RU2720672C1 - Method for assessing angiogenic potential of scaffolds - Google Patents
Method for assessing angiogenic potential of scaffolds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2720672C1 RU2720672C1 RU2019114410A RU2019114410A RU2720672C1 RU 2720672 C1 RU2720672 C1 RU 2720672C1 RU 2019114410 A RU2019114410 A RU 2019114410A RU 2019114410 A RU2019114410 A RU 2019114410A RU 2720672 C1 RU2720672 C1 RU 2720672C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vegf
- syndecan
- ratio
- angiogenic potential
- blood
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, биологии, ветеринарии, фармакологии и предназначено для количественной оценки способности биодеградируемых матриц (скаффолдов) к васкуляризации или их ангиогенного потенциала при имплантационных тестах на животных. The invention relates to medicine, biology, veterinary medicine, pharmacology, and is intended for the quantitative assessment of the ability of biodegradable matrices (scaffolds) to vascularize or their angiogenic potential in implantation tests in animals.
Согласно межгосударственному стандарту ISO оценка способности скаффолдов к васкуляризации при имплантационных тестах имеет большое значение в оценке биологического действия медицинских изделий. Ангиогенный потенциал напрямую определяет регенераторный потенциал скаффолдов, так как формирующееся сосудистое русло обеспечивает трофику заселяющих скаффолд клеточных элементов. Морфологическая верификация наличия в скаффолде сосудов через определенный период времени является единственным, рекомендованным действующим стандартом ГОСТ ISO 10993-6 - 2011, методом, позволяющим характеризовать ангиогенный потенциал биодеградируемых матриц [ГОСТ ISO 10993-6 – 2011]. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации /Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 6. Tests for local effects after implantation. Дата введения: 01.01.2013). Изготовление гистологических препаратов является крайне трудоемким процессом. При этом морфологическая оценка в стандартных окрасках затруднена в связи с тем, что визуализируются только хорошо перфузируемые сосуды. Идентифицировать капилляры возможно только в областях, где в них находятся эритроциты, что резко снижает точность оценки. Согласно ранее опубликованным данным с помощью морфологических методов оценки выявление признаков васкуляризации биодеградируемых матриц возможно с 14-х суток после имплантации под кожу белым крысам [Исследование биосовместимости матриц на основе поликапролактона и гидроксиапатита в условиях in vivo / А.Н. Иванов, M.Н. Козадаев, Н.В. Богомолова, О.В. Матвеева, Д.М. Пучиньян, И.А. Норкин, Ю.Е. Сальковский, Г.П. Любунь // Цитология. 2015. Т. 57, № 4. C. 286-293]. According to the interstate ISO standard, assessing the ability of scaffolds to vascularize during implant tests is of great importance in assessing the biological effects of medical devices. The angiogenic potential directly determines the regenerative potential of scaffolds, since the emerging vascular bed provides trophism of cellular elements that inhabit the scaffold. Morphological verification of the presence of vessels in a scaffold after a certain period of time is the only method recommended by the current standard GOST ISO 10993-6 - 2011, which allows characterizing the angiogenic potential of biodegradable matrices [GOST ISO 10993-6 - 2011]. Interstate standard. Medical Products. Assessment of the biological effects of medical devices. Part 6. Local studies after implantation / Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 6. Tests for local effects after implantation. Date of introduction: 01/01/2013). The manufacture of histological preparations is an extremely time-consuming process. Moreover, the morphological assessment in standard stains is difficult due to the fact that only well-perfused vessels are visualized. Capillaries can only be identified in areas where red blood cells are located in them, which sharply reduces the accuracy of the assessment. According to previously published data using morphological methods of assessment, the detection of signs of vascularization of biodegradable matrices is possible from the 14th day after implantation under the skin of white rats [Study of biocompatibility of matrices based on polycaprolactone and hydroxyapatite in vivo / A.N. Ivanov, M.N. Kozadaev, N.V. Bogomolova, O.V. Matveeva, D.M. Puchinyan, I.A. Norkin, Yu.E. Salkovsky, G.P. Lubun // Cytology. 2015. T. 57, No. 4. C. 286-293].
Известны модификации морфологической оценки интенсивности васкуляризации, в частности, за счет применения методов иммуногистохимии, что позволяет повысить точность оценки. Так, предложен способ определения удельной плотности сосудов при иммунохимическом исследовании ткани. Образец ткани подвергают исследованию с использованием моноклональных антител к CD34 ,выявляющих эндотелиальные клетки сосудов. Некоторое снижение трудоемкости достигается оцифровыванием всей площади среза исследуемой ткани и использованием автоматизированной системы анализа изображений. Рассчитывают отношение количества сосудов к площади исследуемой ткани-удельную плотность сосудов [патент RU на изобретение №2366951]. Однако, при реализации данного способа не устраняется необходимость приготовления гистологического препарата, а иммуногистохимическая техника его окрашивания только усложняет методику.Modifications of the morphological assessment of vascularization intensity are known, in particular, due to the application of immunohistochemistry methods, which allows to increase the accuracy of the assessment. Thus, a method is proposed for determining the specific density of blood vessels in an immunochemical study of tissue. A tissue sample was tested using monoclonal antibodies to CD34, detecting vascular endothelial cells. A certain decrease in the complexity is achieved by digitizing the entire cut-off area of the tissue under study and using an automated image analysis system. Calculate the ratio of the number of vessels to the area of the investigated tissue-specific density of blood vessels [patent RU for invention No. 2366951]. However, when implementing this method, the need to prepare a histological preparation is not eliminated, and the immunohistochemical technique of staining it only complicates the technique.
