RU2717160C1 - Method for determining proteins using giant raman scattering using cryosols of plasmon nanoparticles - Google Patents
Method for determining proteins using giant raman scattering using cryosols of plasmon nanoparticles Download PDFInfo
- Publication number
- RU2717160C1 RU2717160C1 RU2019129494A RU2019129494A RU2717160C1 RU 2717160 C1 RU2717160 C1 RU 2717160C1 RU 2019129494 A RU2019129494 A RU 2019129494A RU 2019129494 A RU2019129494 A RU 2019129494A RU 2717160 C1 RU2717160 C1 RU 2717160C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- substrate
- spectrum
- sers
- protein
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 37
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 claims description 24
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 11
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 70
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 abstract 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 31
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 27
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 27
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 25
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 25
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 25
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 24
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 24
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 16
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 15
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 12
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 6
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine hydrochloride Chemical compound Cl.ON WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000011898 label-free detection Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000003989 Aurora kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000433 Aurora kinases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L calcium difluoride Chemical compound [F-].[F-].[Ca+2] WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001634 calcium fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000004093 laser heating Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
- G01J3/28—Investigating the spectrum
- G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
- G01J3/4406—Fluorescence spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
Abstract
Description
Изобретение относится к области определения биомолекул с помощью эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и может быть использовано в медицинской диагностике для определения белков-маркеров различных патологий, в том числе, с использованием технологии «лаборатория на чипе».The invention relates to the field of determination of biomolecules using the effect of giant Raman scattering (GCR) and can be used in medical diagnostics to determine marker proteins of various pathologies, including using the laboratory-on-chip technology.
В настоящее время все более широкое применение находят микрофлюидные устройства, так называемые «лаборатории на чипе», позволяющие быстро и надежно обнаруживать и количественно определять в биологических жидкостях пациента (кровь, моча, слюна и др.) наличие биомаркеров, свидетельствующих о развитии тех или иных заболеваний. Эти устройства, предназначенные для экспресс-диагностики «у постели больного», должны быть компактны, мобильны, недороги, просты в изготовлении и использовании и обеспечивать получение надежных диагностических результатов.At present, microfluidic devices, the so-called “laboratories on a chip”, are used to more quickly and reliably detect and quantify the presence of biomarkers in biological fluids of a patient (blood, urine, saliva, etc.), indicating the development of various diseases. These devices, designed for express diagnostics "at the patient’s bedside", should be compact, mobile, inexpensive, easy to manufacture and use, and ensure reliable diagnostic results.
Для идентификации биомаркеров в подобных системах в числе других применяют методы, основанные на эффекте гигантского комбинационного рассеяния, см., например, [US 7267948 В2, опубл. 11.09.2007] и др. В англоязычной литературе для его обозначения используют аббревиатуру SERS (Surface Enhanced Raman Scattering). Эффект ГКР наблюдается при регистрации комбинационного рассеяния (КР) света от молекул, адсорбированных на поверхности наноструктур некоторых металлов, в частности, серебра и золота. При облучении лазером за счет индукции локализованных поверхностных плазмонов в металлических наноструктурах достигается многократное усиление локальных электрических полей, что позволяет усилить сигнал КР. Спектроскопия с использованием эффекта ГКР обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения и определения анализируемых веществ, в частности, большая скорость анализа, возможность регистрировать спектр ГКР заданного вещества в смеси с посторонними веществами за счет возможности выделить спектр отдельного соединения из общих спектральных данных, высокая чувствительность, сравнимая с классическими иммуноферментными методами анализа. Во всем мире наблюдается повышенный интерес к практическому применению спектроскопии ГКР для детекции и/или идентификации биомаркеров различных патологий, в том числе, биомаркеров белковой природы.To identify biomarkers in such systems, among others, methods based on the effect of giant Raman scattering are used, see, for example, [US 7267948 B2, publ. September 11, 2007] and others. In the English literature, the abbreviation SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) is used to designate it. The SERS effect is observed when Raman scattering (RS) of light is detected from molecules adsorbed on the surface of nanostructures of certain metals, in particular, silver and gold. When laser irradiation due to the induction of localized surface plasmons in metal nanostructures, multiple amplification of local electric fields is achieved, which allows amplification of the Raman signal. Spectroscopy using the SERS effect has several advantages over other methods for the detection and determination of analytes, in particular, a high analysis rate, the ability to record the SERS spectrum of a given substance in a mixture with foreign substances due to the ability to separate the spectrum of an individual compound from the general spectral data, high sensitivity comparable to classical enzyme immunoassay methods. Around the world there is an increased interest in the practical application of SERS spectroscopy for the detection and / or identification of biomarkers of various pathologies, including protein biomarkers.
Для усиления локальных электромагнитных полей и получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния часто применяют коллоидные растворы плазмонных наночастиц, обычно серебра или золота [Lucas A. Lane, Ximei Qian, Shuming Nie, SERS Nanoparticles in Medicine: From Label-Free Detection to Spectroscopic Tagging, Chemical Reviews, 2015, 115(19), 10489-10529]. В отличие от ГКР-активных наноструктурированных поверхностей, получаемых при помощи литографических методов, наночастицы относительно дешевы, долго хранятся и не требуют сложного оборудования для получения и использования. Как правило, раствор анализируемого образца смешивают с коллоидным раствором наночастиц, после чего наночастицы должны сформировать агрегаты, имеющие частоты плазмонного резонанса, близкие к частоте лазера, используемого для получения сигнала КР. Получают спектры ГКР с высокими коэффициентами усиления сигнала, что позволяет обнаруживать наличие в растворе низких концентраций целевых белков и проводить их количественное определение по интенсивности характерных полос на получаемом спектре.To amplify local electromagnetic fields and obtain an amplified Raman signal, colloidal solutions of plasmon nanoparticles, usually silver or gold, are often used [Lucas A. Lane, Ximei Qian, Shuming Nie, SERS Nanoparticles in Medicine: From Label-Free Detection to Spectroscopic Tagging, Chemical Reviews 2015, 115 (19), 10489-10529]. In contrast to the SERS-active nanostructured surfaces obtained by lithographic methods, nanoparticles are relatively cheap, stored for a long time and do not require sophisticated equipment to obtain and use. As a rule, the solution of the analyzed sample is mixed with a colloidal solution of nanoparticles, after which the nanoparticles must form aggregates having plasmon resonance frequencies close to the frequency of the laser used to obtain the Raman signal. GCR spectra with high signal amplification coefficients are obtained, which makes it possible to detect the presence of low concentrations of target proteins in the solution and quantify them by the intensity of the characteristic bands in the resulting spectrum.
Однако, достаточное для получения надежного диагностического результата усиление сигнала полностью зависит от характера агрегации плазмонных наночастиц, приводящего к формированию «горячих точек» -участков максимального усиления локального электрического поля в результате плазмонного резонанса в отдельных участках, расположенных между агрегированными частицами. Неагрегированные наночастицы имеют пренебрежимо малую ГКР-активность, из-за чего проблема контролируемой агрегации наночастиц является одним из основных направлений исследований в области применения ГКР.However, the signal amplification sufficient to obtain a reliable diagnostic result completely depends on the nature of the aggregation of plasmon nanoparticles, which leads to the formation of “hot spots” of the maximum amplification of the local electric field as a result of plasmon resonance in separate sections located between the aggregated particles. Non-aggregated nanoparticles have negligible SERS activity, which is why the problem of controlled aggregation of nanoparticles is one of the main areas of research in the application of SERS.
