RU2714208C1

RU2714208C1 - Cell product for loading and activation of human dendrite cells

Info

Publication number: RU2714208C1
Application number: RU2019106338A
Authority: RU
Inventors: Ирина Александровна Балдуева; Анна Борисовна Данилова; Татьяна Леонидовна Нехаева; Наталья Александровна Авдонкина; Наталья Викторовна Емельянова; Алексей Михайлович Беляев
Priority date: 2019-03-05
Filing date: 2019-03-05
Publication date: 2020-02-13

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and biotechnology, namely to creation of cell products from cell lines of human skin melanoma lines. Cell product consists of equal parts of lysates of human skin melanoma cell lines deposited in a specialized collection of vertebrate cell cultures of the Russian collection of cell cultures under the corresponding registration numbers: 226 AB mel – under number RKKK(P)725D, 283 mel – under number RKKK(P)726D, Mel 311 – under number RKKK(P)703D, 515 mel – under number RKKK(P)757D, mel 520 DVA – under RKKK(P)779D, 685 mel GSN number – RKKK(P)781D, 686 mel FLA – under number RKKK(P)782D, 860 mel BII – under number RKKK(P)783D, mel 929 SVU – under number RKKK(P)780D. Lysates of said cell lines are prepared by multiple freezing-thawing with determination of cell viability by flow cytometry, one aliquot of the cell product contains the total number of cells 30 million, which are in 500 mcl of normal saline.

EFFECT: cell product enables effective loading and activation of human dendritic cells with cancer-testicular antigens (CTA) expressed in malignant growth cells that can provide creation of universal anti-tumor dendritic-cell human vaccines.

1 cl, 12 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к созданию клеточных продуктов из клеточных линий клеток линий меланомы кожи человека, и может быть использовано для нагрузки и активации дендритных клеток (ДК) человека.The invention relates to the field of medicine and biotechnology, namely to the creation of cell products from cell lines of cells of the lines of melanoma of human skin, and can be used to load and activate dendritic cells (DC) of a person.

Известно, что свободные (несвязанные) антигены не распознаются Т-лимфоцитами даже в том случае, если эти клетки экспрессируют рецепторы, соответствующие антигену. Для того чтобы инициировать иммунный ответ, антиген должен быть представлен на поверхности антиген-презентирующей клетки в контексте с HLA молекулами и в ассоциации с другими поверхностными молекулярными структурами (костимулирующие, адгезивные и др.). Это событие является определяющим как в стимуляции Т-клеток, так и в формировании эффективного иммунного ответа [Guinan Е.С., Gribben J.G., Boussiotis V.A., Freeman G.J., Nadler L.M. Pivotal role of the B7:CD28 pathway in transplantation tolerance and tumor immunity // Blood. 1994 Nov 15; 84(10):3261-82].It is known that free (unbound) antigens are not recognized by T-lymphocytes even if these cells express receptors corresponding to the antigen. In order to initiate an immune response, an antigen must be presented on the surface of an antigen-presenting cell in the context of HLA molecules and in association with other surface molecular structures (costimulatory, adhesive, etc.). This event is decisive both in stimulation of T cells and in the formation of an effective immune response [Guinan E.S., Gribben J.G., Boussiotis V.A., Freeman G.J., Nadler L.M. Pivotal role of the B7: CD28 pathway in transplantation tolerance and tumor immunity // Blood. 1994 Nov 15; 84 (10): 3261-82].

Как показали исследования, количество дендритных клеток (ДК) в организме больных злокачественными опухолями снижено, а сами они функционально неполноценны. ДК, выделенные из периферических лимфоидных и нелимфоидных тканей и периферической крови как экспериментальных животных с опухолями, так и онкологических больных не способны стимулировать специфический ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и слабо стимулируют Т-хелперы [Zitvogel L., Robbins P.D., Storkus W.J. etal. Interleukin-12 and B7.1 co-stimulation cooperate in the induction of effective antitumor immunity and therapy of established tumors // Eur J Immunol. 1996 Jun; 26(6):1335-41]. Кроме того, на их поверхности было выявлено снижение экспрессии адгезивных и костимулирующих молекул, а также критическое снижение экспрессии HLA-молекул, особенно I класса. Предполагается, что уменьшение количества ДК и потеря ими ряда функций может быть одной из главных причин отсутствия полноценного иммунного ответа на развивающуюся опухоль.As studies have shown, the number of dendritic cells (DC) in the body of patients with malignant tumors is reduced, and they themselves are functionally inferior. DCs isolated from peripheral lymphoid and non-lymphoid tissues and peripheral blood of both experimental animals with tumors and cancer patients are not able to stimulate a specific response of cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and weakly stimulate T-helpers [Zitvogel L., Robbins P.D., Storkus W.J. etal. Interleukin-12 and B7.1 co-stimulation cooperate in the induction of effective antitumor immunity and therapy of established tumors // Eur J Immunol. 1996 Jun; 26 (6): 1335-41]. In addition, a decrease in the expression of adhesive and costimulatory molecules, as well as a critical decrease in the expression of HLA molecules, especially class I, were revealed on their surface. It is assumed that a decrease in the number of DCs and their loss of a number of functions may be one of the main reasons for the lack of a full-fledged immune response to a developing tumor.

Культивирование периферических ДК invitro в условиях, позволяющих получить их максимальный рост и активацию, приводило к увеличению экспрессии поверхностных молекул, но уровень их часто оказывался недостаточным для индукции устойчивого ответа специфических ЦТЛ [Veglia F., Gabrilovich D.I. Dendritic cells in cancer: the role revisited // Curr Opin Immunol. 2017 Apr; 45:43-51. doi: 10.1016/j.coi.2017.01.002]. Наибольшей способностью по сравнению с периферическими ДК к представлению специфического опухолевого антигена Т-лимфоцитам обладают костномозговые предшественники ДК, а также сингенные или аллогенные ДК из периферической крови здоровых индивидуумов, активированные invitro опухолеассоциированными антигенами (ОАА) [Palmer Е.М., van Seventer G.A. Human T helper cell differentiation is regulated by the combined action of cytokines and accessory cell-dependent costimulatory signals // J Immunol. 1997 Mar 15; 158(6):2654-62]. Только такие ДК в большинстве случаев стимулировали нормальный ответ ЦТЛ. Это позволяет считать активированные ДК перспективными кандидатами для активной специфической иммунотерапии пациентов с распространенными формами злокачественных опухолей, в том числе и резистентных к стандартному лечению.The cultivation of invitro peripheral DCs under conditions allowing their maximum growth and activation to be obtained led to an increase in the expression of surface molecules, but their level was often insufficient to induce a stable response of specific CTLs [Veglia F., Gabrilovich D.I. Dendritic cells in cancer: the role revisited // Curr Opin Immunol. 2017 Apr 45: 43-51. doi: 10.1016 / j.coi.2017.01.01.002]. Bone marrow DC precursors, as well as syngenic or allogeneic DCs from the peripheral blood of healthy individuals activated by invitro tumor-associated antigens (OAAs) [Palmer EM, van Seventer G.A., have the greatest ability, compared with peripheral DCs, to present a specific tumor antigen to T lymphocytes. Human T helper cell differentiation is regulated by the combined action of cytokines and accessory cell-dependent costimulatory signals // J Immunol. 1997 Mar 15; 158 (6): 2654-62]. Only such DCs in most cases stimulated a normal CTL response. This allows us to consider activated DCs as promising candidates for active specific immunotherapy of patients with common forms of malignant tumors, including those resistant to standard treatment.