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ оценки интенсивности ангиогенеза у животных при имплантационных тестах биодеградируемых скаффолдов [Особенности процесса регенерации костной ткани у крыс при имплантации скаффолда, минерализованного ватеритом, с адсорбированной таниновой кислотой/ А.Н. Иванов, М.С. Савельева, М.О. Куртукова, С.В. Кустодов, Е.В. Гладкова, В.В. Блинникова, И.В. Бабушкина, Б.В. Парахонский, В.Ю. Ульянов, И.А. Норкин// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. Т. 167. № 2. С. 236-239), основанный на определении концентрации в кровотоке фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Однако, было обнаружено, что имплантация небиосовместимых матриц также индуцирует повышение уровня VEGF, которое не приводит к васкуляризации такой матрицы, а направлено на формирование барьера грануляционной ткани и отграничение скаффолда. Следовательно, сам по себе уровень VEGF в сыворотке крови не может являться критерием для оценки ангиогенного потенциала скаффолдов при имплантационных тестах на животных. Для адекватной количественной характеристики ангиогенного потенциала путем определения концентрации VEGF необходимо верифицировать направление ангиогенных процессов при помощи морфологических методов исследования.The closest analogue to the claimed invention is a method for assessing the intensity of angiogenesis in animals during implantation tests of biodegradable scaffolds [Features of the bone tissue regeneration process in rats after implantation of a scaffold mineralized with vaterite with adsorbed tannic acid / A.N. Ivanov, M.S. Savelyeva, M.O. Kurtukova, S.V. Kustodov, E.V. Gladkova, V.V. Blinnikova, I.V. Babushkina, B.V. Parakhonsky, V.Yu. Ulyanov, I.A. Norkin // Bulletin of experimental biology and medicine. 2019.V. 167. No. 2. P. 236-239), based on the determination of the concentration in the bloodstream of vascular endothelial growth factor (VEGF) using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, it was found that implantation of non-biocompatible matrices also induces an increase in the level of VEGF, which does not lead to vascularization of such a matrix, but is aimed at forming a granulation tissue barrier and scaffold delimitation. Therefore, serum VEGF alone cannot be a criterion for assessing the angiogenic potential of scaffolds in implantation tests in animals. For an adequate quantitative characterization of the angiogenic potential by determining the concentration of VEGF, it is necessary to verify the direction of angiogenic processes using morphological research methods.
Задачей заявляемого изобретения является модернизация методологии количественной биохимической оценки ангиогенного потенциала биодеградируемых скаффолдов на ранних сроках субкутанных имплантационных тестов на животных для повышения ее точности и снижения трудоемкости. The task of the invention is to modernize the methodology of quantitative biochemical assessment of the angiogenic potential of biodegradable scaffolds in the early stages of subcutaneous implantation tests in animals to increase its accuracy and reduce labor intensity.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки ангиогенного потенциала скаффолдов, включающем имплантацию скаффолда в форме диска под кожу крысам, после чего под наркозом выполняют забор крови в объеме 3-5 мл, кровь центрифугируют для получения сыворотки, в которой определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF), забор крови производят через 7 суток после имплантации, дополнительно в сыворотке крови определяют концентрацию синдекана-1, рассчитывают соотношение VEGF и синдекана-1, для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных, если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, то матрицы не обладают ангиогенным потенциалом, если соотношение больше 2, то выраженность ангиогенного потенциала оценивается прямо пропорционально нормированной величине указанного соотношения. The essence of the claimed invention lies in the fact that in the method for assessing the angiogenic potential of scaffolds, including implantation of a scaffold in the form of a disk under the skin of rats, then under anesthesia blood sampling is performed in a volume of 3-5 ml, the blood is centrifuged to obtain a serum in which the concentration of the factor is determined the growth of vascular endothelium-A (VEGF), blood sampling is performed 7 days after implantation, in addition, the concentration of syndecan-1 is determined in the blood serum, the ratio of VEGF and syndecan-1 is calculated, to normalize the ratio of the concentrations of VEGF and syndecan-1 it is multiplied by a correction coefficient K, defined as the ratio of the median values of the concentrations of syndecan-1 and VEGF in intact animals, if the normalized ratio of the concentrations of VEGF and syndecan-1 does not exceed 2, then the matrices do not have an angiogenic potential, if the ratio is greater than 2, then the severity of the angiogenic potential is directly estimated in proportion to the normalized value the specified ratio.
Технический результат заявляемого изобретения.The technical result of the claimed invention.
Использование комбинации концентрации маркеров индукции ангиогенеза и стабильности эндотелиального гликокаликса при реализации данного способа, позволяет охарактеризовать интенсивность и направление структурного ремоделирование микроциркуляторного русла за счет чего достигается повышение точности оценки ангиогенного потенциала биодеградируемого скаффолда на ранних сроках подкожного имплантационного теста. Using a combination of the concentration of markers of the induction of angiogenesis and the stability of endothelial glycocalyx during the implementation of this method allows us to characterize the intensity and direction of the structural remodeling of the microvasculature, thereby improving the accuracy of assessing the angiogenic potential of a biodegradable scaffold in the early stages of a subcutaneous implantation test.
