица/биологически активная оболочка» со способностью селективно концентрироваться в требуемом месте организма и притягиваться к тому или иному типу клеток. Такой подход потенциально позволяет существенно снизить побочные эффекты химиотерапии за счет снижения вводимых доз, и, в то же время, повысить концентрацию препарата в необходимой области организма, обеспечивая тем самым существенный терапевтический эффект и положительную исход лечения.The use of nanoparticles in therapy is justified by their ability to move inside even the thinnest capillaries and penetrate into cells by endocytosis, as well as the ability to attach molecules of various substances to them and, thus, create nanoparticles / biologically active shell nanocomposites with the ability to selectively concentrate in the desired place in the body and attracted to one or another type of cell. This approach can potentially significantly reduce the side effects of chemotherapy by reducing the administered doses, and, at the same time, increase the concentration of the drug in the required area of the body, thereby providing a significant therapeutic effect and a positive outcome of treatment.

Нановакцины и наночастицы широко используются в противораковой терапии. Исследованы средства, содержащие платину с паклитакселом и альбумином (патент на изобретение RU 2589513) для лечения плоскоклеточной карциномы немелкоклеточного рака легких, а также с таксаном и белок-носителем (патент на изобретение RU 2452482). Широко изучено использование наночастиц в качестве активаторов или сенсибилизаторов гипертермии. Так, известен способ плазмонно-резонансной фототермической терапии опухолей с помощью многократного введения раствора золотых наностержней, покрытых полиэтиленгликолем и облучения инфракрасным лазером (патент на изобретение RU 2614507).Nano-vaccines and nanoparticles are widely used in anti-cancer therapy. The preparations containing platinum with paclitaxel and albumin (patent for invention RU 2589513) for the treatment of squamous cell carcinoma of non-small cell lung cancer, as well as with taxane and a carrier protein (patent for invention RU 2452482) were studied. The use of nanoparticles as activators or sensitizers of hyperthermia has been widely studied. Thus, there is a known method of plasmon resonance photothermal therapy of tumors by repeatedly injecting a solution of gold nanorods coated with polyethylene glycol and irradiating with an infrared laser (patent RU 2614507).

Важной проблемой при лечении рака химиотерапевтическим препаратами является ряд побочных эффектов, связанных с ранним выделением лекарств в организме человека и их воздействием на здоровые клетки. Тем не менее, до сих пор в медицинской практике нет достаточно эффективной замены химиотерапии. Наиболее страдают при этом костныймозг, лимфатическая система, эпителий желудочно-кишечного тракта, кожи, волосяных фолликулов и репродуктивные органы. Поддерживающей терапии посвящена значительная часть процедуры лечения. Одним из возможных путей минимизации влияния противоопухолевых антибиотиков на организм является их направленная доставка до клеток-мишеней в опухоли. Такой метод позволяет предотвратить распространение цитотоксичных веществ в здоровые области организма.An important problem in the treatment of cancer with chemotherapeutic drugs is a number of side effects associated with the early release of drugs in the human body and their effect on healthy cells. However, in medical practice there is still no sufficiently effective replacement for chemotherapy. The most affected are the bone marrow, lymphatic system, epithelium of the gastrointestinal tract, skin, hair follicles and reproductive organs. Supportive therapy focuses on a significant part of the treatment procedure. One of the possible ways to minimize the effect of antitumor antibiotics on the body is their targeted delivery to target cells in the tumor. This method allows you to prevent the spread of cytotoxic substances in healthy areas of the body.

Так, например, проверена возможность использования для лечения и профилактики рака магнитных наночастиц железа и его оксидов при активации высвобождения терапевтически активного вещества переменным магнитным полем (патент на изобретение RU 2490027). Другим способом является сорбция противопухолевых агентов в наночастицах из синтетических полимеров (Luo, М. et al. A STING-activating nanovaccine for cancer immunotherapy. Nat. Nanotechnol. 12, 648-654 (2017)). В изобретении RU 2610170 наночастицы магнетита покрывают гидрофильным полимером, содержащим в своем составе векторный фрагмент из группы растительных лектинов, способный связываться с углеводными фрагментами на мембране раковых клеток, что также дает возможность использовать данные наночастицы для доставки цитотоксичного препарата. В заявке WO 2014178468 как средство направленной доставки предложена противораковая наночастица из порфиринового соединения с лекарственным средством и сывороточным альбумином. Известны также решения, направленные на снижение побочных эффектов противораковой терапии. В частности в заявке WO 2007069272 представлены 27 композиций, способствующих снижению алопеции, с использованием паклитаксела и доцетаксела, их производных и аналогов.For example, the possibility of using magnetic nanoparticles of iron and its oxides for the treatment and prevention of cancer when activating the release of a therapeutically active substance by an alternating magnetic field has been tested (patent RU 2490027). Another method is the sorption of antitumor agents in synthetic polymer nanoparticles (Luo, M. et al. A STING-activating nanovaccine for cancer immunotherapy. Nat. Nanotechnol. 12, 648-654 (2017)). In the invention RU 2610170, magnetite nanoparticles are coated with a hydrophilic polymer containing a vector fragment from the group of plant lectins that can bind to carbohydrate fragments on the membrane of cancer cells, which also makes it possible to use these nanoparticles to deliver a cytotoxic drug. WO 2014178468 discloses an anticancer nanoparticle of a porphyrin compound with a drug and serum albumin as a targeted delivery vehicle. Solutions are also known to reduce the side effects of anticancer therapy. In particular, in the application WO 2007069272, 27 compositions are presented that contribute to alopecia reduction using paclitaxel and docetaxel, their derivatives and analogues.

Известно, что многие неорганические наночастицы могут почти беспрепятственно перемещаться в организме, за исключением мозга, ограниченного малопроницаемым гематоэнцефалическим барьером, но существенным недостатком большинства подобных систем доставки является токсичность и способность накапливаться в организме, что влечет за собой дополнительные побочные эффекты (Garnett, М.С. & Kallinteri, Р. Nanomedicines and nanotoxicology: Some physiological principles. Occup.Med. (Chic. Ill). 56, 307-311 (2006)).It is known that many inorganic nanoparticles can move almost unhindered in the body, with the exception of the brain, which is limited by the low-permeable blood-brain barrier, but a significant drawback of most of these delivery systems is toxicity and the ability to accumulate in the body, which entails additional side effects (Garnett, M.C. . & Kallinteri, R. Nanomedicines and nanotoxicology: Some physiological principles. Occup. Med. (Chic. Ill.) 56, 307-311 (2006)).

Данные недостатки полностью отсутствуют при использовании наночастиц, основанных на химически чистом кремнии, которые при попадании в организм выводятся оттуда в виде ортокремниевой кислоты (Дурнев, А.Д. et al. Исследование генотоксической и тератогенной активности нанокристаллов кремния. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 4, 429-433 (2010)).These drawbacks are completely absent when using nanoparticles based on chemically pure silicon, which when ingested are excreted in the form of orthosilicic acid (Durnev, A.D. et al. Study of the genotoxic and teratogenic activity of silicon nanocrystals. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 4, 429-433 (2010)).

