RU2710539C1 - Diagnostic method of central hypogonadism in females - Google Patents
Diagnostic method of central hypogonadism in females Download PDFInfo
- Publication number
- RU2710539C1 RU2710539C1 RU2019120245A RU2019120245A RU2710539C1 RU 2710539 C1 RU2710539 C1 RU 2710539C1 RU 2019120245 A RU2019120245 A RU 2019120245A RU 2019120245 A RU2019120245 A RU 2019120245A RU 2710539 C1 RU2710539 C1 RU 2710539C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hypogonadism
- central
- level
- genes
- expression
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и предназначено для диагностики центрального гипогонадизма у женщин.The invention relates to medicine, namely to endocrinology, and is intended for the diagnosis of central hypogonadism in women.
Гипогонадотропный гипогонадизм (ГГ) - гетерогенное заболевание. Встречаемость синдрома ГГ составляет 1:5000-10000 у мужчин, 1:50000-100000 - у женщин, т.е. заболевание является достаточно редким и считается орфанным. При снижении уровней гонадотропинов в крови в сочетании с низкими уровнями периферических половых стероидов диагностируется центральный, или гипогонадотропный гипогонадизм (ЦГ). ЦГ характеризуется тем, что низкие уровни периферических половых стероидов по принципу обратной отрицательной связи не вызывают физиологического ответа от гипофиза в виде повышения ЛГ и ФСГ; по этой причине нельзя исключить наличие центрального гипогонадизма у женщин в случае аменореи на фоне относительно нормальных уровней ЛГ и ФСГ.Hypogonadotropic hypogonadism (GH) is a heterogeneous disease. The incidence of GH syndrome is 1: 5000-10000 in men, 1: 50000-100000 in women, i.e. the disease is quite rare and is considered orphan. With a decrease in blood gonadotropins, in combination with low levels of peripheral sex steroids, central or hypogonadotropic hypogonadism (TS) is diagnosed. CH is characterized by the fact that low levels of peripheral sex steroids by the principle of negative feedback do not cause a physiological response from the pituitary gland in the form of increased LH and FSH; for this reason, the presence of central hypogonadism in women in the case of amenorrhea against the background of relatively normal levels of LH and FSH cannot be ruled out.
Так, в уровне техники известен способ диагностики центрального гипогонадизма у женщин (Иловайская И.А. и др., Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы при центральном гипогонадизме у женщин, Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии, 2008, Т.7, №5, с. 22-28), включающий проведение мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение нескольких часов. Способ обладает следующими недостатками: забор крови на гормоны осуществляется многократно в течение нескольких часов, при этом референсные значения существенно различаются в различных лабораториях.So, in the prior art, a method for diagnosing central hypogonadism in women is known (I. Ilovaiskaya et al., Functional state of the hypothalamic-pituitary-ovarian system in women with central hypogonadism, Issues of Gynecology, Obstetrics and Perinatology, 2008, Vol. 7, No. 5, pp. 22-28), including monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) with multiple studies over several hours. The method has the following disadvantages: blood sampling for hormones is carried out repeatedly for several hours, while the reference values vary significantly in different laboratories.
У большинства пациентов в основе заболевания лежат генетические нарушения (Achermann J.С.et al., Genetic causes of human reproductive disease, 2002, J. Clinical Endocrinol. Metabolism, V. 87. №6, p. 2447-2454, M. Bonomi, D.V. Libri et al. New understandings of the genetic basis of isolated idiopathic central hypogonadism. Asian Journal of Andrology, 2012 14, 49-56). При наличии мутаций в генах, ответственных за нормальное функционирование гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы, может развиться врожденная форма ЦГ (например, синдром Каллманна, СК - вариант ЦГ с аносмией, или нормосмический вариант идиопатического гипогонадотропного гипогонадизма - нИГГ), сопровождающийся задержкой или полным отсутствием пубертата. Также некоторые мутации обуславливают предрасположенность к развитию ЦГ при наличии таких факторов риска, как выраженный психологический стресс, быстрое и значительное снижение массы тела, интенсивные физические нагрузки, использование комбинированных оральных контрацептивов. К генам, мутации в которых приводят к развитию фенотипа данного состояния, относятся следующие (Иловайская И.А. и др., Генетическая основа гипогонадотропного гипогонадизма, Гинекология Эндокринология, №1 (89), 2014, с. 89-94) (Таблица 1). 