В присутствии анализируемого вещества агрегация может быть самопроизвольной. Так, в статье [Li-Jia Xu, Cheng et. al. "Label-Free Detection of Native Proteins by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Using Iodide-Modified Nanoparticles", Analytical Chemistry, 2014, 86: 2238-2245] описано определение нативных белков с помощью ГКР, включающее самопроизвольную агрегацию серебряных наночастиц в золе в присутствии исследуемого белка, со снятием спектров непосредственно из жидкой капли. В этом случае молекула белка служит в качестве моста, связывающего отдельные плазмонные наночастицы в агрегаты, в центре которых находится белок. Такой подход позволяет получить очень интенсивные спектры, но не обеспечивает хорошую воспроизводимость - в статье указано, что для некоторых аналитов авторы дополнительно добавляют в качестве агрегирующего реагента сульфат магния. Кроме того, самопроизвольная агрегация обычно происходит в относительно чистых растворах - присутствие примесей зачастую препятствует формированию агрегатов из белковых молекул и плазмонных наночастиц. Такой способ агрегации также требует контроля рН раствора и знания изоэлектрической точки исследуемых белков, т.к. в большинстве случаев связывание белка и плазмонных наночастиц, которые обычно отрицательно заряжены, обусловлено электростатическим притяжением за счет положительного заряда белков. Соответственно, становится необходимо использовать значения рН, при которых белок имеет достаточно большой положительный заряд. Это накладывает ограничения на универсальность метода, поскольку многие белки теряют стабильность при тех значениях рН, при которых они приобретают положительный заряд.In the presence of an analyte, aggregation can be spontaneous. So, in the article [Li-Jia Xu, Cheng et. al. "Label-Free Detection of Native Proteins by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Using Iodide-Modified Nanoparticles", Analytical Chemistry, 2014, 86: 2238-2245] describes the determination of native proteins using SERS, including spontaneous aggregation of silver nanoparticles in ash in the presence of the test protein, with the removal of spectra directly from a liquid drop. In this case, the protein molecule serves as a bridge connecting individual plasmon nanoparticles into aggregates in the center of which the protein is located. This approach allows one to obtain very intense spectra, but does not provide good reproducibility - the article states that for some analytes the authors additionally add magnesium sulfate as an aggregating reagent. In addition, spontaneous aggregation usually occurs in relatively pure solutions - the presence of impurities often prevents the formation of aggregates from protein molecules and plasmon nanoparticles. This method of aggregation also requires control of the pH of the solution and knowledge of the isoelectric point of the studied proteins, because in most cases, the binding of protein and plasmon nanoparticles, which are usually negatively charged, is due to electrostatic attraction due to the positive charge of the proteins. Accordingly, it becomes necessary to use pH values at which the protein has a sufficiently large positive charge. This imposes limitations on the universality of the method, since many proteins lose stability at those pH values at which they acquire a positive charge.
Улучшения воспроизводимости результатов для различных типов аналитов можно добиться при помощи принудительной агрегации частиц в золе. С этой целью для получения агрегированных наноструктур в коллоидных растворах наночастиц металлов используют химические агрегирующие агенты, как правило, соли металлов, например, хлорид лития [WO 2005065541 (А2), опубл. 21.07.2005], хлорид натрия [Soumik Siddhanta, Dhanasekaran Karthigeyan, Partha P. Kundu, Tapas K. Kundu, Chandrabhas Narayana, Surface enhanced Raman spectroscopy of Aurora kinases: direct, ultrasensitive detection of autophosphorylation, RSC Advances, 2013, 3: 4221-4230], закисленный сульфат натрия [Xiao X. Han, et. al. "Label-Free Highly Sensitive Detection of Proteins in Aqueous Solutions Using Surface-Enhanced Raman Scattering, Analytical Chemistry, 2008, 81: 3329-3333]. Однако, образцы, полученные из биологического материала пациента, не являются чистыми растворами анализируемых белков и могут содержать множество примесей, способных препятствовать агрегации наночастиц даже после добавления агрегирующего реагента. Агрегирующий реагент также может вытеснять анализируемое вещество с поверхности наночастиц, тем самым препятствуя получению сигнала. Применяемый чаще всего в качестве агрегирующего реагента хлорид натрия может служить типичным примером - хлорид-ион способен вытеснять с поверхности серебра многие вещества, которые в его отсутствие могли бы дать интенсивный сигнал. Сродство аналитов к серебру варьирует, поэтому сложно подобрать агрегирующий реагент, не имеющий собственного спектра и пригодный к использованию для определения широкого круга анализируемых веществ, тем более в присутствии посторонних примесей. Другое ограничение связано с тем, что в присутствии агрегатора может наблюдаться нерегулируемый рост степени агрегации, в результате чего интенсивность сигнала ГКР начинает падать, при этом регистрирация ГКР-спектров с временами накопления больше 20-60 секунд, становится неэффективной. Это связано с тем, что упомянутые выше «горячие точки» расположены по всему объему растущего агрегата, а сигнал ГКР генерируется только «горячими точками», расположенными на его поверхности. По мере роста агрегатов отношение объема к поверхности растет, и количество анализируемого белка, попавшего в «горячие точки», находящиеся внутри агрегата и таким образом экранированные, растет, в то время как количество аналита в «горячих точках» на поверхности агрегатов падает вместе с общей поверхностью раздела фаз в коллоидной системе. В результате, существует оптимальный уровень агрегации, в котором система пребывает ограниченное время.Improving reproducibility of results for various types of analytes can be achieved by forced aggregation of particles in the ash. To this end, to obtain aggregated nanostructures in colloidal solutions of metal nanoparticles, chemical aggregating agents are used, usually metal salts, for example, lithium chloride [WO 2005065541 (A2), publ. 07.21.2005], sodium chloride [Soumik Siddhanta, Dhanasekaran Karthigeyan, Partha P. Kundu, Tapas K. Kundu, Chandrabhas Narayana, Surface enhanced Raman spectroscopy of Aurora kinases: direct, ultrasensitive detection of autophosphorylation, RSC Advances, 2013, 3: 4221 -4230], acidified sodium sulfate [Xiao X. Han, et. al. "Label-Free Highly Sensitive Detection of Proteins in Aqueous Solutions Using Surface-Enhanced Raman Scattering, Analytical Chemistry, 2008, 81: 3329-3333]. However, samples obtained from the biological material of the patient are not pure solutions of the analyzed proteins and may contain many impurities that can interfere with the aggregation of nanoparticles even after addition of the aggregating reagent. The aggregating reagent can also displace the analyte from the surface of the nanoparticles, thereby preventing the signal from being obtained. Most commonly used as sodium chloride aggregating reagent I can serve as a typical example - a chloride ion can displace many substances from the silver surface that could give an intense signal in its absence.The affinity of analytes for silver varies, so it is difficult to choose an aggregating reagent that does not have its own spectrum and is suitable for determining a wide range of analytes, especially in the presence of impurities. Another limitation is due to the fact that in the presence of an aggregator an unregulated increase in the degree of aggregation can be observed, as a result of which the intensity of the SERS signal begins to decrease, and the registration of SERS spectra with accumulation times of more than 20-60 seconds becomes ineffective. This is due to the fact that the above-mentioned "hot spots" are located throughout the volume of the growing unit, and the GCR signal is generated only by "hot spots" located on its surface. As aggregates grow, the ratio of volume to surface increases, and the amount of analyzed protein that has fallen into the “hot spots” located inside the aggregate and thus shielded increases, while the amount of analyte in the “hot spots” on the surface of the aggregates decreases along with the total phase boundary in the colloidal system. As a result, there is an optimal level of aggregation at which the system stays for a limited time.
Достижение принудительной агрегации наночастиц металлов в коллоидных растворах возможно под действием физических методов. В статье [Jianhua Zhou et. al. "Convenient formation of nanoparticle aggregates on microfluidic chips for highly sensitive SERS detection of biomolecules" Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402: 1601-1609] для принудительной агрегации золь золотых наночастиц пропускают через микрофлюидный канал микрочипа, снабженного клапаном, пропускающим воду, но задерживающим наночастицы. Наночастицы, концентрируясь в зоне перед клапаном, агрегируются за счет концентрирования и механического столкновения под действием потока жидкости. Через эту же зону пропускают раствор с анализируемым белком, который адсорбируется на сформированные агрегаты наночастиц и генерирует сигнал ГКР. После регистрации спектра ГКР клапан открывают, и агрегаты удаляются потоком, затем процесс можно повторить. К недостаткам способа следует отнести:Achievement of forced aggregation of metal nanoparticles in colloidal solutions is possible under the influence of physical methods. In the article [Jianhua Zhou et. al. "Convenient formation of nanoparticle aggregates on microfluidic chips for highly sensitive SERS detection of biomolecules" Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402: 1601-1609] for forced aggregation, sols of gold nanoparticles are passed through a microfluidic channel of a microchip equipped with a valve that allows water to pass through but retains nanoparticles. Nanoparticles, concentrating in the zone in front of the valve, are aggregated due to concentration and mechanical collision under the action of a fluid flow. A solution with the analyzed protein is passed through the same zone, which is adsorbed onto the formed nanoparticle aggregates and generates a SERS signal. After registering the GCR spectrum, the valve is opened, and the units are removed by flow, then the process can be repeated. The disadvantages of the method include:
- необходимость использования меньших, чем обычно, мощностей лазера с целью предотвращения формирования пузырьков газа в микрофлюидном канале;- the need to use lower than usual laser powers in order to prevent the formation of gas bubbles in the microfluidic channel;
- потеря в интенсивности сигнала, вызванная тем, что анализируемый белок подают уже после формирования агрегатов, когда общая поверхность, доступная для адсорбции уже уменьшилась;- a loss in signal intensity caused by the fact that the analyzed protein is fed after the formation of aggregates, when the total surface available for adsorption has already decreased;
- уязвимость к наличию примесей, конкурентно связывающихся с наночастицами.- vulnerability to the presence of impurities competitively binding to nanoparticles.
