RU2716485C1

RU2716485C1 - Method of growing enamel in experiment

Info

Publication number: RU2716485C1
Application number: RU2019104280A
Authority: RU
Inventors: Игорь Юрьевич Малышев; Лариса Вячеславовна Кузнецова; Светлана Владимировна Лямина; Сергей Валерьевич Калиш; Галина Сергеевна Рунова; Олег Олегович Янушевич
Original assignee: Олег Олегович Янушевич
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2020-03-11

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to dentistry, cell biotechnologies, regenerative medicine. Epithelial portion of the dental germ is separated from the mesenchyma with preserving a fragment of the mesenchymal tissue. In the petri dish, a drop of collagen gel with volume of 30 mcl is formed, into which a tissue fragment is introduced - a previously separated epithelial portion of the dental germ and a fragment of a mesenchyma associated with it. Petri dish with collagen gel drop is incubated for 15 minutes at 37 °C in an incubator in conditions of 5 % CO₂ for hardening of collagen gel. Culture plate is used to insert mesenchymal cells prepared from a tooth germ. Cell culture insert with a pore diameter of 0.4 mcm is placed in the well; a formed drop of collagen gel with an epithelial tissue of a dental germ associated with a fragment of mesenchymal tissue is transferred by tweezers. After 14 days, developing enamel is transferred into a biological reactor - for a mouse kidney capsule. After 10 weeks, the kidney of the experimental animal is isolated, as well as developing enamel from under the kidney capsule.

EFFECT: method enables to obtain enamel identical to enamel of natural origin by biochemical and histological structure.

1 cl, 1 ex, 18 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, клеточным биотехнологиям, регенеративной медицине и может быть использовано для восстановления поврежденных структур - эмали или создания образцов эмали с последующим применением в клинической практикеThe invention relates to medicine, namely to dentistry, cellular biotechnology, regenerative medicine and can be used to repair damaged structures - enamel or create enamel samples with subsequent use in clinical practice

Зрелая эмаль представляет собой наиболее твердую минерализованную ткань в организме человека, содержащую более 95% минеральных и менее 1% органических веществ [Chen, H.F.; Tang, Z.Y.; Liu, J.; Sun, K.; Chang, S.R.; Peters, M.C.; Mansfield, J.F.; Czajka-Jakubowska, A.; Clarkson, B.H. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Adv. Mater. 2006, 18, 1846-1851]. Учитывая невозможность самопроизвольного восстановления структуры эмали, рассматриваются несколько вариантов ее репарации. Существующие традиционные методы реставрации повреждений эмали не обеспечивают полное соответствие восстановленных повреждений и граничащей с ними естественной эмали по химическому составу, кристаллическим и физико-химическими свойствами. Применяемые материалы не могут хорошо сочетаться с эмалью на границе повреждения, подвергаются риску краевого подтекания, что приводит к развитию гиперчувствительности и вторичному кариесу. В связи с этим особую актуальность приобретают разработки альтернативных стратегий восстановления дефектов эмали, основанных на применении клеточных технологий и использовании стволовых клеток, скэффолдов и факторов роста.Mature enamel is the hardest mineralized tissue in the human body, containing more than 95% mineral and less than 1% organic matter [Chen, H.F .; Tang, Z.Y .; Liu, J .; Sun, K .; Chang, S.R .; Peters, M.C .; Mansfield, J.F .; Czajka-Jakubowska, A .; Clarkson, B.H. Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure. Adv. Mater. 2006, 18, 1846-1851]. Given the impossibility of spontaneous restoration of the enamel structure, several options for its repair are considered. Existing traditional methods for the restoration of enamel damage do not provide full correspondence between the damaged lesions and the natural enamel bordering them in terms of chemical composition, crystalline and physicochemical properties. The materials used cannot combine well with the enamel at the boundary of the damage; they are at risk of edge leakage, which leads to the development of hypersensitivity and secondary caries. In this regard, the development of alternative strategies for the restoration of enamel defects based on the use of cell technology and the use of stem cells, scaffolds and growth factors is of particular relevance.

Проведенный анализ существующих биотехнологий восстановления дефектов или создания эмали показал, что методы основываются как на принципе биомиметической минерализации: RU 2535080, US 2012/0148538, US 8466101, WO 2009/157869, так и применении тканевой инженерии и клеточных биотехнологий с применением стволовых клеток, факторов роста и скэффолдов (WO 2015/168022, US 2014/0023979, US 2014/0370515, US 2014/0093481, WO 2014126007 A1, US 8679755 B2, US 20110306135 A1).The analysis of existing biotechnologies for the restoration of defects or the creation of enamel showed that the methods are based both on the principle of biomimetic mineralization: RU 2535080, US 2012/0148538, US 8466101, WO 2009/157869, and the use of tissue engineering and cell biotechnology using stem cells, factors growth and scaffolds (WO 2015/168022, US 2014/0023979, US 2014/0370515, US 2014/0093481, WO 2014126007 A1, US 8679755 B2, US 20110306135 A1).

Биотехнология, описанная в патенте WO 2015/168022 «Enamel products and methods of use» (русс.«Продукты эмали и методы применения»), включает применение трехмерных культуральных систем (3D), которые могут быть использованы для получения эмали. Изобретение описывает способы культивирования различных типов клеток для получения эмали с помощью описанных моделей, а также методы применения полученных эмалевых продуктов в хирургических пособиях в стоматологии. В качестве возможных источников стволовых клеток могут быть использованы первичный эмалевый орган, пул эпителиальных клеток Малассез, генетически модифицированные клетки. Предлагаются возможные варианты культивирования клеток - как в условиях 2D с последующим переводом в трехмерные структуры, так и исходное культивирование клеток в 3D структурах, применение матригеля и дополнительно вносимых в кулыуральную среду факторов роста - TGF, EGF, инсулино-подобного фактора роста, фактора роста фибробластов, тканевого активатора плазминогена и др. Для 3D культур предлагается использование специализированного культурального пластика AggreWell™ с последующим внесением сформированных сфероидов в специализированные биореакторы ProtoTissue™. Для стимуляции процессов минерализации предлагается дополнительное использование минерализующего раствора (кальций 2,5 mM, фосфаты 1,5 mM), либо возможно использование других минерализующих растворов, содержащих 10% раствора глюконата кальция, 1% фторида натрия, 3% раствор ремодент. В качестве контрольных маркеров дифференцировки in vivo и in vitro использованы амелогенин, амелобластин, тафтелин, энамелин, ММР-20 (матриксная металлопротеиназа-20) и EMSP-1 (сериновая протеаза эмалевого матрикса-1), цитокератин-14. Предлагаемая методика подтверждается результатами, полученными на примере использования иммортализованной культуры кератиноцитов ротовой полости мыши (IMOK). Данная методика включает подробное описание условий культивирования выбранных типов клеток, однако подразумевает использование достаточно большого числа дополнительных внешних факторов роста и минерализующего раствора, а также требует достаточного технического обеспечения, поскольку включает обязательное использование специализированного биореактора и систем для 3D культивирования.Biotechnology described in patent WO 2015/168022 "Enamel products and methods of use" (rus. "Enamel products and methods of application") includes the use of three-dimensional culture systems (3D), which can be used to obtain enamel. The invention describes methods for culturing various types of cells to obtain enamel using the described models, as well as methods for using the obtained enamel products in surgical aids in dentistry. Primary enamel organ, a pool of Malasses epithelial cells, and genetically modified cells can be used as possible sources of stem cells. Possible cell cultivation options are proposed - both in 2D conditions with subsequent transfer to three-dimensional structures, as well as initial cell cultivation in 3D structures, the use of matrigel and additional growth factors introduced into the cuyural medium - TGF, EGF, insulin-like growth factor, fibroblast growth factor , tissue plasminogen activator, etc. For 3D cultures, the use of specialized culture plastic AggreWell ™ is proposed with the subsequent introduction of the formed spheroids into specialized biorea Ctoors ProtoTissue ™. To stimulate mineralization processes, an additional use of a mineralizing solution is proposed (calcium 2.5 mM, phosphates 1.5 mM), or it is possible to use other mineralizing solutions containing 10% calcium gluconate solution, 1% sodium fluoride, 3% remodent solution. Amelogenin, ameloblastin, taftelin, enamelin, MMP-20 (matrix metalloproteinase-20) and EMSP-1 (enamel matrix-1 serine protease), cytokeratin-14 were used as control markers of in vivo and in vitro differentiation. The proposed methodology is confirmed by the results obtained using an immortalized culture of mouse keratinocytes in the oral cavity (IMOK) as an example. This technique includes a detailed description of the cultivation conditions of the selected cell types, however, it implies the use of a sufficiently large number of additional external growth factors and a saline solution, and also requires sufficient technical support, since it includes the mandatory use of a specialized bioreactor and systems for 3D cultivation.

В разработке, запатентованной US 2014/0023979 Regeneration of ameloblast cells and dental enamel in vivo» (русс.«Регенерация амелобластов и эмали зуба in vivo»), предлагается способ лечения зубов при необходимости регенерации эмали зуба и/или амелобластов. Этот способ включает воздействие, по меньшей мере, на часть коронки, корневого канала или периапикальной части ткани зуба и введение эмалевого материала в количестве, достаточном, чтобы способствовать регенерации зубной эмали и/или амелобластов таким образом, что по меньшей мере часть обнаженной коронки, корневого канала или периапикальной ткани находятся в контакте с эмалью.In the development, patented US 2014/0023979 Regeneration of ameloblast cells and dental enamel in vivo "(rus." Regeneration of ameloblasts and tooth enamel in vivo "), a method of treating teeth if necessary, the restoration of tooth enamel and / or ameloblasts. This method includes exposing at least a portion of the crown, root canal or periapical part of the tooth tissue and introducing enamel material in an amount sufficient to promote the regeneration of tooth enamel and / or ameloblasts such that at least a portion of the exposed root crown canal or periapical tissue are in contact with enamel.