Так, в уровне техники известен способ диагностики центрального гипогонадизма у женщин (Енева Н.Г. и др., Проблема женского бесплодия: поиск генетических маркеров, Журнал общей биологии, 2017, Т. 78, №2, с. 3-13), выбранный нами за прототип. Способ включает в себя забор венозной крови, выделение генетического материала из лейкоцитов и проведение количественного определения мРНК, характеризующего экспрессию 6 генов, отвечающих за функционирование нейроразвивающей и нейроэндокринной регуляции системы гонадотропин-релизинг-гормона, а именно генов WDR11, CHD7, DUSP6 и PROK2, GNRH1/GNRHR, а также исследование мутаций этих и еще пяти генов. Гены были выбраны в качестве исследуемых по причине наличия их мРНК в периферической крови (Tanriverdi F. et al. GnRH-I and GnRH-II have differential modulatory effects on human peripheral blood mononuclear cell proliferation and interleukin-2 receptor γ-chain mRNA expression in healthy males // Clinical & Experimental Immunology. - 2005. - T. 142. - №. 1. - C. 103-110) Недостатками данного способа являются не слишком высокая чувствительность и специфичность за счет недостаточного количества субъектов исследуемой группы и сложности способа в применении, отсутствие пороговых диагностических значений для точной диагностики центрального генеза гипогонадизма у женщин.So, in the prior art there is a known method for diagnosing central hypogonadism in women (Eneva N.G. et al., The problem of female infertility: the search for genetic markers, Journal of General Biology, 2017, T. 78, No. 2, pp. 3-13), selected by us for the prototype. The method includes venous blood sampling, isolation of genetic material from leukocytes and quantification of mRNA characterizing the expression of 6 genes responsible for the functioning of the neurodeveloping and neuroendocrine regulation of the gonadotropin-releasing hormone system, namely, the genes WDR11, CHD7, DUSP6 and PROK2, GNRH1 / GNRHR, as well as a study of the mutations of these and five other genes. Genes were chosen as being studied because of the presence of their mRNA in peripheral blood (Tanriverdi F. et al. GnRH-I and GnRH-II have differential modulatory effects on human peripheral blood mononuclear cell proliferation and interleukin-2 receptor γ-chain mRNA expression in healthy males // Clinical & Experimental Immunology. - 2005. - T. 142. - No. 1. - C. 103-110) The disadvantages of this method are not too high sensitivity and specificity due to the insufficient number of subjects of the study group and the complexity of the method in application, lack of threshold diagnostic values for accurate diagnosis of the central genesis of hypogonadism among women.
Таким образом, существует потребность в способе диагностики центрального гипогонадизма у женщин, лишенном вышеуказанных недостатков.Thus, there is a need for a method for diagnosing central hypogonadism in women, devoid of the above disadvantages.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности диагностики центрального гипогонадизма у женщин за счет определения пороговых значений экспрессии значимых для диагностики заболевания генов и одновременной оценки объективного и высокочувствительного маркера - референсного значения уровня лютеинизирующего гормона.The technical result of the proposed method is to increase the accuracy of diagnosis of central hypogonadism in women by determining expression thresholds of genes that are important for diagnosing a disease and at the same time assessing an objective and highly sensitive marker - a reference value of the level of luteinizing hormone.
Для достижения указанного технического результата в способе диагностики центрального гипогонадизма у женщин, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала из лейкоцитов и проведение количественного определения мРНК, характеризующего экспрессию генов PROK2, DUSP6 и WDR11, предлагается дополнительно определять уровень лютеинизирующего гормона хемилюминесцентным методом, и при выявлении значений уровня экспрессии выше референсного по крайней мере, у двух из трех генов, а именно PROK2 более 0,009356, DUSP6 более 0,01478, WDR11 более 0,002224, а также уровня лютеинизирующего гормона менее 1,95 МЕ/л диагностировать центральный гипогонадизм.In order to achieve the indicated technical result in a method for diagnosing central hypogonadism in women, including venous blood sampling, isolation of leukocyte genetic material and quantification of mRNA characterizing the expression of PROK2, DUSP6 and WDR11 genes, it is proposed to additionally determine the level of luteinizing hormone by the chemiluminescent method, and upon detection values of the expression level are higher than the reference level in at least two of the three genes, namely PROK2 more than 0.009356, DUSP6 more than 0.01478, WDR11 more than 0.002224, as well as a luteinizing hormone level of less than 1.95 IU / L, diagnose central hypogonadism.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Выполняют забор крови из периферической вены, после чего кровь разделяют на фракции. Из фракции лейкоцитов производят выделение тотальной мРНК. После выделения проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени (real-time ПЦР, RT-ПЦР), которая обладает точностью количественного измерения. Далее результаты нормируют по референсному праймеру гена бета-актин, и по полученным численным данным строят экспрессионные профили пациентов. Способ осуществляют в несколько этапов:Peripheral blood sampling is performed, after which the blood is separated into fractions. The total mRNA is isolated from the leukocyte fraction. After isolation, a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR, RT-PCR) is carried out, which has the accuracy of quantitative measurement. Further, the results are normalized by the reference primer of the beta-actin gene, and expression profiles of patients are constructed from the obtained numerical data. The method is carried out in several stages:
- выделение тотальной РНК из лейкоцитов периферической крови пациентов и субъектов группы контроля.- Isolation of total RNA from the peripheral blood leukocytes of patients and subjects of the control group.