В работе [Barbara Fazio et. al. "SERS detection of Biomolecules at Physiological pH via aggregation of Gold Nanorods mediated by Optical Forces and Plasmonic Heating", Scientific Reports 2016, 6, doi:10.1038/srep26952] описан способ ГКР анализа биомолекул, в котором агрегацию плазмонных наночастиц индуцируют при помощи оптических сил и плазмонного нагрева, т.е. наночастицы вынужденно двигаются под давлением света и концентрируются около поверхности ячейки, оставаясь в луче лазера из-за взаимодействия индуцированного в частице дипольного момента и электрического поля лазера. Смесь раствора анализируемого образца и золя наночастиц помещают под лазер, в результате чего происходит самопроизвольная сборка агрегатов, включающих наночастицы и молекулы анализируемого вещества. Недостатком способа является необходимость использования наночастиц определенной формы (авторы используют золотые наностержни), т.к. форма наночастиц влияет на характеристики движения под действием света. Как и в большинстве других способов, в данном случае также существует непредсказуемость и невоспроизводимость результатов при исследовании растворов, содержащих разнообразные примеси, например, биологических жидкостей и их экстрактов. Также, поскольку агрегаты формируются в течение длительного времени (до 30 минут), возможна денатурация белковых молекул из-за длительного нагрева лазером.In [Barbara Fazio et. al. "SERS detection of Biomolecules at Physiological pH via aggregation of Gold Nanorods mediated by Optical Forces and Plasmonic Heating", Scientific Reports 2016, 6, doi: 10.1038 / srep26952] describes a method for SERS analysis of biomolecules, in which aggregation of plasmon nanoparticles is induced by optical forces and plasmon heating, i.e. nanoparticles are forced to move under the pressure of light and concentrate near the cell surface, remaining in the laser beam due to the interaction of the dipole moment induced in the particle and the laser electric field. A mixture of the solution of the analyzed sample and the sol of nanoparticles is placed under the laser, as a result of which spontaneous assembly of aggregates, including nanoparticles and analyte molecules, takes place. The disadvantage of this method is the need to use nanoparticles of a certain shape (the authors use gold nanorods), because the shape of the nanoparticles affects the characteristics of motion under the influence of light. As in most other methods, in this case there is also unpredictability and irreproducibility of the results when studying solutions containing various impurities, for example, biological fluids and their extracts. Also, since aggregates form for a long time (up to 30 minutes), protein molecules can be denatured due to prolonged laser heating.
Общей чертой всех упомянутых аналогов является то, что формирование агрегатов наночастиц с белковыми молекулами происходит в жидкой фазе. В качестве прототипа настоящего изобретения взят способ определения белка с помощью ГКР, основанный на использовании твердофазного ГКР-субстрата, содержащего агрегаты наночастиц серебра с белком [Sercan Keskina, Mustafa Culha, "Label-free detection of proteins from dried-suspended droplets using surface enhanced Raman scattering", International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 537-547]. Для получения твердого ГКР-субстрата навеску белка (лизоцим, цитохром С, миоглобин, BSA и др.) растворяют в воде и добавляют золь серебряных наночастиц, приготовленный по общепринятой методике [Ratyakshi, R.P. Chaunan, Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles, Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(10): 113-116] путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия при кипячении. В одном из вариантов способа каплю смеси помещают на нижнюю сторону горизонтально расположенной подложки из фторида кальция, после чего высушивают при комнатной температуре. После высушивания подложку переворачивают и проводят измерение сигналов ГКР с поверхности высушенной капли с использованием конфокального микроскопа на спектрометре с длиной волны лазера 785 нм. В процессе высушивания наночастицы формируют агрегаты постоянного размера, что позволяет получать сигналы ГКР, не деградирующие со временем. При этом агрегаты включают в себя белок независимо от заряда белковой молекулы, что позволяет использовать отрицательно заряженные наночастицы для определения отрицательно заряженных белков. К недостаткам способа следует отнести:A common feature of all the mentioned analogues is that the formation of aggregates of nanoparticles with protein molecules occurs in the liquid phase. As a prototype of the present invention, a method for determining protein using HCR, based on the use of a solid-state HCR substrate containing aggregates of silver nanoparticles with protein [Sercan Keskina, Mustafa Culha, "Label-free detection of proteins from dried-suspended droplets using surface enhanced Raman scattering ", International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 537-547]. To obtain a solid HCR substrate, a sample of protein (lysozyme, cytochrome C, myoglobin, BSA, etc.) is dissolved in water and a sol of silver nanoparticles prepared according to the generally accepted method is added [Ratyakshi, R.P. Chaunan, Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles, Asian Journal of Chemistry, 2009, 21 (10): 113-116] by reduction of silver nitrate with sodium citrate by boiling. In one embodiment of the method, a drop of the mixture is placed on the lower side of a horizontally placed calcium fluoride substrate, and then dried at room temperature. After drying, the substrate is turned over and the SERS signals are measured from the surface of the dried drop using a confocal microscope on a spectrometer with a laser wavelength of 785 nm. In the process of drying, nanoparticles form aggregates of constant size, which makes it possible to obtain SERS signals that do not degrade with time. Moreover, aggregates include protein regardless of the charge of the protein molecule, which allows the use of negatively charged nanoparticles to determine negatively charged proteins. The disadvantages of the method include:
- относительно низкий уровень сигнала, поскольку сигнал снимается с плоской поверхности, которая содержит меньше «горячих точек», чем аналогичный объем жидкости,- a relatively low signal level, since the signal is removed from a flat surface that contains fewer "hot spots" than a similar volume of liquid,
- невозможность использования больших мощностей лазера, что вызвано неэффективным отводом тепла от точки фокусировки лазера - высушенный золь не является сплошной металлической пленкой и обладает ограниченной теплопроводностью, а плазменный резонанс приводит к усиленному поглощению энергии лазера и нагреву агрегатов.- the inability to use large laser powers, which is caused by inefficient heat removal from the laser focusing point - the dried sol is not a continuous metal film and has limited thermal conductivity, and plasma resonance leads to enhanced absorption of laser energy and heating of the aggregates.
- ненадежность результатов в присутствии примесей. В процессе высушивания увеличение концентрации примесей может индуцировать неконтролируемую агрегацию наночастиц и нарушить равномерное распределение наночастиц и анализируемых белков в высушенной капле.- unreliability of the results in the presence of impurities. During the drying process, an increase in the concentration of impurities can induce uncontrolled aggregation of nanoparticles and disrupt the uniform distribution of nanoparticles and analyzed proteins in the dried drop.
- сложность подготовки ГКР-субстрата, связанная с необходимостью использования специальных материалов подложки и обеспечения гладкости и чистоты поверхности.- the complexity of the preparation of the GCR substrate, associated with the need to use special substrate materials and ensure smoothness and cleanliness of the surface.
Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в совершенствовании ГКР-способа анализа белков с использованием твердофазного ГКР-субстрата. Настоящее изобретение обеспечивает повышение интенсивности и увеличение соотношения сигнал/шум получаемых спектров в отсутствие агрегирующих реагентов, в том числе, в присутствии примесей, а также позволяет повысить стабильность и воспроизводимость получаемых результатов анализа во времени.The technical problem solved by the present invention is to improve the SERS method of protein analysis using a solid-state SERS substrate. The present invention provides an increase in intensity and an increase in the signal-to-noise ratio of the obtained spectra in the absence of aggregating reagents, including in the presence of impurities, and also improves the stability and reproducibility of the obtained analysis results over time.
Техническая проблема решена заявляемым способом определения белков с использованием гигантского комбинационного рассеяния, включающим приготовление твердофазного ГКР-субстрата, содержащего смесь плазмонных наночастиц с содержащим белок анализируемым образцом, воздействие на полученный субстрат лучом лазера, запись ГКР-спектра и его математическую обработку, отличающимся тем, что в качестве твердофазного ГКР-субстрата используют криозоль, представляющий собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, при этом капля смеси заморожена на подложке из теплопроводного, не имеющего собственного спектра комбинационного рассеяния, преимущественно, отражающего свет материала, а воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии в процессе анализа.The technical problem is solved by the inventive method for determining proteins using giant Raman scattering, including the preparation of a solid-phase SERS substrate containing a mixture of plasmon nanoparticles with a protein containing the analyzed sample, exposure to the obtained substrate by a laser beam, recording of the SERS spectrum and its mathematical processing, characterized in that cryosol is used as a solid-phase SERS substrate, which is a drop of a mixture of sols of plasmon nanoparticles with a solution containing protein a of the sample being analyzed, in this case, a drop of the mixture is frozen on a substrate from a heat-conducting material that does not have its own Raman spectrum, mainly reflecting the light of the material, and the effect on the HRS substrate is carried out by a laser beam while cooling the HRS substrate to a temperature that ensures the existence of the substrate in the solid state in analysis process.