В настоящее время хорошо известно, что опухолевые клетки отличаются от нормальных по своему антигенному составу, и распознавание клеток опухолей иммунной системой отличается от такового для клеток нормальных тканей и существенно зависит от распознавания Т-лимфоцитами ОАА. Многочисленные исследования последних десятилетий убедительно показали, что опухолевые клетки экспрессируют антигенные детерминанты (эпитопы), которые могут распознаваться аутологичными цитоксическими Т-лимфоцитами. Эти эпитопы, являющиеся мишенями для клеток иммунной системы, представляют собой результат эпигенетических, транскрипционных, трансляционных и пост-трансляционных модификаций опухолевых клеток [Arenas-Ramirez N., Sahin D., Boyman О. Epigenetic mechanisms of tumor resistance to immunotherapy // Cell Mol Life Sci. - 2018. -Aug 23. doi: 10.1007/s00018-018-2908-7].At present, it is well known that tumor cells differ from normal in their antigenic composition, and recognition of tumor cells by the immune system differs from that for normal tissue cells and significantly depends on the recognition of OAA by T-lymphocytes. Numerous studies of recent decades have convincingly shown that tumor cells express antigenic determinants (epitopes) that can be recognized by autologous cytoxic T-lymphocytes. These epitopes, which are targets for cells of the immune system, are the result of epigenetic, transcriptional, translational and post-translational modifications of tumor cells [Arenas-Ramirez N., Sahin D., Boyman O. Epigenetic mechanisms of tumor resistance to immunotherapy // Cell Mol Life Sci. - 2018. -Aug 23. doi: 10.1007 / s00018-018-2908-7].

Обнаружение ОАА стало толчком к их использованию для нагрузки ДК. Сейчас известны ОАА многих типов опухолей, в частности, меланомы (gp100, Melan-A/Mart-1, тирозиназа, MAGE-1), рака предстательной железы (PSA, PSCA) и др. [Марков О.В., Миронова Н.Л., Власов В.В., Зенкова М.А. Противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток: от экспериментов на животных моделях до клинических испытаний // Acta naturae. - 2017. - Т. 9. - №3(34). - С. 29-41].The discovery of OAA was the impetus for their use for loading DC. OAA is now known for many types of tumors, in particular, melanoma (gp100, Melan-A / Mart-1, tyrosinase, MAGE-1), prostate cancer (PSA, PSCA), etc. [Markov OV, Mironova N. L., Vlasov V.V., Zenkova M.A. Dendritic cell-based antitumor vaccines: from animal model experiments to clinical trials // Acta naturae. - 2017. - T. 9. - No. 3 (34). - S. 29-41].

Кроме уникальных антигенов, опухолевые клетки имеют широкий спектр молекул, которые экспрессированы многими гистологическими типами злокачественных новообразований, а также могут встречаться в клетках нормальных тканей.In addition to unique antigens, tumor cells have a wide range of molecules that are expressed by many histological types of malignant neoplasms, and can also be found in normal tissue cells.

Раково-тестикулярные антигены (РТА) представляют собой кластер опухоле-ассоциированных белков, которые не эксперссируются в нормальных соматических клетках, за исключением клеток семенников и плаценты, но широко представлены в разнообразных злокачественных новообразованиях. В настоящее время известно 228 РТА, объединяемых в семейства по ряду родственных признаков, которые классифицируют обычно в две основные группы: антигены СТ-Х, локализующиеся на Х-хромосоме, и составляющие 52% (120), и остальные, так называемые «non-Х СТ», закодированные в аутосомах и в Y-хромосоме [Salmaninejad А., Zamani M.R., Pourvahedi М. etal. Cancer/Testis Antigens: Expression, Regulation, Tumor Invasion, and Use in Immunotherapy of Cancers // Immunol Invest. 2016 Oct; 45(7):619-40. doi: 10.1080/08820139.2016.1197241]. Факт, что РТА экспрессируются многими злокачественными новообразованиями позволяет использовать их для нагрузки и активации ДК.Cancer-testicular antigens (PTAs) are a cluster of tumor-associated proteins that are not expressed in normal somatic cells, with the exception of testis and placenta cells, but are widely represented in a variety of malignant neoplasms. Currently, 228 PTAs are known that are united in families according to a number of related characteristics, which are usually classified into two main groups: ST-X antigens located on the X chromosome, which make up 52% (120), and the rest, the so-called “non- X CT "encoded in the autosomes and in the Y chromosome [Salmaninejad A., Zamani MR, Pourvahedi M. etal. Cancer / Testis Antigens: Expression, Regulation, Tumor Invasion, and Use in Immunotherapy of Cancers // Immunol Invest. 2016 Oct; 45 (7): 619-40. doi: 10.1080 / 08820139.2016.1197241]. The fact that PTAs are expressed by many malignant neoplasms makes it possible to use them for loading and activating DCs.