Производят забор периферической венозной крови из подкожной вены руки в области локтевого сгиба в одноразовую вакуумную систему (нами была использована «BD Vacutainer» (сиреневая крышка) с антикоагулянтом (6% ЭДТА) объемом 8 мл).Peripheral venous blood is drawn from the saphenous vein of the arm in the elbow region into a disposable vacuum system (we used the BD Vacutainer (lilac lid) with an anticoagulant (6% EDTA) with a volume of 8 ml).
Использованный метод выделения лейкоцитов основан на разделении клеточных элементов крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла (
Производят выделение РНК (мы проводили с помощью набора фирмы «Евроген» и протокола, рекомендованного фирмой-производителем с некоторыми модификациями - добавляли в эппендорф с лейкоцитами и тризолом 167 мкл хлороформа (р-р В) и 100 мкл ацетата Na (р-р Е). Инкубировали при комнатной температуре 20 мин при периодическом перемешивании до образования гомогенной эмульсии. Полученную смесь центрифугировали при 4°С 15 мин при 16000g. Собирали супернатант и переносили в новый эппендорф, добавив 400 мкл изопропанола (р-р С). Инкубировали при -20°С 1 ч (можно оставлять на ночь для лучшего выхода РНК). Центрифугировали при 16000g при 8°С 15 мин. Осторожно удаляли супернатант, к осадку добавляли 500 мкл 70% этанола, центрифугировали 5 мин при 8°С при 16000g. Удаляли супернатант. Осадок РНК подсушивали 3 мин при 40°С (крышки эппендорфов приоткрыты). Осадок РНК растворяли пипетированием в 30 мкл деионизованной воды (H20mq). Прогревали 5 мин при 70°С). Охлаждали и отбирали 2 мкл для измерения концентрации РНК и 4 мкл для оценки целостности РНК с помощью электрофореза. Измеряли концентрацию РНК (мы измеряли спектрофотометрически на приборе NanoDrop («Peqlab»)). Растворы РНК хранят в морозильной камере при -20°С.RNA is isolated (we performed using the Eurogen kit and the protocol recommended by the manufacturer with some modifications - 167 μl of chloroform (solution B) and 100 μl of Na acetate (solution E were added to eppendorf with leukocytes and trizole) ). Incubated at room temperature for 20 min with periodic stirring until a homogeneous emulsion is formed. The resulting mixture was centrifuged at 4 ° C for 15 min at 16000 g. The supernatant was collected and transferred to a new eppendorf, adding 400 μl of isopropanol (solution C). 20 ° C 1 h overnight for better RNA yield.) Centrifuged at 16000g at 8 ° C for 15 minutes, the supernatant was carefully removed, 500 μl of 70% ethanol was added to the pellet, centrifuged for 5 minutes at 8 ° C at 16000g. The supernatant was removed, and the RNA pellet was dried for 3 minutes at 40 ° C (the covers of the eppendorfs were ajar.) The RNA pellet was dissolved by pipetting in 30 μl of deionized water (H20mq). It was heated for 5 min at 70 ° C). Cooled and selected 2 μl to measure the concentration of RNA and 4 μl to assess the integrity of RNA by electrophoresis. The RNA concentration was measured (we measured spectrophotometrically with a NanoDrop instrument (Peqlab)). RNA solutions are stored in a freezer at -20 ° C.
Качество выделенной РНК оценивали методом электрофореза в агарозном геле (для этого мы к 4 мкл раствора РНК добавляли 3 мкл краски. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле (0,05 г агарозы, 50 мл ТАЕ [40 мМ трис-ацетатный буфер рН=7,6, 20 мМ уксусная кислота, 2 мМ EDTA]; 5 мкл бромистого этидия [0,5 мг/мл]). Напряженность электрического поля составляла 5 В/см). Пригодность РНК для дальнейшей работы определяли по наличию четко различимых полос, соответствующих рибосомальным РНК.The quality of the isolated RNA was evaluated by agarose gel electrophoresis (for this, we added 3 μl of paint to 4 μl of RNA solution. Electrophoresis was carried out in 1% agarose gel (0.05 g of agarose, 50 ml of TAE [40 mM Tris-Acetate buffer pH = 7 , 6, 20 mM acetic acid, 2 mM EDTA]; 5 μl ethidium bromide [0.5 mg / ml]). The electric field strength was 5 V / cm). The suitability of RNA for further work was determined by the presence of clearly distinguishable bands corresponding to ribosomal RNA.
Далее осуществляли обработку полученного РНК ДНКазой (для этого мы перед постановкой реакции обратной транскрипции РНК обрабатывали ДНКазой I («Fermentas») для очистки от ДНК. Реакцию проводили в объеме 20 мкл.Then, the obtained RNA was treated with DNase (for this, before setting up the reverse transcription reaction, RNA was treated with DNase I ("Fermentas") for DNA purification. The reaction was carried out in a volume of 20 μl.