Из уровня техники известен патент на изобретение US 5,914,183, в котором описаны слои пористого кремния и раскрыт способ их изготовления с помощью жидкостного электрохимического травления. Известен патент US 6,666,214, а также патенты US 7,186,267 и US 7,332,339, где показано, что некоторые виды кремниевых наноструктур и наночастиц являются биосовместимыми и даже биоактивными. В патенте RU 2504403 описан способ получения водной суспензии биосовместимых пористых кремниевых наночастиц, которые способны проникать в живые клетки, сохраняя свои полезные биологические свойства и люминесценцию. В ряде статей была показана биосовместимость наночастиц кремния, и, как следствие, удобство их применения в биомедицине как фотосенсибилизаторов при фотодинамической терапии рака или в качестве матрицы для лекарственного средства системы доставки (Anenkova, K.А., Petrova, G.P., Osminkina, L.А. & Tamarov, K.P. Biocompatibility of Silicon Nanoparticles as a New Material for Diagnostics and Treatment of Common Diseases. WDS'13 Proc. Contrib. Pap. 3, 180-183 (2013); Mishchenko, T.A. et al. Biocompatibility of Bare Nanoparticles Based on Silicon and Gold for Nervous Cells. KnE Energy Phys. 2018, 232-239 (2018)). Уникальность физико-химических свойств пористого кремния выражается и в отсутствии токсичности материалов на его основе при проверке на клетках (in vitro), органах и тканях (in vivo) (Liu, D., Shahbazi, M., Bimbo, L.M., Hirvonen, J. & Santos, H.A. Biocompatibility of porous silicon for biomedical applications. Porous silicon for biomedical applications (Woodhead Publishing Limited, 2014)).The prior art patent for the invention is US 5,914,183, which describes layers of porous silicon and discloses a method for their manufacture using liquid electrochemical etching. Known US patent 6,666,214, as well as patents US 7,186,267 and US 7,332,339, where it is shown that some types of silicon nanostructures and nanoparticles are biocompatible and even bioactive. RU 2504403 describes a method for producing an aqueous suspension of biocompatible porous silicon nanoparticles that are able to penetrate into living cells, while maintaining their beneficial biological properties and luminescence. A number of articles have shown the biocompatibility of silicon nanoparticles, and, as a consequence, the convenience of their use in biomedicine as photosensitizers in the photodynamic therapy of cancer or as a matrix for a drug delivery system (Anenkova, K.A., Petrova, GP, Osminkina, L. A. & Tamarov, KP Biocompatibility of Silicon Nanoparticles as a New Material for Diagnostics and Treatment of Common Diseases. WDS'13 Proc. Contrib. Pap. 3, 180-183 (2013); Mishchenko, TA et al. Biocompatibility of Bare Nanoparticles Based on Silicon and Gold for Nervous Cells. KnE Energy Phys. 2018, 232-239 (2018)). The uniqueness of the physicochemical properties of porous silicon is also expressed in the absence of toxicity of materials based on it when tested on cells (in vitro), organs and tissues (in vivo) (Liu, D., Shahbazi, M., Bimbo, LM, Hirvonen, J . & Santos, HA Biocompatibility of porous silicon for biomedical applications. Porous silicon for biomedical applications (Woodhead Publishing Limited, 2014).

Все вышесказанное свидетельствует о том, что наночастицы кремния являются биодеградируемым низкотоксичным материалом, перспективным для широкого использования в биомедицине.All of the above indicates that silicon nanoparticles are a biodegradable low-toxic material, promising for widespread use in biomedicine.

Близким аналогом к данному изобретению является заявка на изобретение ЕА 201700214, в которой раскрыт метод получения наночастиц нитрида бора для доставки противоопухолевых препаратов, что также предотвращает возникновение токсичности наноконтейнеров для клеток. Также способом, обеспечивающим низкую токсичность контейнера, является изобретение по патенту RU 2635865 «Способ получения наночастиц полистирольных ионообменников для доставки противоопухолевых препаратов». В патенте описан способ приготовления водного раствора наночастиц, отделение суспензии и добавления к ней ионогенного лекарственного вещества. При этом благодаря повышению активности поглощения клетками наноконтейнеров с противоопухолевым веществом вследствие поверхностных особенностей используемых наночастиц достигается повышение эффективности противоопухолевой терапии. Другим близким аналогом к данному изобретению является патент RU 2625722, предлагающий использование кремнийорганических ниосом с бактерицидными и парамагнитными свойствами для адресной доставки лекарств. Тем не менее, токсические эффекты от высокого содержания серебра в данном препарате препятствуют его использованию в организме. В качестве средства доставки противоопухолевого препарата доксорубицин в патенте RU 2026687 предлагается использовать альфа-фетопротеин, полученный из сыворотки пуповинной крови человека.A close analogue to this invention is the application for invention EA 201700214, which discloses a method for producing boron nitride nanoparticles for the delivery of antitumor drugs, which also prevents the occurrence of toxicity of nanocontainers for cells. Another method that ensures low toxicity of the container is the invention according to patent RU 2635865 "A method for producing polystyrene ion exchangers nanoparticles for the delivery of antitumor drugs." The patent describes a method for preparing an aqueous solution of nanoparticles, separating the suspension and adding to it an ionic drug substance. Moreover, due to the increased activity of the absorption of nanocontainers with an antitumor substance by the cells due to the surface features of the nanoparticles used, an increase in the efficiency of antitumor therapy is achieved. Another close analogue to this invention is patent RU 2625722, which proposes the use of organosilicon niosomes with bactericidal and paramagnetic properties for targeted drug delivery. However, the toxic effects of the high silver content in this drug prevent its use in the body. In the patent RU 2026687, doxorubicin is proposed to use alpha-fetoprotein obtained from human cord blood serum as a delivery vehicle for the antitumor drug.

Перспективным противоопухолевым препаратом для загрузки наноконтейнеров является полиэфирный ионофорный антибиотик салиномицин. Клинические исследования доказали способность салиномицина эффективно устранять раковые стволовые клетки и индуцировать частичную клиническую регрессию сильно обработанных и устойчивых к терапии раковых заболеваний (Naujokat, С. & Steinhart, R. Salinomycin as a drug for targeting human cancer stem cells. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 44-46 (2012)).A promising antitumor drug for loading nanocontainers is the polyester ionophore antibiotic salinomycin. Clinical studies have proven the ability of salinomycin to efficiently eliminate cancer stem cells and induce partial clinical regression of highly treated and therapy-resistant cancers (Naujokat, C. & Steinhart, R. Salinomycin as a drug for targeting human cancer stem cells. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 44-46 (2012)).

Недавние исследования показали возможность еще более активного уничтожения клеток рака груди производными салиномицина благодаря накоплению и секвестрации железа в лизосомах (Mai, Т.Т. et al. Salinomycin kills cancer stem cells by sequestering iron in lysosomes. Nat. Chem. 9, 1025-1033 (2017)). Преимущество салиномицина заключается в том, что он обладает избирательной токсичностью в отношении опухолевых стволовых клеток, действуя как ингибитор ряда белков, индуцируя апоптоз раковых клеток (Москалева, Е.Ю. & Северин, С.Е. Противоопухолевая активность ионофорного антибиотика салиномицина: мишень - опухолевые стволовые клетки. Молекулярная медицина 6, (2012).). Известен способ загрузки салиномицина в детонационные наноалмазы - углеродные наноструктуры (Коноплянников, А.Г. и др. Комплексы детонационных наноалмазов с ингибиторами раковых стволовых клеток или с паракринными продуктами мезенхимальных стволовых клеток как новые потенциальные лекарственные средства. Кристаллография 60, 831-836 (2015)).Recent studies have shown the possibility of even more active destruction of breast cancer cells by salinomycin derivatives due to the accumulation and sequestration of iron in lysosomes (Mai, T.T. et al. Salinomycin kills cancer stem cells by sequestering iron in lysosomes. Nat. Chem. 9, 1025-1033 (2017)). The advantage of salinomycin is that it has selective toxicity to tumor stem cells, acting as an inhibitor of a number of proteins, inducing apoptosis of cancer cells (Moskaleva, E.Yu. & Severin, S.E. Antitumor activity of the ionophore antibiotic salinomycin: the target is tumor stem cells, Molecular Medicine 6, (2012).). There is a method of loading salinomycin into detonation nanodiamonds — carbon nanostructures (Konoplyannikov, A.G. et al. Detonation nanodiamond complexes with cancer stem cell inhibitors or with paracrine products of mesenchymal stem cells as new potential drugs. Crystallography 60, 831-836 (2015) )