Патентованная биотехнология US 2014/0370515 «Method of co-culturing human endometrial stem cells and rat embryonic tooth bud cells to obtain ameloblast cells» (русс. «Метод кокультивирования стволовых клеток эндометрия человека и эмбриональных клеток зачатка зуба крысы для получения амелобластов») описывает различные варианты совместного культивирования человеческих эндометриальных стволовых клеток и эмбриональных клеток зачатка зуба крысы для получения амелобластов. Человеческие стволовые клетки эндометрия выделяют у женщин в возрасте 18-40 лет, культивируют, идентифицируют с помощью проточной цитометрии. Клетки крысы выделяют из зачатков зубов эмбрионов и культивируют. После того достижения желаемого количества клеток клетки переносят в культуральный планшет для совместного культивирования и получения амелобластов. Недостатком данного метода является использование различных видовых источников клеток и исключительно экспериментальная апробация данного способа, а также получение лишь дифференцированных клеток - амелобластов без описания достижения конечного результата - эмали.Patented biotechnology US 2014/0370515 “Method of co-culturing human endometrial stem cells and rat embryonic tooth bud cells to obtain ameloblast cells” (Russian. “Method for co-cultivation of human endometrial stem cells and embryonic cells, rat tooth rudiment for obtaining ameloblasts”) describes various options for co-cultivation of human endometrial stem cells and embryonic cells, rat tooth rudiment to obtain ameloblasts. Human endometrial stem cells are isolated in women aged 18-40 years old, cultivated, identified by flow cytometry. Rat cells are isolated from the embryos of the tooth embryos and cultured. After reaching the desired number of cells, the cells are transferred to a culture plate for co-culture and obtaining ameloblasts. The disadvantage of this method is the use of various species of cell sources and exclusively experimental testing of this method, as well as obtaining only differentiated cells - ameloblasts without a description of the achievement of the final result - enamel.

Биотехнология US 20140093481 «Production of dentin, cementum and enamel by cells» (русс. «Продукция дентина, цемента и эмали клетками»), рассматривает способ формирования минерализованного материала путем совместного культивирования эпителиальных клеток, таких как амелобласты и мезенхимальных клеток, таких как остеобласты или одонтобласты, в минерализирующей среде. Предусмотрено внесение эпителиальных клеток и клеток мезенхимы, а также минерализованной среды для минерализации в матрице. Также описаны способы данного культивирования и способы применения этого метода. Данный способ достаточно близок к разрабатываемому, однако включает использование уже дифференцированных клеток.Biotechnology US 20140093481 "Production of dentin, cementum and enamel by cells" (rus. "Production of dentin, cement and enamel by cells"), considers a method of forming mineralized material by co-culturing epithelial cells such as ameloblasts and mesenchymal cells, such as osteoblasts or odontoblasts in a mineralizing medium. The introduction of epithelial cells and mesenchyme cells, as well as a mineralized medium for mineralization in the matrix. Also described are methods of this cultivation and methods of using this method. This method is quite close to the developed one, however, it involves the use of already differentiated cells.

Кроме того, изучена и представлена экспериментально возможность использования синтетических и биоактивных наноструктур с возможностью самосборки в физиологических условиях с целью имитации внеклеточного матрикса, окружающего амелобласты [Huang Z, Newcomb CJ, Zhou Y, Lei YP, Bringas P Jr, Stupp SI, et al. The role of bioactive nanofibers in enamel regeneration mediated through integrin signals acting upon C/EBPβ and c-Jun. Biomaterials. 2013;34(13):3303-14]. Амелобласто-подобные клетки (клеточная линия LS8) и эпителиальные клетки первичного эмалевого органа (ЕОЕ) культивировались с полиакриламидным гидрогелем, а также полиакриламид вводился в эпителий эмалевого органа резцов мышиных эмбрионов, которые затем трансплантировались под капсулу почки мыши-хозяина для длительного культивирования [Huang Z, Newcomb CJ, Zhou Y, Lei YP, Bringas P Jr, Stupp SI, et al. The role of bioactive nanofibers in enamel regeneration mediated through integrin signals acting upon C/EBPβ and c-Jun. Biomaterials. 2013;34(13):3303-14]. Биоактивный полиакриламид индуцировал развитие структур гидроксиапатита, подобных естественной эмали за счет воздействия на клетки путем увеличения их пролиферации и дифференцировки при доставке ключевых сигналов интегринов. Описанный метод апробирован экспериментально и трудновыполним в условиях клинической практики. Тем не менее, разработка технологии по управлению клетками первичного эмалевого органа является существенным преимуществом по сравнению с замещением эмали и позволяет рассмотреть возможность разработки эмали, основанной на применении пассированных клеток первичного эмалевого органа с использованием тканевой инженерии.In addition, the possibility of using synthetic and bioactive nanostructures with the possibility of self-assembly under physiological conditions to simulate the extracellular matrix surrounding ameloblasts has been studied and presented experimentally [Huang Z, Newcomb CJ, Zhou Y, Lei YP, Bringas P Jr, Stupp SI, et al. The role of bioactive nanofibers in enamel regeneration mediated through integrin signals acting upon C / EBPβ and c-Jun. Biomaterials. 2013; 34 (13): 3303-14]. Ameloblast-like cells (LS8 cell line) and primary enamel organ epithelial cells (EOE) were cultured with a polyacrylamide hydrogel, and polyacrylamide was introduced into the epithelium of the enamel organ of mouse embryo incisors, which were then transplanted under the capsule of the kidney of the host mouse for long-term cultivation [Huang Z , Newcomb CJ, Zhou Y, Lei YP, Bringas P Jr, Stupp SI, et al. The role of bioactive nanofibers in enamel regeneration mediated through integrin signals acting upon C / EBPβ and c-Jun. Biomaterials. 2013; 34 (13): 3303-14]. Bioactive polyacrylamide induced the development of hydroxyapatite structures, similar to natural enamel, by affecting cells by increasing their proliferation and differentiation upon delivery of key integrin signals. The described method has been tested experimentally and is difficult to perform in clinical practice. Nevertheless, the development of technology for managing cells of the primary enamel organ is a significant advantage over enamel replacement and allows one to consider the possibility of developing enamel based on the use of passivated cells of the primary enamel organ using tissue engineering.

В эксперименте клетки первичного эмалевого органа свиней также трансплантировали на биоразлагаемые скэффолды in vivo [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010]. Свежие клетки пульпы зуба из третьих моляров свиней на ранней стадии формирования коронки вначале помещались на верхушку скэффолда, а затем пересеянные клетки первичного эмалевого органа помещались непосредственно на слой клеток пульпы. Через 4 недели после трансплантации клеток в сочетании с клетками пульпы зуба на скэффолде, было выявлено несколько феноменов, относящихся к амелогенезу [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010]. В наиболее зрелых структурах в имплантах была выявлена эмаль. Кроме того, иммунологическая реактивность на амелогенин была выявлена в высоких столбчатых эпителиальных клетках на поверхности дентина или эмали, что свидетельствует о том, что эмаль, созданная в результате тканевой инженерии, содержит хорошо развитые амелобласты. Учитывая совокупность полученных результатов, пассируемые клетки эмалевого органа обладают способностью генерировать эмаль. Продукция эмали в данной культуральной модели увеличивалась, поскольку клетки первичного эмалевого органа поддерживались на недифференцированной стадии в амелобласто-подобной линии клеток на ЗТЗ слое фидеров. Формирование эмали всегда наблюдалось после дентина, который образовывался в имплантах. С другой стороны, при сочетании пассируемых клеток эмалевого органа с пассируемыми клетками пульпы зуба, комплексы эмаль-дентин ни в одном из имплантов выявлены не были [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010]. Недостатком использованного способа является применение в качестве основных - клеток первичного эмалевого органа, однако данный тип клеток отсутствует в зубах взрослых, и в качестве альтернативных источников клеток, формирующих эмаль, необходимо рассматривать другие источники, такие как пул эпителиальных клеток Малассез [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010], клетки костного мозга [Ни В, Unda F, Bapp-Kuchler S, Jimenez L, Wang XJ, Haikel Y, et al. Bone marrow cells can give rise to Ameloblast like cells. J Dent Res. 2006;85(5):416-21], эпителиальные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека [Li-Wei Zheng, Logan Linthicum, Pamela K, Den Besten, Yan Zhang. The similarity between human embryonic stem cell-derived epithelial cells and ameloblast-lineage cells. Journal of Oral Science. 2013;5:1-6], кератиноциты ротовой полости [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010], эпителиальные клетки кожи [Liu Y, Jiang M, Hao W, Liu W, Tang L, Liu H, Jin Y. Skin epithelial cells as possible substitutes for ameloblasts during tooth regeneration. J Tissue Eng Regen Med. 2013;7(12):934-43].In an experiment, cells of pig primary enamel organ were also transplanted into biodegradable scaffolds in vivo [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010]. Fresh tooth pulp cells from third molars of pigs at an early stage of crown formation were first placed on the top of the scaffold, and then the transplanted cells of the primary enamel organ were placed directly on the pulp cell layer. 4 weeks after transplantation of cells in combination with tooth pulp cells on a scaffold, several phenomena related to amelogenesis were identified [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010]. Enamel was detected in the most mature structures in implants. In addition, immunological reactivity to amelogenin was detected in high columnar epithelial cells on the surface of dentin or enamel, which indicates that the enamel created as a result of tissue engineering contains well-developed ameloblasts. Given the totality of the results, passivated cells of the enamel organ have the ability to generate enamel. Enamel production in this culture model increased, as the cells of the primary enamel organ were maintained at an undifferentiated stage in the ameloblast-like cell line on the ZTZ layer of feeders. Enamel formation has always been observed after dentin, which was formed in implants. On the other hand, when the passivated cells of the enamel organ were combined with the passivated cells of the tooth pulp, enamel-dentin complexes were not detected in any of the implants [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010]. The disadvantage of the used method is the use of primary cells of the primary enamel organ as the main cells, however, this type of cells is absent in the teeth of adults, and other sources, such as a pool of Malasses epithelial cells [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010], bone marrow cells [NI B, Unda F, Bapp-Kuchler S, Jimenez L, Wang XJ, Haikel Y, et al. Bone marrow cells can give rise to Ameloblast like cells. J Dent Res. 2006; 85 (5): 416-21], epithelial cells derived from human embryonic stem cells [Li-Wei Zheng, Logan Linthicum, Pamela K, Den Besten, Yan Zhang. The similarity between human embryonic stem cell-derived epithelial cells and ameloblast-lineage cells. Journal of Oral Science. 2013; 5: 1-6], oral keratinocytes [Masaki J. Honda and Ken-ichiroHata. Enamel Tissue Engineering. In Daniel Eberli Editor. Tissue Engineering, publisher. In tech. 2010], skin epithelial cells [Liu Y, Jiang M, Hao W, Liu W, Tang L, Liu H, Jin Y. Skin epithelial cells as possible substitutes for ameloblasts during tooth regeneration. J Tissue Eng Regen Med. 2013; 7 (12): 934-43].