Состав смеси (на 20 мкл):The composition of the mixture (20 μl):
1-16 мкл раствора РНК1-16 μl of RNA solution
2 мкл Dnase I (1 ед/мкг РНК)2 μl Dnase I (1 unit / μg RNA)
2 мкл 10-кратного Dnase I реакционного буфера с Mg2+H2Omq.2 μl of 10-fold Dnase I reaction buffer with Mg2 + H 2 Omq.
На стадии обработки ДНКазой проводили уравнивание концентраций проб с растворами РНК, варьируя количество РНК и H2Omq. Наиболее концентрированную пробу брали в объеме 5 мкл, наименее - 15 мкл. Смесь инкубировали при 37°С в течение 40 мин. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 25 мМ EDTA рН 8.0. DNase I инактивировали при 65°С в течение 10 мин).At the stage of DNase treatment, the concentration of samples was equalized with RNA solutions, varying the amount of RNA and H 2 Omq. The most concentrated sample was taken in a volume of 5 μl, the least - 15 μl. The mixture was incubated at 37 ° C for 40 minutes. The reaction was stopped by adding 2 μl of 25 mm EDTA pH 8.0. DNase I was inactivated at 65 ° C for 10 min).
- определение количественной мРНК исследуемых генов.- determination of quantitative mRNA of the studied genes.
Осуществляли реакцию обратной транскрипции. (Для этого мы проводили реакцию синтеза первой цепи кДНК с помощью набора реактивов MMLV RT kit («Евроген», Россия). Готовили смесь: 1 мкл 20 мкМ случайного праймера (Random) и 3 мкл H2Omq. В смесь добавляем 5 мкл РНК, обработанной ДНКазой. Прогревали смесь 2 мин при 70°С для расплавления вторичных структур РНК. Затем добавляли 11 мкл предварительно приготовленной смеси:The reverse transcription reaction was carried out. (To do this, we performed the synthesis of the first cDNA chain using the MMLV RT kit reagent kit (Evrogen, Russia). The mixture was prepared: 1 μl of 20 μM random primer (Random) and 3 μl of H 2 Omq. Add 5 μl of RNA to the mixture treated with DNase. The mixture was heated for 2 min at 70 ° C to melt the secondary RNA structures. Then 11 μl of the previously prepared mixture was added:
4 мкл 5х буфера4 μl 5x buffer
2 мкл dNTP (10 мМ)2 μl dNTP (10 mM)
2 мкл DDT (20 мМ)2 μl DDT (20 mm)
1 мкл H2Omq1 μl H 2 Omq
1 мкл MMLV ревертаза (в последнюю очередь)1 μl MMLV revertase (last)
Инкубировали 50 мин при 40°С. Ревертазу инактивировали прогреванием в течение 10 мин при 70°С).Incubated for 50 min at 40 ° C. Revertase was inactivated by heating for 10 min at 70 ° C).
Проводили полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-ПЦР) (для проведения RT-ПЦР мы использовали набор реагентов «2,5 х реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ с Taq ДНК-полимеразой и интеркалирующим красителем SYBR-Green» («Синтол», Россия). К смеси добавляли по 1 мкл праймеров PROK2, DUSP6 и WDR11 и 1 мкл кДНК.Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was carried out (for RT-PCR we used a set of reagents “2.5 x reaction mixture for PCR-PB with Taq DNA polymerase and intercalating dye SYBR-Green” (Synthol) , Russia) 1 μl of PROK2, DUSP6 and WDR11 primers and 1 μl of cDNA were added to the mixture.
Объем смеси составлял 25 мкл. Реакцию ставили в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System производства Bio-Rad. Программа амплификации:The volume of the mixture was 25 μl. The reaction was carried out in a MiniOpticon Real-Time PCR System manufactured by Bio-Rad. Amplification program:
1. T=95°C, 10 мин1. T = 95 ° C, 10 min
2. Т=95°С, 30 сек2. T = 95 ° C, 30 sec
Т=55°С, 1 мин 40 цикловT = 55 ° C, 1 min 40 cycles
Т=72°С, 1 мин)T = 72 ° C, 1 min)
Анализировали относительную экспрессию генов-кандидатов ИГГ, нормированную на экспрессию гена бета-актин (АСТВ).The relative expression of the YHG candidate genes normalized to beta-actin gene expression (ASTV) was analyzed.
- количественное определение концентрации лютеинизирующего гормона.- quantitative determination of the concentration of luteinizing hormone.