Дополнительно было показано, что добавление к салиномицину наночастиц серебра усиливает апоптоз и аутофагию в клетках рака яичников человека (Zhang, X.-F. & Gurunathan, S. Combination of salinomycin and silver nanoparticles enhances apoptosis and autophagy in human ovarian cancer cells: an effective anticancer therapy. Int. J. Nanomedicine 11, 3655-75 (2016)). Различными группами проводилась загрузка салиномицина в PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот) нановолокна с сохранением высокой противоопухолевой активности (Norouzi, М., Abdali, Z., Liu, S. & Miller, D.W. Salinomycin-loaded Nanofibers for Glioblastoma Therapy. Sci. Rep. 8, 10 (2018); Zhang, Y., Zhang, Q., Sun, J., Liu, H. & Li, Q. The combination therapy of salinomycin and gefitinib using poly (d, l -lactic-co-glycolic acid) - poly (ethylene glycol) nanoparticles for targeting both lung cancer stem cells and cancer cells. Onco. Targets. Ther. 10, 5653-5666 (2017)).Additionally, addition of silver nanoparticles to salinomycin has been shown to enhance apoptosis and autophagy in human ovarian cancer cells (Zhang, X.-F. & Gurunathan, S. Combination of salinomycin and silver nanoparticles enhances apoptosis and autophagy in human ovarian cancer cells: an effective anticancer therapy. Int. J. Nanomedicine 11, 3655-75 (2016)). Different groups loaded salinomycin into a PLGA (copolymer of lactic and glycolic acids) nanofibers with high antitumor activity (Norouzi, M., Abdali, Z., Liu, S. & Miller, DW Salinomycin-loaded Nanofibers for Glioblastoma Therapy. Sci. Rep . 8, 10 (2018); Zhang, Y., Zhang, Q., Sun, J., Liu, H. & Li, Q. The combination therapy of salinomycin and gefitinib using poly (d, l-lactic-co- glycolic acid) - poly (ethylene glycol) nanoparticles for targeting both lung cancer stem cells and cancer cells. Onco. Targets. Ther. 10, 5653-5666 (2017)).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ загрузки салиномицина в детонационные наноалмазы - углеродные наноструктуры (Коноплянников, А.Г. и др. Комплексы детонационных наноалмазов с ингибиторами раковых стволовых клеток или с паракринными продуктами мезенхимальных стволовых клеток как новые потенциальные лекарственные средства. Кристаллография 60, 831-836 (2015). Согласно данному способу комплексы наноалмазов смешивают с водным раствором салиномицина и вводят животным на девятые сутки после перевивки опухоли (карцинома легких Льюис, штамм LLC) однократно внутрибрюшинно 0.2 мл суспензии полученного комплекса или такое же количество салиномицина, суспендированного в воде. Было установлено, что введение комплекса существенно повышает противоопухолевый эффект салиномицина, что объясняется постепенным освобождением данного препарата, связанного с поверхностью наноалмазов. К недостаткам данного способа можно отнести отсутствие биодеградируемости наноалмазов, что может приводить к нежелательным последствиям при их накоплении в организме, а также отсутствием пористой структуры у таких наноконтейнеров, что ограничивает возможность доставки больших количеств салиномицина и не позволяет контролировать процесс выхода препарата из наноконтейнеров.Closest to the claimed method is a method for loading salinomycin into detonation nanodiamonds — carbon nanostructures (Konoplyannikov, A.G. et al. Complexes of detonation nanodiamonds with cancer stem cell inhibitors or with paracrine products of mesenchymal stem cells as new potential drugs. Crystallography 60, 831 31 -836 (2015) According to this method, nanodiamond complexes are mixed with an aqueous salinomycin solution and administered to the animals on the ninth day after tumor inoculation (Lewis lung carcinoma, LLC strain) once intraperitoneally with 0.2 ml of a suspension of the obtained complex or the same amount of salinomycin suspended in water. It was found that the introduction of the complex significantly increases the antitumor effect of salinomycin, which is explained by the gradual release of this drug associated with the surface of nanodiamonds. The disadvantages of this method include the lack of biodegradability of nanodiamonds. to undesirable consequences during their accumulation in the body, as well as the lack of a porous structure in such nanocontainers, which limits the ability to deliver large quantities of salinomycin and does not allow controlling the process of drug release from nanocontainers.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является создание способа получения твердотельных пористых наноконтейнеров на основе наночастиц кремния для доставки и контролируемого выделения противоопухолевых препаратов.The objective of the invention is to provide a method for producing solid-state porous nanocontainers based on silicon nanoparticles for the delivery and controlled release of antitumor drugs.

Технический результат достигается за счет получения наночастиц мезопористого кремния с заданными размерами, морфологией и химическим составом покрытия внутренней поверхности пор, позволяющими осуществить их полную загрузку противоопухолевыми препаратами (за счет устойчивого внедрения молекул противоопухолевого препарата в поры наночастиц мезопористого кремния), и его замедленное высвобождение в водной среде, являющееся подтверждением пролонгированного выделения препарата для щадящей химиотерапии рака.The technical result is achieved by obtaining mesoporous silicon nanoparticles with specified sizes, morphology and chemical composition of the coating of the inner surface of the pores, allowing them to be fully loaded with antitumor drugs (due to the stable incorporation of antitumor drug molecules into the pores of mesoporous silicon nanoparticles), and its slow release in aqueous medium, which confirms the prolonged release of the drug for gentle cancer chemotherapy.

Перечисленные преимущества доказаны проведенными экспериментами как по физико-химическому анализу полученных наноконтейнеров и процессов высвобождения препаратов из них, так и результатами исследований in vivo. Получаемые заявляемым способом наночастицы имеют смешанное оксидно-гидридное покрытие внутренней поверхности пор, что обеспечивает как их гидрофильные свойства, выражающиеся в способности формирования устойчивых водных суспензий, так и высокую эффективность связывания с лекарственными препаратами, имеющими низкую степень растворимости в воде. Указанные суспензии могут храниться в темноте при комнатной температуре в течение не менее одного месяца.These advantages are proved by experiments both in the physicochemical analysis of the obtained nanocontainers and the processes of drug release from them, and in vivo studies. Obtained by the claimed method, the nanoparticles have a mixed oxide-hydride coating of the inner surface of the pores, which ensures both their hydrophilic properties, expressed in the ability to form stable aqueous suspensions, and high binding efficiency with drugs having a low degree of solubility in water. These suspensions can be stored in the dark at room temperature for at least one month.

Оригинальность используемого метода заключается в выборе в качестве исходного материала мезопористого кремния определенной пористости и состава поверхностного покрытия кремниевых наночастиц, последующего их измельчения в шаровой планетарной мельнице, что обеспечивает получение водной суспензии мезопористых наночастиц кремния, которые можно заполнить противоопухолевыми препаратами, в том числе с низкой степенью растворимости в водной среде.The originality of the method used consists in the choice of a certain porosity and composition of the surface coating of silicon nanoparticles as the starting material of mesoporous silicon, their subsequent grinding in a planetary ball mill, which ensures the production of an aqueous suspension of mesoporous silicon nanoparticles, which can be filled with antitumor preparations, including those with a low degree of solubility in water.