Опухолевые лизаты признаны превосходным источником ОАА для дендритных клеток. Экспериментальные работы на животных моделях показали, что дендритные клетки, нагруженные опухолевым лизатом, способны индуцировать иммунный ответ через генерацию ЦТЛ, специфически активированных против опухолевых антигенов, что приводит к регрессу опухолей у животных [Rainone V., Martelli С., Ottobrini L., Biasin M., Texido G., Degrassi A., Borelli M., Lucignani G., Trabattoni D., Clerici M. Immunological Characterization of Whole Tumour Lysate-Loaded Dendritic Cells for Cancer Immunotherapy // PLoS One. - 2016. - 11(1): e0146622. doi: 10.1371/journal.pone.0146622]. Тестирование разных способов нагрузки и активации ДК, в частности, лизатами на основе аутологичных и аллогенных опухолевых клеток, цельными опухолевыми клетками и мРНК, выделенной из опухолевых клеток, показало, что наиболее эффективный иммунологический ответ вызывали именно ДК, активированные цельными или лизированными клетками опухоли [Nathenson M.J., Conley А.Р., Sausville Е. Immunotherapy: A New (and Old) Approach to Treatment of Soft Tissue and Bone Sarcomas // The Oncologist. - 2018. - 23:71-83. doi: 10.1634/theoncologist.2016-0025]. Одними из первых были разработаны вакцины на основе аутологичных ДК, выращенных из моноцитов периферической крови и активированных лизатом аллогенных клеток меланомы кожи и рака предстательной железы, применение которых показало формирование опухолеспецифической реакции гиперчувствительности замедленного типа и увеличение показателей выживаемости пациентов с диссеминированными формами заболевания, то есть продемонстрировало иммунологический и клинический ответ [Lopez M.N., Pereda С., Segal G., Munoz L., Aguilera R., Gonzalez F.E., Escobar A., Ginesta A., Reyes D., Gonzalez R. etal. Prolonged survival of dendritic cell-vaccinated melanoma patients correlates with tumor-specific delayed type IV hypersensitivity response and reduction of tumor growth factor β-expressing T cells // J Clin Oncol. - 2009. - 27:945-952. doi: 10.1200/JCO.2008.18.0794].Tumor lysates are recognized as an excellent source of OAA for dendritic cells. Experimental work on animal models showed that dendritic cells loaded with a tumor lysate are able to induce an immune response through the generation of CTLs specifically activated against tumor antigens, which leads to regression of tumors in animals [Rainone V., Martelli C., Ottobrini L., Biasin M., Texido G., Degrassi A., Borelli M., Lucignani G., Trabattoni D., Clerici M. Immunological Characterization of Whole Tumour Lysate-Loaded Dendritic Cells for Cancer Immunotherapy // PLoS One. - 2016 .-- 11 (1): e0146622. doi: 10.1371 / journal.pone.0146622]. Testing different methods of loading and activating DCs, in particular, lysates based on autologous and allogeneic tumor cells, whole tumor cells and mRNA isolated from tumor cells, showed that the most effective immunological response was caused by DCs activated by whole or lysed tumor cells [Nathenson MJ, Conley A.R., Sausville E. Immunotherapy: A New (and Old) Approach to Treatment of Soft Tissue and Bone Sarcomas // The Oncologist. - 2018 .-- 23: 71-83. doi: 10.1634 / theoncologist.2016-0025]. One of the first to develop vaccines based on autologous DCs grown from peripheral blood monocytes and activated by lysate of allogeneic skin melanoma cells and prostate cancer, the use of which showed the formation of a tumor-specific delayed hypersensitivity reaction and an increase in the survival rates of patients with disseminated forms of the disease, that is, it demonstrated immunological and clinical response [Lopez MN, Pereda C., Segal G., Munoz L., Aguilera R., Gonzalez FE, Escobar A., Ginesta A., Reyes D., Gonzalez R. etal. Prolonged survival of dendritic cell-vaccinated melanoma patients correlates with tumor-specific delayed type IV hypersensitivity response and reduction of tumor growth factor β-expressing T cells // J Clin Oncol. - 2009 .-- 27: 945-952. doi: 10.1200 / JCO.2008.18.0794].

В начале 2000-х годов уже было отмечено, что опухоли разной гистотипической принадлежности могут иметь сходный антигенный профиль, например антигены семейства MAGE или ТА-90, что позволяет в данном случае использовать противоопухолевые вакцины на основе клеток меланомы кожи для лечения больных другими типами онкологических заболеваний, при условии, что их опухолевые клетки экспрессируют соответствующие антигены [Habal N., Gupta R.K., Bilchik A.J., Yee R., Leopoldo Z., Ye W., Elashoff R.M., Morton D.L. CancerVax, an allogeneic tumor cell vaccine, induces specific humoral and cellular immune responses in advanced colon cancer // Ann Surg Oncol. - 2001. - 8(5):389-401. PMID: 11407512].In the early 2000s, it was already noted that tumors of different histotypic affiliation may have a similar antigenic profile, for example, antigens of the MAGE or TA-90 family, which makes it possible in this case to use antitumor vaccines based on skin melanoma cells for the treatment of patients with other types of cancer provided that their tumor cells express the corresponding antigens [Habal N., Gupta RK, Bilchik AJ, Yee R., Leopoldo Z., Ye W., Elashoff RM, Morton DL CancerVax, an allogeneic tumor cell vaccine, induces specific humoral and cellular immune responses in advanced colon cancer // Ann Surg Oncol. - 2001 .-- 8 (5): 389-401. PMID: 11407512].

Большинство РТА представлены мультиантигенными семействами, состоящими из родственных антигенов. Другие РТА могут не иметь аналогов, например, SCP-1. Разнообразие родственных антигенов позволяет полагать, что стимулирование иммунного ответа против одного члена семейства будет способствовать распознаванию и элиминации клеток, экспрессирующих родственные антигены. Таким образом, чтобы оценить иммуногенные свойства опухоли, достаточно определить активность только некоторых генов-представителей семейств.Most PTAs are represented by multi-antigenic families consisting of related antigens. Other PTAs may not have analogues, such as SCP-1. A variety of related antigens suggests that stimulation of the immune response against one member of the family will facilitate the recognition and elimination of cells expressing related antigens. Thus, in order to evaluate the immunogenic properties of a tumor, it is sufficient to determine the activity of only some genes that are representatives of families.

В процессе опухолевой прогрессии опухолевые клетки реализуют разнообразные механизмы, позволяющие им «ускользать» от воздействия клеток иммунной системы. Один из подобных механизмов - это синтез и экскреция в микроокружение опухоли различных молекул, оказывающих локальное блокирующее воздействие на функционирование опухолеассоциированных компонентов иммунной системы, а также способных оказывать системное иммуносупрессивное действие [Wu А.А., Drake V., Huang H.S., Chiu S., Zheng L. Reprogramming the tumor microenvironment: tumor-induced immunosuppressive factors paralyze T cells // Oncoimmunology. - 2015. - Apr 1; 4(7):е1016700].In the process of tumor progression, tumor cells implement a variety of mechanisms that allow them to "escape" from the effects of cells of the immune system. One of such mechanisms is the synthesis and excretion into the tumor microenvironment of various molecules that have a local blocking effect on the functioning of the tumor-associated components of the immune system, as well as those that can have a systemic immunosuppressive effect [Wu A.A., Drake V., Huang HS, Chiu S. , Zheng L. Reprogramming the tumor microenvironment: tumor-induced immunosuppressive factors paralyze T cells // Oncoimmunology. - 2015. - Apr 1; 4 (7): e1016700].

Таким образом, разработка клеточного продукта, содержащего широкий спектр основных изученных семейств РТА, лишенного специфического иммуносупрессивного действия на клетки иммунной системы, имеет большое значение для совершенствования дендритно-клеточных вакцин.Thus, the development of a cell product containing a wide range of the main studied PTA families, devoid of a specific immunosuppressive effect on cells of the immune system, is of great importance for improving dendritic cell vaccines.

Известны иммуностимулирующие и вакцинные композиции, суть которых заключается в использовании маннанов с молекулярным весом более чем приблизительно 1000 кДа, применяемых как самостоятельный агент, так и в комплексе с по меньшей мере одним опухолевым антигеном или кодирующей его нуклеиновой кислотой (патент RU 2578420, опубл. 22.10.2015).Immunostimulating and vaccine compositions are known, the essence of which is the use of mannans with a molecular weight of more than approximately 1000 kDa, used both as an independent agent and in combination with at least one tumor antigen or nucleic acid encoding it (patent RU 2578420, publ. 22.10 .2015).

Недостатком данных композиций является их моноспецифичность.The disadvantage of these compositions is their monospecificity.

Известны композиции для активации ДК человека, содержащие интерферон гамма и аутологичные опухолевые клетки больного, в присутствии которых происходит созревание активированных дендритных клеток (Заявка на изобретение 2008122550, опубл. 20.01.2010).Known compositions for the activation of human DC, containing interferon gamma and autologous tumor cells of the patient, in the presence of which the maturation of activated dendritic cells occurs (Application for invention 2008122550, publ. 01.20.2010).