Все использованные подходы способствуют восстановлению эмали, но, применялись только на экспериментальных моделях и позволяли достичь реминерализации или восстановления эмали в различной степени.All approaches used contribute to the restoration of enamel, but were used only on experimental models and made it possible to achieve remineralization or restoration of enamel to various degrees.

Кроме того, разработан ряд клеточных биотехнологий, основной целью которых является создание целостного зуба или нескольких зубов из одного клеточного источника.In addition, a number of cellular biotechnologies have been developed, the main purpose of which is to create an integral tooth or several teeth from one cellular source.

Патент US 8679755 В2 «Method of producing tooth, set of teeth and method of producing tissue» (русс.«Метод выращивания зуба, зубного ряда и метод выращивания ткани») 8679755, патентообладатель Organ Technologies Inc, описывает модель культивирования двух типов клеток (мезенхимальных и эпителиальных) внутри носителя, с последующим контактом носителя с клетками почки. В данной модели используются клеточные массы, содержащие только мезенхимальные клетки или эпителиальные клетки. Клеточные массы, находящиеся в непосредственном контакте друг с другом, помещают внутрь поддерживающего носителя и культивируют, при этом в процессе культивирования не достигается перемешивания различных типов клеток, тогда как контакт между клеточными массами сохраняется. Данный способ позволял эффективно воспроизводить взаимодействие между мезенхимальными и эпителиальными клетками, необходимое для формирования тканей зуба.Patent US 8679755 B2 "Method of producing tooth, set of teeth and method of producing tissue" (rus. "Method of growing a tooth, dentition and method of growing tissue") 8679755, patent holder of Organ Technologies Inc, describes a model of cultivation of two types of cells (mesenchymal and epithelial) inside the carrier, followed by contact of the carrier with kidney cells. In this model, cell masses containing only mesenchymal cells or epithelial cells are used. Cellular masses that are in direct contact with each other are placed inside the support carrier and cultured, while in the process of cultivation, mixing of different types of cells is not achieved, while the contact between the cell masses is maintained. This method made it possible to efficiently reproduce the interaction between mesenchymal and epithelial cells, necessary for the formation of tooth tissues.

Патент RU 2521195 С2 «Способ восстановления утраченного зуба и способ изготовления восстановительного материала» содержит данные о возможности изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта. В предлагаемом изобретении используется два возможных варианта комбинаций исходного биологического материала. В качестве первого варианта исходного биологического материала рассматривается клеточная масса, образованная клетками/клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, в качестве второго - клеточная масса, образованная другой клеткой/другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток. Отмечено, что одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и указанные клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания. Выращивают указанные клеточные массы с формированием целого восстанавливаемого зуба или его зачатка. Затем определяют ориентацию целого восстанавливаемого зуба или его зачатка, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить целый восстанавливаемый зуб или его зачаток в области утраченного зуба таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта, при этом зубной зачаток или зуб используют в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба. Данное техническое решение предполагает восстановление области утраченного зуба путем внедрения восстанавливаемого зубного зачатка или восстанавливаемого целого зуба, изготавливаемого способом, описанным в данном патенте. Данный способ близок к разрабатываемому, однако его основной целью является восстановление области утраченного зуба за счет внедрения восстанавливаемого зубного зачатка, либо восстанавливаемого целого зуба, но не определенного конкретного фрагмента ткани. В патенте рассматривается возможность использования с целью регенерации зубного зачатка или целого зуба эпителиальных и мезенхимальных клеток, полученных из различных источников, при этом рассматривается только вариант культивирования указанных пулов клеток в тесном контакте друг с другом в присутствии питательной среды, стандартных концентраций сыворотки и применения возможных дополнительных факторов роста.Patent RU 2521195 C2 “A method of restoring a lost tooth and a method of manufacturing a restorative material” contains data on the possibility of manufacturing a restorative material used to restore an area of a lost tooth in the oral cavity. In the present invention uses two possible combinations of the source of biological material. As the first variant of the initial biological material, the cell mass formed by the cells / cell from mesenchymal or epithelial cells is considered, and the second is the cell mass formed by another cell / other cells from mesenchymal or epithelial cells. It is noted that one of the mesenchymal or epithelial cells is obtained from the tooth germ and these cell masses are placed in close contact with each other without mixing. These cell masses are grown with the formation of a whole restored tooth or its rudiment. Then, the orientation of the whole restored tooth or its rudiment formed by the cultivation is determined, which allows introducing the whole restored tooth or its rudiment in the region of the lost tooth so that the crown of the tooth is directed inside the oral cavity, while the tooth germ or tooth is used as a restorative material to obtain the equivalent of a lost tooth in the area of a lost tooth. This technical solution involves the restoration of the area of a lost tooth by introducing a restored dental embryo or a restored whole tooth produced by the method described in this patent. This method is close to being developed, however, its main goal is to restore the area of the lost tooth due to the introduction of a restored tooth germ, or a restored whole tooth, but not a specific specific tissue fragment. The patent considers the possibility of using epithelial and mesenchymal cells obtained from various sources for the purpose of regenerating a tooth germ or a whole tooth, while only the option of culturing these cell pools in close contact with each other in the presence of a nutrient medium, standard serum concentrations and the use of possible additional growth factors.

В патенте WO 2014126007 А1 описан «Method for producing a plurality of teeth from one isolated tooth germ» (русс.«Метод создания нескольких зубов из одного изолированного зубного зачатка»). В данном изобретении предлагается способ получения множества зубов из одного изолированного зубного зачатка с целью увеличения общего числа структур, которые могут быть использованы для трансплантации. Указанный способ получения множества зубов из одного изолированного зубного зародыша, включающего слой эпителиальной ткани и слой мезенхимальной ткани, подразумевает две последовательные стадии: (а) стадии, на которой один изолированный зубной зародыш, включающий слой эпителиальной ткани и слой мезенхимальной ткани, полностью или частично разделен, причем указанное разделение характеризуется тем, что каждая разделенная часть зуба-зародыша разделена так, чтобы включать часть слоя эпителиальной ткани и часть слой мезенхимальной ткани; и (b) стадию, на которой образуется множество зубов путем культивирования разделенного зубного зародыша in vitro или культивирования раздробленного зубного зачатка in vivo у экспериментального животного. Данный способ близок к разрабатываемому, однако его основной целью является получение целостных зубов, а также дробление зубного зачатка, исходно использующегося как источник стволовых клеток с целью получения множества зубных структур.Patent WO 2014126007 A1 describes “Method for producing a plurality of teeth from one isolated tooth germ” (Russian: “Method for creating several teeth from one isolated tooth germ”). The present invention provides a method for producing multiple teeth from one isolated tooth germ in order to increase the total number of structures that can be used for transplantation. The specified method of obtaining multiple teeth from one isolated dental embryo, including a layer of epithelial tissue and a layer of mesenchymal tissue, involves two successive stages: (a) the stage at which one isolated dental embryo, comprising a layer of epithelial tissue and a layer of mesenchymal tissue, is fully or partially divided moreover, the specified separation is characterized in that each divided part of the tooth-germ is divided so as to include part of the layer of epithelial tissue and part of the layer of mesenchymal tissue; and (b) a stage in which a plurality of teeth is formed by in vitro cultivating a divided dental embryo or in vivo culturing a fragmented dental germ in an experimental animal. This method is close to being developed, however, its main goal is to obtain complete teeth, as well as crushing the tooth germ, which was originally used as a source of stem cells in order to obtain many dental structures.

Основным недостатком применения биотехнологий для восстановления дефектов эмали с помощью стволовых клеток (WO 2007/036232, US 2014/0093481, US 2014/0023979, US 2014/0370515, WO 2016/076929) является сложность получения исходного материала, отсутствие данных о жесткости предлагаемых скэффолдов для генерации амелобластов и существенные ограничения для трансляции в клиническую практику (US 2014/0370515); при использовании различных составов для реминерализации и восстановления дефектов эмали (WO 2009/157869, WO 2015/168022, US 2012/0148538, RU 2535080) - необходимость применения белков, их аналогов в сочетании с различными реминерализующими средами и стволовыми клетками, что существенно затрудняет возможность трансляции в клиническую практику и не обеспечивает стабильной степени восстановления дефектов эмали; способы, описанные в патентах WO 2014126007 A1, US 8679755 В2, RU 2521195 С2, предлагают в качестве конечного результата выращивание целостных биоинженерных структур - зубов, одного, либо нескольких, а также описывают возможность генерации восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, из экспериментально доступных источников - зубных зачатков эмбрионов, либо с использованием эпителиальных и мезенхимальных клеток иного происхождения, например, кроветворных, либо жировой ткани (патент RU 2521195 С2). Все описанные способны в качестве конечной цели имели создание целостных структур - зубного зачатка, либо целого зуба, подразумевая использование для этого именно клеточные источники двух популяций - эпителиальные и мезенхимальные. Однако, учитывая применяемые биоинженерные технологии, все предлагаемые способы характеризуются многостадийностью и значительным числом манипуляций с клетками, что требует многократных воздействий на стволовые клетки как ферментами, нарушающими межклеточные взаимодействия, так и механическими факторами.The main drawback of the use of biotechnologies for the restoration of enamel defects using stem cells (WO 2007/036232, US 2014/0093481, US 2014/0023979, US 2014/0370515, WO 2016/076929) is the difficulty in obtaining the source material, the lack of data on the rigidity of the proposed scaffolds for the generation of ameloblasts and significant limitations for translation into clinical practice (US 2014/0370515); when using various compositions for the remineralization and restoration of enamel defects (WO 2009/157869, WO 2015/168022, US 2012/0148538, RU 2535080) - the need for the use of proteins, their analogues in combination with various remineralizing media and stem cells, which significantly complicates the possibility translation into clinical practice and does not provide a stable degree of restoration of enamel defects; The methods described in patents WO 2014126007 A1, US 8679755 B2, RU 2521195 C2, offer, as an end result, the growth of integral bioengineered structures - teeth, one or several, and also describe the possibility of generating restorative material used to restore the area of a lost tooth in the cavity mouth, from experimentally available sources - the embryonic dental rudiments, or using epithelial and mesenchymal cells of a different origin, for example, hematopoietic or adipose tissue (patent RU 2521195 C2). All those described are capable, as an ultimate goal, of creating integral structures - the tooth germ, or the whole tooth, implying the use of the cellular sources of two populations for this - epithelial and mesenchymal. However, given the applied bioengineering technologies, all the proposed methods are characterized by multistage and a significant number of manipulations with cells, which requires multiple effects on stem cells both by enzymes that disrupt intercellular interactions and by mechanical factors.