Способ получения водных суспензий мезопористых кремниевых наночастиц для биомедицинских применений включает формирование на поверхности пластин кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм*см пленок мезопористого кремния толщиной от 10 до 100 мкм, пористостью от 50 до 80% и размером пор от 2 до 10 нм. Формирование пленки производят методом электрохимического травления пластин кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм*см в растворе, содержащем водный раствор плавиковой кислоты с концентрацией 40-50% и этиловый спирт в объемном соотношении от 1:1 до 1:5, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см2. После этого полученные пленки мезопористого кремния отделяют от подложки кратковременным воздействием электрического тока от 1 до 5 секунд с увеличением плотности тока до 500-600 мА/см2, а отслоенные пленки пористого кремния, промывают в дистиллированной воде в течение от 1 до 2 минут, затем высушивают на воздухе при комнатной температуре. Полученные в результате мезопористые пленки заливают дистиллированной водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергают механическому измельчению посредством помола в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, таких как оксид циркония, нержавеющая сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин. В результате образуется концентрированная водная суспензия наночастиц мезопористого кремния с поперечными размерами от 50 до 100 нм.A method for producing aqueous suspensions of mesoporous silicon nanoparticles for biomedical applications involves forming hole-type conductivity on the surface of crystalline silicon wafers with specific resistance from 1 to 50 mOhm * cm of mesoporous silicon films with a thickness of 10 to 100 μm, porosity from 50 to 80% and pore size from 2 to 10 nm. The film is formed by the method of electrochemical etching of crystalline silicon plates of hole type conductivity with a resistivity of 1 to 50 mOhm * cm in a solution containing an aqueous solution of hydrofluoric acid with a concentration of 40-50% and ethyl alcohol in a volume ratio of 1: 1 to 1: 5 , for a period of time from 10 to 60 minutes with a current density of 20 to 60 mA / cm 2 . After that, the obtained films of mesoporous silicon are separated from the substrate by short-term exposure to electric current from 1 to 5 seconds with an increase in current density to 500-600 mA / cm 2 , and the exfoliated films of porous silicon are washed in distilled water for 1 to 2 minutes, then dried in air at room temperature. The resulting mesoporous films are poured with distilled water in a ratio of 1: 2 to 1: 3 by weight and subjected to mechanical grinding by grinding in a planetary ball mill using balls with a diameter of 1 to 5 mm from solid materials such as zirconia, stainless steel, tungsten carbide, and similar grinding jars, for a period of time from 15 to 30 minutes at rotational speeds from 900 to 1100 rpm. As a result, a concentrated aqueous suspension of mesoporous silicon nanoparticles with transverse sizes from 50 to 100 nm is formed.

Способ получения наноконтейнеров с химиотерапевтическим противоопухолевым препаратом включает загрузку наноконтейнеров противоопухолевым препаратом путем перемешивания его водной суспензии с полученной суспензией наночастиц мезопористого кремния в массовом соотношении от 1:1 до 10:1 в течение промежутка времени от 1 до 5 часов при комнатной температуре, дальнейшим отделением загруженных наночастиц центрифугированием и промыванием водой или физраствором с последующим высушиванием на воздухе при комнатной температуре или в лиофильной сушке с получением порошкообразной формы препарата.A method of producing nanocontainers with a chemotherapeutic antitumor drug involves loading the nanocontainers with an antitumor drug by mixing its aqueous suspension with the obtained suspension of mesoporous silicon nanoparticles in a mass ratio of 1: 1 to 10: 1 for a period of time from 1 to 5 hours at room temperature, then separating the loaded nanoparticles by centrifugation and washing with water or saline, followed by drying in air at room temperature or in freeze drying to obtain a powder form of the drug.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На Фиг. 1 представлено изображение полученных наночастиц в просвечивающем электронном микроскопе. На фиг. 2 представлена картина дифракции электронов в просвечивающем электронном микроскопе на наночастицах мезопористого кремния, подтверждающая наличие пор и кремниевых нанокристаллов в полученных образцах. На фиг. 3 - спектры ИК пропускания слоев наночастиц мезопористого кремния (кривая 1) и пленок, из которых они были получены (кривая 2), свидетельствующие о присутствии на их поверхности как гидридных (кремний-водородных, Si-Hx, х=1, 2, 3), так и оксидных (кремний-кислородных, Si-O) и смешанных осигидридных (O-Si-Hx, х=1, 2, 3) молекулярных групп. Таким образом, фиг. 3 демонстрирует смешанный оксидно-гидридный состав покрытия поверхности пор в полученных наночастицах, что обеспечивает сочетание их гидрофильных свойств, обеспечивающих существование устойчивых водных суспензий наночастиц, и эффективной загрузки противоопухолевыми лекарственными препаратами, в том числе, имеющими низкую степень растворимости в воде. На фиг. 4 представлены временные зависимости количества вышедшего салиномицина из наночастиц мезопористого кремния для образцов 1-3 в воде при 37°С. На фиг. 5 - результаты эксперимента по измерению объема опухоли карциномы Льюиса, привитой лабораторным мышам без какого-либо воздействия (контрольный образец) и после внутриопухолевого введения наночастиц кремния и наночастиц кремния, загруженных салиномицином.In FIG. 1 shows an image of the obtained nanoparticles in a transmission electron microscope. In FIG. Figure 2 shows the electron diffraction pattern in a transmission electron microscope on mesoporous silicon nanoparticles, confirming the presence of pores and silicon nanocrystals in the samples obtained. In FIG. 3 - IR transmission spectra of the layers of mesoporous silicon nanoparticles (curve 1) and the films from which they were obtained (curve 2), indicating the presence of hydride (silicon-hydrogen, Si-H x , x = 1, 2, 3), and oxide (silicon-oxygen, Si-O) and mixed osyhydride (O-Si-H x , x = 1, 2, 3) molecular groups. Thus, FIG. 3 shows the mixed oxide-hydride composition of the pore surface coating in the obtained nanoparticles, which provides a combination of their hydrophilic properties, which ensure the existence of stable aqueous suspensions of nanoparticles, and effective loading with anticancer drugs, including those having a low degree of solubility in water. In FIG. Figure 4 shows the time dependences of the amount of salinomycin released from the mesoporous silicon nanoparticles for samples 1-3 in water at 37 ° C. In FIG. 5 shows the results of an experiment measuring the volume of a Lewis carcinoma tumor inoculated to laboratory mice without any effect (control sample) and after intratumoral administration of silicon nanoparticles and silicon nanoparticles loaded with salinomycin.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Способ получения наноконтейнеров для комбинированной терапии рака заключается в приготовлении водной суспензии наночастиц мезопористого кремния с заданными размерами, морфологией и химическим составом покрытия внутренней поверхности пор, с последующей их загрузкой лекарственным препаратом путем перемешивания их смеси в водной среде при определенном соотношении по массе препарата и наночастиц с последующим отделением нерастворимой фракции, промывки водой получившихся заполненных препаратом наноконтейнеров и их последующего высушивания. Результатом являются порошки наноконтейнеров, загруженных противоопухолевым препаратом, обладающих свойством постепенного высвобождения при помещении в водную среду или организм человека.A method for producing nanocontainers for combination cancer therapy consists in preparing an aqueous suspension of mesoporous silicon nanoparticles with specified sizes, morphology and chemical composition of the coating of the inner pore surface, followed by loading them with the drug by mixing their mixture in an aqueous medium at a certain ratio by weight of the drug and nanoparticles with subsequent separation of the insoluble fraction, washing with water the resulting nanocontainers filled with the preparation, and their subsequent drying. The result is powders of nanocontainers loaded with an antitumor drug with the property of gradual release when placed in an aqueous medium or human body.