Проведение оценки ангиогенного потенциала с помощью заявляемого способа, не требует верификации биохимических данных путем приготовления морфологических препаратов, что позволяет добиться сокращения сроков исследования до 7 суток и снизить трудоемкость. Assessment of the angiogenic potential using the proposed method does not require verification of biochemical data by preparing morphological preparations, which allows to reduce the study time to 7 days and reduce the complexity.
Сохранение дублей аликвот сыворотки в условиях морозильной камеры дополнительно обеспечивает возможность контроля воспроизводимости и точности результатов биохимических исследований при сравнении различных скаффолдов. Preservation of duplicates of serum aliquots in a freezer additionally provides the ability to control the reproducibility and accuracy of the results of biochemical studies when comparing various scaffolds.
Нормирование результатов измерения концентраций маркеров ангиогенного потенциала посредством поправочного коэффициента позволяет добиться универсальности данного метода с возможностью использования реагентов различных производителей, а также разных линий животных. Сохранение дублей аликвот сыворотки в условиях морозильной камеры дополнительно обеспечивает возможность контроля воспроизводимости и точности результатов биохимических исследований при использовании различных реагентов, пород белых крыс, а также изучаемых скаффолдов.Normalization of the results of measuring the concentrations of markers of angiogenic potential by means of a correction coefficient allows achieving the universality of this method with the possibility of using reagents from different manufacturers, as well as different animal lines. Preservation of duplicates of serum aliquots in a freezer additionally provides the ability to control the reproducibility and accuracy of the results of biochemical studies using various reagents, white rat breeds, and scaffolds under study.
Способ оценки ангиогенного потенциала скаффолдов используют следующим образом.A method for assessing the angiogenic potential of scaffolds is used as follows.
Белым крысам выполняют имплантацию скаффолда в форме диска под кожу крысам. Согласно действующему стандарту ГОСТ ISO 10993-6 – 2011 образцы имплантируют в виде дисков (пластин) диаметром от 10 до 12 мм и толщиной от 0,3 до 1 мм. Через 7 суток после имплантации под наркозом выполняют забор крови в объеме 3-5 мл в пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем путем пункции правых отделов сердца; кровь центрифугируют для получения сыворотки (возможно хранение аликвот сыворотки крови при температуре -20 С). Определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов-А (VEGF) и синдекана-1 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов видоспецифических реагентов на микропланшентном спектрфотометре. Рассчитывают соотношение концентраций VEGF и синдекана-1. Для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных. Если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, то матрицы не обладают ангиогенным потенциалом. Если соотношение больше 2, то выраженность ангиогенного потенциала оценивается прямо пропорционально нормированной величине указанного соотношения.White rats are implanted with a scaffold in the form of a disk under the skin of rats. According to the current standard GOST ISO 10993-6 - 2011, samples are implanted in the form of disks (plates) with a diameter of 10 to 12 mm and a thickness of 0.3 to 1 mm. 7 days after implantation under anesthesia, blood sampling in a volume of 3-5 ml is performed in test tubes with a coagulation activator and a separation gel by puncture of the right heart; the blood is centrifuged to obtain serum (it is possible to store aliquots of blood serum at a temperature of -20 ° C). Determine the concentration of vascular endothelial growth factor-A (VEGF) and syndecan-1 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using sets of species-specific reagents on a microplate spectrophotometer. Calculate the ratio of the concentrations of VEGF and syndecan-1. To normalize the ratio of the concentrations of VEGF and syndecan-1, it is multiplied by a correction factor K, defined as the ratio of the median values of the concentrations of syndecan-1 and VEGF in intact animals. If the normalized ratio of the concentrations of VEGF and syndecan-1 does not exceed 2, then the matrices do not have angiogenic potential. If the ratio is greater than 2, then the severity of the angiogenic potential is estimated directly proportional to the normalized value of the specified ratio.
Пример 1Example 1
Заявляемый способ был апробирован при оценки ангиогенного потенциала скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита на 44 лабораторных белых крысах-самцах массой 200-250 г. Животные были разделены на 3 группы: 1-я группа включала 8 интактных крыс, 2-я группа – 18 крыс, которым проводилась имплантация в рану скаффолда на основе поликапролактона с адсорбированным на нем чужеродным белком (отрицательный контроль – скаффолд, не обладающий биосовместимостью), 3-я группа – 18 крыс, которым проводилась подкожная имплантация скаффолда из поликапролактона и ватерита. Забор крови у 8 крыс 2-й и 8 крыс 3-й групп осуществлялся на 7-й день эксперимента. Морфологическая верификация васкуляризации скаффолдов осуществлялась в соответствии с требованиями стандарта ГОСТ ISO 10993-6 – 2011 при исследовании гистологического материала, полученного от 10 крыс из 2-й и 10 крыс их 3-й групп, выведенных из эксперимента на 21 после имплантации матриц. The inventive method was tested in assessing the angiogenic potential of scaffolds based on polycaprolactone and vaterite on 44 laboratory white male rats weighing 200-250 g. Animals were divided into 3 groups: group 1 included 8 intact rats, group 2 - 18 rats that implanted a polycaprolactone-based scaffold into a wound with a foreign protein adsorbed on it (a negative control was a biocompatible scaffold), group 3 consisted of 18 rats that underwent subcutaneous implantation of a polycaprolactone and vaterite scaffold. Blood sampling in 8 rats of the 2nd and 8 rats of the 3rd group was carried out on the 7th day of the experiment. Morphological verification of vascularization of scaffolds was carried out in accordance with the requirements of the standard GOST ISO 10993-6 - 2011 when examining histological material obtained from 10 rats from the 2nd and 10 rats of their 3rd groups, which were removed from the experiment by 21 after matrix implantation.