Наиболее близким к предлагаемой технологии выращивания эмали является метод выращивания биоинженерного зуба из стволовых эпителиальных и мезенхимальных клеток, описанный в литературе [Takashi Tsuji (ed.), Organ Regeneration: 3D Stem Cell Culture & Manipulation, Methods in Molecular Biology, vol. 1597, DOI 10.1007/978-1-4939-6949-4_8]. В качестве основного источника стволовых клеток авторами рассматривается зубной зачаток эмбриона мыши на сроке эмбрионального развития 14,5 дней, из которого выделяются эпителиальная и мезенхимальная части зубного зачатка с последующим ферментативным разделением тканей на отдельные пулы эпителиальных и мезенхимальных клеток, соответственно. Далее пулы клеток последовательно помещаются в носитель, представленный коллагеном (коллагеновая капля) и культивируются в стерильных условиях инкубатора в течение 14 дней, после чего выполняется помещение сформированного биоинженерного зачатка зуба под капсулу почки на 30-60 дней, достаточных для формирования зуба необходимой длины и гистологически соответствующего обычному зубу.Closest to the proposed enamel growing technology is a method for growing a bioengineered tooth from stem epithelial and mesenchymal cells described in the literature [Takashi Tsuji (ed.), Organ Regeneration: 3D Stem Cell Culture & Manipulation, Methods in Molecular Biology, vol. 1597, DOI 10.1007 / 978-1-4939-6949-4_8]. The authors consider the tooth germ of the mouse embryo at the embryonic development period of 14.5 days as the main source of stem cells, from which the epithelial and mesenchymal parts of the tooth germ are distinguished, followed by enzymatic separation of tissues into separate pools of epithelial and mesenchymal cells, respectively. Next, the cell pools are sequentially placed in a carrier represented by collagen (collagen drop) and cultured under sterile incubator conditions for 14 days, after which the formed bioengineered tooth rudiment is placed under the kidney capsule for 30-60 days, sufficient to form a tooth of the required length and histologically corresponding to an ordinary tooth.

В качестве прототипа разрабатываемой биотехнологии можно рассматривать патент US 20110306135 A1, патентообладатель Organ Tech Inc, «Method for producing tooth» (русс.«Метод создания зуба»), предусматривающий возможность выращивания зуба желаемой длины в одном направлении. Данный способ описывает двухступенчатую модель культивирования двух типов клеток (мезенхимальных и эпителиальных) внутри поддерживающего носителя на примере коллагенового геля, при обязательном соблюдении непосредственного контакта пулов мезенхимальных и эпителиальных клеток друг с другом. Описана возможность использования стволовых эпителиальных и мезенхимальных клеток из зубного зачатка для формирования целого зуба. В патенте указывается, что существенное значение при определении длины выращиваемого зуба имеет площадь контакта эпителиального и мезенхимального клеточных слоев.As a prototype of the biotechnology being developed, one can consider US 20110306135 A1, the patent holder of Organ Tech Inc, “Method for producing tooth” (Russian: “Method for creating a tooth”), which provides for the possibility of growing a tooth of the desired length in one direction. This method describes a two-stage model for the cultivation of two types of cells (mesenchymal and epithelial) inside a support carrier using the example of a collagen gel, with the obligatory observance of the direct contact of the pools of mesenchymal and epithelial cells with each other. The possibility of using stem epithelial and mesenchymal cells from the tooth germ to describe the formation of an entire tooth is described. The patent indicates that the contact area of the epithelial and mesenchymal cell layers is essential in determining the length of the grown tooth.

Задачей данного изобретения является получение фрагмента эмали зуба, по биохимическому и гистологическому строению идентичному эмали естественного происхождения.The objective of the invention is to obtain a fragment of tooth enamel, according to the biochemical and histological structure of an identical enamel of natural origin.

Технический результат заключается в образовании эмали, по биохимическому и гистологическому строению, идентичной эмали естественного происхождения.The technical result consists in the formation of enamel, according to the biochemical and histological structure, identical to enamel of natural origin.

Это достигается за счет в последовательного культивирования целостного фрагмента эпителиальной части зубного зачатка с небольшим фрагментом мезенхимальной ткани, включающий следующие этапы: в чашке Петри формируется капля коллагенового геля объемом 30 мкл, в которую вносится фрагмент ткани - ранее отделенная эпителиальная часть зубного зачатка и небольшой фрагмент связанной с ней мезенхимы, чашка Петри с каплей геля коллагена инкубируется в течение 15 мин при 37°С в инкубаторе в условиях 5% CO2 для затвердевания коллагенового геля, в культуральный планшет вносятся полученные из зубного зачатка мезенхимальные клетки, после чего в лунку помещается вставка для клеточной культуры с диаметром пор 0,4 мкм, на которую с помощью тонкого пинцета переносится сформированная капля коллагенового геля с эпителиальной тканью из зубного зачатка, связанная с незначительным количеством мезенхимальной ткани, через 14 дней развивающаяся эмаль переносится в биологический реактор - под капсулу почки мыши и по истечении 10 недель проводится выделение почки экспериментального животного, а также выделение развившейся эмали из-под капсулы почки.This is achieved through the successive cultivation of an integral fragment of the epithelial part of the tooth germ with a small fragment of mesenchymal tissue, which includes the following steps: a drop of collagen gel with a volume of 30 μl is formed in the Petri dish, into which a piece of tissue is introduced - the previously separated epithelial part of the tooth germ and a small fragment of the bound with it mesenchymes, a Petri dish with a drop of collagen gel is incubated for 15 min at 37 ° C in an incubator under 5% CO2 to solidify the collagen gel, into a cult A mesenchymal cell obtained from the tooth germ is inserted into the well, after which a cell culture insert with a pore diameter of 0.4 μm is inserted into the well, onto which a drop of collagen gel with epithelial tissue from the tooth bud associated with a small amount of mesenchymal tissue is transferred using a thin tweezers tissue, after 14 days the developing enamel is transferred to a biological reactor - under the capsule of the mouse kidney and after 10 weeks the kidney of the experimental animal is isolated, and the allocation of developed enamel from under the capsule of the kidney.

Для достижения наиболее оптимального результата в предлагаемой модели выращивания эмали используется сохранение необходимого для полноценного амелогенеза контакта между стволовыми и мезенхимальными клетками при их культивировании, что наблюдается в развивающемся эмбрионе в естественных условиях и позволяет разработать и воспроизвести полностью функциональный биоинженерный подход in vitro. Сохранение эпителиально-мезенхимального контакта и взаимодействие между клетками обеспечивает достижение необходимых для полноценного амелогенеза профилей экспрессии генов, сигнальных молекул и сигнальные пути факторов транскрипции.To achieve the most optimal result in the proposed enamel growing model, the preservation of the contact between stem and mesenchymal cells necessary for full amelogenesis during their cultivation is used, which is observed in a developing embryo in vivo and allows developing and reproducing a fully functional bio-engineering approach in vitro. Preservation of epithelial-mesenchymal contact and interaction between cells ensures the achievement of the gene expression profiles, signaling molecules and signaling pathways of transcription factors necessary for complete amelogenesis.

Эксперименты проводились на зубных зачатках, выделенных из эмбрионов мыши генетической линии C57/BL6 на 14,5 день эмбрионального развития. Выбор данного срока развития мышиных эмбрионов обусловлен минимально достаточной стадией развития зубного зачатка - на данном сроке зуб находится на стадии развития с достаточно четким выделением зубного сосочка, обеспечивающего дальнейшее развитие пульпы зуба и дентин-секретирующих одонтобластов, а также эмалевого узелка, содержащего пул стволовых эпителиальных клеток и формирующего в дальнейшем эмаль.The experiments were carried out on dental primordia isolated from mouse embryos of the C57 / BL6 genetic line on day 14.5 of embryonic development. The choice of this developmental period for murine embryos is determined by the minimally sufficient stage of development of the tooth germ - at this time the tooth is at the developmental stage with a sufficiently clear separation of the dental papilla, which ensures the further development of tooth pulp and dentin-secreting odontoblasts, as well as an enamel nodule containing a pool of stem epithelial cells and forming further enamel.

Животные перед проведением экспериментов содержались в условиях аккредитованного вивария ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России в стандартных условиях, не допускающих попадания патогенных микроорганизмов при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище [Приказ №63 МЗ СССР от 10.03.1966; «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» за №1045-73, утвержденные Главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с положениями приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977, а также с соблюдением правил Надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, РФ ГОСТ Р-53434-2009). Животные были сопоставимы по возрасту, весу, полу.Animals before experiments were kept in an accredited vivarium FSBEI HE MGMSU them. A.I. Evdokimova of the Ministry of Health of Russia under standard conditions that prevent pathogenic microorganisms from entering in natural light and with free access to water and food [Order No. 63 of the USSR Ministry of Health dated 10.03.1966; "Sanitary rules for the design, equipment and maintenance of experimental biological clinics (vivariums)" No. 1045-73 approved by the Chief State Sanitary Doctor of the USSR dated 04/06/1973. All animal experiments were carried out in accordance with the provisions of Order No. 755 of the Ministry of Health of the USSR dated 08/12/1977, as well as in compliance with the rules of Good Laboratory Practice (Good Laboratory Practice, RF GOST R-53434-2009). Animals were comparable in age, weight, gender.