В настоящем изобретении предлагается использовать метод загрузки наночастиц плохо водорастворимыми препаратами, например, такими как салиномицин. Раствор лекарства с наночастицами оптимальной концентрации в течение 1 часа при комнатной температуре интенсивно перемешивают, например, на шейкере Eppendorf, далее центрифугируют в течение 3 минут в режиме 5000 об/мин, после чего три раза промывают осадок деионизованной водой. Анализ концентрации салиномицина в получаемых наноконтейнерах можно проводить по интенсивности полос инфракрасного поглощения света, а именно полос 1703 см-1, 1554 см-1, 1456 см-1, 1040 см-1 (Преч, Э., Бюльман, Ф., Аффольтер, К. Определение строения органических соединений. Издательство 'Мир', 2006). Учитывая, что полоса 1040 см-1 может перекрываться с полосами поглощения кремниевых наночастиц, целесообразно для определения содержания салиномицина использовать полосу 1456 см-1 как узкую и интенсивную, с контролем по полосе 1554 см-1 (может быть чувствительна к рН). Допустим также контроль по полосе 1703 см-1 при условии высокого качества регистрации спектров (чувствительна к ошибкам вычитания спектра фонового раствора).The present invention proposes to use the method of loading nanoparticles with poorly soluble preparations, for example, such as salinomycin. A solution of a drug with optimal concentration nanoparticles is intensively stirred for 1 hour at room temperature, for example, on an Eppendorf shaker, then centrifuged for 3 minutes at 5000 rpm, after which the precipitate is washed three times with deionized water. The analysis of the salinomycin concentration in the obtained nanocontainers can be carried out by the intensity of the infrared absorption bands of light, namely the bands of 1703 cm -1 , 1554 cm -1 , 1456 cm -1 , 1040 cm -1 (Prech, E., Bulman, F., Affolter, K. Determination of the structure of organic compounds. Mir Publishing House, 2006). Considering that the 1040 cm -1 band can overlap with the absorption bands of silicon nanoparticles, it is advisable to use the 1456 cm -1 band as narrow and intense to determine the salinomycin content, with a control over the band of 1554 cm -1 (it can be sensitive to pH). We also allow control over a band of 1703 cm –1 , provided that the spectra are of high quality (sensitive to errors in subtracting the spectrum of the background solution).

По итогам проведенного нами исследования установлено, что изменяя соотношения масс кремния с противоопухолевым препаратом, можно получать различные степени загрузки салиномицина в наноконтейнерах (Таблица 1). Особенность заявляемого способа применения наночастиц мезопористого кремния в качестве наноконтейнеров заключается в использовании в качестве исходного материала пленок кремния с высокой пористостью не менее 50%, которые можно измельчать в воде при помощи механического измельчения помолом в шаровой мельнице, что сохраняло нанокристаллическую структуру и пористость наночастиц и определяло состав их поверхностного покрытия. Такие наночастицы существуют в виде водных суспензий, безопасных для введения в живые системы.According to the results of our study, it was found that by changing the ratio of the masses of silicon with the antitumor drug, it is possible to obtain different degrees of salinomycin loading in nanocontainers (Table 1). A feature of the proposed method for the use of mesoporous silicon nanoparticles as nanocontainers is to use silicon films with a high porosity of at least 50% as starting material, which can be milled in water by mechanical grinding by grinding in a ball mill, which preserved the nanocrystalline structure and porosity of the nanoparticles and determined composition of their surface coating. Such nanoparticles exist in the form of aqueous suspensions that are safe for introduction into living systems.

Предлагаемый метод изготовления наночастиц мезопористого кремния позволяет получать водные суспензии с размерами наночастиц от 50 до 100 нм и концентрации до 10 мг/мл. При этом получаемые заявляемым способом наночастицы имеют смешанное оксидно-гидридное покрытие внутренней поверхности пор, что обеспечивает как их гидрофильные свойства, выражающиеся в способности формирования устойчивых водных суспензий, так и высокую эффективность связывания с лекарственными препаратами, имеющими низкую степень растворимости в воде. Указанные суспензии могут храниться в темноте при комнатной температуре в течение не менее одного месяца. При этом размеры наночастиц существенно не изменяются. Наночастицы в виде суспензий могут быть введены в культуры клеток и биологические системы, а именно в кровь, соединительные и мышечные ткани для использования их в качестве диагностического и терапевтического средства.The proposed method for the manufacture of mesoporous silicon nanoparticles allows to obtain aqueous suspensions with nanoparticle sizes from 50 to 100 nm and a concentration of up to 10 mg / ml. Moreover, the nanoparticles obtained by the claimed method have a mixed oxide-hydride coating of the inner surface of the pores, which ensures both their hydrophilic properties, expressed in the ability to form stable aqueous suspensions, and high binding efficiency with drugs with a low degree of solubility in water. These suspensions can be stored in the dark at room temperature for at least one month. In this case, the sizes of nanoparticles do not change significantly. Suspension nanoparticles can be introduced into cell cultures and biological systems, namely, blood, connective and muscle tissues for use as a diagnostic and therapeutic agent.

Данные суспензии мезопористых кремниевых наночастиц, заполненных лекарственным препаратом, таким как, салиномицин, доксорубицин или другими противоопухолевым лекарством, предназначены для введения в биологические системы, а именно, культуры клеток, ткани и кровеносную систему, для последующей активации с помощью света, ультразвука и других физических воздействий для достижения необходимого терапевтического эффекта.These suspensions of mesoporous silicon nanoparticles filled with a drug, such as salinomycin, doxorubicin or other antitumor drugs, are intended to be introduced into biological systems, namely, cell cultures, tissues and the circulatory system, for subsequent activation by light, ultrasound and other physical impacts to achieve the desired therapeutic effect.

Примеры получения наноконтейнеровExamples of obtaining nanocontainers

Наноконтейнеры получали следующим образом. Вначале были получены слои мезопористого кремния методом электрохимического травления пластин кристаллического кремния (c-Si) p-типа проводимости с ориентацией поверхности (100) и удельным сопротивлением 10 мОм*см в растворе плавиковой кислоты и этилового спирта (HF(50%):C2H5OH) при плотности тока травления от 50-60 мА/см2 в течение 40-60 мин. Это позволяло сформировать на подложке c-Si пленки так называемого мезопористого кремния с пористостью 50-60% и толщиной слоя до 100 мкм. При этом, большее время травления обеспечивало большую толщину слоя. После получения пористого слоя, полученные пленки пористого кремния отслаиваются от подложки кратковременным от 1 до 5 секунд увеличением плотности тока до 500-600 мА/см2, а отслоенные пленки промывали в дистиллированной воде в течение 1-2 минут и затем высушивали на воздухе при комнатной температуре. Полученные в результате пористые пленки заливали дистиллированной водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергали механическому измельчению посредством помола в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, таких как оксид циркония, нержавеющая сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин. В результате образуется концентрированная водная суспензия наночастиц пористого кремния с размером пор в диапазоне от 2 до 10 нм, пористостью от 50 до 60% и поперечными размерами наночастиц от 50 до 100 нм (см. фиг. 1). Картины дифракции электронов в виде концентрических окружностей в сочетании с наборами ориентированных по углу рефлексов (см. фиг. 2), полученные в просвечивающем электронном микроскопе для данных наночастиц, указывают на их нанокристаллическое строение.Nanocontainers were prepared as follows. First, mesoporous silicon layers were obtained by electrochemical etching of p-type crystalline silicon (c-Si) plates with a surface orientation of (100) and a specific resistance of 10 mOhm * cm in a solution of hydrofluoric acid and ethyl alcohol (HF (50%): C2H5OH) at an etching current density of from 50-60 mA / cm 2 for 40-60 minutes This made it possible to form so-called mesoporous silicon films with a porosity of 50-60% and a layer thickness of up to 100 μm on a c-Si substrate. Moreover, a longer etching time provided a greater layer thickness. After obtaining the porous layer, the obtained films of porous silicon are peeled from the substrate by a short-term increase in current density from 500 to 600 mA / cm 2 from 1 to 5 seconds, and the peeled films were washed in distilled water for 1-2 minutes and then dried in air at room temperature temperature. The resulting porous films were poured with distilled water in a ratio of 1: 2 to 1: 3 by weight and subjected to mechanical grinding by grinding in a planetary ball mill using balls with a diameter of 1 to 5 mm from solid materials such as zirconia, stainless steel, tungsten carbide, and similar grinding jars, for a period of time from 15 to 30 minutes at rotational speeds from 900 to 1100 rpm. The result is a concentrated aqueous suspension of porous silicon nanoparticles with pore sizes ranging from 2 to 10 nm, porosity from 50 to 60% and transverse nanoparticle sizes from 50 to 100 nm (see Fig. 1). Electron diffraction patterns in the form of concentric circles in combination with sets of angle-oriented reflections (see Fig. 2) obtained in a transmission electron microscope for these nanoparticles indicate their nanocrystalline structure.