Определение концентрации лютеинизирующего гормона (LH) в человеческой сыворотке осуществляют при помощи хемилюминесцентного иммуноферментного теста (мы использовали хемилюминесцентные тесты CIA. Для проведения данного теста, калибратор LH, препарат пациента и контроли сначала добавляли в лунку, покрытую стрептавидином. Добавляли биотинилированное моноклональное антитело и антитела, меченые ферментами (направленные на различные участки эпитопа лютеинизирующего гормона), и смешивали реагенты).Determination of the concentration of luteinizing hormone (LH) in human serum is carried out using a chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay (we used CIA chemiluminescent tests. For this test, the LH calibrator, patient preparation and controls were first added to a streptavidin-coated well. Biotinylated monoclonal antibody was added. labeled with enzymes (aimed at different parts of the epitope of the luteinizing hormone), and mixed reagents).
Оценивают полученные уровни экспрессии генов и уровень ЛГ относительно экспериментальным путем полученных референсных значений, и при выявлении значений уровня экспрессии выше референсного по крайней мере, у двух из трех генов, а именно PROK2 более 0,009356, DUSP6 более 0,01478, WDR11 более 0,002224, а также уровня лютеинизирующего гормона менее 1,95 МЕ/л диагностируют центральный гипогонадизм у женщин.The obtained gene expression levels and the LH level are estimated experimentally with the obtained reference values, and if expression levels are found to be higher than the reference level in at least two of the three genes, namely PROK2 more than 0.009356, DUSP6 more than 0.01478, WDR11 more than 0 , 002224, as well as a luteinizing hormone level of less than 1.95 IU / L, diagnose central hypogonadism in women.
Для того, чтобы упростить и сделать более доступным выявление этиологии ЦГ, нами впервые был предложен метод оценки уровней экспрессии определенных генов - поиск эпигенетических причин развития подобного состояния, т.е. выявление нарушений в работе генов. В группу исследуемых пациентов вошла 31 женщина с центральным гипогонадизмом, подтвержденным низкими уровнями гонадотропинов, эстрадиола и функциональными пробами. В контрольную группу вошли 35 женщин с нормальным овуляторным менструальным циклом. Нами было установлено, что для исследования особенно ценны конкретные 3 гена, экспрессирующиеся в периферической крови человека, а именно PROK2, DUSP6 и WDR11. Это существенно упрощает и уточняет определение центрального генеза гипогонадизма у женщин, поскольку прототип включал в себя качественный и количественный анализ 11 генов-кандидатов, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина и генов-кандидатов, функционирующих как нейроразвивающие и нейроэндокринные регуляторы, при этом четких критериев для выявления центрального гипогонадизма обозначено не было.In order to simplify and make more accessible the identification of the etiology of CH, we first proposed a method for assessing the expression levels of certain genes - the search for epigenetic reasons for the development of such a condition, i.e. identification of violations in the work of genes. The group of patients studied included 31 women with central hypogonadism, confirmed by low levels of gonadotropins, estradiol and functional tests. The control group included 35 women with a normal ovulatory menstrual cycle. We found that for the study, specific 3 genes expressed in human peripheral blood are particularly valuable, namely PROK2, DUSP6 and WDR11. This greatly simplifies and clarifies the determination of the central genesis of hypogonadism in women, since the prototype included a qualitative and quantitative analysis of 11 candidate genes responsible for the synthesis and secretion of gonadoliberin and candidate genes that function as neurodeveloping and neuroendocrine regulators, with clear criteria for identifying central hypogonadism was not indicated.
Собственным исследованием был обоснован диагностический уровень ЛГ - менее 1,95 МЕ/л считается одним из критериев центрального гипогонадизма. Для определения диагностического уровня были проанализированы уровни гонадотропинов у группы пациенток с центральным гипогонадизмом (46 пациенток) и здоровых женщин с регулярным овуляторным менструальным циклом (38 женщин); в ходе статистической обработки (ROC-анализ) было выявлено, что измеренный хемилюминисцентным методом уровень ЛГ менее 1,95 МЕ/л указывает на наличие центрального гипогонадизма с чувствительностью более 81% и специфичностью более 91%.Own research has substantiated the diagnostic level of LH - less than 1.95 IU / l is considered one of the criteria for central hypogonadism. To determine the diagnostic level, gonadotropin levels were analyzed in a group of patients with central hypogonadism (46 patients) and healthy women with a regular ovulatory menstrual cycle (38 women); During statistical processing (ROC analysis), it was found that the LH level measured by the chemiluminescent method is less than 1.95 IU / L indicates the presence of central hypogonadism with a sensitivity of more than 81% and a specificity of more than 91%.
Что касается диагностического уровня ФСГ - для центрального гипогонадизма был характерен уровень менее 5,075 МЕ/л, но последний характеризовался существенно меньшими чувствительностью и специфичностью, чем диагностический уровень ЛГ. Следовательно, выявление уровня ЛГ менее 1,95 МЕ/л может считаться критерием в комплексной диагностике центрального гипогонадизма.As for the diagnostic level of FSH, the level of less than 5.075 IU / L was typical for central hypogonadism, but the latter was characterized by significantly lower sensitivity and specificity than the diagnostic level of PH. Therefore, the identification of LH levels of less than 1.95 IU / L can be considered a criterion in the comprehensive diagnosis of central hypogonadism.