При проведении экспериментов на животных соблюдались этические принципы в соответствии с Женевской конвенцией (Geneva, 1990). Всем животным за 5 минут до проведения манипуляций вводилась внутримышечно комбинация золетила («Virbac Sante Animale», Франция) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг для достижения наркоза. When conducting animal experiments, ethical principles were observed in accordance with the Geneva Convention (Geneva, 1990). For all animals, 5 minutes prior to the manipulation, a combination of zoletil (Virbac Sante Animale, France) at a dose of 0.1 ml / kg and xylazine (Interchemie, Netherlands) at a dose of 1 mg / kg was administered intramuscularly to achieve anesthesia.
Во второй и третьей группах белым крысам в межлопаточной области (в области холки) проводилась подкожная имплантация скаффолда в форме диска диаметром 10 мм, толщиной 1 мм.In the second and third groups, white rats in the interscapular region (in the withers area) underwent subcutaneous implantation of a scaffold in the form of a disk with a diameter of 10 mm and a thickness of 1 mm.
Кровь забирали в объеме 5 мл в пробирки Vacuettе с активатором свертывания и разделительным гелем. Сыворотку крови получали путем центрифугирования 3000 об/мин. Аликвоты сыворотки крови замораживали и хранили при температуре -20°С.Blood was collected in a volume of 5 ml in Vacuett tubes with coagulation activator and separation gel. Blood serum was obtained by centrifugation at 3000 rpm. Aliquots of blood serum were frozen and stored at a temperature of -20 ° C.
Для оценки механизмов регуляции ангиогенеза проводилось определение концентрации VEGF в сыворотке крови экспериментальных животных методом ИФА с использованием набора реактивов Rat VEGF Immunoassay (R&D Systems, США). Для оценки стабильности микрососудистого русла оценивали концентрацию фрагментов гликокаликса эндотелиальных клеток – растворимых форм синдекана-1 в сыворотке крови методом ИФА с использованием наборов реагентов «ELISA Kit For Syndecan 1 Rat» (Cloud-Clone Corp., США). ИФА реализован в точном соответствии с инструкциями производителей реагентов на микропланшентном спектрфотометре Anthos 2020 (Biochrom, Великобритания). To assess the mechanisms of regulation of angiogenesis, the concentration of VEGF in the blood serum of experimental animals was determined by ELISA using the Rat VEGF Immunoassay reagent kit (R&D Systems, USA). To assess the stability of the microvascular bed, the concentration of glycocalyx fragments of endothelial cells — soluble forms of syndecan-1 in serum — was measured by ELISA using ELISA Kit For Syndecan 1 Rat reagents (Cloud-Clone Corp., USA). ELISA was implemented in strict accordance with the instructions of the reagent manufacturers on the Anthos 2020 microplate spectrophotometer (Biochrom, UK).
При использовании наборов реагентов Rat VEGF Immunoassay (R&D Systems, США) и ELISA Kit For Syndecan 1 Rat (Cloud-Clone Corp., США) концентрация в сыворотке крови VEGF у 8 интактных животных составила 9,4 (7,3;15,7) пг/мл, а концентрация синдекана-1 1,11 (0,82;1,51). Поправочный коэффициент определен как частное от деления медиан концентраций синдекана-1 и VEGF в сыворотке крови: К=1,11/9,4=0,12.Using Rat VEGF Immunoassay reagent kits (R&D Systems, USA) and ELISA Kit For Syndecan 1 Rat (Cloud-Clone Corp., USA), the concentration of VEGF in the blood serum of 8 intact animals was 9.4 (7.3; 15.7 ) pg / ml, and the concentration of syndecan-1 is 1.11 (0.82; 1.51). The correction factor is defined as the quotient of the division of median concentrations of syndecan-1 and VEGF in blood serum: K = 1.11 / 9.4 = 0.12.
Для верификации использовались морфологические методы оценки состояния мягких тканей области имплантации на 21-е сутки. После выведения животных из эксперимента путем передозировки препаратов для наркоза забирали материал для морфологического исследования. Для этого скаффолд с окружающими тканями извлекали единым блоком. Материал для исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах. После чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли среду Bio-Monht («BioOptica», Италия). For verification, morphological methods were used to assess the condition of the soft tissues of the implantation area on the 21st day. After removing animals from the experiment by overdose of drugs for anesthesia, material was taken for morphological studies. For this, a scaffold with surrounding tissues was removed in a single block. The material for the study was fixed in a 10% solution of neutral formalin (LLC Biovitrum, Russia), dehydrated in alcohols. Then it was poured into paraffin. Sections 5-7 μm thick were stained with Mayer hematoxylin (Biovitrum LLC, Russia) and eosin (Biovitrum LLC, Russia). Bio-Monht medium (BioOptica, Italy) was used to cover sections.