Перед началом экспериментов все животные в течение 2 часов находились в условиях лаборатории. После умерщвления мыши-самки генетической линии C57/BL6 живот животного разрезался вдоль средней линии небольшими хирургическими ножницами. У животного удалялась матка, содержащая эмбрионы, и промывалась стерильным раствором PBS без Са²⁺, Mg²⁺ (далее - PBS(-)) комнатной температуры. Эмбрионы выделялись из матки. У эмбрионов отрезались головки от тела, отделялись нижние челюсти от головы, после чего нижние челюсти немедленно помещались в холодную (4°С) культуральную среду (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin, 10-mM HEPES). Далее проводилось выделение зачатков нижних моляров, использованных для экспериментов: пересекался язычок нижней челюсти и отделялась одна сторона челюсти. От нижней челюсти отделялся хрящ Меккеля, затем выполнялась резекция ткани на стороне, противоположной хрящу Меккеля. Удалялась вся избыточная ткань вокруг зачатков резца и моляра. При удалении всех необходимых для эксперимента зачатков зубов уже изолированные в ходе эксперимента зубные зачатки обязательно должны находиться в холодной культуральной среде.Before the start of the experiments, all animals were in the laboratory for 2 hours. After killing the female mouse of the C57 / BL6 genetic line, the animal’s stomach was cut along the midline with small surgical scissors. The uterus containing the embryos was removed from the animal and washed with a sterile PBS solution without Ca ²⁺ , Mg ²⁺ (hereinafter - PBS (-)) at room temperature. Embryos secreted from the uterus. In the embryos, the heads from the body were cut off, the lower jaw was separated from the head, after which the lower jaw was immediately placed in a cold (4 ° C) culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 10- mM HEPES). Next, the primordia of the lower molars used for the experiments were distinguished: the tongue of the lower jaw intersected and one side of the jaw separated. Meckel’s cartilage was separated from the lower jaw, then tissue resection was performed on the side opposite to Meckel’s cartilage. All excess tissue around the rudiments of the incisor and molar was removed. When removing all the tooth rudiments necessary for the experiment, the tooth buds already isolated during the experiment must necessarily be in a cold culture medium.

Следующим необходимым этапом работы является отделение эпителиальной части зачатка зуба от окружающей его мезенхимы, однако при этом необходимым условием являлось сохранение незначительного количества мезенхимальной ткани, связанной с эпителиальной частью, с целью обеспечения полноценного эпителиально-мезенхимального контакта, необходимого для надлежащего течения процесса амелогенеза и последующего формирования полноценной эмали. Для этого выделенные зачатки зубов необходимо дважды промыть в стерильном PBS (-), после чего добавить 50 ед/мл раствора диспазы и оставить для процесса ферментации при комнатной температуре на 10,5 мин. Завершение ферментативной реакции обеспечивается добавлением культуральной среды (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin). После остановки процесса ферментации зубные зачатки дважды промываются в культуральной среде (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) с последующим добавлением 1 мкл ДНКазы в 2 мл культуральной среды и инкубацией при комнатной температуре в течение 10 секунд. Под микроскопом проводится отделение эпителиальных и мезенхимальных тканей зубного зачатка с использованием игл 25 G. После разделения эпителиальная ткань зубного зачатка помещается в культуральную среду (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) при температуре 4°С. Оставшиеся фрагменты мезенхимальной ткани также помещаются в культуральную среду (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) при температуре 4°С и подвергаются дальнейшей ступенчатой обработке для получения отдельных клеток. Фрагменты мезенхимальной ткани в указанной питательной среде помещаются в пробирки объемом 15 мл и центрифугируются в течение 3 минут при 3000 оборотах/минуту, после чего супернатант отбирается и клеточный осадок еще дважды отмывается PBS (-). После последней отмывки проводится удаление PBS(-) и начинается процесс ферментативного расщепления ткани. С этой целью к осадку мезенхимы добавляется 2 мл смеси раствора PBS(-) и 1,83 мкл коллагеназы I типа и 0,25% трипсина с последующей инкубацией при 37°С в течение 10 минут. Ферментативная реакция завершается добавлением 6 мл культуральной среды (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) и последующим центрифугированием в течение 5 минут при 3000 оборотах/минуту. После центрифугирования супернатант удаляется до остаточного объема 80 мкл и интенсивно пиппетируется клеточный осадок. После в пробирку вносится 1 мл культуральной среды (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) и вновь центрифугируется при 3000 оборотах/минуту в течение 3 минут. Супернатант после центрифугирования удаляется до остаточного объема 200 мкл, после чего к оставшейся в пробирке среде добавляется 1 мкл раствора ДНКазы и вновь интенсивно пиппетируется клеточный осадок до получения однородной клеточной суспензии. Далее для обеспечения in vitro необходимых условий культивирования и факторов роста эпителиальная часть зубного зачатка с небольшим фрагментом мезенхимальной ткани помещаются в in vitro систему, состоящую из специализированного поддерживающего носителя - коллагенового геля и культуральной чашки Петри. В чашке Петри формируется капля коллагенового геля (использован Celimatrix type I-А, производства Nitta gelatin, Osaka, Japan) объемом 30 мкл (одна капля для каждого из фрагментов эпителия), в которую вносится фрагмент ткани - ранее отделенная эпителиальная часть зубного зачатка и небольшой фрагмент связанной с ней мезенхимы. Чашка Петри с каплей геля коллагена инкубируется в течение 15 мин при 37°С в инкубаторе в условиях 5% СО₂ для затвердевания коллагенового геля. В культуральный 12-луночный планшет вносятся полученные из зубного зачатка мезенхимальные клетки (1 млн клеток/ 500 мкл питательной среды), после чего в лунку помещается вставка для клеточной культуры с диаметром пор 0,4 мкм, на которую с помощью тонкого пинцета переносится сформированная капля коллагенового геля с внесенной структурой - эпителиальная ткань из зубного зачатка, связанная с незначительным количеством мезенхимальной ткани. В лунках кулыурального планшета производится замена культуральной среды, с внесением 10% FBS, 100 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 2-мМ L-глутамина. Замена культуральной среды в лунках проиводится 1 раз в 2 дня. Структуры в коллагеновом геле находятся в инкубаторе в течение 14 дней, после чего будут перенесены уже в биологических реактор - под капсулу почки мыши. Экспериментальная мышь, которой будет выполнена имплантация развивающейся структуры, анестезируется и размещается в положении лежа. Лапки животного фиксируются на рабочей поверхности. Проводится сбривание волос на коже животного в области вмешательства, проводится разрез кожи в области спины длиной около 2 см и разделение кожи и фасции. Фасция рассекается и выводится почка. Рассекается примерно 2-3 мм наружной мембраны субренальной капсулы, отделяется пространство между паренхимой почки и наружной мембраной капсулы, куда помещается развивающаяся структура. Далее почка аккуратно возвращается в перитонеальную полость, зашиваются фасция и кожа. Развивающаяся эмаль находится под капсулой почки в течение 10 недель. По истечении необходимого времени развития проводится выделение почки экспериментального животного и выделение развившейся эмали из-под капсулы почки.The next necessary stage of work is the separation of the epithelial part of the tooth germ from the surrounding mesenchyme, however, the necessary condition was the preservation of a small amount of mesenchymal tissue associated with the epithelial part, in order to ensure the full epithelial-mesenchymal contact necessary for the proper course of the process of amelogenesis and subsequent formation full enamel. To do this, the extracted tooth buds must be washed twice in sterile PBS (-), after which add 50 u / ml dispase solution and leave for the fermentation process at room temperature for 10.5 minutes. The completion of the enzymatic reaction is ensured by the addition of a culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin). After stopping the fermentation process, the tooth buds are washed twice in culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin), followed by the addition of 1 μl of DNase in 2 ml of culture medium and incubation at room temperature for 10 seconds. Under the microscope, the epithelial and mesenchymal tissues of the tooth germ are separated using 25 G needles. After the separation, the epithelial tissue of the tooth germ is placed in a culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin streptomycin) at a temperature of 4 ° WITH. The remaining fragments of mesenchymal tissue are also placed in the culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) at a temperature of 4 ° C and are subjected to further stepwise processing to obtain individual cells. Fragments of mesenchymal tissue in the indicated nutrient medium are placed in 15 ml tubes and centrifuged for 3 minutes at 3000 rpm, after which the supernatant is collected and the cell pellet is washed twice with PBS (-). After the last wash, PBS (-) is removed and the enzymatic cleavage of the tissue begins. For this purpose, 2 ml of a mixture of a solution of PBS (-) and 1.83 μl of type I collagenase and 0.25% trypsin are added to the mesenchyme precipitate, followed by incubation at 37 ° C for 10 minutes. The enzymatic reaction is completed by adding 6 ml of culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) and subsequent centrifugation for 5 minutes at 3000 rpm. After centrifugation, the supernatant is removed to a residual volume of 80 μl and the cell pellet is intensively pipetted. Then, 1 ml of culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) is added to the tube and centrifuged again at 3000 rpm for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant is removed to a residual volume of 200 μl, after which 1 μl of the DNAse solution is added to the remaining medium in the tube and the cell pellet is again intensely pipetted until a homogeneous cell suspension is obtained. Further, in order to provide the necessary cultivation conditions and growth factors in vitro, the epithelial part of the tooth germ with a small fragment of mesenchymal tissue is placed in an in vitro system consisting of a specialized support carrier - collagen gel and a Petri culture dish. A drop of collagen gel is formed in a Petri dish (used Celimatrix type I-A, manufactured by Nitta gelatin, Osaka, Japan) with a volume of 30 μl (one drop for each of the epithelial fragments), into which a tissue fragment is introduced - the previously separated epithelial part of the tooth germ and a small a fragment of the associated mesenchyme. A Petri dish with a drop of collagen gel is incubated for 15 min at 37 ° C in an incubator under 5% CO ₂ to solidify the collagen gel. Mesenchymal cells obtained from the tooth germ are introduced into the 12-well culture plate (1 million cells / 500 μl of culture medium), after which a cell culture insert with a pore diameter of 0.4 μm is placed into the well, onto which a drop is transferred using fine tweezers structured collagen gel - epithelial tissue from the tooth germ, associated with a small amount of mesenchymal tissue. In the wells of the cuyural plate, the culture medium is replaced with 10% FBS, 100 μg / ml ascorbic acid and 2 mM L-glutamine. The replacement of the culture medium in the wells is carried out 1 time in 2 days. The structures in the collagen gel are in the incubator for 14 days, after which they will be transferred to the biological reactor under the capsule of the mouse kidney. The experimental mouse, which will be used for implantation of the developing structure, is anesthetized and placed in a prone position. The paws of the animal are fixed on the working surface. The hair is shaved on the skin of the animal in the area of intervention, a skin incision is made in the back area about 2 cm long and the skin and fascia are separated. The fascia is dissected and the kidney is excreted. About 2-3 mm of the outer membrane of the subrenal capsule is dissected, the space between the parenchyma of the kidney and the outer membrane of the capsule, where the developing structure is placed, is separated. Next, the kidney returns carefully to the peritoneal cavity, the fascia and skin are sutured. Developing enamel is under the capsule of the kidney for 10 weeks. After the necessary development time has elapsed, the kidney of the experimental animal is extracted and the developed enamel is extracted from under the kidney capsule.