Перечисленные ниже графические материалы поясняют сущность изобретения. На всех фигурах по оси ординат указана интенсивность ГКР-спектра в CCDcts (CCD counts - количество условных цифровых единиц, накопленных ПЗС матрицей).The following graphic materials illustrate the invention. In all the figures along the ordinate axis, the intensity of the Raman spectrum in CCDcts is indicated (CCD counts is the number of conventional digital units accumulated by the CCD matrix).
Фиг. 1. ГКР-спектр миоглобина в присутствии мочевины, полученный заявляемым способом. Образец для анализа - криозоль, полученный замораживанием в течение 20 мин. при температуре - 8°С смеси (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором миоглобина, содержащего примесь мочевины. Концентрация компонентов в криозоле - наночастицы - 5×1010 ч./мл, миоглобин - 50 нг/мл, мочевина - 0,5 мМ. Условия анализа: спектрометр BWTek i-Raman 532 nm, длина волны лазера 532 нм, мощность 7,5 мВт, время накопления 100 сек. Образец криозоля во время анализа охлаждают сухим льдом.FIG. 1. The SEC spectrum of myoglobin in the presence of urea, obtained by the claimed method. Sample for analysis - cryosol obtained by freezing for 20 minutes at a temperature of -8 ° С a mixture (1: 1 by volume) of a sol of silver nanoparticles (particle size 42 nm) with a solution of myoglobin containing an admixture of urea. The concentration of components in the cryosol — nanoparticles — 5 × 10 10 ppm, myoglobin — 50 ng / ml, urea — 0.5 mM. Analysis conditions: BWTek i-Raman 532 nm spectrometer, laser wavelength 532 nm, power 7.5 mW, accumulation time 100 sec. A cryosol sample is cooled with dry ice during analysis.
Фиг. 2. ГКР-спектр той же смеси в жидком виде без замораживания. Условия анализа: спектрометр BWTek i-Raman 532 nm, длина волны лазера 532 нм, мощность 7,5 мВт, время накопления 100 сек.FIG. 2. The SERS spectrum of the same mixture in liquid form without freezing. Analysis conditions: BWTek i-Raman 532 nm spectrometer, laser wavelength 532 nm, power 7.5 mW, accumulation time 100 sec.
Фиг. 3 Сопоставление ГКР-спектров, представленных на Фиг. 1 и 2, приведенных в одном масштабе. А - ГКР-спектр криозоля, Б - ГКР-спектр жидкого золя.FIG. 3 Comparison of the SERS spectra shown in FIG. 1 and 2, given in one scale. A - HRS spectrum of a cryosol; B - HRS spectrum of a liquid sol.
Фиг. 4. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина, полученных в соответствии с заявляемым способом, в зависимости от времени приготовления криозоля. Концентрация компонентов в криозоле: наночастицы - 5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл. А - ГКР-спектры, измеренные через 1, 5, 10, 15 и 20 мин после приготовления криозоля, Б -зависимость интенсивности пика 1002 см-1 от времени хранения криозоля. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.FIG. 4. Comparison of the SEC spectra of hemoglobin obtained in accordance with the claimed method, depending on the time of preparation of the cryosol. The concentration of components in the cryosol: nanoparticles - 5 × 10 10 hours / ml, hemoglobin - 1000 ng / ml. A - SEC spectra measured 1, 5, 10, 15 and 20 minutes after preparation of the cryosol; B - dependence of the peak intensity 1002 cm -1 on the storage time of the cryosol. Analysis conditions: BWTek innoRam spectrometer 785 nm, laser wavelength 785 nm, power 42 mW,
Фиг. 5. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина, в жидком золе, полученных в разное время после приготовления. Концентрация компонентов в анализируемой смеси: наночастицы - 5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, NaCl - 40 мМ. А - ГКР-спектры, измеренные через 1, 5, 10, 15 и 20 мин после приготовления раствора, Б - зависимость интенсивности пика 1002 см-1 от времени хранения образца. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.FIG. 5. Comparison of the SEC spectra of hemoglobin in liquid ash obtained at different times after preparation. The concentration of components in the analyzed mixture: nanoparticles - 5 × 10 10 hours / ml, hemoglobin - 1000 ng / ml, NaCl - 40 mm. A — SEC spectra measured 1, 5, 10, 15, and 20 min after preparation of the solution; B — dependence of the peak intensity 1002 cm –1 on the storage time of the sample. Analysis conditions: BWTek innoRam spectrometer 785 nm, laser wavelength 785 nm, power 42 mW,
Фиг. 6. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина без и в присутствии примеси сахарозы. Образец для анализа - жидкий золь, полученный смешением (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором гемоглобина. В смесь добавляют NaCl и перемешивают. Концентрация компонентов в анализируемой смеси - наночастицы - 5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, NaCl - 40 мМ. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек. А - ГКР-спектр гемоглобина без примеси сахарозы, Б - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в концентрации 10 мкг/мл.FIG. 6. Comparison of the SEC spectra of hemoglobin without and in the presence of sucrose impurities. The sample for analysis is a liquid sol obtained by mixing (1: 1 by volume) a sol of silver nanoparticles (particle size 42 nm) with a hemoglobin solution. NaCl was added to the mixture and stirred. The concentration of components in the analyzed mixture - nanoparticles - 5 × 10 10 hours / ml, hemoglobin - 1000 ng / ml, NaCl - 40 mm. Analysis conditions: BWTek innoRam spectrometer 785 nm, laser wavelength 785 nm, power 42 mW,
Фиг. 7. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина в присутствии примеси сахарозы, полученных из криозоля и из раствора. А - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в криозоле, полученном замораживанием смеси (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором гемоглобина, содержащего примесь сахарозы, в течение 60 мин при температуре -3°С. Концентрация компонентов в криозоле - наночастицы -5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, сахароза - 10 мкг/мл. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек., охлаждение криозоля сухим льдом. Б - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в жидком золе. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.FIG. 7. Comparison of the HCR spectra of hemoglobin in the presence of sucrose impurities obtained from cryosol and from solution. A - HCR spectrum of hemoglobin in the presence of sucrose in cryosol obtained by freezing a mixture (1: 1 by volume) of a sol of silver nanoparticles (particle size 42 nm) with a hemoglobin solution containing an admixture of sucrose for 60 min at a temperature of -3 ° C. The concentration of components in the cryosol — nanoparticles — 5 × 10 10 ppm, hemoglobin — 1000 ng / ml, sucrose — 10 μg / ml. Analysis conditions: BWTek innoRam spectrometer 785 nm, laser wavelength 785 nm, power 42 mW,
Сущность физических процессов, предположительно, происходящих при формировании криозоля плазмонных наночастиц, описана ниже. При комнатной температуре в жидком водном золе в отсутствии агрегирующих реагентов плазмонные наночастицы (например, серебра или золота) находятся в состоянии свободной подвижности; по мере роста кристаллов льда плазмонные наночастицы концентрируются между кристаллами и агрегируют, формируя в местах столкновения фронтов кристаллизации воды трехмерные структуры, повторяющие контуры кристаллов льда. Особенностью заявляемого способа является одновременное концентрирование молекул определяемых белков в зоне формирования агрегатов в пространстве между растущими кристаллами льда.The essence of physical processes, presumably occurring during the formation of a cryosol of plasmon nanoparticles, is described below. At room temperature in liquid aqueous ash in the absence of aggregating reagents, plasmon nanoparticles (for example, silver or gold) are in a state of free mobility; as ice crystals grow, plasmon nanoparticles concentrate between the crystals and aggregate, forming three-dimensional structures at the points of collision of water crystallization fronts that follow the contours of ice crystals. A feature of the proposed method is the simultaneous concentration of the molecules of the determined proteins in the area of formation of aggregates in the space between the growing ice crystals.