Препараты исследовали при помощи микроскопа AxioImager Z2 (CarlZeiss, Германия) и микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФО-ТОНИКА», Россия). На гистологических препаратах выявляли локальные признаки воспалительной реакции: отек, гиперемия, инфильтрация скаффолда иммунокомпетентными клетками. Проводили морфометрический подсчет количества клеток каждой клеточной популяции: фибробластов, фиброцитов, полиморфоядерных лейкоцитов (нейтрофилов и эозинофилов), лимфоцитов, и макрофагов в пяти полях зрения скаффолда при увеличении объектива 63х. Качественно определяли наличия сосудов в скаффолде.The preparations were examined using an AxioImager Z2 microscope (CarlZeiss, Germany) and a transmitted light microvisor of the μVizo-103 series (LOMO FO-TONIKA LLC, Russia). On histological preparations, local signs of an inflammatory reaction were revealed: edema, hyperemia, scaffold infiltration by immunocompetent cells. Morphometric counts were made of the number of cells in each cell population: fibroblasts, fibrocytes, polymorphonuclear leukocytes (neutrophils and eosinophils), lymphocytes, and macrophages in five scaffold fields of view with a 63x magnification. Qualitatively determined the presence of vessels in the scaffold.
Статистическую обработку данных осуществляли средствами программ MS Excel 2013 и Statistica 10.0. Большинство полученных данных имели распределение отличное от нормального, поэтому при статистической обработке вычислялись медианна, верхний и нижний квартили, а для сравнения групп использовали U-критерий Мана-Уитни, на основании которого рассчитывался показатель достоверности р. Для оценки взаимосвязи рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена и показатель достоверности р. Различия считали значимыми при р < 0,05.Statistical data processing was carried out using MS Excel 2013 and Statistica 10.0. Most of the obtained data had a different distribution than normal, therefore, the statistical processing calculated the median, upper and lower quartiles, and for comparison of the groups, the Man-Whitney U-test was used, based on which the confidence indicator p was calculated. To assess the relationship, the Spearman correlation coefficient and confidence indicator p were calculated. Differences were considered significant at p <0.05.
У крыс группы отрицательного контроля на 7-е сутки после имплантации матриц, не обладающих биосовместимостью, концентрации VEGF в сыворотке крови в 3,3 раза выше, чем у интактных животных группы контроля (табл. 1). При этом на 7-е сутки эксперимента у крыс группы отрицательного контроля в два раза по сравнению с контролем увеличена концентрация в сыворотке крови синдекана-1, что свидетельствует о его интенсивном отщеплении с поверхности эндотелиальных клеток.In rats of the negative control group, on the 7th day after implantation of matrices lacking biocompatibility, the concentration of VEGF in blood serum is 3.3 times higher than in intact animals of the control group (Table 1). Moreover, on the 7th day of the experiment in rats of the negative control group, the concentration in the blood serum of syndecan-1 was doubled compared to the control, which indicates its intense cleavage from the surface of endothelial cells.
На 7-е сутки эксперимента у животных группы отрицательного контроля соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 варьирует от 7,77 до 16,73 составляя в среднем 12,5 (10,7;15), что статистически значимо превышает значения контроля. Нормированная величина данного соотношения у животных группы отрицательного контроля изменялась в пределах от 0,93 до 2,0 составляя в среднем 1,5 (1,3;1,8), что также значимо выше, чем у крыс контрольной группы (табл. 1).On the 7th day of the experiment in animals of the negative control group, the ratio of serum concentrations of VEGF and syndecan-1 varies from 7.77 to 16.73, averaging 12.5 (10.7; 15), which is statistically significantly higher than the control value . The normalized value of this ratio in animals of the negative control group varied from 0.93 to 2.0, averaging 1.5 (1.3; 1.8), which is also significantly higher than in rats of the control group (Table 1 )
Таблица 1Table 1
Концентрация VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови у экспериментальных животных на 7-е сутки после имплантации матриц с чужеродным белком в сравнении с интактными крысами группы контроляThe concentration of VEGF and Sindecan-1 in blood serum in experimental animals on the 7th day after implantation of matrices with a foreign protein in comparison with intact rats of the control group
ГруппыIndicators
Groups
Синдекан-1 VEGF
Sindecan-1
Синдекан-1 K x VEGF
Sindecan-1
(n=8)Control: intact animals
(n = 8)
(n=8)Negative control: polycaprolactone with foreign protein
(n = 8)
р=0,00340530.8 (26.1; 34.4)
p = 0.003405
р=0,0013482.31 (1.91; 2.67)
p = 0.001348
р=0,01242012.5 (10.7; 15)
p = 0.012420
р=0,0124201.5 (1.3; 1.8)
p = 0.012420
Примечание – в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. Р - по сравнению с животными группы контроля.Note - in each case the median, lower and upper quartiles are given. P - in comparison with animals of the control group.