Недостатком подобной композиции является невозможность учитывать гетерогенизацию опухоли in vivo, когда в результате опухолевой прогрессии появляются новые злокачественные клоны с измененным антигенным фенотипом.The disadvantage of this composition is the inability to take into account tumor heterogenization in vivo when new malignant clones with a modified antigenic phenotype appear as a result of tumor progression.

Известны новые вакцинные адъюванты на основе адъювантов-антител, нацеливающих непосредственно на антигенпрезентирующие клетки, представляющие собой композицию, включающую специфическое к ДК антитело или его связывающий фрагмент, конъюгированные с агонистом TLR; и, по меньшей мере, один антиген, где антиген и агонист являются эффективными для вызова иммунного ответа у объекта-человека, нуждающегося в иммуностимуляции (Заявка на изобретение 2013110889/10, 12.08.2011). В качестве антигена могут выступать пептиды ОАА, выделенные из злокачественных новообразований.New vaccine adjuvants based on adjuvant antibodies are known that directly target antigen-presenting cells, which are a composition comprising a DC-specific antibody or its binding fragment conjugated to a TLR agonist; and at least one antigen, where the antigen and agonist are effective for eliciting an immune response in a human subject in need of immunostimulation (Application for invention 2013110889/10, 08/12/2011). OAA peptides isolated from malignant neoplasms can act as antigen.

Недостатком данной композиции является узкая иммуноспецифичность формируемого иммунного ответа, так как предполагается, что выделенные из организма ДК человека будут приведены в контакт с заявленной вакцинной композицией.The disadvantage of this composition is the narrow immunospecificity of the generated immune response, since it is assumed that the human DC extracted from the body will be brought into contact with the claimed vaccine composition.

Известен клеточный продукт для нагрузки и активации дендритных клеток, представляющий собой клеточный лизат на основе 4 клеточных линий меланомы кожи человека, протестированных иммуноцитохимическим методом на присутствие шести меланомо-ассоциированных дифференцировочных антигенов и методом проточной цитометрии на присутствие трех раково-тестикулярных антигенов (Нехаева Т.Л. Оптимизация технологии и стандартизация получения противоопухолевых вакцин на основе аутологичных дендритных клеток: автореф. дис. канд. медицинских наук: 14.01.12, 14.03.09 / СПб, 2014. 24 с.) Данный продукт применялся для создания вакцин на основе дендритных клеток для лечения больных преимущественно меланомой кожи.A well-known cell product for loading and activating dendritic cells is a cell lysate based on 4 cell lines of human skin melanoma, tested by immunocytochemical method for the presence of six melanoma-associated differentiation antigens and flow cytometry for the presence of three cancer-testicular antigens (T. Nekhaeva Optimization of technology and standardization of the production of antitumor vaccines based on autologous dendritic cells: abstract of dissertation of the candidate of medical sciences: 14.01.1 2, 03/14/09 / St. Petersburg, 2014. 24 pp.) This product was used to create dendritic cell vaccines for the treatment of patients with predominantly melanoma of the skin.

Недостатком данного клеточного продукта является незначительная выборка однотипных клеточных линий с продукцией антигенов, присутствующих исключительно на злокачественных меланоцитах и отсутствующих в клетках других солидных опухолей.The disadvantage of this cell product is a small sample of the same cell lines with the production of antigens that are present exclusively on malignant melanocytes and absent in the cells of other solid tumors.

Техническим результатом изобретения является создание клеточного продукта (условное название IRTAN-2018), содержащего расширенный спектр РТА и проверенного на отсутствие продукции значительного количества факторов, участвующих в процессах неоангиогенеза, метастазирования, ингибирования свойств клеток иммунной системы, что приводит к повышению функциональной активности клеточного продукта в производстве дендритно-клеточных вакцин и универсализации получаемых лечебных препаратов для лечения солидных опухолей, несущих родственные РТА. Техническим результатом является также возможность использования заявляемого клеточного продукта для тестирования функциональной состоятельности дендритных клеток пациентов, которым показана клеточная иммунотерапия, а также для создания клонов опухоле-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (цитокин-активированных киллеров).The technical result of the invention is the creation of a cellular product (code name IRTAN-2018) containing an expanded spectrum of PTA and tested for the absence of production of a significant number of factors involved in the processes of neoangiogenesis, metastasis, inhibition of the properties of cells of the immune system, which leads to an increase in the functional activity of the cellular product in the production of dendritic cell vaccines and the universalization of the resulting drugs for the treatment of solid tumors bearing related PTA. The technical result is also the possibility of using the inventive cell product to test the functional viability of dendritic cells of patients who are shown cell immunotherapy, as well as to create clones of tumor-specific cytotoxic T-lymphocytes (cytokine-activated killers).

Указанный технический результат достигается в клеточном продукте для нагрузки и активации дендритных клеток человека, состоящем из равных долей лизатов клеточных линий меланомы кожи человека, депонированных в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под соответствующими регистрационными номерами:The indicated technical result is achieved in a cellular product for loading and activating human dendritic cells, consisting of equal shares of lysates of human melanoma cell lines in human skin deposited in a specialized collection of vertebrate cell cultures of the Russian collection of cell cultures under the appropriate registration numbers:

226 АВ mel - под номером РККК(П)725Д,226 AB mel - under the number of RKKK (P) 725D,

283 mel - под номером РККК(П)726Д,283 mel - under the number of RKKK (P) 726D,

Mel 311 - под номером РККК(П)703Д,Mel 311 - under the number of RKKK (P) 703D,

515 mel - под номером РККК(П)757Д,515 mel - under the number of RKKK (P) 757D,

mel 520 DVA- под номером РККК(П)779Д,mel 520 DVA- under the number of RKKK (P) 779D,

685 mel GSN - под номером РККК(П)781Д,685 mel GSN - under the number of RKKK (P) 781D,

686 mel FLA - под номером РККК(П)782Д,686 mel FLA - under the number of RKKK (P) 782D,

860 mel BII - под номером РККК(П)783Д,860 mel BII - under the number of RKKK (P) 783D,

mel 929 SVU - под номером РККК(П)780Д,mel 929 SVU - under the number of RKKK (P) 780D,

обладающих хорошими ростовыми характеристиками, экспрессирующих гены основных семейств РТА и продуцирующих очень низкие количества иммуносупрессивных факторов, лизаты указанных клеточных линий приготовлены путем многократного замораживания-оттаивания с определением жизнеспособности клеток методом проточной цитометрии, одна аликвота клеточного продукта содержит суммарное число клеток 30 млн, которые находятся в 500 мкл физиологического раствора.possessing good growth characteristics, expressing the genes of the main PTA families and producing very low amounts of immunosuppressive factors, the lysates of these cell lines were prepared by repeated freezing-thawing with determination of cell viability by flow cytometry, one aliquot of the cell product contains a total number of 30 million cells that are in 500 μl of saline.