Предлагаемым способом в период с 2015 по 2019 г. обследовано 15 пациенток с подозрением на центральный гипогонадизм (группа контроля -21 здоровая женщина). У 4 пациенток центральный генез гипогонадизма был подтвержден низкими базальными уровнями ЛГ (0,4-1,09 МЕ/л), отсутствием пиков ЛГ при мониторинге и повышенной экспрессией всех 3 исследованных генов относительно вышеуказанных референсов. У 7 других пациенток отмечались снижение или отсутствие пиков ЛГ в ходе мониторига и повышение экспрессии 2 из 3 значимых генов, при этом у 5 из них базальный ЛГ был снижен относительно референсного значения (0,01-1,94 МЕ/л), таким образом, этим пациенткам правомочно поставить диагноз центрального гипогонадизма. 4 пациенткам из 15 обследованных удалось исключить диагноз центрального гипогонадизма: несмотря на наличие у 2 из них низких базальных уровней ЛГ (0,85 и 0,25 МЕ/л), были зафиксированы нормальные частота и амплитуда пиков в ходе мониторирования, а также нормальная экспрессия 2 из 3 значимых генов; аменорея и гипогонадизм у этих пациенток носят иной, отличный от центрального, генез. Лишь у 1 пациентки из 15 обследованных выявлены расхождения: базальный уровень ЛГ у нее составил <0,02 МЕ/л, при мониторировании не выявлено пиков секреции ЛГ - что доказывает центральный генез ЦГ; но при экспрессионном анализе у данной пациентки отклонение выявлено лишь в экспрессии 1 из 3 генов. Это расхождение вполне согласуется с чувствительностью и специфичностью предлагаемого способа.The proposed method in the period from 2015 to 2019 examined 15 patients with suspected central hypogonadism (control group -21 healthy women). In 4 patients, the central genesis of hypogonadism was confirmed by low basal levels of LH (0.4-1.09 IU / L), the absence of LH peaks during monitoring and increased expression of all 3 investigated genes relative to the above references. In 7 other patients, there was a decrease or absence of LH peaks during monitoring and an increase in the expression of 2 of 3 significant genes, while in 5 of them, basal LH was reduced relative to the reference value (0.01-1.94 IU / L), thus , these patients are authorized to diagnose central hypogonadism. 4 patients out of 15 examined managed to exclude the diagnosis of central hypogonadism: despite the presence of low basal levels of LH (0.85 and 0.25 IU / L) in 2 of them, the normal frequency and amplitude of the peaks during monitoring, as well as normal expression were recorded 2 out of 3 significant genes; amenorrhea and hypogonadism in these patients have a different, different from the central, genesis. Only 1 patient out of 15 examined revealed discrepancies: the basal level of LH in her was <0.02 IU / L, while monitoring there were no peaks of LH secretion - which proves the central genesis of CG; but in the expression analysis of this patient, deviation was detected only in the expression of 1 of 3 genes. This discrepancy is consistent with the sensitivity and specificity of the proposed method.
Таким образом, при совокупном выявлении значений уровня экспрессии выше референсного по крайней мере, у двух из трех генов, а именно PROK2 более 0,009356, DUSP6 более 0,01478, WDR11 более 0,002224, а также уровня лютеинизирующего гормона менее 1,95 МЕ/л диагноз ЦГ обоснован, объективен и высокоточен.Thus, when the expression level is higher than the reference value in at least two of the three genes, namely, PROK2 is more than 0.009356, DUSP6 is more than 0.01478, WDR11 is more than 0.002224, and the level of luteinizing hormone is less than 1.95 IU / L diagnosis of CG is reasonable, objective and highly accurate.
Пример 1. Пациентка №1: женщина, 23 лет.Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:Example 1. Patient No. 1: a woman, 23 years old. Amenorrhea against a background of low levels of estradiol, central hypogonadism (?). A study according to the proposed method. The level of gene expression was:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,09 МЕ/л.When studying basal gonadotropin levels: LH 1.09 IU / L.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у трех генов, PROK2, DUSP6, WDR11, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.Totally, values of the expression level above the reference value were found for three genes, PROK2, DUSP6, WDR11, the level of LH was less than 1.95 IU / L. Diagnosed with central hypogonadism by the proposed method.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.When monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) with a multiple study within 4 hours, the diagnosis of central hypogonadism was confirmed, due to the low frequency and amplitude of the peaks of LH.