При морфологической верификации ангиогенного потенциала и параметров воспалительной реакции в соответствии с рекомендациями стандарта ГОСТ ISO 10993-6—2011 на 21-е сутки после имплантации матрицы с чужеродным белком у 10 животных группы отрицательного контроля вокруг скаффолда обнаружен соединительнотканный барьер, инфильтрированный лейкоцитами, отек тканей перифокальной области, а также полнокровие сосудов артериального и венозного русла в этой зоне. Количество фибробластов и фиброцитов в 5 полях зрения матрицы, не обладающей биосовместимостью, при увеличении объектива 63х в среднем по группе достигало соответственно 5 (1;12) и 2 (0;6), что составляло 19 и 7% клеток скаффолда, характеризуя слабо выраженное заселение матрицы элементами фибробластического ряда (низкий регенераторный потенциал). В поликапролактоновых скаффолдах с адсорбированным чужеродным белком наблюдалось преобладание полиморфных лейкоцитов (в основном нейтрофилов), число которых достигало в среднем по группе 13 (5;16) в 5 полях зрения при увеличении объектива 63х, что составляло около 48% от общего числа клеток. Определялись лимфоциты и макрофаги, число которых достигало в среднем 3 (2;3) и 4 (2;6) в 5 полях зрения при увеличении объектива 63х, что составляло 11% и 15% клеток скаффолда с адсорбированным чужеродным белком. В совокупности 74% клеток матрицы у животных группы отрицательного контроля представлены различными разновидностями лейкоцитов, что характеризует воспалительную инфильтрацию матрицы и отсутствие ее биосовместимости. Признаков васкуляризации скаффолдов с адсорбированным чужеродным белком не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии ангиогенного потенциала данного типа матриц.During morphological verification of the angiogenic potential and inflammatory response parameters in accordance with the recommendations of GOST ISO 10993-6—2011 on the 21st day after implantation of a matrix with a foreign protein in 10 animals of the negative control group, a connective tissue barrier infiltrated by leukocytes, edema of peripheral tissues was found around the scaffold areas, as well as plethora of vessels of the arterial and venous channels in this zone. The number of fibroblasts and fibrocytes in 5 fields of view of a matrix that does not have biocompatibility, with an increase in the lens of 63x, on average in the group reached 5 (1; 12) and 2 (0; 6), respectively, which amounted to 19 and 7% of the scaffold cells, characterizing a weakly expressed population of the matrix with elements of the fibroblastic series (low regenerative potential). In polycaprolactone scaffolds with an adsorbed foreign protein, a predominance of polymorphic leukocytes (mainly neutrophils) was observed, the number of which reached an average of 13 (5; 16) in 5 fields of view with an increase in the lens of 63x, which amounted to about 48% of the total number of cells. Lymphocytes and macrophages were determined, the number of which reached an average of 3 (2; 3) and 4 (2; 6) in 5 fields of view with an increase in the lens of 63x, which amounted to 11% and 15% of scaffold cells with an adsorbed foreign protein. In total, 74% of the matrix cells in animals of the negative control group are represented by various types of leukocytes, which characterizes the inflammatory infiltration of the matrix and the absence of its biocompatibility. No signs of vascularization of scaffolds with an adsorbed foreign protein were found, which indicates the absence of angiogenic potential of this type of matrix.
Таким образом, соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 от 7,77 до 16,73 и его нормированная величина от 0,93 до 2,0 на 7-е сутки после имплантации скаффолда соответствуют отсутствию васкуляризации матриц, то есть отсутствию у них ангиогенного потенциала. Thus, the ratio of serum concentrations of VEGF and syndecan-1 from 7.77 to 16.73 and its normalized value from 0.93 to 2.0 on the 7th day after implantation of the scaffold correspond to the absence of matrix vascularization, i.e., the absence of them angiogenic potential.
Пример 2Example 2
У животных опытной группы на 7-е сутки после имплантации скаффолдов из поликапролактона и ватерита концентрация VEGF в сыворотке крови значимо выше, чем у крыс групп контроля и отрицательного контроля в 5,3 и 1,6 раза соответственно. При этом в отличие от животных группы отрицательного контроля у крыс опытной группы не отмечается значимого увеличения концентрации синдекана-1 в сыворотке крови, что свидетельствует об отсутствии признаков повреждения гликокаликса эндотелиоцитов (табл. 2). In animals of the experimental group, on the 7th day after implantation of scaffolds from polycaprolactone and vaterite, the concentration of VEGF in the blood serum is significantly higher than in rats of the control and negative control groups by 5.3 and 1.6 times, respectively. Moreover, in contrast to animals of the negative control group, in rats of the experimental group, there was no significant increase in the concentration of syndecan-1 in the blood serum, which indicates the absence of signs of damage to the endothelial cell glycocalyx (Table 2).
На 7-е сутки эксперимента у животных опытной группы соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 варьирует от 20,1 до 57,5 составляя в среднем 30,1 (24,9; 55,8), что статистически значимо превышает как значения контроля, так и отрицательного контроля. Нормированная величина данного соотношения у животных опытной группы варьировала от 2,41 до 6,9 составляя в среднем 3,6 (3;6,7), что также значимо выше, чем у крыс контрольной группы и группы отрицательного контроля (табл. 2).On the 7th day of the experiment in animals of the experimental group, the ratio of serum concentrations of VEGF and syndecan-1 varies from 20.1 to 57.5 averaging 30.1 (24.9; 55.8), which is statistically significantly higher than values of control and negative control. The normalized value of this ratio in animals of the experimental group ranged from 2.41 to 6.9, averaging 3.6 (3; 6.7), which is also significantly higher than in rats of the control group and the negative control group (Table 2) .
Таблица 2table 2
Концентрация VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови у животных опытной группы на 7-е сутки после имплантации матриц в сравнении с крысами группы отрицательного контроляThe concentration of VEGF and Sindecan-1 in blood serum in animals of the experimental group on the 7th day after implantation of the matrices in comparison with rats of the negative control group
ГруппыIndicators
Groups
Синдекан-1 VEGF
Sindecan-1
Синдекан-1 K x VEGF
Sindecan-1
(n=8)Negative control: polycaprolactone with foreign protein
(n = 8)
(n=8)Experimental group: polycaprolactone mineralized with laterite
(n = 8)
р1=0,002165
р2=0,03832050.02 (32.34; 66.2)
p 1 = 0.002165
p 2 = 0,038320
р1=0,344563
р2=0,0116581.31 (1.11; 1.78)
p 1 = 0.344563
p 2 = 0.011658
р1=0,002165
р2=0,00340530.1 (24.9; 55.8)
p 1 = 0.002165
p 2 = 0.003405
р1=0,002165
р2=0,0034053.6 (3; 6.7)
p 1 = 0.002165
p 2 = 0.003405
Примечание – в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. р1 - по сравнению с животными группы контроля; р2 – по сравнению животными группы отрицательного контроля.Note - in each case, the median, lower and upper quartiles are given. p 1 - compared with animals of the control group; p 2 - compared with animals of the negative control group.