Изобретение сопровождается графическими изображениями на фиг. 1-13, где:The invention is accompanied by graphical representations in FIG. 1-13, where:

на фиг. 1 - табл. 1. Числовое выражение интенсивности экспрессии РТА клеточными линиями меланомы кожи, выраженное в процентах по отношению к референсному гену;in FIG. 1 - tab. 1. A numerical expression of the intensity of PTA expression by cell lines of skin melanoma, expressed as a percentage in relation to the reference gene;

на фиг. 2 - табл. 2. Продукция иммуносупрессивных факторов 9 клеточными линиями меланомы кожи;in FIG. 2 - tab. 2. Production of immunosuppressive factors by 9 cell lines of skin melanoma;

на фиг. 3 - табл. 3. Характеристика клеточных линий меланомы кожи, входящих в композицию клеточного препарата IRTAN-2018;in FIG. 3 - tab. 3. Characterization of cell lines of skin melanoma included in the composition of the cell preparation IRTAN-2018;

на фиг. 4 - табл. 4. Цитогенетическая характеристика клеточных линий МК, входящих в композицию клеточного препарата IRTAN-2018;in FIG. 4 - tab. 4. Cytogenetic characteristics of MK cell lines included in the composition of the cell preparation IRTAN-2018;

на фиг. 5 - табл. 5. Морфологические особенности клеточных линий МК, входящих в композицию клеточного препарата IRTAN-2018:in FIG. 5 - tab. 5. Morphological features of MK cell lines included in the composition of the cell preparation IRTAN-2018:

на фиг. 6 - определение жизнеспособности клеточного лизата, входящего в состав клеточного продукта IRTAN-2018;in FIG. 6 - determination of the viability of the cell lysate, which is part of the cellular product of IRTAN-2018;

на фиг. 7 - графическое изображение основных субпопуляций зрелых ДК, полученных в результате их активации клеточным препаратом IRTAN-2018;in FIG. 7 is a graphical depiction of the main subpopulations of mature DCs obtained as a result of their activation with the IRTAN-2018 cell preparation;

на фиг. 8 - сравнение антигенного иммунофенотипа незрелых и зрелых ДК. Гистограммы, полученные методом проточной цитометрии. Незрелые ДК - зеленый цвет, зрелые ДК - красный;in FIG. 8 is a comparison of the antigenic immunophenotype of immature and mature DCs. Histograms obtained by flow cytometry. Unripe DK - green, mature DK - red;

на фиг. 9 - табл. 6. Сравнение экспрессии антигенов, присутствующих на незрелых и зрелых дендритных клетках, полученных в результате их активации клеточным препаратом IRTAN-2018:in FIG. 9 - tab. 6. Comparison of the expression of antigens present on immature and mature dendritic cells obtained as a result of their activation with the IRTAN-2018 cell preparation:

на фиг. 10 - табл. 7. Результаты мультиплексного анализа продукции цитокинов незрелыми и зрелыми ДК, полученными в результате их активации клеточным препаратом IRTAN-2018 (пг/мл);in FIG. 10 - tab. 7. The results of the multiplex analysis of cytokine production by immature and mature DCs obtained as a result of their activation by the IRTAN-2018 cell preparation (pg / ml);

на фиг. 11 - относительное содержание активированных ЦТЛ в клеточной популяции, полученной в результате кокультивирования с ДК, нагруженными клеточным продуктом IRTAN-2018:in FIG. 11 - the relative content of activated CTLs in the cell population obtained as a result of co-cultivation with DC loaded with the IRTAN-2018 cell product:

на фиг. 12 - графическое изображение результатов ММТ теста при кокультивировании активированных ЦТЛ и клеток меланомы кожи, полученных из операционного материала разных больных. * - р<0,005in FIG. 12 is a graphical representation of the results of the MMT test during cocultivation of activated CTLs and skin melanoma cells obtained from the surgical material of different patients. * - p <0.005

Технический результат изобретения достигается за счет расширения используемой популяции клеток меланомы кожи путем создания клеточного продукта из 9 клеточных линий меланомы кожи человека, каждая из которых гиперэкспрессирует уникальный набор РТА (фиг. 1, табл. 1).The technical result of the invention is achieved by expanding the used population of skin melanoma cells by creating a cell product from 9 cell lines of human skin melanoma, each of which overexpresses a unique set of PTA (Fig. 1, Table 1).

Каждая клеточная линия меланомы кожи человека, входящая в состав клеточного продукта, продуцирует низкое количество иммуносупрессивных факторов, определенных методом мультиплексного анализа на приборе BioPlex (BioRad, США) в супернатантах культивируемых клеток на поздних пассажах (фиг. 2, табл. 2).Each cell line of human skin melanoma, which is part of the cell product, produces a low amount of immunosuppressive factors determined by the method of multiplex analysis on a BioPlex device (BioRad, USA) in the supernatants of cultured cells in late passages (Fig. 2, Table 2).

Каждая клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под соответствующим регистрационным номером (фиг. 3, табл. 3).Each cell line has stable cultural and morphological characteristics and is stored in the Specialized Collection of Vertebrate Cell Cultures of the Russian Cell Culture Collection under the appropriate registration number (Fig. 3, Table 3).

Преимущество использования композиции клеточных линий меланомы кожи человека, экспрессирующих РТА, перед использованием отдельных клеточных линий заключается в том, что композиционное решение базируется на выявлении метаболических особенностей полученных клеточных линий меланомы кожи, и заявляемая клеточная композиция (клеточный продукт) содержит полный набор РТА, в том числе редко встречающихся активных генов (HAGE, SPANXA1), необходимых для активации дендритных клеток, что отсутствует в каждой клеточной линии по отдельности.The advantage of using a composition of human skin melanoma cell lines expressing PTAs over the use of individual cell lines is that the compositional solution is based on identifying the metabolic features of the obtained skin melanoma cell lines, and the claimed cell composition (cell product) contains a complete set of PTA, including the number of rarely found active genes (HAGE, SPANXA1) necessary for the activation of dendritic cells, which is absent in each cell line individually.

Клеточные линии меланомы кожи получены из операционного материала онкологических больных. Одна клеточная линия получена из первичной опухоли, остальные восемь имеют метастатическое происхождение.Cell line melanoma of the skin obtained from the surgical material of cancer patients. One cell line was obtained from a primary tumor, the remaining eight are of metastatic origin.

Получение клеточных линий осуществлено следующим образом.Obtaining cell lines is as follows.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30-60 сек. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Пассажи, на которых были получены стабильно растущие клеточные линии, указаны в табл. 3 на фиг. 3.Tumor tissue obtained by surgery. Tumor samples ground with a sterile scalpel (1-3 mm ² ) were subjected to mechanical disaggregation in automatic mode, placing them on sterile knives for 30-60 seconds. The resulting cell suspension was passed successively through sterile nylon filters of 100 μm, 70 μm, 50 μm, suspended in complete medium and transferred to a culture dish in which cultivation was carried out for a long time. Passages on which stably growing cell lines were obtained are indicated in Table. 3 in FIG. 3.

Культуральные свойства клеточных линий представлены следующим образом.The cultural properties of cell lines are presented as follows.