ПримерExample

После умерщвления мыши-самки генетической линии C57/BL6 живот животного был разрезан вдоль средней линии небольшими хирургическими ножницами. У животного удалена матка, содержащая 4 эмбриона и промыта раствором PBS без Са²⁺, Mg²⁺ (-). Эмбрионы выделены из матки. У эмбрионов отрезаны головки от тела, отделены нижние челюсти от головы, после чего нижние челюсти немедленно помещены в холодную (4°С) культуральную среду (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 10 mM HEPES). Далее проведено выделение зачатков нижних моляров, использованных для экспериментов: пересечен язычок нижней челюсти и отделена одна сторона челюсти. От нижней челюсти отделен хрящ Меккеля, выполнена резекция ткани на стороне, противоположной хрящу Меккеля. Удалена вся избыточная ткань вокруг зачатков резца и моляра. При удалении всех необходимых для эксперимента зачатков зубов уже изолированные в ходе эксперимента зубные зачатки обязательно находятся в холодной культуральной среде. (Фиг. 1)After killing the female mouse of the C57 / BL6 genetic line, the animal’s stomach was cut along the midline with small surgical scissors. The uterus containing 4 embryos was removed from the animal and washed with a PBS solution without Ca ²⁺ , Mg ²⁺ (-). Embryos are isolated from the uterus. In the embryos, the heads were cut off from the body, the lower jaw was separated from the head, after which the lower jaw was immediately placed in a cold (4 ° C) culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 10 mM HEPES). Next, the primordia of the lower molars used for the experiments were distinguished: the tongue of the lower jaw was crossed and one side of the jaw was separated. Meckel’s cartilage is separated from the lower jaw, tissue resection is performed on the side opposite to Meckel’s cartilage. Removed all excess tissue around the rudiments of the incisor and molar. When removing all the tooth rudiments necessary for the experiment, the tooth buds already isolated during the experiment are necessarily in a cold culture medium. (Fig. 1)

Выполнено отделение эпителиальной части зачатка зуба от окружающей его мезенхимы, однако при этом сохранено незначительное количество мезенхимальной ткани, связанной с эпителиальной частью с целью обеспечения полноценного эпителиально-мезенхимального контакта, необходимого для надлежащего течения процесса амелогенеза и последующего формирования полноценной эмали. (Фиг. 2) Для этого выделенные зачатки зубов дважды промыты в стерильном PBS (-), после чего добавлено 50 ед/мл раствора диспазы для обеспечения процесса ферментации при комнатной температуре на 10,5 мин. Завершение ферментативной реакции обеспечивалось добавлением культуральной среды (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin). После остановки процесса ферментации зубные зачатки дважды промыты в культуральной среде с последующим добавлением 1 мкл ДНКазы в 2 мл культуральной среды и инкубацией при комнатной температуре в течение 10 секунд. Под микроскопом проводится отделение эпителиальных и мезенхимальных тканей зубного зачатка с использованием игл 25 G. После разделения эпителиальная ткань зубного зачатка помещена в холодную культуральную среду (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) при температуре 4°С.The epithelial part of the tooth rudiment was separated from the surrounding mesenchyme, however, a small amount of mesenchymal tissue associated with the epithelial part was preserved in order to ensure the full epithelial-mesenchymal contact necessary for the proper course of the amelogenesis process and the subsequent formation of a full-fledged enamel. (Fig. 2) For this, the isolated tooth buds are washed twice in sterile PBS (-), after which 50 u / ml of dispase solution are added to ensure the fermentation process at room temperature for 10.5 minutes. The completion of the enzymatic reaction was provided by the addition of a culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin). After the fermentation process was stopped, the tooth buds were washed twice in the culture medium, followed by the addition of 1 μl of DNase in 2 ml of culture medium and incubation at room temperature for 10 seconds. A microscope is used to separate epithelial and mesenchymal tissues of the tooth germ using 25 G needles. After separation, the epithelial tissue of the tooth germ is placed in a cold culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin streptomycin) at a temperature of 4 ° C.

Оставшиеся фрагменты мезенхимальной ткани также помещались в культуральную среду (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) при температуре 4°С и подвергались дальнейшей ступенчатой обработке для получения отдельных клеток. Фрагменты мезенхимальной ткани в указанной питательной среде помещались в пробирки объемом 15 мл и центрифугировались в течение 3 минут при 3000 оборотах/минуту, после чего супернатант отбирался и клеточный осадок еще дважды отмывался PBS (-). После последней отмывки проводилось удаление PBS(-) и начинался процесс ферментативного расщепления ткани. С этой целью к осадку мезенхимы добавляли 2 мл смеси раствора PBS(-) и 1,83 мкл коллагеназы I типа и 0,25% трипсина с последующей инкубацией при 37°С в течение 10 минут. Ферментативная реакция завершалась добавлением 6 мл культуральной среды (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) и последующим центрифугированием в течение 5 минут при 3000 оборотах/минуту. После центрифугирования супернатант удаляли до остаточного объема 80 мкл и интенсивно пиппетировали клеточный осадок. После в пробирку вносили 1 мл культуральной среды (питательная среда DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin- streptomycin) и вновь центрифугировали при 3000 оборотах/минуту в течение 3 минут. Супернатант после центрифугирования удаляли до остаточного объема 200 мкл, после чего к оставшейся в пробирке среде добавляли 1 мкл раствора ДНКазы и вновь интенсивно пиппетировали клеточный осадок до получения однородной клеточной суспензии.The remaining fragments of mesenchymal tissue were also placed in culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin streptomycin) at 4 ° C and subjected to further stepwise processing to obtain single cells. Fragments of mesenchymal tissue in the indicated nutrient medium were placed in 15 ml tubes and centrifuged for 3 minutes at 3000 rpm, after which the supernatant was collected and the cell pellet was washed twice with PBS (-). After the last wash, PBS (-) was removed and enzymatic cleavage of the tissue began. For this purpose, 2 ml of a mixture of a solution of PBS (-) and 1.83 μl of type I collagenase and 0.25% trypsin were added to the mesenchyme precipitate, followed by incubation at 37 ° C for 10 minutes. The enzymatic reaction was completed by adding 6 ml of culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) and subsequent centrifugation for 5 minutes at 3000 rpm. After centrifugation, the supernatant was removed to a residual volume of 80 μl and the cell pellet was intensively pipetted. Then, 1 ml of culture medium (DMEM culture medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin) was added to the tube and centrifuged again at 3000 rpm for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed to a residual volume of 200 μl, after which 1 μl of a DNAse solution was added to the remaining in vitro medium and the cell pellet was again intensively pipetted until a homogeneous cell suspension was obtained.

Далее для обеспечения in vitro необходимых условий культивирования и факторов роста эпителиальная часть зубного зачатка с небольшим фрагментом мезенхимальной ткани помещается в in vitro систему, состоящую из специализированного поддерживающего носителя - коллагенового геля и культуральной чашки Петри. В чашке Петри формируется капля коллагенового геля объемом 30 мкл, в которую вносится ранее отделенная эпителиальная засть зубного зачатка и связанные с ней фрагменты мезенхимальной ткани. (Фиг. 3)Further, in order to provide the necessary cultivation conditions and growth factors in vitro, the epithelial part of the tooth germ with a small fragment of mesenchymal tissue is placed in an in vitro system consisting of a specialized support carrier - collagen gel and a Petri culture dish. A drop of collagen gel with a volume of 30 μl is formed in the Petri dish, into which the previously separated epithelial stump of the tooth germ and the fragments of mesenchymal tissue connected with it are introduced. (Fig. 3)

Чашка Петри с каплей геля коллагена инкубируется в течение 15 мин при 37°С в инкубаторе в условиях 5% СО₂ для затвердевания коллагенового геля. В культуральный 12-луночный планшет, лунки которого заполнены культуральной средой 500 мкл/лунку помещается вставка для клеточной культуры, на которую с помощью тонкого пинцета переносится сформированная капля коллагенового геля с внесенной структурой. Производится замена культуральной среды, с внесением 10% FBS, 100 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 2-мМ L-глутамина. Замена культуральной среды в лунках проиводится 1 раз в 2 дня. Структуры в коллагеновом геле находятся в инкубаторе в течение 14 дней, после чего будут перенесены уже в биологических реактор - под капсулу почки мыши. Экспериментальная мышь, которой будет выполнена имплантация развивающейся структуры, анестезируется и размещается в положении лежа. Лапки животного фиксируются на рабочей поверхности. Проводится сбривание волос на коже животного в области вмешательства, проводится разрез кожи в области спины длиной около 2 см и разделение кожи и фасции. Фасция рассекается и выводится почка. Рассекается примерно 2-3 мм наружной мембраны субренальной капсулы, отделяется пространство между паренхимой почки и наружной мембраной капсулы, куда помещается развивающаяся структура. Далее почка аккуратно возвращается в перитонеальную полость, зашиваются фасция и кожа. Развивающаяся эмаль находится под капсулой почки в течение 10 недель. По истечении необходимого времени развития проводится выделение почки экспериментального животного и выделение развившейся эмали из-под капсулы почки. (Фиг. 4)A Petri dish with a drop of collagen gel is incubated for 15 min at 37 ° C in an incubator under 5% CO ₂ to solidify the collagen gel. A cell culture insert is placed in a 12-well culture plate, the wells of which are filled with a culture medium of 500 μl / well, onto which a formed drop of collagen gel with the added structure is transferred using fine tweezers. The culture medium is replaced with 10% FBS, 100 μg / ml ascorbic acid and 2 mM L-glutamine. The replacement of the culture medium in the wells is carried out 1 time in 2 days. The structures in the collagen gel are in the incubator for 14 days, after which they will be transferred to the biological reactor under the capsule of the mouse kidney. The experimental mouse, which will be used for implantation of the developing structure, is anesthetized and placed in a prone position. The paws of the animal are fixed on the working surface. The hair is shaved on the skin of the animal in the area of intervention, a skin incision is made in the back area about 2 cm long and the skin and fascia are separated. The fascia is dissected and the kidney is excreted. About 2-3 mm of the outer membrane of the subrenal capsule is dissected, the space between the parenchyma of the kidney and the outer membrane of the capsule, where the developing structure is placed, is separated. Next, the kidney returns carefully to the peritoneal cavity, the fascia and skin are sutured. Developing enamel is under the capsule of the kidney for 10 weeks. After the necessary development time has elapsed, the kidney of the experimental animal is extracted and the developed enamel is extracted from under the kidney capsule. (Fig. 4)

Полученный образец направлен на гистологическое исследование, а также анализ с помощью электронной растровой микроскопии для получения данных о соответствии структуры полученного образца имеющимся данным о структуре эмали.The resulting sample is aimed at histological examination, as well as analysis using electron scanning microscopy to obtain data on the correspondence of the structure of the obtained sample to the available data on the structure of enamel.