Используя метод инфракрасной (ИК) спектроскопии с обратным Фурье преобразованием был проведен анализ химического состава покрытия поверхности пор в получившихся наночастицах. Использованная процедура их формирования обеспечивала кислородно-водородное (оксигидридное) покрытие поверхности пор, как проиллюстрировано на ИК-спектрах на фиг. 3.Using the method of infrared (IR) spectroscopy with inverse Fourier transform, an analysis was made of the chemical composition of the coating of the pore surface in the resulting nanoparticles. The procedure used for their formation provided oxygen-hydrogen (oxyhydride) coating of the pore surface, as illustrated in the IR spectra in FIG. 3.

Содержания салиномицина в водном растворе и в полученных наноконтейнерах находилось из соотношения полос ИК-поглощения данного вещества. ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре Фурье Tensor 27 «Bruker» (Германия), оснащенного МСТ-детектором, охлаждаемым жидким азотом, с термостатом фирмы «Huber» (США). Измерения проводили в термостатируемой ячейке НПВО, (BioATR-II, «Bruker», Германия) с использованием кристалла однократного отражения ZnSe, при 22С и постоянной скорости продувки системы сухим воздухом аппаратом «Jun-Air» (Германия). На кристалл ячейки НПВО наносили аликвоту (30 мкл) образца, спектр регистрировали трижды в интервале от 3000 до 950 см-1, с разрешением 1 см-1; производили 70-кратное сканирование и усреднение. Фоновый раствор регистрировали аналогичным образом. Спектры анализировали с помощью программы Opus 7.5.The salinomycin content in the aqueous solution and in the obtained nanocontainers was found from the ratio of the IR absorption bands of this substance. IR spectra were recorded on a Tensor 27 Bruker Fourier IR spectrometer (Germany) equipped with a liquid nitrogen cooled MCT detector with a Huber thermostat (USA). The measurements were carried out in a thermostatically controlled ATR cell (BioATR-II, Bruker, Germany) using a ZnSe single reflection crystal at 22 ° C and a constant speed of purging the system with dry air using a Jun-Air apparatus (Germany). An aliquot (30 μl) of the sample was applied to the crystal of the ATR cell, the spectrum was recorded three times in the range from 3000 to 950 cm -1 , with a resolution of 1 cm -1 ; performed 70-fold scanning and averaging. The background solution was recorded in a similar manner. The spectra were analyzed using the Opus 7.5 program.

Далее производилась загрузка салиномицина в мезопористые частицы кремния в воде. Была оценена степень включения салиномицина и определено необходимое число промывок. Исследовались водная суспензия салиномицина (Sal) 10 мг/мл (порошок в стеклянной ампуле) и водная суспензия мезопористых наночастиц кремния (mPSi) с исходной концентрацией 10 мг/мл, размерами наночастиц от 50 до 100 нм, размерами пор 2-5 нм.Then, salinomycin was loaded into mesoporous silicon particles in water. The degree of salinomycin incorporation was evaluated and the required number of washes was determined. We studied an aqueous suspension of salinomycin (Sal) 10 mg / ml (powder in a glass ampoule) and an aqueous suspension of mesoporous silicon nanoparticles (mPSi) with an initial concentration of 10 mg / ml, nanoparticle sizes from 50 to 100 nm, pore sizes of 2-5 nm.

Исследовались суспензии с различным соотношением масс пористого кремния к салиномицину: 1:1, 1:2 и 2:1, обозначаемые условно образцами 1, 2 и 3 соответственно (Табл. 2). Образцы помещали на 1 час при температуре 22°С на шейкер Eppendorf, после чего центрифугировали на мини-центрифуге Eppendorf и трижды промывали осадок деионизованной водой. Условия центрифугирования: 3 минуты, 5000 rpm. Для трех образцов, полученных с различными концентрациями салиномицина и мезопористого кремния регистрировали ИК-спектры, которые сравнивались с контрольными спектрами салиномицина. На всех зарегистрированных спектрах подтверждалось наличие салиномицина в порах кремния. Расчеты эффективности включения салиномицина в поры кремния приведены в Табл. 2.Suspensions with different mass ratios of porous silicon to salinomycin were studied: 1: 1, 1: 2, and 2: 1, conditionally designated samples 1, 2, and 3, respectively (Table 2). Samples were placed for 1 hour at 22 ° C on an Eppendorf shaker, then centrifuged on an Eppendorf mini-centrifuge and the precipitate was washed three times with deionized water. Centrifugation conditions: 3 minutes, 5000 rpm. For three samples obtained with different concentrations of salinomycin and mesoporous silicon, IR spectra were recorded, which were compared with the control spectra of salinomycin. The presence of salinomycin in silicon pores was confirmed on all recorded spectra. The calculations of the efficiency of incorporation of salinomycin into silicon pores are given in Table. 2.

При недостатке салиномицина (образец 3) эффективного включения не наблюдается, 1 мг кремния несет на себе 0,14 мг лекарства. Напротив, при двукратном массовом избытке салиномицина (образец 2) наблюдается высокая степень включения: 1 мг кремния несет такую же массу салиномицина.With a lack of salinomycin (sample 3), effective inclusion is not observed, 1 mg of silicon carries 0.14 mg of the drug. On the contrary, with a double mass excess of salinomycin (sample 2), a high degree of inclusion is observed: 1 mg of silicon carries the same mass of salinomycin.

Был проведен эксперимент по высвобождению салиномицина при температуре 37°С в течение 6 часов в воде по следующей методике. Результаты показаны на Фиг. 3 Наночастицы, очищенные трехкратной промывкой, ресуспендировали в воде (150 мкл), после чего отбирали пробы по 50 мкл, центрифугировали их и отделяли супернатант, который содержал высвободившийся салиномицин. Регистрировали ИК-спектр супернатанта, определяли по интенсивности полосы поглощения 1553 см-1 количество высвободившегося салиномицина. Результаты приведены на Фиг..An experiment was conducted to release salinomycin at a temperature of 37 ° C for 6 hours in water according to the following procedure. The results are shown in FIG. 3 Nanoparticles purified by washing three times were resuspended in water (150 μl), after which 50 μl samples were taken, centrifuged, and the supernatant that contained the released salinomycin was separated. The IR spectrum of the supernatant was recorded, and the amount of salinomycin released was determined by the intensity of the absorption band of 1553 cm -1 . The results are shown in Fig ..

Образец 3, полученный в недостатке салиномицина, в течение часа высвобождает все содержимое, что указывает на поверхностное расположение салиномицина в порах. Образец 1 характеризуется практически линейным высвобождением препарата на заданном временном интервале до 3 ч. Можно предположить, что все молекулы салиномицина находятся в одинаковом положении в порах кремния, образуя монослой, который при помещении в водную среду медленно десорбируется с поверхности наночастиц.Sample 3, obtained in a lack of salinomycin, releases all contents within an hour, indicating the surface location of salinomycin in the pores. Sample 1 is characterized by an almost linear release of the drug over a given time interval of up to 3 hours. It can be assumed that all salinomycin molecules are in the same position in the silicon pores, forming a monolayer, which, when placed in the aqueous medium, is slowly desorbed from the surface of the nanoparticles.