Для изготовления клеточного продукта по изобретению клеточные линии меланомы кожи культивируются и наращиваются однотипным способом: с использованием питательной среды DMEM/F12 (80%), эмбриональной телячьей сыворотки 20%, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно); 37°С, 5% СО₂, 100% влажности. Культуры клеток имеют адгезионный монослойный тип роста, посевная доза и частота пересева указана в табл. 3 на фиг. 3.For the manufacture of the cell product according to the invention, the skin melanoma cell lines are cultured and grown in the same manner: using DMEM / F12 nutrient medium (80%), fetal calf serum 20%, insulin (5 μg / ml), transferrin (5 μg / ml), selenium (5 ng / ml), antibiotics (penicillin with streptomycin at a concentration of 100 u / ml and 100 μg / ml, respectively); 37 ° C, 5% CO ₂ , 100% humidity. Cell cultures have an adhesive monolayer type of growth, the seeding dose and the frequency of reseeding are shown in table. 3 in FIG. 3.

Условия криоконсервации следующие.Cryopreservation conditions are as follows.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%), DMSO10%; 3×106 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см2. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации указана в табл. 3 на фиг. 3.For long-term storage, cells are preserved by freezing in liquid nitrogen. Cryomedia: DMEM / F12 50%, fetal calf serum 40%), DMSO10%; 3 × 106 cells / ml per vial. Cell line cells are resuspended in freezing medium. Freezing mode: liquid nitrogen, lowering the temperature by 1 ° С per minute to -25 ° С, then quick freezing to minus 70 ° С. Storage in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C. Defrosting is quick at 37 ° C. Cells are diluted in 10 ml of serum-free medium and precipitated by centrifugation, resuspended in 5 ml of the same medium containing 20% fetal calf serum, and transferred to a 25 cm2 culture vial. Cell viability is assessed by the inclusion of trepan blue. Cell viability after cryopreservation is shown in table. 3 in FIG. 3.

Контаминация исследована следующим образом.Contamination is investigated as follows.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasmapneumonia, genitalium, hominis-тест на микоплазму отрицателен.With prolonged observation, bacteria and fungi were not found in the culture. PCR studies have been conducted for the presence of Mycoplasmapneumonia, genitalium, the hominis test for mycoplasma is negative.

Цитогенетическая характеристика клеточных линий представлена в табл. 4, на фиг. 4The cytogenetic characteristics of cell lines are presented in table. 4, in FIG. 4

Морфологические характеристики клеточных линий представлены в табл. 5 на фиг. 5.Morphological characteristics of cell lines are presented in table. 5 in FIG. 5.

Изобретательский уровень настоящего изобретения обеспечивается тем, что девять заявленных клеточных линий меланомы кожи наращивают вышеописанным способом, снимают с субстрата, отмывают дважды в физиологическом растворе путем центрифугирования 10 мин при 1000 об/мин и соединяют в равных долях с общим количеством клеток 30 млн/ампула в 500 мкл физиологического раствора. Полученная клеточная суспензия подвергается шестикратному замораживанию до температуры -196°С и моментальному оттаиванию при комнатной температуре, в результате чего получают клеточный лизат. Проверку жизнеспособности клеточного лизата осуществляют методом проточной цитометрии с использованием флюоресцентного красителя 7-AAD (BD Bioscience, США) (рис. 2). Количество мертвых клеток в лизате составляет не менее 99,3-99,8%. Аликвоты клеточного продукта IRTAN-2018 помещают в криопробирки объемом 1,5 мл (BD Bioscience, США) и хранят при -30°С до использования.The inventive step of the present invention is ensured by the fact that nine claimed cell lines of skin melanoma are expanded as described above, removed from the substrate, washed twice in physiological saline by centrifugation for 10 minutes at 1000 rpm and combined in equal proportions with a total number of cells of 30 million / ampoule in 500 μl of saline. The resulting cell suspension is subjected to six-fold freezing to a temperature of -196 ° C and instantly thawing at room temperature, resulting in a cell lysate. The viability of the cell lysate is checked by flow cytometry using a 7-AAD fluorescent dye (BD Bioscience, USA) (Fig. 2). The number of dead cells in the lysate is at least 99.3-99.8%. Aliquots of the IRTAN-2018 cell product are placed in 1.5 ml cryovials (BD Bioscience, USA) and stored at -30 ° C until use.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Изучение антигенного иммунофенотипа ДК при использовании клеточного продукта IRTAN-2018 для их нагрузки и активации.Example 1. The study of the antigenic immunophenotype of DC using the cellular product IRTAN-2018 for their load and activation.

А) Для получения дендритных клеток CD14⁺ моноциты, выделенные из периферической крови четырех практически здоровых человек методом позитивной магнитной сепарации с помощью набора STEMCELL Technologies Inc, США, помещали в плоскодонные культуральные флаконы 75 см² с вентилируемыми пробками (Sarstedt, Германия).A) To obtain CD14 ⁺ dendritic cells, monocytes isolated from the peripheral blood of four practically healthy individuals by positive magnetic separation using a STEMCELL Technologies Inc kit, USA, were placed in 75 cm ² flat-bottomed culture bottles with vented plugs (Sarstedt, Germany).

Б) Дифференцировку моноцитов в незрелые ДК проводили в сбалансированной бессывороточной среде CellGro DC (CellGenix, Германия) с применением ростовых факторов и факторов дифференцировки - GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) (CellGenix, Германия), которые вносили на 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования.B) Differentiation of monocytes into immature DC was performed in a balanced serum-free medium CellGro DC (CellGenix, Germany) using growth factors and differentiation factors - GM-CSF (72 ng / ml) and IL-4 (20 ng / ml) (CellGenix, Germany ), which were made on the 1st, 3rd and 5th days of cultivation.

В) На седьмые сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены (1 аликвота клеточного препарата IRTAN-2018, 30 млн клеток), исходя из соотношения 1 ДК:3 лизированные опухолевые клетки, ростовые факторы и факторы дифференцировки - GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл) и TNF-α (BD, США) (20 нг/мл).C) On the seventh day of cultivation, tumor antigens (1 aliquot of the IRTAN-2018 cell preparation, 30 million cells) were introduced for DC maturation, based on the ratio of 1 DC: 3 lysed tumor cells, growth factors and differentiation factors - GM-SCF (72 ng / ml), IL-4 (20 ng / ml) and TNF-α (BD, USA) (20 ng / ml).

Г) На 7-й и 9-й день отбирали ДК в количестве не менее 1×10⁶, анализ поверхностных антигенов осуществляли на приборе BD FACS Canto™ II (BD, США).D) On the 7th and 9th day, DCs were taken in an amount of at least 1 × 10 ⁶ , surface antigens were analyzed on a BD FACS Canto ™ II instrument (BD, USA).

Д) Производили оценку иммунофенотипа ДК по следующей схеме с использованием следующих реагентов:D) Assessed the immunophenotype of DC according to the following scheme using the following reagents:

- пробирка №1: 20 мкл CD14 FITC, 20 мкл CD11c РЕ, 5 мкл CD86 PerCP-Су5.5, 5 мкл CD83 РЕ-Су7, 20 мкл CD1a АРС, 5 мкл CD80 АРС-Н7.- tube No. 1: 20 μl CD14 FITC, 20 μl CD11c PE, 5 μl CD86 PerCP-Su5.5, 5 μl CD83 PE-Su7, 20 μl CD1a ARC, 5 μl CD80 APC-H7.