Для гистологического исследования образцы тканей, после фиксации в 10%-м забуференном нейтральном формалине, при необходимости, подвергали предварительной декальцинации (реагент Биодек R, Италия) и под контролем лупы вырезали искомый участок ткани. После дополнительного, второго этапа декальцинации, образцы ткани по общепринятой методике обезвоживали и заливали в парафиновые блоки. Гистологические срезы, толщиной 3-4 мкм, полученные на микротоме «Leica» (Германия) окрашивали гематоксилином и эозином (Фиг. 5). Для получения гистологического среза правильной ориентации, материал многократно дорезали методами ступенчатых и серийных срезов, меняя положение парафинового блока. Гистологические препараты исследовали и фотографировали на микроскопе AxioLab A1 (Carl Zeiss Microscopy, Германия)For histological examination, tissue samples, after fixation in 10% buffered neutral formalin, were, if necessary, subjected to preliminary decalcification (Biodec R reagent, Italy) and, under the control of a magnifier, the desired tissue site was excised. After an additional, second stage of decalcification, tissue samples were dehydrated and poured into paraffin blocks according to the generally accepted technique. Histological sections, 3-4 μm thick, obtained on a Leica microtome (Germany) were stained with hematoxylin and eosin (Fig. 5). To obtain a histological section of the correct orientation, the material was repeatedly cut by the methods of stepwise and serial sections, changing the position of the paraffin block. Histological preparations were examined and photographed with an AxioLab A1 microscope (Carl Zeiss Microscopy, Germany)

Для электронно-микроскопического исследования образцы исследовали с помощью растровых микроскопов «FE Quanta 200 3D» и «FE1 Quanta 600 FEG» (Нидерланды) с функцией бесконтактного определения процентного содержания макро- и микроэлементов. Микроэлементный анализ был сделан с использованием детектора для регистрации спектров характеристического рентгеновского излучения фирмы «ЕРАХ». Детекторы интегрированы с растровым электронным микроскопом «Quanta 600 FEG».For electron microscopy, the samples were examined using FE Quanta 200 3D and FE1 Quanta 600 FEG scanning microscopes (Netherlands) with the function of non-contact determination of the percentage of macro- and microelements. The trace element analysis was performed using a detector to record the spectra of characteristic x-ray radiation from EPAX. The detectors are integrated with a Quanta 600 FEG scanning electron microscope.

Метод микроэлементного анализа основан на возникновении непрерывного флуоресцентного излучения при бомбардировке исследуемых образцов пучком первичных рентгеновских лучей. Для определения химического состава вещества в сканирующем электронном микроскопе использовали энергодисперсионный спектрометр. Принцип его работы заключается в том, что пучок электронов падает на поверхность образца и взаимодействует с материалом, в результате чего возникает, в том числе, характеристическое рентгеновское излучение, которое регистрируется полупроводниковым детектором. Система обработки сигнала разделяет рентгеновские фотоны по энергиям и, таким образом, получается полный спектр, по которому судят об элементном составе образца-мишени. Если на внешней оболочке атома элемента (например, Са) два электрона, на спектре появляются две близких по длине волны. Проведено изучение содержания 8-и макроэлементов (углерода, азота, кислорода, натрия, магния, фосфора, серы, кальция) и микроэлемента (кремния) (Фиг. 6)The microelement analysis method is based on the occurrence of continuous fluorescence radiation during the bombardment of the samples under study by a beam of primary x-rays. An energy dispersive spectrometer was used to determine the chemical composition of a substance in a scanning electron microscope. The principle of its operation is that an electron beam falls on the surface of the sample and interacts with the material, resulting in, among other things, characteristic x-ray radiation, which is detected by a semiconductor detector. The signal processing system separates the x-ray photons by energy and, thus, the full spectrum is obtained, which is used to judge the elemental composition of the target sample. If there are two electrons on the outer shell of an atom of an element (for example, Ca), two waves of close wavelength appear on the spectrum. The study of the content of 8 macrocells (carbon, nitrogen, oxygen, sodium, magnesium, phosphorus, sulfur, calcium) and a microelement (silicon) (Fig. 6)

Исследование образца «Эмаль 10.05.18»Study of the sample "Enamel 05/10/18"

Выполненное гистологическое исследование образца с окраской гематоксилином-эозином, представленное на Фиг. 5, показало наличие комплекса из эмали и дентина с окружающими тканями под капсулой почки. Эмаль базофильная, с одной стороны ограничивает щелевидную полсть, с другой - тесно связана с дентином, их соотношение примерно равное. Между ним и тканью почки - фрагмент губчатой костной ткани с костным мозгом между костными балками и полнокровная соединительная ткань, сходная с периодонтальной связкой. Вверху справа - жировая ткань, внизу слева -капсула и часть коркового слоя почки с клубочками, без патологических изменений.A histological examination of a sample stained with hematoxylin-eosin shown in FIG. 5, showed the presence of a complex of enamel and dentin with surrounding tissues under the kidney capsule. Enamel is basophilic, on the one hand it limits the slit-like cavity, and on the other hand it is closely connected with dentin, their ratio is approximately equal. Between it and the kidney tissue is a fragment of spongy bone tissue with bone marrow between the bone beams and a full-blooded connective tissue similar to the periodontal ligament. Above right is adipose tissue, bottom left is the capsule and part of the cortical layer of the kidney with glomeruli, without pathological changes.

Проведенные исследования образца эмали (Фиг. 7-9) показали, что поверхность образца, размерами 1,93 на 1,75 мм, неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы, представлена эмалью и дентином.Studies of an enamel sample (Fig. 7-9) showed that the surface of the sample, 1.93 by 1.75 mm in size, is heterogeneous, with protruding areas of round growth, represented by enamel and dentin.

Проведенные исследования образца Фиг. (10-16) эмали показали, что поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм.Investigations of the sample of FIG. (10-16) enamels showed that the surface of the enamel is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible.

На Фиг. 16-18 показано, что поверхность образца в области дентина неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы. В таких участках наблюдаются структуры, сходные со сформированными сосудами. Они окружены формирующейся костной тканью. В срезе вещество, аналогичное дентину, и представленные в большом количестве дентинные трубочки. Дентин по своему строению напоминает грубоволокнистую костную ткань. Канальцы расположены перпендикулярно поверхности и выглядят темными отверстиями на сером фоне интертубулярного дентина. Формирующиеся канальцы в форме неправильного овала, различного диаметра 25,8±5,3 мкм (Фиг. 16), с белым венчиком более минерализованного дентина (Фиг. 18).In FIG. 16-18 it is shown that the surface of the sample in the dentin region is heterogeneous, with protruding round growth areas. In such areas, structures similar to the formed vessels are observed. They are surrounded by forming bone tissue. In a section, a substance similar to dentin, and a large number of dentin tubules. Dentin in its structure resembles coarse-fiber bone tissue. The tubules are perpendicular to the surface and look like dark holes on a gray background of intertubular dentin. Forming tubules in the form of an irregular oval, various diameters of 25.8 ± 5.3 μm (Fig. 16), with a white rim of more mineralized dentin (Fig. 18).

Представленные результаты гистологического исследования (Фиг. 5) и данные электронной микроскопии (Фиг. 10-16) согласуются с гистологической структурой и известными данными электронной микроскопии о структуре эмали и возможных вариантах ориентации эмалевых призм в эмали естественного происхождения. Биохимический состав эмали образца по наличию основных микро- и макроэлементов также не отличается от эмали естественного происхождения, кроме того соотношение таких основных элементов, как кальций и фосфор в эмали образца соответствует средним значениям известного диапазона (Hwa-Yen Liu, Jiunn-Hsing Chao, Chun-Yu Chuang, Hung-Lin Chiu,Chung-Wei Yang, Yuh-Chang Sun. Study of P, Ca, Sr, Ba and Pb Levels in Enamel and Dentine of Human Third Molars for Environmental and Archaeological Research // Advances in Anthropology 2013. Vol. 3, No. 2, 71-77; Г. Флейшер. Методы обследования пациента на приеме врача-стоматолога. Руководство для врачей // Ridero // 230 с.)The presented results of a histological examination (Fig. 5) and electron microscopy data (Fig. 10-16) are consistent with the histological structure and known electron microscopy data on the structure of enamel and possible orientations of enamel prisms in natural enamel. The biochemical composition of the enamel of the sample by the presence of basic micro and macro elements also does not differ from the enamel of natural origin, in addition, the ratio of such basic elements as calcium and phosphorus in the enamel of the sample corresponds to the average values of the known range (Hwa-Yen Liu, Jiunn-Hsing Chao, Chun -Yu Chuang, Hung-Lin Chiu, Chung-Wei Yang, Yuh-Chang Sun. Study of P, Ca, Sr, Ba and Pb Levels in Enamel and Dentine of Human Third Molars for Environmental and Archaeological Research // Advances in Anthropology 2013 Vol. 3, No. 2, 71-77; G. Fleischer. Methods of examining a patient at a dentist appointment. Guide for physicians // Ridero // 230 p.)

Таким образом, эмаль исследованного образца по гистологическому и биохимическому составу соответствует эмали зуба мыши естественного происхождения.Thus, the enamel of the studied sample according to the histological and biochemical composition corresponds to the enamel of a tooth of a mouse of natural origin.

Краткое описание фигур.A brief description of the figures.

На Фиг. 1. представлено фото выделенных зачатков зуба мыши генетической линии C57/BL6 (срок развития эмбрионов мыши 14,5 ED).In FIG. 1. a photo of the isolated mouse tooth rudiments of the C57 / BL6 genetic line is presented (mouse embryo development time is 14.5 ED).