При морфологической верификации ангиогенного потенциала и параметров воспалительной реакции в соответствии с рекомендациями стандарта ГОСТ ISO 10993-6—2011 на 21-е сутки после имплантации поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, у животных опытной в перифокальной зоне, отмечено преимущественно умеренное кровенаполнение сосудов как артериального, так и венозного русла. Отеков, лейкоцитарной инфильтрации признаков формирования отграничивающего барьера вокруг поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, не выявлено. На 21-е сутки после имплантации поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, заселяются фибробластическими элементами и васкуляризуются. Количество фибробластов и фиброцитов в поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом, в 2,5 раза больше, чем в матрицах, не обладающих биосовместимостью (табл. 3). Доля этих клеточных популяций в поликапролактоновых скаффолдах, минерализованных ватеритом, достигала в среднем по группе 34% и 60% от общего числа клеток соответственно, что отражает высокий регенераторный потенциал. Количество фибробластических элементов матрицы прямо коррелировало с величиной нормированного соотношения VEGF и Синдекана-1 в сыворотке крови, что подтверждает прямую зависимость регенераторного потенциала от величины указанного соотношения. Количество лейкоцитов в поликапролактоновых скаффолдах, минерализованных ватеритом, в 1,5-2 раза ниже, чем в матрицах, не обладающих биосовместимостью, у крыс группы отрицательного контроля (табл. 3).During morphological verification of the angiogenic potential and parameters of the inflammatory response in accordance with the recommendations of the standard GOST ISO 10993-6—2011 on the 21st day after implantation of polycaprolactone scaffolds mineralized with vaterite in animals tested in the perifocal zone, mainly moderate blood vessels in both arterial and and venous bed. Edema, leukocyte infiltration of signs of the formation of a delimiting barrier around polycaprolactone scaffolds mineralized with vaterite were not detected. On the 21st day after implantation of polycaprolactone scaffolds mineralized with vaterite, they are populated by fibroblastic elements and are vascularized. The number of fibroblasts and fibrocytes in polycaprolactone scaffolds mineralized with vaterite is 2.5 times greater than in matrices that do not have biocompatibility (Table 3). The share of these cell populations in polycaprolactone scaffolds mineralized with vaterite reached an average of 34% and 60% of the total number of cells in the group, respectively, which reflects a high regenerative potential. The number of fibroblastic elements of the matrix directly correlated with the normalized ratio of VEGF and Sindecan-1 in blood serum, which confirms the direct dependence of the regenerative potential on the value of this ratio. The number of leukocytes in polycaprolactone scaffolds mineralized with vaterite is 1.5–2 times lower than in matrices lacking biocompatibility in rats of the negative control group (Table 3).
Таким образом, соотношение концентраций в сыворотке крови VEGF и синдекана-1 выше 16,73 и его нормированная величина выше 2 на 7-е сутки после имплантации скаффолда соответствуют эффективной васкуляризации и заселению клеточными элементами, что характеризует высокий ангиогенный потенциал матриц из поликапролактона и ватерита.Thus, the ratio of serum concentrations of VEGF and syndecan-1 is higher than 16.73 and its normalized value is higher than 2 on the 7th day after scaffold implantation corresponds to effective vascularization and population with cellular elements, which characterizes the high angiogenic potential of polycaprolactone and vaterite matrices.