- пробирка №2: 20 мкл CD14 FITC, 20 мкл CD40 РЕ, 20 мкл CD209 PerCP-Су5.5, 5 мкл CD83 РЕ-Су7, 20 мкл CD1a АРС, 5 мкл HLA-DR АРС-Н7.- test tube No. 2: 20 μl of CD14 FITC, 20 μl of CD40 PE, 20 μl of CD209 PerCP-Su5.5, 5 μl of CD83 PE-Su7, 20 μl of CD1a ARC, 5 μl of HLA-DR ARC-H7.

- пробирка №3: 20 мкл CD14 FITC, 5 мкл CD83 РЕ-Су7, 20 мкл CD1a АРС, 5 мкл CD197 (CCR7) BV421. Все реагенты производства BD Bioscience, США.- tube No. 3: 20 μl of CD14 FITC, 5 μl of CD83 PE-Su7, 20 μl of CD1a ARC, 5 μl of CD197 (CCR7) BV421. All reagents manufactured by BD Bioscience, USA.

Е) Полученные результаты отражены на фиг. 7, 8 и в табл. 6 на фиг. 9.E) The results are shown in FIG. 7, 8 and in table. 6 in FIG. 9.

Из фиг. 7, 8 и табл. 6 на фиг. 9 видно, что в результате активации после инкубации с клеточным продуктом статистически значимо меняется иммунофенотип ДК: увеличивается присутствие на клеточной поверхности CCR7, CD83, CD86, CD80, CD40, в том числе коэкспрессия CD83/CD1a, CD83/CD86, CD83/CD80, CD83/CD209, CD83/CCR7; наблюдается уменьшение относительного содержания ДК, позитивных по CD83/CD1a, что свидетельствует об эффективном созревании ДК, их готовности мигрировать и презентировать ОАА.From FIG. 7, 8 and tab. 6 in FIG. Figure 9 shows that as a result of activation after incubation with the cell product, the immunophenotype of DC changes statistically significantly: the presence of CCR7, CD83, CD86, CD80, CD40 on the cell surface increases, including coexpression of CD83 / CD1a, CD83 / CD86, CD83 / CD80, CD83 / CD209, CD83 / CCR7; there is a decrease in the relative content of DCs positive for CD83 / CD1a, which indicates the effective maturation of DCs, their readiness to migrate and present OAA.

Пример 2. Анализ продукции цитокинов ДК при использовании клеточного продукта IRTAN-2018 для их нагрузки и активации.Example 2. Analysis of the production of DC cytokines when using the cellular product IRTAN-2018 for their loading and activation.

А) ДК получали и культивировали описанным выше способом. На 7-й и 9-й день культивирования отбирали надосадочную жидкость (супернатант) в количестве не менее 500 мкл и использовали для анализа количественного содержания цитокинов методом мультиплексного анализа на приборе Bio-Plex 200 (Bio-Rad, США) с программным обеспечением Bio-Plex Manager™ v. 6.1 (Bio-Rad, США) помощью набора Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-plex Assay(Bio-Rad, США).A) DC were obtained and cultured as described above. On the 7th and 9th day of cultivation, at least 500 μl of supernatant (supernatant) was taken and used to analyze the quantitative content of cytokines by multiplex analysis on a Bio-Plex 200 instrument (Bio-Rad, USA) with Bio-software Plex Manager ™ v. 6.1 (Bio-Rad, USA) using the Bio-Plex Pro ™ Human Cytokine 27-plex Assay kit (Bio-Rad, USA).

Б) Полученные результаты отражены в табл. 7 на фиг. 10. В результате активации под воздействием клеточного препарата IRTAN-2018 в супернатантах культур ДК статистически значимо увеличивается количественное содержание цитокинов IL-2, IL-17 и уменьшаются концентрация цитокинов IL-5, IL-10, G-CSF, MIP-1b, что свидетельствует об эффективном созревании ДК, проявлении их способности синтезировать молекулы, привлекающие и активирующие Т-лимфоциты.B) The results are shown in table. 7 in FIG. 10. As a result of activation under the influence of the cellular preparation IRTAN-2018 in the supernatants of DC cultures, the quantitative content of the cytokines IL-2, IL-17 statistically significantly increases and the concentration of the cytokines IL-5, IL-10, G-CSF, MIP-1b decreases, which testifies to the effective maturation of DCs, the manifestation of their ability to synthesize molecules that attract and activate T-lymphocytes.

Пример 3. Получение специфически активированных ЦТЛ путем кокультивирования с ДК, активированными с помощью клеточного продукта IRTAN-2018.Example 3. Obtaining specifically activated CTLs by co-cultivation with DCs activated using the IRTAN-2018 cell product.

А) Выделяли мононуклеарные клетки (МНК) методом лейкафереза периферической крови пациентов или центрифугирования периферической крови в градиенте плотности. Затем МНК вносили в плоскодонные культуральные флаконы 75 см² для разделения фракций преимущественно моноцитов и преимущественно лимфоцитов методом адгезии к субстрату. Среду с не прилипшими клетками (преимущественно лимфоцитами) аккуратно отбирали, подсчитывали количество, отбирали пробу для анализа методом проточной цитофлуорометрии и криоконсервировали до использования. С прилипшей фракцией клеток работали для получения активированных ДК, нагруженных РТА. Для этого вносили в культуру полученных моноцитов ростовые факторы и факторов дифференцировки - GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) (CellGenix, Германия) в сбалансированной бессывороточной среде CellGro DC (CellGenix, Германия) на 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования.A) Mononuclear cells (MNCs) were isolated by the method of peripheral blood leukapheresis of patients or by centrifugation of peripheral blood in a density gradient. Then, MNCs were introduced into 75 cm ² flat-bottomed culture bottles to separate fractions of mainly monocytes and mainly lymphocytes by adhesion to the substrate. Medium with non-adherent cells (mainly lymphocytes) was carefully taken, the number was counted, a sample was taken for analysis by flow cytometry and cryopreserved before use. The adherent fraction of cells was worked to obtain activated DCs loaded with PTA. For this purpose, growth factors and differentiation factors — GM-CSF (72 ng / ml) and IL-4 (20 ng / ml) (CellGenix, Germany) in a balanced serum-free CellGro DC medium (CellGenix, Germany) per 1, were introduced into the culture of the obtained monocytes 3rd, 3rd and 5th days of cultivation.

Б) На седьмые сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены (1 аликвота клеточного препарата IRTAN-2018, 30 млн клеток), исходя из соотношения 1 ДК:3 лизированные опухолевые клетки, ростовые факторы и факторы дифференцировки - GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл) и TNF-α (BD, США) (20 нг/мл).B) On the seventh day of cultivation, tumor antigens (1 aliquot of the cell preparation IRTAN-2018, 30 million cells) were introduced to mature the DCs, based on the ratio of 1 DC: 3 lysed tumor cells, growth factors and differentiation factors - GM-SCF (72 ng / ml), IL-4 (20 ng / ml) and TNF-α (BD, USA) (20 ng / ml).