Пример 2. Пациентка №2: женщина, 18 лет. Аменорея, на фоне низкого уровня эстрадиола. Центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:Example 2. Patient No. 2: woman, 18 years old. Amenorrhea, amid low estradiol levels. Central hypogonadism (?). A study according to the proposed method. The level of gene expression was:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 5,00 МЕ/л.When examining basal gonadotropin levels: LH 5.00 IU / L.
Выявлены значения уровня экспрессии выше референсного только у одного из генов, PROK2, уровень ЛГ составил более 1,95 МЕ/л. Центральный гипогонадизм не выявлен.The values of the expression level above the reference value were found for only one of the genes, PROK2, the level of LH was more than 1.95 IU / L. Central hypogonadism has not been identified.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов диагноз центрального гипогонадизма не был подтвержден вторично, в связи с нормальной частотой и амплитудой пиков ЛГ.When monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) in a multiple study within 4 hours, the diagnosis of central hypogonadism was not confirmed a second time, due to the normal frequency and amplitude of the peaks of LH.
Пример 3. Пациентка №3: женщина, 19 лет. Аменорея, на фоне низкого уровня эстрадиола. Центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:Example 3. Patient No. 3: woman, 19 years old. Amenorrhea, amid low estradiol levels. Central hypogonadism (?). A study according to the proposed method. The level of gene expression was:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,96 МЕ/л).When examining basal gonadotropin levels: LH 1.96 IU / L).
Выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у трех генов, PROK2, DUSP6, WDR11, однако уровень ЛГ составил более 1,95 МЕ/л. Центральный гипогонадизм не выявлен.The expression level was found to be higher than the reference in three genes, PROK2, DUSP6, WDR11, but the level of LH was more than 1.95 IU / L. Central hypogonadism has not been identified.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов диагноз центрального гипогонадизма не был подтвержден вторично, в связи с нормальной частотой и амплитудой пиков ЛГ.When monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) in a multiple study within 4 hours, the diagnosis of central hypogonadism was not confirmed a second time, due to the normal frequency and amplitude of the peaks of LH.
Пример 4. Пациентка №4: женщина, 26 лет. Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:Example 4. Patient No. 4: woman, 26 years old. Amenorrhea against a background of low estradiol, central hypogonadism (?). A study according to the proposed method. The level of gene expression was:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 0,65 МЕ/л.When examining basal gonadotropin levels: LH 0.65 IU / L.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у двух из трех генов, PROK2, DUSP6, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.Together, values of the expression level above the reference level were revealed in two of the three genes, PROK2, DUSP6, and the LH level was less than 1.95 IU / L. Diagnosed with central hypogonadism by the proposed method.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.When monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) with a multiple study within 4 hours, the diagnosis of central hypogonadism was confirmed, due to the low frequency and amplitude of the peaks of LH.
Пример 5. Пациентка №5: женщина, 20 лет. Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил: 
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,94 МЕ/л.When examining basal gonadotropin levels: LH 1.94 IU / L.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у двух из трех генов, PROK2, WDR11, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.Together, values of the expression level above the reference level were revealed in two of the three genes, PROK2, WDR11, and the LH level was less than 1.95 IU / L. Diagnosed with central hypogonadism by the proposed method.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.When monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) with a multiple study within 4 hours, the diagnosis of central hypogonadism was confirmed, due to the low frequency and amplitude of the peaks of LH.
Пример 6. Пациентка №6: женщина, 22 лет. Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:Example 6. Patient No. 6: woman, 22 years old. Amenorrhea against a background of low estradiol, central hypogonadism (?). A study according to the proposed method. The level of gene expression was:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,8 МЕ/л.When examining basal gonadotropin levels: LH 1.8 IU / L.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у двух из трех генов, DUSP6, WDR11, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.Together, values of the expression level above the reference level were revealed in two of the three genes, DUSP6, WDR11, the level of LH was less than 1.95 IU / L. Diagnosed with central hypogonadism by the proposed method.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.When monitoring the amplitude and frequency of the peaks of secretion of gonadotropins (LH, FSH) with a multiple study within 4 hours, the diagnosis of central hypogonadism was confirmed, due to the low frequency and amplitude of the peaks of LH.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики центрального гипогонадизма у женщин за счет определения пороговых значений экспрессии значимых для диагностики заболевания генов и одновременной оценки объективного и высокочувствительного маркера - референсного значения уровня лютеинизирующего гормона.Thus, the proposed method allows to increase the accuracy of diagnosis of central hypogonadism in women by determining expression thresholds of genes that are significant for the diagnosis of disease and at the same time assessing an objective and highly sensitive marker — the reference value of the level of luteinizing hormone.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019120245A RU2710539C1 (en) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | Diagnostic method of central hypogonadism in females |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019120245A RU2710539C1 (en) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | Diagnostic method of central hypogonadism in females |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2710539C1 true RU2710539C1 (en) | 2019-12-27 |