Таблица 3 Table 3
Клеточные популяции поликапролактоновых скафолдов с ватеритом в сравнении с матрицами с адсорбированным чужеродным белкомCellular populations of polycaprolactone scaffolds with vaterite in comparison with matrices with adsorbed foreign protein
Среднее число клеток
в 5 полях зренияGroups of animals
The average number of cells
in 5 fields of view
с чужеродным белком
(n=10)Negative Control: Polycaprolactone
with alien protein
(n = 10)
(n=10)Experimental group: polycaprolactone mineralized with laterite
(n = 10)
р=0,00000238 (21; 47)
p = 0.000002
р=0,00000222 (13; 32)
p = 0.000002
р=0,0000050 (0; 1)
p = 0.000005
р=0,6253752 (0; 4)
p = 0.625375
р=0,0379992 (0; 4)
p = 0.037999
Примечание – в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; р – статистическая значимость различий между группами.Note - in each case the median, upper and lower quartiles are given; p is the statistical significance of differences between groups.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019114410A RU2720672C1 (en) | 2019-05-13 | 2019-05-13 | Method for assessing angiogenic potential of scaffolds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019114410A RU2720672C1 (en) | 2019-05-13 | 2019-05-13 | Method for assessing angiogenic potential of scaffolds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2720672C1 true RU2720672C1 (en) | 2020-05-12 |
Family
ID=70735342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019114410A RU2720672C1 (en) | 2019-05-13 | 2019-05-13 | Method for assessing angiogenic potential of scaffolds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2720672C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11143659B2 (en) | 2015-01-27 | 2021-10-12 | Arterez, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2366951C1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-09-10 | ФГУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Vascularity degree estimation method |
| RU2548801C2 (en) * | 2011-12-06 | 2015-04-20 | Российская Федерация ,от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации,RU | Method of estimating angiogenic potential of progenotor cells in patients with cardiovascular diseases |
| RU2571232C1 (en) * | 2014-12-16 | 2015-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СарНИИТО" Минздрава России) | Method of assessment of biocompatibility of scaffolds |
-
2019
- 2019-05-13 RU RU2019114410A patent/RU2720672C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2366951C1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-09-10 | ФГУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Vascularity degree estimation method |
| RU2548801C2 (en) * | 2011-12-06 | 2015-04-20 | Российская Федерация ,от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации,RU | Method of estimating angiogenic potential of progenotor cells in patients with cardiovascular diseases |
| RU2571232C1 (en) * | 2014-12-16 | 2015-12-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СарНИИТО" Минздрава России) | Method of assessment of biocompatibility of scaffolds |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HU Y. et al. Development of collagen/polydopamine complexed matrix as mechanically enhanced and highly biocompatible semi-natural tissue engineering scaffold. Acta Biomater. 2017, 47, p.135-148. * |
| NGUYEN B.B. et al. Collagen hydrogel scaffold promotes mesenchymal stem cell and endothelial cell coculture for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2017, 105(4), p.1123-1131. * |
| ИВАНОВ А.Н. и др. Особенности процесса регенерации костной ткани у крыс при имплантации скаффолда, минерализованного ватеритом, с адсорбированной таниновой кислотой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019, 167(2), стр.236-239. * |
| ИВАНОВ А.Н. и др. Особенности процесса регенерации костной ткани у крыс при имплантации скаффолда, минерализованного ватеритом, с адсорбированной таниновой кислотой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019, 167(2), стр.236-239. NGUYEN B.B. et al. Collagen hydrogel scaffold promotes mesenchymal stem cell and endothelial cell coculture for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2017, 105(4), p.1123-1131. HU Y. et al. Development of collagen/polydopamine complexed matrix as mechanically enhanced and highly biocompatible semi-natural tissue engineering scaffold. Acta Biomater. 2017, 47, p.135-148. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11143659B2 (en) | 2015-01-27 | 2021-10-12 | Arterez, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
| US11821905B2 (en) | 2015-01-27 | 2023-11-21 | Arterez, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lügering et al. | Immunohistochemical distribution and serum levels of the Ca2+-binding proteins MRP8, MRP14 and their heterodimeric form MRP8/14 in Crohn’s disease | |
| Scollay et al. | Thymus cell migration: quantitative aspects of cellular traffic from the thymus to the periphery in mice | |
| Smith et al. | Alternative activation of macrophages in rhesus macaques (Macaca mulatta) with endometriosis | |
| Miller et al. | Chorioamnionitis stimulates angiogenesis in saccular stage fetal lungs via CC chemokines | |
| Coupes et al. | TRANSFORMING GROWTH FACTOR β1 IN RENAL ALLOGRAFT RECIPIENTS1 | |
| Tsokos | Postmortem diagnosis of sepsis | |
| Walraven et al. | Transforming growth factor-β (TGF-β) signaling in healthy human fetal skin: A descriptive study | |
| Yagi et al. | Immunohistochemical detection of CD14 and combined assessment with CD32B and CD68 for wound age estimation | |
| Sun et al. | Characterization of cellular senescence in doxorubicin-induced aging mice | |
| RU2720672C1 (en) | Method for assessing angiogenic potential of scaffolds | |
| Fraga et al. | Immunohistochemical profile of HIF-1α, VEGF-A, VEGFR2 and MMP9 proteins in tegumentary leishmaniasis | |
| Tessier et al. | Characterization of immune cells and cytokine localization in the rat utero-placental unit mid-to late gestation | |
| Li et al. | Critical role of FPR1 in splenocyte migration into brain to worsen inflammation and ischemic brain injury in mice | |
| RU2714461C1 (en) | Method for assessing of scaffolds biocompatibility | |
| Sawada et al. | Clinical utility of decorin in follicular fluid as a biomarker of oocyte potential | |
| US20240036061A1 (en) | Methods for the diagnosis and treatment of endometriosis | |
| KR101875788B1 (en) | Biomarker for diagnosing neuroinflammation and use thereof | |
| Jóźwiak et al. | Tuberin and hamartin expression is reduced in the majority of subependymal giant cell astrocytomas in tuberous sclerosis complex consistent with a two-hit model of pathogenesis | |
| US20190100802A1 (en) | Marker for predicting pressure ulcer development and use thereof | |
| US5780244A (en) | Changes in laminin subunit composition are diagnostic of Fukuyama congenital muscular dystrophy | |
| EP3717912A1 (en) | Methods and materials for assessing biological age and slowing the progress of excessive biological aging | |
| Yasui et al. | Epithelial-mesenchymal transition in chronic hypersensitivity pneumonitis | |
| Di Lieto et al. | Collagen content and growth factor immunoexpression in uterine lower segment of type IA osteogenesis imperfecta: Relationship with recurrent uterine rupture in pregnancy | |
| Nüesch et al. | Epithelial proliferation in inflammatory skin disease is regulated by tetratricopeptide repeat domain 7 (Ttc7) in fibroblasts and lymphocytes | |
| US6855505B2 (en) | Method for quantifying TGF-β |