Механизмы агрегации частиц в разбавленных коллоидных растворах недостаточно изучены, однако, на основании имеющихся данных можно предполагать, как формируется криозоль при замораживании раствора. Известно, что при замораживании водных растворов формирование льда начинается в отдельных центрах кристаллизации с постепенным ростом кристаллов, которые прекращают расти после столкновения разных фронтов кристаллизации. Растворимость веществ в формируемом кристалле, как правило, ниже, чем в жидкой фазе, поэтому по мере замерзания в растворе растет концентрация веществ, которые были исключены из объема жидкости, потраченного на образование кристаллов. Между растущим льдом и жидкой водой существует равновесное соотношение концентрации растворенного вещества, из-за чего по мере кристаллизации концентрация растворенных веществ в жидкой фазе линейно растет, при условии ограниченного объема. Однако, это справедливо только при условии, что растворенное вещество успевает распределиться по всему объему за счет диффузии. При быстром росте кристалла диффузионные процессы начинают отставать от притока нового вещества в жидкую фазу, растворенное вещество не успевает диффундировать от фронта кристаллизации, а перед растущим кристаллом формируется зона повышенного содержания растворенных веществ. Чем быстрее растет кристалл льда и чем меньше растворимость вещества в твердой фазе, тем более резкий получается градиент концентрации. Максимальная концентрация должна наблюдаться на границе двух отдельных кристаллов льда.The mechanisms of particle aggregation in diluted colloidal solutions are not well understood, however, based on the available data, it can be assumed how a cryosol is formed when the solution is frozen. It is known that when freezing aqueous solutions, ice formation begins in separate crystallization centers with a gradual growth of crystals, which stop growing after the collision of different crystallization fronts. The solubility of substances in the formed crystal is usually lower than in the liquid phase, therefore, as the solution freezes, the concentration of substances that were excluded from the volume of liquid spent on the formation of crystals increases. Between the growing ice and liquid water there is an equilibrium ratio of the concentration of the dissolved substance, because of which, as crystallization occurs, the concentration of dissolved substances in the liquid phase increases linearly, subject to a limited volume. However, this is true only under the condition that the dissolved substance manages to be distributed throughout the entire volume due to diffusion. With rapid crystal growth, diffusion processes begin to lag behind the influx of a new substance into the liquid phase, the dissolved substance does not have time to diffuse from the crystallization front, and a zone of increased content of dissolved substances is formed in front of the growing crystal. The faster the ice crystal grows and the less the solubility of the substance in the solid phase, the sharper the concentration gradient. The maximum concentration should be observed at the boundary of two separate ice crystals.
Агрегация наночастиц происходит в результате похожего процесса концентрирования коллоидных частиц, вызванного их термодинамическим отталкиванием от растущего кристалла льда. Приток воды к поверхности кристалла и структурирование приповерхностных слоев молекул делает энергетически невыгодным нахождение частицы около интерфейса кристаллизации. Энергия взаимодействия воды с наночастицей служит энергетическим барьером для формирования льда и приводит к сверхохлаждению пограничного слоя воды, что замедляет рост кристалла и способствует вытеснению коллоидных частиц в жидкую фазу. Природа явления отличается от концентрирования растворенных веществ, но результат такой же. При этом, из-за малой скорости диффузии в коллоидных растворах даже перед медленно растущим кристаллом формируется слой с повышенной концентрацией наночастиц [Anthony М. Anderson, М. Grae Worster, «Freezing colloidal suspensions: periodic ice lenses and compaction)), Journal of Fluid Mechanics, 2014, 758: 786-808]. По мере преодоления электростатического отталкивания, сближенные наночастицы формируют перманентные агрегаты за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.Aggregation of nanoparticles occurs as a result of a similar process of concentration of colloidal particles, caused by their thermodynamic repulsion from a growing ice crystal. The influx of water to the surface of the crystal and the structuring of the surface layers of molecules makes it energetically disadvantageous to find the particle near the crystallization interface. The interaction energy of water with a nanoparticle serves as an energy barrier for ice formation and leads to supercooling of the boundary layer of water, which slows down the growth of the crystal and promotes the displacement of colloidal particles into the liquid phase. The nature of the phenomenon is different from the concentration of dissolved substances, but the result is the same. Moreover, due to the low diffusion rate in colloidal solutions, even before a slowly growing crystal, a layer with a high concentration of nanoparticles is formed [Anthony M. Anderson, M. Grae Worster, “Freezing colloidal suspensions: periodic ice lenses and compaction)), Journal of Fluid Mechanics, 2014, 758: 786-808]. As electrostatic repulsion is overcome, the adjacent nanoparticles form permanent aggregates due to van der Waals interactions.
Таким образом, в криозоле формируются зоны повышенной концентрации наночастиц и белков, особенно в местах столкновения двух растущих кристаллов льда. Формирующиеся агрегаты захватывают из раствора белковые молекулы, часть которых сорбируется в так называемых «горячих точках» (представляют собой зоны максимального усиления электромагнитного поля за счет эффекта ГКР), расположенных в основном между соседними частицами в агрегатах. Процесс сорбции белка в агрегатах имеет равновесный характер и зависит от концентрации белка в растворе, поэтому концентрирование белка вместе с наночастицами вносит вклад в усиление сигнала ГКР. При этом, как показывают экспериментальные данные и в соответствии с теоретическими представлениями, присутствие примесей в образце меньше влияет на агрегацию наночастиц при формировании криозоля, чем при агрегации в растворе.Thus, zones of increased concentration of nanoparticles and proteins are formed in the cryozole, especially in the places where two growing ice crystals collide. The formed aggregates capture protein molecules from the solution, some of which are sorbed in the so-called “hot spots” (they are zones of maximum amplification of the electromagnetic field due to the SERS effect), located mainly between neighboring particles in the aggregates. The process of protein sorption in aggregates has an equilibrium character and depends on the concentration of protein in the solution; therefore, protein concentration together with nanoparticles contributes to the amplification of the SERS signal. Moreover, according to experimental data and in accordance with theoretical concepts, the presence of impurities in the sample has a lesser effect on the aggregation of nanoparticles during cryosol formation than on aggregation in solution.
По сравнению с прототипом, использование криозоля позволяет получить преимущество в интенсивности ГКР-спектров также за счет того, что рассеяние света происходит в объеме образца, а не на плоской поверхности. При этом большее количество «горячих точек», имеющихся в объеме, вносит вклад в интенсивность сигнала. Как показывают эксперименты, оптимальная интенсивность сигнала достигается при высоте столба замороженной жидкости около 1 мм.Compared with the prototype, the use of cryosol allows you to get an advantage in the intensity of the SERS spectra also due to the fact that light scattering occurs in the volume of the sample, and not on a flat surface. Moreover, a greater number of “hot spots” available in the volume contribute to the signal intensity. As experiments show, the optimal signal intensity is achieved when the height of the column of frozen liquid is about 1 mm.
Возможность использования эффекта совместной агрегации плазмонных наночастиц с молекулами белка при замораживании разбавленных коллоидных растворов для получения ГКР-субстратов, позволяющих регистрировать спектры аналитов непосредственно из замерзшей капли, обнаружена нами впервые и не является очевидной, поскольку процессы агрегирования, происходящие в концентрированных и разбавленных коллоидных системах, не идентичны и не до конца изучены.The possibility of using the effect of the joint aggregation of plasmon nanoparticles with protein molecules when freezing diluted colloidal solutions to obtain HRS substrates that allow recording analyte spectra directly from a frozen drop was discovered by us for the first time and is not obvious, since the aggregation processes that occur in concentrated and diluted colloidal systems not identical and not fully understood.
В качестве плазмонных наночастиц могут быть использованы любые частицы, для которых агрегация способствует усилению эффекта ГКР, в частности, наночастицы серебра, или наночастицы золота, или гибридные наночастицы («core-shell» и др.), размером в диапазоне от 10 до 100 нм, обеспечивающем получение спектров с максимальной интенсивностью. Для получения криозолей могут быть использованы плазмонные наночастицы, полученные любым известным способом, например, путем восстановления нитрата серебра гидроксиламин-гидрохлоридом в щелочных условиях [Nicolae Leopold, Bernhard Lendl, "A New Method for Fast Preparation of Highly Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) Active Silver Colloids at Room Temperature by Reduction of Silver Nitrate with Hydroxylamine Hydrochloride", Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107(24): 5723-5727] или восстановлением нитрата серебра цитратом натрия при кипячении [Ratyakshi, R.P. Chaunan, "Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles", Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(10): 113-116]. Содержание наночастиц в золе, используемом для получения криосубстрата, может варьировать в пределах от 1010 до 1013 ч./мл в зависимости от характеристик используемых наночастиц.As plasmon nanoparticles, any particles can be used for which aggregation enhances the SERS effect, in particular, silver nanoparticles, or gold nanoparticles, or hybrid nanoparticles (core-shell, etc.), ranging in size from 10 to 100 nm providing spectra with maximum intensity. To obtain cryosols, plasmon nanoparticles obtained by any known method can be used, for example, by reducing silver nitrate with hydroxylamine hydrochloride under alkaline conditions [Nicolae Leopold, Bernhard Lendl, "A New Method for Fast Preparation of Highly Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) Active Silver Colloids at Room Temperature by Reduction of Silver Nitrate with Hydroxylamine Hydrochloride ", Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107 (24): 5723-5727] or reduction of silver nitrate with sodium citrate when boiled [Ratyakshi, RP Chaunan," Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles ", Asian Journal of Chemistry, 2009, 21 (10): 113-116]. The content of nanoparticles in the ash used to obtain cryosubstrate can vary from 10 10 to 10 13 hours / ml depending on the characteristics of the nanoparticles used.