Family
ID=69023084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019120245A RU2710539C1 (en) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | Diagnostic method of central hypogonadism in females |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2710539C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2777475C1 (en) * | 2021-10-14 | 2022-08-04 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Method for diagnosing organic lesions of the chiasmal-sellar region in patients with central hypogonadism |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2168931C2 (en) * | 1997-05-23 | 2001-06-20 | Сизова Валентина Федоровна | Express-diagnosis method for determining neuroendocrine regulation disorders in hypothalamohypophyseal gonad system components |
| US20130211372A1 (en) * | 2009-04-23 | 2013-08-15 | Beth Rosenshein | Body Cavity Physiological Measurement Device |
-
2019
- 2019-06-28 RU RU2019120245A patent/RU2710539C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2168931C2 (en) * | 1997-05-23 | 2001-06-20 | Сизова Валентина Федоровна | Express-diagnosis method for determining neuroendocrine regulation disorders in hypothalamohypophyseal gonad system components |
| US20130211372A1 (en) * | 2009-04-23 | 2013-08-15 | Beth Rosenshein | Body Cavity Physiological Measurement Device |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BOEHM U., et al. European Consensus Statement on congenital hypogonadotropic hypogonadism—pathogenesis, diagnosis and treatment. // Nat Rev Endocrinol 11, 547-564 (2015). * |
| TANRIVERDI, F et al. GnRH-I and GnRH-II have differential modulatory effects on human peripheral blood mononuclear cell proliferation and interleukin-2 receptor gamma-chain mRNA expression in healthy males.// Clinical and experimental immunology vol. 142,1 (2005): 103-10. * |
| ЕНЕВА Н.Г. и др. Проблема женского бесплодия: поиск генетических маркеров // Журнал общей биологии. 2017. Т. 78. N 2. С. 3-13. * |
| ЕНЕВА Н.Г. и др. Проблема женского бесплодия: поиск генетических маркеров // Журнал общей биологии. 2017. Т. 78. N 2. С. 3-13. BOEHM U., et al. European Consensus Statement on congenital hypogonadotropic hypogonadism—pathogenesis, diagnosis and treatment. // Nat Rev Endocrinol 11, 547-564 (2015). * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2777475C1 (en) * | 2021-10-14 | 2022-08-04 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Method for diagnosing organic lesions of the chiasmal-sellar region in patients with central hypogonadism |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101225441B (en) | Method for detecting genetic constitution of clone-specific T lymphocyte TCR BV CDR3 | |
| CN115524490B (en) | HLA-DR + CD14 + CD56 + Use of monocytes for diagnosis in AA or HLH | |
| CN113564242A (en) | Application of apoptosis-related gene in repeated planting failure | |
| Steffen et al. | Type 1 innate lymphoid cells regulate the onset of Toxoplasma gondii-induced neuroinflammation | |
| CN109991417B (en) | Immune marker for tuberculosis and application | |
| US10191048B2 (en) | Fluorometric immunoassay for detection of anti-dsDNA antibodies | |
| WO2018156448A1 (en) | Prediction and treatment of immunotherapeutic toxicity | |
| RU2710539C1 (en) | Diagnostic method of central hypogonadism in females | |
| CN110656169B (en) | Diagnostic markers for atrial fibrillation | |
| Mourino-Alvarez et al. | Proteomic characterization of EPCs and CECs “in vivo” from acute coronary syndrome patients and control subjects | |
| CN109061191B (en) | Application of S100P protein as marker in diagnosis of active tuberculosis | |
| US20210080453A1 (en) | Blood biomarker for eosinophilic gastrointestinal disorders | |
| CN109187987B (en) | Application of MS4A3 protein as marker in diagnosis of active tuberculosis | |
| JP2020071030A (en) | Inspection method for primary aldosteronism | |
| US20190223848A1 (en) | Non-invasive ocular biological material gathering device | |
| Wen et al. | Changes and significance of interleukin 17 expression in patients after renal transplantation | |
| CN114740196B (en) | Marker and application thereof in preparation of product for evaluating organism immune function | |
| RU2719411C1 (en) | Method for determining predisposition to reproductive disorders in females in conditions of excessive phenol contamination | |
| WO2020256529A1 (en) | Urine exosome biomarker for diagnosing bk virus-associated nephropathy after kidney transplantation or predicting prognosis of patient after kidney transplantation | |
| RU2621155C1 (en) | Method for evaluation of strontium impact on apoptosis, associated with allellic variants of fas gene in children | |
| RU2715618C1 (en) | Method for assessment of mucosal immunity in urogenital infection in pregnant women | |
| JP5757624B2 (en) | Screening method for antiallergic factors | |
| WO2020256530A1 (en) | Urine exosome biomarker for diagnosing t cell mediated rejection after kidney transplantation or predicting prognosis of patient after kidney transplantation | |
| US20070059696A1 (en) | Assessment method | |
| US20160025728A1 (en) | Brain-specific gene signature of tumor cells |