Ход кривой для образца 2 можно разделить на два линейных участка: 0-60 минут и 60-360 мин., что указывает на присутствие не менее двух популяций молекул салиномицина - приповерхностных и упакованных глубоко в поры. Косвенно на данный факт указывает совпадение «времени перехода» - 60 минут с временем полного высвобождения салиномицина из образца 3 (все молекулы - приповерхностные).The curve for sample 2 can be divided into two linear sections: 0-60 minutes and 60-360 minutes, which indicates the presence of at least two populations of salinomycin molecules - near-surface and packed deep into the pores. This fact is indirectly indicated by the coincidence of the “transition time" - 60 minutes with the time of complete release of salinomycin from sample 3 (all molecules are near-surface).

Пример применения наноконтейнеров для противоопухолевой терапииAn example of the use of nanocontainers for antitumor therapy

В экспериментах использовали линейных мышей (С57В1/6), которым перевивали трансплантируемую опухоль - карциному легких Льюис (LLC). Трансплантацию солидной опухоли LLC производили гомогенатом опухолевой ткани в стерильном растворе среды 199. Животных-доноров выводили из эксперимента, вырезали кусочки опухоли без некротических участков и измельчали. Полученную массу опухоли разводили средой 199 и вводили мышам внутримышечно в 0,2-0,4 мл среды 199 для культивирования клеток.In the experiments, linear mice (С57В1 / 6) were used, which transplanted a transplanted tumor - Lewis lung carcinoma (LLC). A solid tumor LLC transplantation was performed by homogenate of the tumor tissue in a sterile solution of medium 199. Donor animals were removed from the experiment, tumor pieces were cut without necrotic sites and crushed. The resulting tumor mass was diluted with medium 199 and was injected into mice intramuscularly in 0.2-0.4 ml of medium 199 for cell culture.

В экспериментах in vivo клетки карциномы легкого Льюис (LLC) трансплантировали внутримышечно в левую заднюю лапу самцов мышей линии C57Bl/6. В каждой группе было по 10-15 животных. На 15 день роста опухоли проводилось внутриопухолевое введение препаратов суспензий наноконтейнеров и раствора салиномицина, а в случае контрольных групп - физраствора.In in vivo experiments, Lewis lung carcinoma cells (LLC) were transplanted intramuscularly into the left hind paw of male C 57 Bl / 6 mice. In each group there were 10-15 animals. On the 15th day of tumor growth, intratumoral administration of preparations of suspensions of nanocontainers and salinomycin solution was carried out, and in the case of control groups, saline.

Перед введением наноконтейнеры на основе наночастиц мезопористого кремния, заполненных салиномицином в весовом соотношении 1:1, разводили в физрастворе (0,9% NaCl в воде) до концентрации 2,5 мг/мл и вводили втутриопухолево в объеме 0,2 мл однократно. Для сравнения также вводили раствор салиномицина в той же дозе. Измерения размеров опухолей проводились на 13 и 24 сутки после введения препарата.Before administration, nanocontainers based on mesoporous silicon nanoparticles filled with salinomycin in a weight ratio of 1: 1 were diluted in saline (0.9% NaCl in water) to a concentration of 2.5 mg / ml and injected intratriopuly in a volume of 0.2 ml once. For comparison, a salinomycin solution in the same dose was also administered. Tumor sizes were measured on days 13 and 24 after drug administration.

Результаты (фиг. 5) показали двукратное торможение роста опухоли на 13 сутки в случае введения суспензии заполненных салиномицином наночастиц, в то время как при введении чистого салиномицина размеры опухоли были близки к контролю. На 24 сутки после введения препарата эффект торможения роста опухолди по сравнению с контрольной группой и группой с введением только салиномицина сохранялся. Этот пример показывает усиление действия салиномицина при его капсулировании в наноконтейнерах на основе мезопористого кремния по сравнению с салиномицином без наноконтейнеров.The results (Fig. 5) showed a twofold inhibition of tumor growth on day 13 in the case of the introduction of a suspension of salinomycin-filled nanoparticles, while with the introduction of pure salinomycin, the tumor sizes were close to control. On the 24th day after administration of the drug, the effect of inhibition of tumor growth compared with the control group and the group with the introduction of salinomycin alone remained. This example shows the enhanced action of salinomycin when it is encapsulated in mesoporous silicon nanocontainers compared to salinomycin without nanocontainers.

Figure 00000001
Figure 00000001

Figure 00000002
Figure 00000002

Claims (5)

1. Способ получения наноконтейнеров для химиотерапевтических противоопухолевых препаратов, включающий получение наночастиц мезопористого кремния путем электрохимического травления пластин кристаллического кремния с дальнейшим механическим измельчением полученных пористых слоев, при этом используют пластины кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм⋅см, электрохимическое травление пластин осуществляют с формированием на ее поверхности пленки мезопористого кремния толщиной от 10 до 100 мкм и пористостью от 50 до 80%, для чего электрохимическое травление пластины осуществляют в растворе, содержащем водный раствор плавиковой кислоты с объемной концентрацией 40-50% и этиловый спирт в соотношении от 1:1 до 1:5 по объему, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см2, после чего полученные пленки мезопористого кремния отделяют от пластины, промывают в дистиллированной воде, высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем заливают водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергают механическому измельчению в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, включая оксид циркония, нержавеющую сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин до получения концентрированной водной суспензии наночастиц мезопористого кремния с поперечными размерами от 50 до 100 нм и размером пор от 2 до 10 нм.1. A method of producing nanocontainers for chemotherapeutic antitumor drugs, including the production of mesoporous silicon nanoparticles by electrochemical etching of crystalline silicon wafers with further mechanical grinding of the obtained porous layers, using hole-type crystalline wafers with specific conductivity from 1 to 50 mOhmcm, electrochemical the etching of the plates is carried out with the formation of a film of mesoporous silicon on its surface with a thickness of 10 to 100 μm and a porosity of 50 to 80%, for which the electrochemical etching of the plate is carried out in a solution containing an aqueous solution of hydrofluoric acid with a volume concentration of 40-50% and ethyl alcohol in in a ratio of 1: 1 to 1: 5 by volume, for a period of time from 10 to 60 minutes with a current density of 20 to 60 mA / cm 2 , after which the obtained mesoporous silicon films are separated from the plate, washed in distilled water, dried on air at com temperature, then pour water in a ratio of 1: 2 to 1: 3 by weight and subjected to mechanical grinding in a planetary ball mill using balls with a diameter of 1 to 5 mm from solid materials, including zirconium oxide, stainless steel, tungsten carbide, and similar grinding jars, for a period of time from 15 to 30 minutes at rotation frequencies from 900 to 1100 rpm to obtain a concentrated aqueous suspension of mesoporous silicon nanoparticles with transverse sizes from 50 to 100 nm and pore sizes from 2 to 10 nm. 2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что пленки пористого кремния отделяют от пластины кратковременным от 1 до 5 секунд воздействием электрического тока с плотностью тока до 500-600 мА/см2.2. The method according to p. 1, characterized in that the porous silicon film is separated from the plate by a short time from 1 to 5 seconds by the action of an electric current with a current density of up to 500-600 mA / cm 2 . 3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что пленки пористого кремния промывают в дистиллированной воде в течение от 1 до 2 минут.3. The method according to p. 1, characterized in that the porous silicon film is washed in distilled water for 1 to 2 minutes. 4. Способ получения наноконтейнеров с химиотерапевтическим противоопухолевым препаратом для комбинированной терапии рака, включающий загрузку наноконтейнеров, полученных способом по п. 1, противоопухолевым препаратом путем перемешивания его водной суспензии с полученной суспензией наночастиц мезопористого кремния в массовых долях от 1:1 до 10:1 в течение промежутка времени от 1 до 5 часов при комнатной температуре, дальнейшим отделением загруженных наночастиц центрифугированием и промыванием водой или физраствором с последующим высушиванием на воздухе при комнатной температуре или в лиофильной сушке с получением порошкообразной формы препарата.4. A method of producing nanocontainers with a chemotherapeutic antitumor drug for the combined treatment of cancer, comprising loading the nanocontainers obtained by the method according to claim 1, the antitumor drug by mixing its aqueous suspension with the obtained suspension of mesoporous silicon nanoparticles in mass fractions from 1: 1 to 10: 1 in for a period of time from 1 to 5 hours at room temperature, further separation of the loaded nanoparticles by centrifugation and washing with water or saline, followed by drying in air at room temperature or in freeze drying to obtain a powder form of the drug. 5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве химиотерапевтического противоопухолевого препарата используют салиномицин при соотношении массы салиномицина к массе пористого кремния, находящегося в растворе, 2:1, перемешивание водных суспензий осуществляют в течение 1 часа при температуре 22°С на шейкере, центрифугирование - в течение 3 минут в режиме 5000 об/мин, с последующим трехкратным промыванием осадка деионизованной водой.5. The method according to p. 4, characterized in that salinomycin is used as a chemotherapeutic antitumor drug at a ratio of the mass of salinomycin to the mass of porous silicon in solution, 2: 1, the aqueous suspensions are mixed for 1 hour at a temperature of 22 ° C at shaker, centrifugation - for 3 minutes at 5000 rpm, followed by three times washing the precipitate with deionized water.
RU2018147070A 2018-12-27 2018-12-27 Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs RU2722745C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018147070A RU2722745C1 (en) 2018-12-27 2018-12-27 Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018147070A RU2722745C1 (en) 2018-12-27 2018-12-27 Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2722745C1 true RU2722745C1 (en) 2020-06-03