Анализируемый раствор белка и золь наночастиц смешивают в соотношении, близком к 1:1, обеспечивающим, как определено экспериментально, максимально равномерное смешение компонентов и эффективную сорбцию белка на поверхности наночастиц. Смесь перемешивают, затем замораживают, предпочтительно в темноте, при температуре, обеспечивающей формирование в условиях эксперимента агрегатов наночастиц такого размера, который соответствует максимальной интенсивности ГКР-спектров. На практике для большинства белков для получения криозоля используют температуру в диапазоне от минус 1°С до минус 10°С. Для получения криозоля аликвоту смеси помещают на светоотражающую поверхность теплопроводного материала, не имеющего собственного выраженного КР-спектра. На практике удобно использовать подложку из алюминия. Полученный твердый субстрат можно использовать сразу, или хранить в закрытом контейнере в течение нескольких недель при температуре минус 20°С или ниже.The analyzed protein solution and the sol of nanoparticles are mixed in a ratio close to 1: 1, which ensures, as determined experimentally, the most uniform mixing of components and effective sorption of the protein on the surface of the nanoparticles. The mixture is stirred, then frozen, preferably in the dark, at a temperature that ensures the formation, under experimental conditions, of aggregates of nanoparticles of a size that corresponds to the maximum intensity of the SERS spectra. In practice, for most proteins, a temperature in the range from minus 1 ° C to minus 10 ° C is used to obtain cryosol. To obtain a cryosol, an aliquot of the mixture is placed on the reflective surface of a heat-conducting material that does not have its own pronounced Raman spectrum. In practice, it is convenient to use an aluminum substrate. The resulting solid substrate can be used immediately, or stored in a closed container for several weeks at a temperature of minus 20 ° C or lower.
Для измерения ГКР-спектра образец криозоля, охлаждаемый сухим льдом или другим хладагентом, помещают под объектив микроскопа спектрометра, предпочтительно изолированного от внешних источников света. Охлаждение позволяет использовать максимально возможную мощность лазера без риска расплавить криозоль, а также проводить настройку параметров измерения или повторные накопления сигнала без временных ограничений. Для получения ГКР-спектров может быть использовано лазерное излучение с любой подходящей длиной волны, что определяется свойствами анализируемого образца и имеющимися техническими возможностями. Сначала снимают спектр фона при выключенном лазере, затем включают лазер и регистрируют ГКР-спектр. Время накопления сигнала и мощность лазерного излучения подбирают экспериментально с учетом требуемой интенсивности спектра. Полученный спектр подвергают математической обработке с использованием программного обеспечения, позволяющего анализировать спектральные данные.To measure the SEC spectrum, a cryosol sample cooled with dry ice or other refrigerant is placed under the microscope objective of a spectrometer, preferably isolated from external light sources. Cooling allows you to use the maximum possible laser power without risk of melting the cryosol, as well as adjust the measurement parameters or re-accumulate the signal without time limits. To obtain the SEC spectra, laser radiation with any suitable wavelength can be used, which is determined by the properties of the analyzed sample and the available technical capabilities. First, the background spectrum is taken with the laser turned off, then the laser is turned on and the SERS spectrum is recorded. The signal accumulation time and laser radiation power are selected experimentally taking into account the required spectrum intensity. The resulting spectrum is subjected to mathematical processing using software that allows you to analyze spectral data.
Ниже приведены примеры, демонстрирующие возможность осуществления предлагаемого способа с получением заявленного технического результата.The following are examples that demonstrate the feasibility of the proposed method to obtain the claimed technical result.
Пример 1. Получение спектра миоглобина в присутствии примеси мочевины.Example 1. Obtaining the spectrum of myoglobin in the presence of urea impurities.
Известно, что присутствие примеси мочевины затрудняет агрегацию наночастиц, уменьшая ГКР-активность золя.It is known that the presence of urea impurities complicates the aggregation of nanoparticles, reducing the SERS activity of the sol.
Раствор миоглобина в воде 100 нг/мл, содержащий 1 мМ мочевины, смешивают в объемном соотношении 1:1 с золем серебряных наночастиц (гидродинамический диаметр 42 нм), содержащем 1011 ч./мл. Конечная концентрация белка в смеси составляет 50 нг/мл, наночастиц - 5×1010 ч./мл, мочевины - 0,5 мМ. Для получения криозоля каплю полученной смеси (-20 мкл) помещают в пластиковое кольцо толщиной 1 мм и диаметром 5 мм, размещенное на алюминиевой пластине, после чего образец помещают в морозильную камеру с температурой -8°С на 20 мин. Пластину с криозолем в пластиковом контейнере с сухим льдом помещают под объектив микроскопа спектрометра BWTek i-Raman 532, с длиной волны лазера 532 нм. Устанавливают время накопления 100 сек с 5 повторами для усреднения, снимают фоновый спектр, предварительно экранировав микроскоп от внешних источников света. Затем на мощности лазера 20% (7,5 мВт) накапливают ГКР-спектр с тем же временем накопления. Вычитание фонового спектра в процессе обработки полученных спектров с помощью специального программного обеспечения происходит автоматически. Полученный спектр показан на фиг. 1. Как видно из рисунка, на ГКР-спектре криозоля присутствуют характерные полосы высокой интенсивности, соответствующие миоглобину и мочевине.A solution of myoglobin in water 100 ng / ml, containing 1 mm urea, is mixed in a 1: 1 volume ratio with a sol of silver nanoparticles (hydrodynamic diameter 42 nm) containing 10 11 hours / ml. The final concentration of protein in the mixture is 50 ng / ml, nanoparticles - 5 × 10 10 hours / ml, urea - 0.5 mm. To obtain a cryosol, a drop of the resulting mixture (-20 μl) is placed in a
На такой же алюминиевой пластине снимают ГКР-спектр жидкого золя, имеющего тот же состав, что и состав криозоля: 20 мкл смеси помещают в пластиковое кольцо, лежащее на подложке из алюминия, и помещают образец под микроскоп спектрометра. Накопление сигнала и получение спектра осуществляют аналогично тому, как описано выше для криозоля. Полученный спектр, показанный на фиг. 2, не содержит выраженных сигналов миоглобина, присутствуют только пики мочевины и слабо выраженные сигналы, которые сложно опознать в связи с их низкой интенсивностью. Также обращает на себя внимание неблагоприятное соотношение сигнал/шум на спектре, полученном с использованием жидкого субстрата.The HSC spectrum of a liquid sol having the same composition as the cryosol composition is recorded on the same aluminum plate: 20 μl of the mixture is placed in a plastic ring lying on an aluminum substrate and the sample is placed under the microscope of the spectrometer. Signal accumulation and spectrum acquisition are carried out similarly as described above for cryosol. The resulting spectrum shown in FIG. 2, does not contain pronounced signals of myoglobin, only urea peaks and weakly expressed signals are present, which are difficult to recognize due to their low intensity. An unfavorable signal-to-noise ratio in the spectrum obtained using a liquid substrate is also noteworthy.
При сопоставлении спектров криозоля и жидкого образца, представленных на одном рисунке в одинаковом масштабе, как показано на Фиг. 3, наглядно видно, что спектр ГКР криозоля, содержащего миоглобин в присутствии мочевины, в десятки раз превосходит по интенсивности ГКР-спектр жидкого золя аналогичного состава (ср. интенсивность пика мочевины при 1002 см-1). Значительно более высокое соотношение интенсивности сигнал/шум на спектре, полученном для криозоля, обеспечивает более высокую чувствительность определения белка по сравнению с жидким субстратом.When comparing the spectra of cryosol and a liquid sample, shown in the same figure on the same scale, as shown in FIG. 3, it is clearly seen that the SERS spectrum of a cryosol containing myoglobin in the presence of urea is ten times higher in intensity than the SSC spectrum of a liquid sol of a similar composition (compare the intensity of the urea peak at 1002 cm -1 ). The significantly higher signal-to-noise intensity ratio in the spectrum obtained for the cryosol provides a higher sensitivity for protein determination compared to a liquid substrate.