На Фиг. 2 представлено фото отделения эпителиальной части зачатка зуба (срок развития эмбриона 14,5 ED) и связанные с ним небольшие фрагменты мезенхимальной ткани.In FIG. Figure 2 shows a photo of the separation of the epithelial part of the tooth germ (developmental period of the embryo 14.5 ED) and the small fragments of mesenchymal tissue associated with it.

На Фиг. 3 представлено фото эпителиальной части зачатка зуба в капле коллагена.In FIG. 3 shows a photo of the epithelial part of the tooth germ in a drop of collagen.

На Фиг. 4 представлено фото внешнего вида выделенной почки, под капсулой которой в течение 10 недель находился имплантированный образец.In FIG. Figure 4 shows a photo of the appearance of the isolated kidney, under the capsule of which for 10 weeks there was an implanted sample.

На Фиг. 5 представлено изображение образца «Эмаль в почке». Эмаль базофильная, с одной стороны ограничивает щелевидную полость, с другой - тесно связана с дентином, их соотношение примерно равное. Между ним и тканью почки - фрагмент губчатой костной ткани с костным мозгом между костными балками и полнокровная соединительная ткань, сходная с периодонтальной связкой. Вверху справа - жировая ткань, внизу слева - капсула и часть коркового слоя почки с клубочками, без патологических изменений. Окраска гематоксилином и эозином, х 120.In FIG. 5 shows an image of the sample "Enamel in the kidney." Enamel is basophilic, on the one hand limits the slit-like cavity, on the other hand it is closely connected with dentin, their ratio is approximately equal. Between it and the kidney tissue is a fragment of spongy bone tissue with bone marrow between the bone beams and a full-blooded connective tissue similar to the periodontal ligament. Above right is adipose tissue, lower left is a capsule and part of the cortical layer of the kidney with glomeruli, without pathological changes. Stained with hematoxylin and eosin, x 120.

На Фиг. 6 представлено изображение результатов электронно-микроскопического исследования образца «Эмаль 10.05.18» с микроспектальным анализом образца. Проанализировано содержание 8-и макроэлементов (углерода, азота, кислорода, натрия, магния, фосфора, серы, кальция) и микроэлемента (кремния). Если на внешней оболочке атома элемента (например, Са) два электрона, на спектре появляются две близких по длине волны. Микроспектральный анализ образца. Детектор интегрирован с растровым электронным микроскопом «Quanta 600 FEG».In FIG. Figure 6 shows the image of the results of electron microscopic examination of the sample “Enamel 05/10/18” with microspectral analysis of the sample. The content of 8 macroelements (carbon, nitrogen, oxygen, sodium, magnesium, phosphorus, sulfur, calcium) and a microelement (silicon) are analyzed. If there are two electrons on the outer shell of an atom of an element (for example, Ca), two waves of close wavelength appear on the spectrum. Microspectral analysis of the sample. The detector is integrated with a Quanta 600 FEG scanning electron microscope.

На Фиг. 7 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность образца, размерами 1,93 на 1,75 мм, неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы, представлена эмалью и дентином. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 130 x (WD 11.1 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x:11.7430 мм, у: 3.0853 мм, Quanta 600 FEG).In FIG. 7 shows the image of the sample "Enamel 05/10/18". The surface of the sample, measuring 1.93 by 1.75 mm, is heterogeneous, with protruding areas of round growth, represented by enamel and dentin. Scanning electron microscopy. Magnification 130 x (WD 11.1 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.7430 mm, у: 3.0853 mm, Quanta 600 FEG).

На Фиг. 8 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность образца, размерами 1,93 на 1,75 мм, неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы, представлена эмалью и дентином. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 130 х (WD 11.2 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.7210 мм, у: 3.0928 мм, Quanta 600 FEG).In FIG. 8 shows the image of the sample "Enamel 05/10/18". The surface of the sample, measuring 1.93 by 1.75 mm, is heterogeneous, with protruding areas of round growth, represented by enamel and dentin. Scanning electron microscopy. Magnification 130 x (WD 11.2 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.7210 mm, y: 3.0928 mm, Quanta 600 FEG).

На Фиг. 9 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность образца, размерами 1,93 на 1,75 мм, неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы, представлена эмалью и дентином. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 130х (WD 11.1 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.7430 мм, у: 3.0853 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 500 мкм.).In FIG. 9 shows the image of the sample "Enamel 05/10/18". The surface of the sample, measuring 1.93 by 1.75 mm, is heterogeneous, with protruding areas of round growth, represented by enamel and dentin. Scanning electron microscopy. Magnification 130x (WD 11.1 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.7430 mm, y: 3.0853 mm, Quanta 600 FEG. Scale 500 μm.).

На Фиг. 10 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 4000 х. (WD 11.4 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.8805 мм, y: 3.7098 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 20 мкм).In FIG. 10 shows the image of the sample "Enamel 05/10/18". The enamel surface is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible. Scanning electron microscopy. Magnification 4000 x. (WD 11.4 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.8805 mm, y: 3.7098 mm, Quanta 600 FEG. Scale 20 μm).

На Фиг. 11 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 8000х (WD 11.4 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.8805 мм, y: 3.7098 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 20 мкм).In FIG. 11 shows an image of the sample "Enamel 05/10/18". The enamel surface is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible. Scanning electron microscopy. Magnification 8000x (WD 11.4 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.8805 mm, y: 3.7098 mm, Quanta 600 FEG. Scale 20 μm).

На Фиг. 12 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 4000 х (WD 11.4 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.6898 мм, y: 3.6615 мм, Quanta 600 FEG Шкала 20 мкм).In FIG. 12 shows an image of the sample "Enamel 05/10/18". The enamel surface is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible. Scanning electron microscopy. Magnification 4000 x (WD 11.4 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.6898 mm, y: 3.6615 mm, Quanta 600 FEG Scale 20 μm).

На Фиг. 13 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 8000 х (WD 11.4 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.6898 мм, y: 3.6615 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 20 мкм).In FIG. 13 shows the image of the sample "Enamel 05/10/18". The enamel surface is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible. Scanning electron microscopy. Magnification 8000 x (WD 11.4 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.6898 mm, y: 3.6615 mm, Quanta 600 FEG. Scale 20 μm).

На Фиг. 14 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 82000 х (WD 11.4 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.8523 мм, у: 3.7243 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 50 мкм).In FIG. 14 shows an image of the sample “Enamel 05/10/18”. The enamel surface is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible. Scanning electron microscopy. Magnification 82000 x (WD 11.4 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.8523 mm, y: 3.7243 mm, Quanta 600 FEG. Scale 50 μm).

На Фиг. 15 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность эмали сглажена, но местами неровная, в отдельных участках видна относительно правильная ориентация призм. Стрелка показывает границу эмали. Растровая электронная микроскопия. Увеличение 4000 х, WD 11.3 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.3938 мм, у: 2.8835 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 20 мкмIn FIG. 15 shows an image of the sample “Enamel 05/10/18”. The enamel surface is smoothed, but uneven in some places, in some areas the relatively correct orientation of the prisms is visible. The arrow shows the enamel border. Scanning electron microscopy. Magnification 4000 x, WD 11.3 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 11.3938 mm, y: 2.8835 mm, Quanta 600 FEG. 20 μm scale

На Фиг. 16 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность образца в области дентина неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы. Формирующиеся канальцы в форме неправильного овала, различного диаметра 25,8±5,3 мкм. Увеличение 260 х (WD 11.2 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 12.2890 мм, у: 3.3220 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 400 мкм).In FIG. 16 shows an image of the sample “Enamel 05/10/18”. The surface of the sample in the dentin area is heterogeneous, with protruding areas of round growth. Forming tubules in the form of an irregular oval, various diameters of 25.8 ± 5.3 microns. Magnification 260 x (WD 11.2 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 12.2890 mm, y: 3.3220 mm, Quanta 600 FEG. Scale 400 μm).

На Фиг. 17 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность образца в области дентина неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы. Формирующиеся канальцы в форме неправильного овала. Увеличение 1000 х (WD 11.2 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 12.0723 мм, у: 3.0385 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 100 мкм)In FIG. 17 shows an image of the sample "Enamel 05/10/18". The surface of the sample in the dentin area is heterogeneous, with protruding areas of round growth. Forming tubules in the shape of an irregular oval. Magnification 1000 x (WD 11.2 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 12.0723 mm, y: 3.0385 mm, Quanta 600 FEG. Scale 100 μm)

На Фиг. 18 представлено изображение образца «Эмаль 10.05.18». Поверхность образца в области дентина неоднородная, с выступающими участками роста округлой формы. Формирующиеся канальцы в форме неправильного овала. Увеличение 4000 х (WD 11.3 мм, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 12.1065 мм, у: 2.9388 мм, Quanta 600 FEG. Шкала 20 мкм).In FIG. 18 shows an image of the sample "Enamel 05/10/18". The surface of the sample in the dentin area is heterogeneous, with protruding areas of round growth. Forming tubules in the shape of an irregular oval. Magnification 4000 x (WD 11.3 mm, spot 5.0, det LFD, HV 20.00 kV, x: 12.1065 mm, y: 2.9388 mm, Quanta 600 FEG. Scale 20 μm).

Claims

A method for growing enamel in an experiment, which consists in cultivating epithelial tissue in a collagen gel on a nutrient medium, characterized in that the epithelial part of the tooth rudiment is separated from the mesenchyme while maintaining a fragment of the mesenchymal tissue, after which a drop of collagen gel with a volume of 30 μl is formed in a Petri dish, which is introduced by a tissue fragment - the previously separated epithelial part of the tooth germ and a fragment of the associated mesenchyme, the Petri dish with a drop of collagen gel is incubated for 15 min at 37 ° C in incubator under conditions of 5% CO ₂ to solidify the collagen gel, mesenchymal cells obtained from the tooth germ are introduced into the culture plate, after which a cell culture insert with a pore diameter of 0.4 μm is placed into the well, onto which a formed drop of collagen gel is transferred using tweezers with the epithelial tissue from the tooth germ associated with a fragment of the mesenchymal tissue, after 14 days the developing enamel is transferred to a biological reactor - under the capsule of the mouse kidney and after 10 weeks the kidney is isolated animal experimentally, and secrete enamel evolved from under the kidney capsule.