Family

ID=71067619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018147070A RU2722745C1 (en) 2018-12-27 2018-12-27 Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2722745C1 (en)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011073666A1 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Intrinsiq Materials Global Limited Porous silicon
CN102942184A (en) * 2012-12-06 2013-02-27 安徽工业大学 Method for preparing silicon nanotube by taking porous silicon as substrate
RU2504403C1 (en) * 2012-09-13 2014-01-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Method for preparing water suspension of biocompatible porous silicon particle
RU2553913C1 (en) * 2014-07-22 2015-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Method of producing porous ceramic biocompatible nanocarriers
RU2625722C1 (en) * 2016-01-19 2017-07-18 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Клеточные технологии" Silicon-organic niosemes with bactericidal and paramagnetic properties
EA201700214A1 (en) * 2014-11-20 2017-10-31 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС" METHOD FOR PRODUCING NANOPARTICLES NITRID BORON FOR DELIVERY OF ANTI-TUMOR PREPARATIONS

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011073666A1 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Intrinsiq Materials Global Limited Porous silicon
RU2504403C1 (en) * 2012-09-13 2014-01-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Method for preparing water suspension of biocompatible porous silicon particle
CN102942184A (en) * 2012-12-06 2013-02-27 安徽工业大学 Method for preparing silicon nanotube by taking porous silicon as substrate
RU2553913C1 (en) * 2014-07-22 2015-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Method of producing porous ceramic biocompatible nanocarriers
EA201700214A1 (en) * 2014-11-20 2017-10-31 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС" METHOD FOR PRODUCING NANOPARTICLES NITRID BORON FOR DELIVERY OF ANTI-TUMOR PREPARATIONS
RU2625722C1 (en) * 2016-01-19 2017-07-18 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Клеточные технологии" Silicon-organic niosemes with bactericidal and paramagnetic properties

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Гурин С.Ю. "Производство нанопорошков в планетарных мельницах" XVII Международная научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Современная техника и технологии" 18-22 апреля 2011 г., Томск, 301-302. О.И. Ксенофонтова и др. "Пористый кремний и его применение в биологии и медицине" Журнал *
Гурин С.Ю. "Производство нанопорошков в планетарных мельницах" XVII Международная научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Современная техника и технологии" 18-22 апреля 2011 г., Томск, 301-302. О.И. Ксенофонтова и др. "Пористый кремний и его применение в биологии и медицине" Журнал технической физики, т.84, вып. 1, 2014, 67-78. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Pnictogens in medicinal chemistry: evolution from erstwhile drugs to emerging layered photonic nanomedicine
Yu et al. Copper silicate hollow microspheres-incorporated scaffolds for chemo-photothermal therapy of melanoma and tissue healing
Sharifi et al. Mesoporous bioactive glasses in cancer diagnosis and therapy: stimuli‐responsive, toxicity, immunogenicity, and clinical translation
Llevot et al. Applications of vectorized gold nanoparticles to the diagnosis and therapy of cancer
Alshaer et al. Encapsulation of echinomycin in cyclodextrin inclusion complexes into liposomes: in vitro anti-proliferative and anti-invasive activity in glioblastoma
Bourbour et al. Evaluation of anti-cancer and anti-metastatic effects of folate-PEGylated niosomes for co-delivery of letrozole and ascorbic acid on breast cancer cells
CN102421418A (en) Hollow gold nanospheres (haunss) and haunss-loaded microspheres useful in drug delivery
US20140296836A1 (en) Gold-in-silicon nanoassembly for thermal therapy and methods of use
Campora et al. Recent developments and applications of smart nanoparticles in biomedicine
Fathi Karkan et al. Cisplatin-loaded superparamagnetic nanoparticles modified with PCL-PEG copolymers as a treatment of A549 lung cancer cells
Sun et al. Stimuli responsive PEGylated bismuth selenide hollow nanocapsules for fluorescence/CT imaging and light-driven multimodal tumor therapy
Goli et al. Preparation and evaluation of gemcitabin and cisplatin-entrapped Folate-PEGylated liposomes as targeting co-drug delivery system in cancer therapy
Alam et al. Improved efficacy of cisplatin in combination with a nano-formulation of pentacyclic triterpenediol
Irani et al. PVA/κ-carrageenan/Au/camptothecin/pegylated-polyurethane/paclitaxel nanofibers against lung cancer treatment
Yipel et al. Multifunctional materials for cancer therapy: from antitumoral agents to innovative administration
Zielińska et al. Mesoporous silica nanoparticles as drug delivery systems against melanoma
CN105233282B (en) A kind of multifunctional nano pharmaceutical composition and preparation method thereof
Subramanian et al. Overview on in vitro and in vivo investigations of nanocomposite based cancer diagnosis and therapeutics
Chen et al. Four ounces can move a thousand pounds: the enormous value of nanomaterials in tumor immunotherapy
Wang et al. Applications of metal–phenolic networks in nanomedicine: a review
Abdelgalil et al. Engineered sericin-tagged layered double hydroxides for combined delivery of pemetrexed and ZnO quantum dots as biocompatible cancer nanotheranostics
CN113456614A (en) PLGA-based particle size variable anti-tumor bionic nano preparation and preparation method and application thereof
CN113004536A (en) Metal-amino acid/peptide coordination polymer and application thereof
RU2722745C1 (en) Method of producing nanocontainers for chemotherapeutic anticancer drugs
Abdulbaqi Loading of clarithromycin and paclitaxel on prepared Cds/nio nanoparticles as promising nanocarriers

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in inventorship

Effective date: 20201002