Как отмечено выше, в спектре жидкого золя, содержащего миоглобин и примесь мочевины, отсутствуют характерные ГКР-сигналы миоглобина. Показательно, что в отсутствие мочевины удается получить спектр миоглобина в растворе, хотя и существенно менее интенсивный, чем с использованием криозоля. Мочевина способствует исчезновению ГКР-спектра белка, предположительно, из-за нарушения самопроизвольной агрегации наночастиц серебра.As noted above, in the spectrum of a liquid sol containing myoglobin and an admixture of urea, there are no characteristic HSC signals of myoglobin. It is significant that in the absence of urea, it is possible to obtain the spectrum of myoglobin in solution, although significantly less intense than with cryosol. Urea contributes to the disappearance of the SERS spectrum of the protein, presumably due to a violation of the spontaneous aggregation of silver nanoparticles.
Таким образом, использование заявляемого способа позволяет не только увеличить интенсивность спектра белка по сравнению с использованием жидкого субстрата, но и получать ГКР-спектр белка высокой интенсивности при наличии примесей, присутствие которых в образце делает получение спектра белка из раствора невозможным. Использование криозоля также позволяет повысить чувствительность способа за счет возрастания соотношения сигнал/шум.Thus, the use of the proposed method allows not only to increase the intensity of the protein spectrum in comparison with the use of a liquid substrate, but also to obtain a high-intensity HRS spectrum in the presence of impurities, the presence of which in the sample makes it impossible to obtain the protein spectrum from the solution. The use of cryosol also allows you to increase the sensitivity of the method by increasing the signal-to-noise ratio.
Пример 2. Получение спектра гемоглобина в присутствии сахарозы.Example 2. Obtaining a hemoglobin spectrum in the presence of sucrose.
Для приготовления криозоля использованы водные растворы гемоглобина (2000 нг/мл), не содержащие примесей и содержащие примесь сахарозы (10 мкг/мл) сахарозы, которая негативно влияет на агрегацию наночастиц, уменьшая ГКР-активность золя. Исследуемый раствор смешивают с золем серебряных наночастиц (гидродинамический диаметр 42 нм, концентрация 1011 ч./мл) в объемном соотношении 1:1. Конечная концентрация белка в смеси составляет 1000 нг/мл, наночастиц -5×1010 ч./мл, сахарозы, если она присутствует - 10 мкг/мл. Для приготовления образца 5 мкл смеси помещают в алюминиевую лунку высотой 1 мм и диаметром 2 мм. Алюминиевую лунку помещают на 1 час в термоконтейнер, наполненный колотым льдом из замороженного 20% водного раствора глицерина, с температурой около -4°С. Затем образец, помещенный в пластиковый контейнер с сухим льдом, переносят под объектив микроскопа спектрометра BWTek innoRam 785, с длиной волны лазера 785 нм. Устанавливают время накопления 5 сек с 5 повторами для усреднения, снимают фоновый спектр, предварительно экранировав микроскоп от внешних источников света. Затем включают лазер на мощности 20% (42 мВт) и накапливают ГКР-спектр с тем же временем накопления. Вычитание фонового спектра происходит автоматически.For the preparation of cryosol, aqueous hemoglobin solutions (2000 ng / ml) were used that did not contain impurities and contained an sucrose admixture (10 μg / ml) of sucrose, which negatively affected the aggregation of nanoparticles, decreasing the GCR activity of the sol. The test solution is mixed with a sol of silver nanoparticles (hydrodynamic diameter of 42 nm, a concentration of 10 11 hours / ml) in a volume ratio of 1: 1. The final concentration of protein in the mixture is 1000 ng / ml, nanoparticles -5 × 10 10 hours / ml, sucrose, if present, 10 μg / ml. To prepare the sample, 5 μl of the mixture is placed in an aluminum well 1 mm high and 2 mm in diameter. An aluminum well is placed for 1 hour in a thermal container filled with crushed ice from a frozen 20% aqueous solution of glycerol, with a temperature of about -4 ° C. Then the sample, placed in a plastic container with dry ice, is transferred under the microscope objective of a BWTek innoRam 785 spectrometer with a laser wavelength of 785 nm. Set the accumulation time to 5 seconds with 5 repetitions for averaging, take the background spectrum, pre-shielding the microscope from external light sources. Then turn on the laser at a power of 20% (42 mW) and accumulate the SERS spectrum with the same accumulation time. Subtraction of the background spectrum occurs automatically.
В такой же алюминиевой лунке снимают ГКР-спектр жидкого золя: помещают 5 мкл смеси в лунку, в качестве агрегирующего реагента добавляют NaCl в конечной концентрации 40 мМ, перемешивают и помещают образец под микроскоп спектрометра. Накопление сигнала осуществляют аналогично тому, как для замороженных образцов.The SQR spectrum of a liquid sol is taken in the same aluminum well: 5 μl of the mixture are placed in the well, NaCl is added as an aggregating reagent at a final concentration of 40 mM, mixed and the sample is placed under the microscope of the spectrometer. Signal accumulation is carried out in the same way as for frozen samples.
Изменение интенсивности спектра во времени отличается для измерений и использованием криозоля и с использованием жидкого золя. Как видно на фиг. 4, спектр чистого раствора гемоглобина, полученный с использованием криозоля, не убывает в интенсивности в течение, как минимум, 25 минут после замораживания, форма спектра также не меняется. На фиг. 5 представлены спектры такого же раствора белка, полученные с использованием жидкого золя. В этом случае, график на фиг. 5Б демонстрирует падение интенсивности ГКР-сигнала со временем. При сравнении спектров в криозоле и в жидком субстрате в начальный момент времени можно также отметить, что с использованием криозоля интенсивность спектра как минимум в 2,5 раза выше.The change in the intensity of the spectrum with time differs for measurements using cryosol and using liquid sol. As seen in FIG. 4, the spectrum of a pure hemoglobin solution obtained using cryosol does not decrease in intensity for at least 25 minutes after freezing, the shape of the spectrum also does not change. In FIG. 5 shows the spectra of the same protein solution obtained using liquid sol. In this case, the graph in FIG. 5B shows a decrease in the intensity of the SERS signal with time. When comparing the spectra in the cryosol and in the liquid substrate at the initial time, it can also be noted that using cryosol, the spectrum intensity is at least 2.5 times higher.
На Фиг. 6 сопоставлены ГКР-спектры чистого гемоглобина и в присутствии примеси сахарозы, полученные с использованием жидкого золя. Спектр на фиг. 6А получен для раствора гемоглобина без примеси сахарозы, спектр фиг. 6Б - с примесью сахарозы. Видно, что спектр гемоглобина с примесью сахарозы имеет существенно более низкую интенсивность, а также в нем отсутствуют некоторые, характерные для гемоглобина, пики. Очевидно, что присутствие сахарозы в жидком золе значительно затрудняет получение ГКР-спектров белка.In FIG. Figure 6 compares the SERS spectra of pure hemoglobin and in the presence of sucrose impurities obtained using liquid sol. The spectrum in FIG. 6A was obtained for a hemoglobin solution without sucrose impurity, the spectrum of FIG. 6B - with an admixture of sucrose. It can be seen that the spectrum of hemoglobin with an admixture of sucrose has a significantly lower intensity, and it also lacks some peaks characteristic of hemoglobin. Obviously, the presence of sucrose in liquid ash significantly complicates the obtaining of SERS spectra of the protein.
ГКР-спектр, полученный с использованием криозоля, при добавлении того же количества сахарозы оказывается только в два раза менее интенсивным по сравнению с криозолем без сахарозы, при этом полностью сохраняется форма спектра, что видно при сравнении спектра А на фиг. 7 со спектрами на Фиг. 4. Влияние сахарозы на интенсивность и, особенно, на форму спектра белка в криозоле значительно менее выражено, чем в жидком золе. При сравнении на фиг. 7 ГКР-спектров одной и той же смеси гемоглобина с сахарозой, полученных с использованием криозоля и жидкого субстрата (А и Б соответственно), видно, что усиление в криозоле, как минимум, в пять раз выше, чем в жидком золе, если сравнивать по пику на 1002 см-1, а пик 1046 см-1, вообще не определяется на ГКР-спектре, полученном с использованием жидкого субстрата.The SERS spectrum obtained using cryosol, when the same amount of sucrose is added, is only half as intense as cryosol without sucrose, while the shape of the spectrum is completely preserved, which is seen when comparing spectrum A in FIG. 7 with the spectra in FIG. 4. The effect of sucrose on the intensity and, especially, on the shape of the spectrum of the protein in cryosol is much less pronounced than in liquid ash. In comparison with FIG. 7 HSC spectra of the same mixture of hemoglobin with sucrose obtained using cryosol and liquid substrate (A and B, respectively), it is seen that the gain in cryozole is at least five times higher than in liquid ash, if compared by peak at 1002 cm -1 , and peak 1046 cm -1 is not determined at all on the SERS spectrum obtained using a liquid substrate.