В) Фракцию лимфоцитов размораживали и кокультивировали со зрелыми ДК (9-й день культивирования) в присутствии цитокинов GM-CSF (72 нг/мл), IL-2 (12,5 МЕ/мл), IL-4 (15 нг/мл), IL-7 (10 нг/мл), TNF-α (20 нг/мл) (BD Bioscience, США) в течение 7 дней. Затем собирали лимфоциты и переносили их для кокультивирования со свежей порцией зрелых ДК в присутствии искомого коктейля цитокинов. Проводили кокультивирование лимфоцитов и зрелых ДК еще в течение 7 дней, добавляя цитокины каждые 48 часов.C) The lymphocyte fraction was thawed and cocultured with mature DCs (day 9 of cultivation) in the presence of cytokines GM-CSF (72 ng / ml), IL-2 (12.5 IU / ml), IL-4 (15 ng / ml ), IL-7 (10 ng / ml), TNF-α (20 ng / ml) (BD Bioscience, USA) for 7 days. Then lymphocytes were collected and transferred for cocultivation with a fresh portion of mature DCs in the presence of the desired cytokine cocktail. Lymphocytes and mature DCs were cocultured for another 7 days, adding cytokines every 48 hours.

Г) Сортировку клеток осуществляли методом негативной магнитной сепарации с использованием прибора EasySep™ Magnet. CD8⁺ Т-лимфоциты были выделены из клеточной суспензии с помощью набора EasySep™ Human CD8⁺ Т Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc., Канада). Полученные ЦТЛ анализировали на проточном цитометре BD FACS Canto™ II (BD, США).D) Cell sorting was performed by negative magnetic separation using the EasySep ™ Magnet. CD8 ⁺ T lymphocytes were isolated from the cell suspension using the EasySep ™ Human CD8 ⁺ T Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc., Canada). The obtained CTLs were analyzed on a BD FACS Canto ™ II flow cytometer (BD, USA).

Д) Полученные результаты представлены на фиг. 11.D) The results are presented in FIG. eleven.

Клеточная популяция, полученная в результате магнитной сепарации, содержала 95,8% CD3⁺CD8⁺ЦТЛ, среди которых 80,5% ЦТЛ несли на своей поверхности антиген HLA-DR, 90,5% - CD95, 40,3% - CD38, 55,2% ЦТЛ продуцировали гранзим В, 33,8% - перфорин, 20,0% - интерферон гамма.The cell population obtained as a result of magnetic separation contained 95.8% of CD3 ⁺ CD8 ⁺ CTLs, among which 80.5% of CTLs carried HLA-DR antigen on their surface, 90.5% - CD95, 40.3% - CD38, 55.2% of CTLs produced granzyme B, 33.8% - perforin, 20.0% - interferon gamma.

Е) Полученные данные свидетельствуют об активации ЦТЛ, что подтверждается результатами ММТ теста при кокультивировании активированных ЦТЛ и клеток меланомы кожи, полученных из операционного материала разных больных. Для этого проводили оценку жизнеспособности опухолевых клеток с использованием набора Cell Proliferation Kit (МТТ) (Roche, Швейцария), представляющего собой колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Клетки высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в конечном объеме 100 мкл на лунку в количестве 5×104 клеток на лунку. Культивировали клетки меланомы кожи в стандартных условиях в течение времени, необходимого для эксперимента. После инкубационного периода добавляли в каждую лунку 10 мкл MTT-labeling reagent в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Инкубировали 4 часа в условиях CO₂-инкубатора. Затем добавляли в каждую лунку 100 мкл растворяющего компонента и помещали планшету снова на ночь в СО₂-инкубатор. После того, как кристаллы формазана полностью растворялись, использовали микропланшетный ридер Thermo ScienticMultiscan EX (Thermo LabSystems Inc., США) с блоком считывания и обработки информации при длине волны 620 нм для измерения спектрометрической поглощательной способности образцов.E) The data obtained indicate the activation of CTLs, as evidenced by the results of the MMT test during cocultivation of activated CTLs and skin melanoma cells obtained from the surgical material of various patients. For this, tumor cell viability was assessed using the Cell Proliferation Kit (MTT) (Roche, Switzerland), which is a colorimetric test to assess the metabolic activity of cells. Cells were seeded in a flat-bottomed 96-well plate in a final volume of 100 μl per well in the amount of 5 × 104 cells per well. Skin melanoma cells were cultured under standard conditions for the time required for the experiment. After an incubation period, 10 μl of MTT-labeling reagent at a final concentration of 0.5 μg / ml was added to each well. Incubated for 4 hours in a CO ₂ incubator. Then, 100 μl of the solvent component was added to each well and the plate was placed again overnight in a CO ₂ incubator. After the formazan crystals were completely dissolved, a Thermo ScienticMultiscan EX microplate reader (Thermo LabSystems Inc., USA) with an information reading and processing unit at a wavelength of 620 nm was used to measure the spectrometric absorbance of the samples.

Наблюдали в большинстве случаев статистически значимые различия значений оптической плотности между образцами клеток меланомы кожи без воздействия (контроль) и образцами, куда вносили активированные ЦТЛ (фиг. 12).In most cases, there were observed statistically significant differences in the optical density between samples of skin melanoma cells without exposure (control) and samples where activated CTLs were added (Fig. 12).

Заявляемое изобретение - это новый клеточный продукт, содержащий расширенный спектр РТА и проверенный на отсутствие продукции значительного количества факторов, участвующих в процессах неоангиогенеза, метастазирования, ингибирования свойств клеток иммунной системы. Созданный клеточный продукт обладает повышенной функциональной активностью при использовании его в производстве дендритно-клеточных вакцин и универсализации получаемых лечебных препаратов для лечения солидных опухолей, несущих родственные РТА. Появляется возможность использования заявляемого клеточного продукта для тестирования функциональной состоятельности дендритных клеток пациентов, которым показана клеточная иммунотерапия, а также для создания клонов опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (цитокин-активированных киллеров).The claimed invention is a new cell product containing an expanded spectrum of PTA and tested for the absence of production of a significant number of factors involved in the processes of neoangiogenesis, metastasis, and inhibition of the properties of cells of the immune system. The created cell product has increased functional activity when used in the production of dendritic cell vaccines and the universalization of the resulting drugs for the treatment of solid tumors bearing related PTA. There is the possibility of using the inventive cell product to test the functional viability of dendritic cells of patients who are shown cell immunotherapy, as well as to create clones of tumor-specific cytotoxic T-lymphocytes (cytokine-activated killers).

Claims

A cell product for loading and activating human dendritic cells, consisting of equal shares of lysates of human melanoma cell lines in the skin deposited in a specialized collection of vertebrate cell cultures of the Russian collection of cell cultures under the corresponding numbers:

226 AB mel - under the number of RKKK (P) 725D,

283 mel - under the number of RKKK (P) 726D,

Mel 311 - under the number of RKKK (P) 703D,

515 mel - under the number of RKKK (P) 757D,

mel 520 DVA - under the number of RKKK (P) 779D,

685 mel GSN - under the number of RKKK (P) 781D,

686 mel FLA - under the number of RKKK (P) 782D,

860 mel BII - under the number of RKKK (P) 783D,

mel 929 SVU - under the number of RKKK (P) 780D,

where the lysates of these cell lines are prepared by repeated freezing-thawing with determination of cell viability by flow cytometry, one aliquot of the cell product contains a total of 30 million cells that are in 500 μl of physiological saline.