Полученные результаты показывают, что использование криозоля для получения ГКР-спектра гемоглобина демонстрирует ряд преимуществ по сравнению с использованием жидкого золя: получение стабильного во времени ГКР-спектра, по сравнению с затухающим сигналом в жидком золе; повышение интенсивности ГКР-спектра и соотношения сигнал/шум; менее выраженное влияние примеси сахарозы на интенсивность ГКР-спектра; отсутствие влияния примеси сахарозы на форму ГКР-спектра; возможность получения полноценного ГКР-спектра белка в присутствии примеси сахарозы, по сравнению со спектром в жидком золе, в котором исчезла часть пиков, характерных для гемоглобина.The results show that the use of a cryosol to obtain the HSC spectrum of hemoglobin demonstrates a number of advantages compared with the use of liquid sol: obtaining a stable SEC spectrum in time, compared with a decaying signal in liquid ash; increasing the intensity of the SERS spectrum and signal to noise ratio; less pronounced effect of sucrose impurity on the intensity of the SERS spectrum; the absence of the effect of sucrose impurities on the shape of the SERS spectrum; the possibility of obtaining a complete SQR spectrum of the protein in the presence of sucrose impurity, compared with the spectrum in liquid ash, in which part of the peaks characteristic of hemoglobin disappeared.
Таким образом, заявляемый способ характеризуется следующими преимуществами относительно известных аналогов и прототипа:Thus, the claimed method is characterized by the following advantages relative to known analogues and prototype:
- отсутствие необходимости использовать агрегирующий реагент для получения интенсивных ГКР-спектров;- the absence of the need to use an aggregating reagent to obtain intense SERS spectra;
- способ позволяет определять белковые аналиты даже в присутствии веществ, обычно препятствующих агрегации, таких, как мочевина, сахароза и др., что позволяет использовать его для анализа белкового состава образцов, полученных из биологических жидкостей, и содержащих примеси, в присутствии которых невозможно индуцировать агрегацию наночастиц классическими методами;- the method allows the determination of protein analytes even in the presence of substances that usually prevent aggregation, such as urea, sucrose, etc., which allows it to be used to analyze the protein composition of samples obtained from biological fluids and containing impurities in the presence of which it is impossible to induce aggregation nanoparticles by classical methods;
- способ позволяет получить стабильные агрегаты плазмонных наночастиц, сохраняющие высокую ГКР-активность во времени, что позволяет получать спектры ГКР с большими временами накопления и значительно повышает чувствительность метода, а также позволяет сохранять образцы для проведения повторных измерений;- the method allows to obtain stable aggregates of plasmon nanoparticles that retain high SERS activity over time, which allows to obtain SEC spectra with large accumulation times and significantly increases the sensitivity of the method, and also allows you to save samples for repeated measurements;
- способ характеризуется высокой чувствительностью благодаря увеличению интенсивности и соотношения сигнал/шум получаемых ГКР-спектров.- the method is characterized by high sensitivity due to an increase in the intensity and signal-to-noise ratio of the obtained SERS spectra.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129494A RU2717160C1 (en) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Method for determining proteins using giant raman scattering using cryosols of plasmon nanoparticles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129494A RU2717160C1 (en) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Method for determining proteins using giant raman scattering using cryosols of plasmon nanoparticles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2717160C1 true RU2717160C1 (en) | 2020-03-18 |
Family
ID=69898389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019129494A RU2717160C1 (en) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Method for determining proteins using giant raman scattering using cryosols of plasmon nanoparticles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2717160C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438215A (en) * | 2022-04-02 | 2022-05-06 | 山东中医药大学 | SERS (surface enhanced Raman Scattering) probe and kit for detecting lung cancer marker based on DNA (deoxyribonucleic acid) hyperbranched self-assembly |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059820A1 (en) * | 1997-11-26 | 2003-03-27 | Tuan Vo-Dinh | SERS diagnostic platforms, methods and systems microarrays, biosensors and biochips |
| WO2005065541A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Intel Corporation | Methods for using raman spectroscopy to obtain a protein profile of a biological sample |
| RU2643697C1 (en) * | 2017-05-11 | 2018-02-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физического материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук | Method for producing composite nanostructures: silicon dioxide - silver |
| CN110068565A (en) * | 2019-06-06 | 2019-07-30 | 长江师范学院 | The application of SERS sensing chip and its detection method and preparation method |
-
2019
- 2019-09-19 RU RU2019129494A patent/RU2717160C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059820A1 (en) * | 1997-11-26 | 2003-03-27 | Tuan Vo-Dinh | SERS diagnostic platforms, methods and systems microarrays, biosensors and biochips |
| WO2005065541A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Intel Corporation | Methods for using raman spectroscopy to obtain a protein profile of a biological sample |
| RU2643697C1 (en) * | 2017-05-11 | 2018-02-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физического материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук | Method for producing composite nanostructures: silicon dioxide - silver |
| CN110068565A (en) * | 2019-06-06 | 2019-07-30 | 长江师范学院 | The application of SERS sensing chip and its detection method and preparation method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| S. Keskin, M. Culha "Label-free detection of proteins from dried-suspended droplets using surface enhanced Raman scattering", International Journal of Nanomedicine, Analyst, 2012, N137, 2651-2657. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438215A (en) * | 2022-04-02 | 2022-05-06 | 山东中医药大学 | SERS (surface enhanced Raman Scattering) probe and kit for detecting lung cancer marker based on DNA (deoxyribonucleic acid) hyperbranched self-assembly |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rawat et al. | Visual detection of arginine, histidine and lysine using quercetin-functionalized gold nanoparticles | |
| Csáki et al. | Localized surface plasmon resonance based biosensing | |
| Yang et al. | A dynamic surface enhanced Raman spectroscopy method for ultra-sensitive detection: from the wet state to the dry state | |
| Hamon et al. | Colloidal design of plasmonic sensors based on surface enhanced Raman scattering | |
| US9658163B2 (en) | Assaying substrate with surface-enhanced raman scattering activity | |
| Stokes et al. | Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy as a sensitive and selective technique for the detection of folic acid in water and human serum | |
| Rao et al. | Colorimetric and fluorometric detection of protamine by using a dual-mode probe consisting of carbon quantum dots and gold nanoparticles | |
| Lin et al. | Uniform gold spherical particles for single-particle surface-enhanced Raman spectroscopy | |
| Zhang et al. | Chemical segregation and reduction of Raman background interference using drop coating deposition | |
| Lin et al. | Applications of surface-enhanced Raman spectroscopy in detection fields | |
| JP2010203973A (en) | Measuring method of surface enhanced raman scattering | |
| RU2717160C1 (en) | Method for determining proteins using giant raman scattering using cryosols of plasmon nanoparticles | |
| Palanisamy et al. | Fast, sensitive and selective colorimetric gold bioassay for dopamine detection | |
| Unser et al. | Direct glucose sensing in the physiological range through plasmonic nanoparticle formation | |
| Liao et al. | Au–Ag–Au double shell nanoparticles-based localized surface plasmon resonance and surface-enhanced Raman scattering biosensor for sensitive detection of 2-mercapto-1-methylimidazole | |
| Al-Sammarraie et al. | Silver nanoparticles-based substrate for blood serum analysis under 785 nm laser excitation | |
| Zhu et al. | Au nanocone array with 3D hotspots for biomarker chips | |
| Nejdl et al. | Rapid preparation of self-assembled CdTe quantum dots used for sensing of DNA in urine | |
| Cheng et al. | Size-controllable colloidal Ag nano-aggregates with long-time SERS detection window for on-line high-throughput detection | |
| Delfino | Light scattering methods for tracking gold nanoparticles aggregation induced by biotin–neutravidin interaction | |
| Saini et al. | Axonic Au tips induced enhancement in Raman spectra and biomolecular sensing | |
| Liu et al. | Label-free and sensitive detection of microalgae protein using GNRs-based resonance light scattering system | |
| Wang et al. | Research progress of SERS on uranyl ions and uranyl compounds: a review | |
| Geng et al. | Rapid and sensitive detection of amphetamine by SERS-based competitive immunoassay coupled with magnetic separation | |
| Fu et al. | Highly sensitive and naked eye dual-readout method for L-cysteine detection based on the NSET of fluorophore functionalized gold nanoparticles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |