RU2708917C2 - Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием - Google Patents

Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием Download PDF

Info

Publication number
RU2708917C2
RU2708917C2 RU2017133992A RU2017133992A RU2708917C2 RU 2708917 C2 RU2708917 C2 RU 2708917C2 RU 2017133992 A RU2017133992 A RU 2017133992A RU 2017133992 A RU2017133992 A RU 2017133992A RU 2708917 C2 RU2708917 C2 RU 2708917C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
range
chitosan
sample
peroxidase
metabolites
Prior art date
Application number
RU2017133992A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017133992A (ru
RU2017133992A3 (ru
Inventor
Мария Игоревна Македонская
Ольга Евгеньевна Еремина
Ирина Анатольевна Веселова
Татьяна Николаевна Шеховцова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority to RU2017133992A priority Critical patent/RU2708917C2/ru
Publication of RU2017133992A publication Critical patent/RU2017133992A/ru
Publication of RU2017133992A3 publication Critical patent/RU2017133992A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2708917C2 publication Critical patent/RU2708917C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована в медицинской диагностике и биохимических исследованиях для количественного обнаружения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях. Предложены тест-система и способ для экспресс-определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, а также способ получения тест-системы. Тест-система представляет собой планшет с нанесенной на поверхность лунок пленки хитозана с иммобилизованной пероксидазой растительного происхождения толщиной от 0,5 до 1,5 мкм. Пероксидаза содержится в количестве от 2 до 16 пмоль на 1 мм2 площади пленки, а хитозан - от 15 до 60 мг на 1 мм2 площади пленки. Хитозан имеет распределение молекулярных масс 50-220 кДа и степень дезацетилирования не менее 75%. Способ экспресс-определения катехоламинов и их метаболитов включает нанесение пробы биологической жидкости на лунку тест-системы с последующим внесением пероксида водорода и дериватизирующего агента с образованием флуоресцирующих производных, возбуждение флуоресценции в пробе с регистрацией полученных сигналов. Изобретения позволяют определять одновременно несколько маркеров нейромедиаторного обмена, выбранных из норадреналина, дофамина, адреналина и их метаболитов, выбранных из гомованилиновой и ванилилминдальной кислот, в большом количестве образцов биологических жидкостей с достигаемыми воспроизводимостью результатов не менее 99% и временем анализа до 12.5 с на одну пробу. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 13 пр.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к области аналитических исследований, и может быть использовано в медицинской диагностике и биохимических исследованиях для определения маркеров нейромедиаторного обмена в биологических жидкостях с высокими чувствительностью, селективностью и экспрессностью.
Уровень техники
Нейромедиаторный обмен осуществляется посредством метаболизма катехоламинов и составляет основу нервной медиации, как периферической, так и центральной нервной систем. Такие катехоламины (КА), такие как дофамин (ДА), адреналин (АД), норадреналин (НА) и их метаболиты (гомованилиновая и ванилилминдальная кислоты (ГВК и ВМК, соответственно)), норметанефрин (НМН), их предшественник L-ДОФА (3-(3,4-дигидроксифенил)-L-аланин), серотонин (5-гидрокситирамин, 5-ГТ) и его катаболит 5-гидроксииндол-3-уксусная кислота (5-ГИУК), являются биологически активными аминами, участвующими в регуляции нервной деятельности, сердечно-сосудистой системы, системы липопероксидации, в энергетическом обмене и сократительной способности миокарда, в микроциркуляции и снабжении тканей кислородом, в регуляции эмбриогенеза. В связи с тем, что количество катехоламинов и их метаболитов в норме и при патологии различно, их возможно использовать в качестве диагностических маркеров как при проведении фундаментальных исследований, так и в клинической практике. Уровень НА в плазме крови позволяет прогнозировать течение заболевания у пациентов с нарушениями в работе сердечно-сосудистой системы. Соотношение катехоламинов и метаболитов в моче используют для диагностики опухолевых нейроэндокринных (нейробластомы, карциномы, параганглиомы, феохромоцитомы, инсулиномы, соматостиномы, глюкогономы, гастринома и др.) и нейродегенеративных заболеваний (болезней Альцгеймера и Паркинсона). Кроме того, показано, что нарушения в биосинтезе и метаболизме катехоламинов могут возникать впоследствии действия ионизирующего излучения на организм в ходе лечения лучевой терапией.
Сложность определения катехоламинов в плазме крови и других биологических жидкостях на сегодняшний день обусловлена тем, что у здорового человека их концентрации очень низки (на уровне 1 нМ), а при различных патологических нарушениях их концентрация в биообъектах в ряде случаев снижается еще на порядок. При этом следует учитывать, что в крови они быстро окисляются моноаминоксидазами тромбоцитов, в связи с этим определение маркеров нейромедиаторного обмена в организме (особенно при развитии кризисных состояний) должно быть очень быстрым (в течение 15-30 мин). Современные инструментальные методы анализа, к сожалению, не решают эту проблему комплексно: высокая чувствительность и селективность метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием не обеспечивает нужной экспрессности, а ферментативные биосенсоры и иммунохимические методы определения указанного класса аналитов не обеспечивают нужной чувствительности и воспроизводимости полученных результатов. В связи с этим, необходимо создание новых биораспознающих флуоресцентных индикаторных систем для разработки высокоэкспрессных, чувствительных и селективных методик для одновременного определения сразу нескольких катехоламинов и их метаболитов в большом количестве проб биологических жидкостей без предварительной пробоподготовки с целью диагностики различных заболеваний.
Из уровня техники известно решение, представленное в статье Н. Nohta, A. Mitsui, Y. Ohkura «High-performance liquid chromatographic determination of urinary catecholamines by direct pre-column fluorescence derivatization with 1,2-diphenylethylenediamine». J. Chromatogr. 1986. V. 380. P. 229-231, описывающее способ дериватизации KA и их метаболитов 0.1 М 1,2-дифенилэтилендиамином (ДЭД) в присутствии ферроцианида калия, катализирующего окисление растворенным кислородом воздуха молекул КА до КА-о-хинонов, которые в свою очередь взаимодействуют с дериватизирующим агентом (ДЭД) по реакции Михаэля. Конечным продуктом дериватизации КА с ДЭД являются 2-фенил(4,5-дигидропирроло)[2,3-f]бензоксазольные производные, обладающие более интенсивной флуоресценцией, чем К А и их метаболиты в видимой области спектра. Процесс проходит в смеси буферного раствора и метанола: 0.3 М CAPS-KOH (N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid, N-циклогексил-3-аминопропансульфокислота) с рН 10: метанол (30:70 об. %). Окисление кислородом воздуха проходит в присутствии 20 мМ раствора ферроцианида K3[Fe(CN)6] в качестве катализатора, при температуре 50°С, в течение 20 мин.
Однако использование известного решения невозможно в биологических жидкостях из-за использования токсичного растворителя 70 об.% метанола, необходимости термостатирования реакционной смеси при повышенной температуре 50°С, длительности времени получения производных катехоламинов и их метаболитов. Кроме того, известный способ не позволяет селективно определять сразу несколько нейромедиаторов и не дает возможности их определения в большом количестве образцов.
Из уровня техники известно решение, представленное в автореферате на соискание степени кандидата химических наук по специальности «Аналитическая химия» 02.00.02. Москва. 2010. 22 с. К.В. Яблоцкий «Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определения ее ингибиторов и субстратов», описывающее способ дериватизации К А и их метаболитов 0.5 М бензиламином (БА) или дифенилэтилендиамином (ДЭД) в мицеллярной и водно-органической среде в присутствии пероксидазы из корней хрена (ПХ), катализирующей окисление пероксидом водорода молекул КА до КА-о-хинонов, которые в свою очередь взаимодействуют с дериватизирующим агентом по реакции Михаэля. Конечным продуктом дериватизации КА с БА или ДЭД являются 2-фенил(4,5-дигидропирроло)[2,3-f]бензоксазольные производные, обладающие в видимой области спектра более интенсивной флуоресценцией, чем сами КА и их метаболиты. Процесс проходит в 5 мМ растворе цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМА) в 0.1 М CAPS-KOH с рН 11, в случае дериватизации БА или в 0.5 М буферном растворе глицин-KOH : диметилсульфоксид (ДМСО) (70:30 об. %) в случае дериватизации ДЭД, концентрация пероксида водорода - 1 мМ, в течение 30 мин (меньшее время дериватизации, 5 мин, удалось достигнуть только для НА), при температуре 37°С.
Однако и это решение имеет те же недостатки, что и приведенный выше аналог: невозможность использования в биологических объектах обусловливается наличием токсичного растворителя 30 об. % ДМСО, а также необходимостью термостатирования реакционной смеси при повышенной температуре 37°С и использования поверхностно-активных веществ (ПАВ). Известный способ также не позволяет селективно определять одновременно несколько катехоламинов и не дает возможности их определения в большом количестве образцов. Кроме того, ПХ используется в нативном, а не в иммобилизованном состоянии, что обуславливает сложность масштабирования методики и ее низкую воспроизводимость (93%).
Из уровня техники известно решение, представленное в патенте RU 2162228 «Способ одновременного определения свободных и конъюгированных форм катехоламинов, 5,4-диоксифенилаланина, 3,4-диоксифенилуксусной кислоты, 3,4-диоксифенилэтиленгликоля в плазме крови и моче», описывающее способ одновременного определения количества норадреналина, адреналина, дофамина, 3,4-диоксифенилаланина, 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и 3,4-диоксифенилэтиленгликоля в плазме крови и моче. Процесс определения включает адсорбцию определяемых веществ из биологических жидкостей путем нанесения их на смолу Bio Rex 70, затем на активированную окись алюминия, элюирование 0.1 М HClO4 с последующим определением количества веществ по калибровочной кривой с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Причем в качестве подвижной фазы при хроматографии используют 70 мМ раствор NaH2PO4, 10 мМ гептансульфоновой кислоты с pH 3 и общим временем хроматографирования - 10 мин.
Однако этот способ является трудоемким, требующим высококлассного оборудования, постоянного тока высокочистых растворителей и высококвалифицированного персонала из-за использования ВЭЖХ, необходимости длительной пробоподготовки биообъектов и компонентов подвижной фазы, применения стадий предконцентрирования, что увеличивает общее время анализа вплоть до 30-40 мин и возможность получения заниженных результатов из-за потерь анализируемых соединений. Также недостатком известного решения является использование сильных кислот - HClO4 и гептансульфоновой кислоты, что может вызвать деструкцию катехоламинов. Использование электрохимических детекторов с ВЭЖХ также неэффективно, так как потенциалы окисления катехоламинов очень близки, что снижает селективность известного способа определения катехоламинов и повышает вероятность получения ложных результатов.
Наиболее близким к заявляемому является решение, представленное в патенте RU 2546672 «Способ получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов методом дериватизации», раскрывающем способ получения интенсивно флуоресцирующих производных нейромедиаторов по реакции их ферментативной дериватизации. Наиболее интенсивный сигнал получают при проведении процесса в 0.1 М CAPS-КОН или глицин-КОН буферном растворе при концентрации ПХ: 0.01-1 мкМ; концентрации пероксида водорода: 100 мкМ, концентрации дериватизирующего агента (амина): 0.1-33 мМ; концентрации аналитов - катехоламинов и их метаболитов: 0.03-1 мкМ. В качестве дериватизирующего агента был использован бензиламин (БА) и дифенилэтилендиамин (ДЭД). Время реакции составляло 5 мин, при этом не использовалось длительное термостатирование реакционной смеси при повышенной температуре. Реакция проводилась в водной среде, в отсутствие токсичных растворителей (метанола, ДМСО).
Недостатком известного решения является невозможность его применения в анализе реальных биологических жидкостей (моче, плазме крови, церебральной жидкости и др.), особенно для диагностики заболеваний из-за отсутствия селективности описанного способа анализа. Продукты реакций дериватизации всех изучаемых аналитов имеют уширенные перекрывающиеся сигналы флуоресценции, что не позволяет ни качественно судить о присутствии, ни количественно определять содержание конкретных катехоламинов или их метаболитов, а, следовательно, ограничивает применимость ранее известного решения в одновременном определении нескольких маркеров нейромедиаторного обмена при их совместном присутствии в анализируемой пробе. Также в представленном решении невозможно экспрессно анализировать большое количество проб, поскольку для каждого единичного измерения необходимо проводить реакцию дериватизации, что вместе с измерением по времени занимает около 10 мин. Более того, для каждого анализа требуется значительный объем исследуемой пробы около 2-3 мл при том, что для достоверного количественного определения требуется три параллельных пробы, то есть нежелательно большие в случае анализа плазмы крови объемы 6-9 мл. Также необходим существенный расход фермента: 30-300 нмоль на единичный анализ. Кроме того, для постановки достоверного диагноза необходима информация о количественном содержании в анализируемом образце всей тройки катехоламинов: дофамина, норадреналина и адреналина, в многокомпонентной смеси (И.А. Веселова, Е.А. Сергеева, М.И. Македонская, О.Е. Еремина, С.Н. Калмыков, Т.Н. Шеховцова. «Методы определения маркеров нейромедиаторного обмена в целях клинической диагностики». Журн. аналит. химии. 2016. Т. 71. С. 1235-1249.), в то время как в известном решении описано определение только дофамина и адреналина в их индивидуальных растворах. Кроме того, в предложенном способе анализа фермент - ПХ - находится в растворе, т.е. в нативном, а не в иммобилизованном состоянии, что обусловливает относительные нестабильность и, следовательно, непродолжительные сроки хранения фермента (около 1 суток при 4°С), большой расход дорогостоящего фермента в пересчете на объем кюветы, а также низкую воспроизводимость методики (95%). Также описанную методику сложно масштабировать и затруднительно перенести на экспрессный анализ в большом количестве проб.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка способа одновременного определения нескольких маркеров нейромедиаторного обмена с низким пределом обнаружения, высокой селективностью, широким линейным диапазоном определяемых содержаний (концентраций) маркеров нейромедиаторного обмена, высокой воспроизводимостью и экспрессностью.
Заявляемое изобретение устраняет недостатки перечисленных аналогов.
Техническим результатом изобретения является возможность одновременного экспресс-определения сразу нескольких катехоламинов и их метаболитов: норадреналина, дофамина, адреналина, гомованилиновой и ванилилминдальной кислот, в их модельных растворах и пробах биологических жидкостей с достигаемыми воспроизводимостью результатов не менее 99% и временем анализа до 12.5 с на одну пробу.
Поставленная задача решается тест-системой для экспресс-определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, представляющая собой планшет с нанесенной на поверхность лунок пленки хитозана с иммобилизованной пероксидазой растительного происхождения в количестве, достаточном для проведения реакции дериватизации при введении пробы биологической жидкости с дериватизирующим агентом в присутствии пероксида водорода, при этом пероксидазы содержится в количестве от 2 до 16 пмоль на 1 мм площади пленки, а хитозана от 15 до 60 мг на 1 мм площади пленки. Толщина пленки составляет от 0.5 до 1.5 мкм.
Предпочтительно в качестве пероксидазы растительного происхождения использовать пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, а хитозан с распределением молекулярных масс 50-220 кДа и степенью дезацетилирования не менее 75%.
Поставленная задача также решается способом получения заявляемой тест-системы, включающий приготовление водных растворов хитозана и пероксидазы растительного происхождения с последующим их нанесением на лунки планшета и высушиванием до образования пленки. Концентрация наносимого водного раствора хитозана составляет от 0.5 до 2 мас. %, а раствора пероксидазы от 15 до 20 мкМ. При этом для приготовления водного раствора хитозана используют водные растворы кислот с рН не менее 2 в количестве достаточном для растворения хитозана в воде, при этом предотвращающем реакцию сшивания хитозана.
Предпочтительно в качестве пероксидазы растительного происхождения использовать пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм и хитозан с распределением молекулярных масс 50-220 кДа и степенью дезацетилирования не менее 75%.
Предпочтительно для растворения хитозана использовать водные растворы уксусной, соляной или угольной кислот.
Объемное соотношение растворов хитозана и пероксидазы при их нанесении на лунку составляет от 1:1 до 6:1.
Высушивание планшета с нанесенными растворами осуществляют при температуре до 23±3°С.
Способ экспресс-определения катехоламинов и их метаболитов в образцах биологических жидкостей, включающий нанесение пробы биологической жидкости на лунку заявляемой тест-системы, полученной заявляемым способом, с последующим внесением пероксида водорода и дериватизирующего агента в количестве обеспечивающем проведения реакции дериватизации с образованием флуоресцирующих производных; возбуждение флюоресценции в пробе с регистрацией полученных сигналов, и при выявлении максимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце. При этом пробу биологической жидкости наносят в объеме от 10 до 30 мкл, и на 1 объемную часть пробы используют 3-5 об. частей дериватизирующего агента и 1-5 об. частей пероксида водорода. Для получения сигнала флуоресценции пробу облучают монохроматичным излучением с длиной волны в диапазоне 300-370 нм. Вывод о наличии в образце биологической жидкости норадреналина делают при выявлении максимума в диапазоне от 452 до 458 нм, дофамина - в диапазоне от 455 до 465 нм, адреналина - в диапазоне от 475 до 485 нм, ванилилминдальной кислоты - в диапазоне от 417 до 423 нм, гомованилиновой кислоты - в диапазоне от 422 до 428 нм, L-ДОФА - в диапазоне от 456 до 460 нм, норметанефрина - в диапазоне от 460 до 460 нм, серотонина - в диапазоне от 463 до 473 нм, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты - в диапазоне от 470 до 480 нм.
Предпочтительно в качестве дериватизирующего агента использовать ароматические амины, а именно бензиламин или 1,2-дифенилэтилендиамин.
Для определения количественного содержания аналитов в образцах биологических жидкостей измеряют интенсивность полученного сигнала, вывод о количественном содержании делают по предварительно рассчитанным градуировочным зависимостям. Дополнительно проводят обработку полученных сигналов путем вычисления второй производной интенсивности флуоресцентных сигналов и при выявлении минимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце: о наличии в образце биологической жидкости норадреналина делают при выявлении минимума в диапазоне от 452 до 458 нм, дофамина - в диапазоне от 455 до 465 нм, адреналина - в диапазоне от 475 до 485 нм, ванилилминдальной кислоты - в диапазоне от 417 до 423 нм, гомованилиновой кислоты - в диапазоне от 422 до 428 нм, L-ДОФА - в диапазоне от 456 до 460 нм, норметанефрина - в диапазоне от 460 до 460 нм, серотонина - в диапазоне от 463 до 473 нм, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты - в диапазоне от 470 до 480 нм.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен микропланшетный оптический биосенсор, состоящий из 96-луночного полистирольного планшета в качестве подложки и оптически прозрачной пленки, состоящей из пероксидазы из корней хрена (ПХ) в слое хитозана, в качестве чувствительного слоя.
На фиг. 2 представлена схема формирования чувствительного слоя биосенсора. Позициями на фигурах обозначены: 1 - смесь для чувствительного слоя, состоящая из раствора ПХ и 1 мас. %-го раствора хитозана; 2 - 96-луночный полистирольный планшет в качестве подложки; 3 - формирование чувствительного слоя в каждой ячейке микропланшета; 4 - высушивание на воздухе; 5 - микропланшетный оптический биосенсор.
На фиг. 3 представлена схема образования флуоресцирующих производных КА (R1=Н и R2=Н для ДА, R1=ОН и R2=Н для НА, R1=ОН и R2=СН3 для АД) с использованием бензиламина (БА) в качестве дериватизирующего агента.
На фиг. 4 представлена схема образования флуоресцирующих производных КА (R1=Н и R2=Н для ДА, R1=ОН и R2=Н для НА, R1=ОН и R2=СН3 для АД) с использованием 7,2-дифенилэтилендиамина (ДЭД) в качестве дериватизирующего агента.
На фиг. 5 представлены: 1-3 спектры флуоресценции, производные спектры флуоресценции 4-6 первого и 7-9 второго порядка системы флуоресцирующих производных КА - НА / ДА / АД в соотношениях, аналогичных референсным концентрациям КА в моче здорового человека (0.1, 1.0 и 0.05 мкМ для НА, ДА, АД, соответственно). Позициями на фигурах обозначены: 1, 4, 7 - НА / ДА / АД с БА, λex=330 нм, λem=455 нм; 2, 5, 8 - НА / ДА / АД с ДЭД,=340 нм, λex=460 нм; 3, 6, 9 - НА / ДА / АД с БА, λex=356 нм, λem=480 нм.
На фиг. 6 представлены: производные спектры флуоресценции первого (а) и второго (б) порядка системы флуоресцирующих производных КА - НА / ДА / АД в соотношениях, аналогичных референсным концентрациям КА в моче здорового человека (0.1, 1.0 и 0.05 мкМ для НА, ДА, АД, соответственно) и индивидуальных флуоресцирующих производных НА, ДА, АД. Позициями на фигурах обозначены: 1 - НА / ДА / АД с БА, λех=330 нм, λem=455 нм; 2 - НА / ДА / АД с ДЭД, λех=340 нм, λem=460 нм; 3 - НА / ДА / АД с БА, λех=356 нм, λem=480 нм; 4 - НА с БА, λех=330 нм, λem=455 нм; 5 - ДА с ДЭД, λех=340 нм, λem=460 нм; 6 - АД с БА, λех=356 нм, λem=480 нм.
Осуществление изобретения
Получение флуоресцирующих низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена - биогенных аминов методом дериватизации (фиг. 3, 4), включает окисление исходных соединений и их обработку образующими конденсированные структуры аминами, в присутствии биокатализатора - пероксидазы растительного происхождения, в частности пероксидазы из корней хрена (ПХ). Новизна и неочевидность при этом заключается в том, что окисление исходных соединений, катализируемое пероксидазой, проводят в присутствии малого количества фермента, например, на единичный анализ используется 75-500 пмоль ПХ. Использование микропланшетного оптического биосенсора на основе иммобилизованной в пленках хитозана ПХ (фиг. 2) позволяет увеличить воспроизводимость получаемых результатов до 99% и сроки хранения фермента до 6 месяцев при 4°С. При этом хитозан, природный полисахарид, является эффективной биосовместимой и нетоксичной матрицей и образует оптически прозрачные тонкие пленки. Биосенсор существенно упрощает процедуру массового экспрессного анализа - 96 проб за 20 мин, т.е. около 12.5 с на одну пробу. Иммобилизация фермента в пленках хитозана позволяет повысить удобство, экспрессность и воспроизводимость определения маркеров нейромедиаторного обмена в биологических жидкостях.
Необходимое количество хитозана (с различными по распределению молекулярными массами 50-220 кДа и степенью дезацетилирования не менее 75%) для получения 1 мас. %-го раствора растворяют в 0.1-1 об. %-й слабой кислоте или разбавленной сильной, преимущественно одноосновной, кислоте, например, уксусной кислоте, поскольку хитозан гидрофобен и водонерастворим, однако в присутствии небольших количеств даже слабых кислот происходит протонирование амино-групп хитозана, что делает его водорастворимым. Поэтому для растворения хитозана подойдет не только раствор уксусной, но и соляной, угольной и других кислот, рН которых не менее 2, т.е. в присутствии которых не происходит сшивки хитозана.
В ячейки планшета заливают полученные растворы хитозана и пероксидазы в объемном соотношении от 1:1 до 6:1 при нанесении на лунку. Так, например, в каждую ячейку 96-луночного полистирольного планшета (∅ 6.54 мм) заливают по 30 мкл 0.5-2 мас. %-го раствора хитозана и 5-30 мкл 15-20 мкМ раствора ПХ, при этом в качестве фермента, катализирующего процесс получения флуоресцирующих производных КА и их метаболитов, могут быть использованы пероксидазы (КФ 1.11.1.7) не только из корней хрена, но и из других источников растительного происхождения: соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм. Затем добавляли 0-25 мкл деионизированной воды таким образом, чтобы общий объем смеси составлял 60 мкл. При этом на один образец приходился малый расход фермента: 150-450 пмоль. Точная концентрация фермента устанавливалась фотометрически согласно инструкции производителя (для ПХ ε403=1.02⋅105 М-1⋅см-1 согласно данным производителя «Sigma-Aldrich»). Для образования тонких пленок полимера, толщиной 0.5-1.5 мкм, планшет с лунками высушивали не менее 12 ч на воздухе при комнатной температуре (фиг. 2). Планшеты с иммобилизованной ПХ хранили при температуре 4°С, при этом срок хранения фермента составлял до 6 месяцев.
В качестве планшета для изготовления тест-системы могут быть использованы любые цельные или сборные культуральные полимерные (например, полистирольные, полипропиленовые и др.) планшеты с любым количеством лунок, из которых наиболее применимыми являются 6, 12, 24, 48, 72, 96-луночные, подходящие для проведения флуоресцентного анализа, т.е. оптически непрозрачные: либо белые (абсолютно отражающие), либо черные (абсолютно поглощающие), при этом их химическая и термическая устойчивости не имеют значения, поскольку анализ проводится в водной среде при комнатной температуре.
Способ определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена (с молекулярной массой до 900 Да) с помощью оптического биосенсенсора, описанного в заявляемом изобретении, включает в себя последовательное введение компонентов реакции: на 1 объемную часть водного раствора нейромедиатора или биологической жидкости (мочи, крови) 10-15 частей глицин-КОН или CAPS-KOH буфера (0.1-0.5 М), 3-5 об. частей дериватизирующего агента (ДЭД или БА) и 1-5 об. частей пероксида водорода (фиг. 3, 4). После чего реакционную смесь тщательно перемешивали и измеряли интенсивность флуоресценции по истечении 5 мин.
Для осуществления высокоселективного одновременного определения сразу нескольких нейромедиаторов из одной пробы использована дополнительная математическая обработка интенсивности флуоресцентного сигнала путем взятия первой и второй производной по длине волны. Исходные зарегистрированные спектры флуоресценции (нулевого порядка) представляли собой зависимость интенсивности (I) испускания от длины волны (λ) (фиг. 5). Затем спектры нулевого порядка преобразовывались в соответствующие спектры производных первого и второго порядков. Спектр первой производной представлял собой график зависимости градиента кривой испускания (скорость изменения интенсивности с длиной волны, dI/dλ) от длины волны (фиг. 5). Спектр второй производной представлял собой график зависимости кривизны спектра испускания (d2I/dλ2) от длины волны. Первая (dI/dλ) и вторая производные (d2I/dλ2) при характерной длине волны для данного аналита линейно зависят от его концентрации. Производная спектрофлуориметрия может быть использована как для целей идентификации катехоламинов и их метаболитов, так и их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновая флуоресценция (например, для мочевины в образце мочи).
Направленный выбор дериватизирующего агента, длины волны возбуждения, использование микропланшетного биосенсора и производной спектрофлуориметрии позволяет разделять и определять сразу несколько КА и их метаболитов в смеси (фиг. 5, 6).
Наиболее интенсивный сигнал получают при проведении процесса в 0.1-0.5 М CAPS-КОН с рН 11 и глицин-КОН с рН 8 буферном растворе при концентрации ПХ: 0.1-10 мкМ; концентрации пероксида водорода: 0.01-1 мМ, концентрации дериватизирующего агента: 0.1-100 мМ; концентрации определяемых соединений -катехоламинов и их метаболитов: 0.005-5 мкМ.
Наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала получают при использовании в качестве дериватизирующих агентов бензиламина и дифенилэтилендиамина, а также при возбуждении флуоресценции в диапазоне λex=305-356 нм и регистрации аналитического сигнала в диапазоне λem=420-480 нм.
Наилучшую воспроизводимость (99%) и наиболее интенсивный флуоресцентный сигнал получают при иммобилизации ПХ в ячейках полистирольного планшета в 1 мас. %-м растворе хитозана и высушивании на воздухе в течение суток. Необходимое количество хитозана растворяют в 0.5 об.% уксусной кислоте. Полученный биосенсор сохраняет свою каталитическую активность в течение 6 месяцев при хранении в холодильнике при 4°С.
Предлагаемое изобретение также позволяет сократить время проведения единичного анализа с 10 мин до почти 12.5 с, что может быть использовано в массовых анализах биологических жидкостей в целях диагностики на молекулярном уровне нейродегенеративных заболеваний (деменций) и нейроэндокринных опухолей (карциномы, нейробластомы, параганглиомы, феохромоцитомы и др.) на ранних стадиях.
Качественное определение и вывод о присутствии того или иного нейромедиатора делались по наличию максимумов на спектрах флуоресценции и экстремумов на спектрах второй производной в диапазоне от 452 до 458 нм для норадреналина, в диапазоне от 475 до 485 нм для дофамина, в диапазоне от 455 до 465 нм для адреналина, в диапазоне от 417 до 423 нм для ванилилминдальной кислоты, в диапазоне от 422 до 428 нм для гомованилиновой кислоты. Количественное определение молекул нейромедиаторов в образце проводят с применением градуровочных зависимостей. Градуировочный график строится в координатах интенсивность флуоресцентного сигнала - концентрация нейромедиатора в максимуме характеристического пика. В целях установления неизвестного содержания катехоламинов и их метаболитов в растворе используют уравнения вида I=(а±Δа)×с+(b±Δb), либо dI/dλ=(а±Δа)×с+(b±Δb), либо d2I/dλ2=(а±Δа)×с+(b±Δb), в которые подставляется значение интенсивности флуоресцентного сигнала в максимуме характеристического пика (I, либо dI/dλ, либо d2I/dλ2), и вычисляется концентрация определяемого соединения (с). В настоящем изобретении приняты следующие обозначения и термины:
n - количество параллельных измерений,
Р - доверительная вероятность,
сн - концентрация аналита, минимальная из диапазона определяемых содержаний,
sr - относительное стандартное отклонение измерений,
r - коэффициент корреляции,
λem - длина волны испускания (эмиссии),
λех - длина волны возбуждения флуоресценции,
5-ГИУК - 5-гидроксииндол-3-уксусная кислота,
5-ГТ - 5-гидрокситриптамин (серотонин),
CAPS - N-циклогексил-3-аминопропансульфокислота (N-cyclohexyl-3-aminopro-panesulfonic acid),
L-ДОФА - 3-(3,4-дигидроксифенил)-L-аланин
АД - адреналин (эпинефрин, 4-[(1R)-1-гидрокси-2-(метиламино)этил]фенил-1,2-диол),
БА - бензиламин,
ВМК - ванилилминдальная кислота (2-гидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)уксусная кислота),
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,
ГВК - гомованилиновая кислота (4-гидрокси-3-метоксифенилуксусная кислота),
ДА - дофамин (допамин, 4-(2-аминоэтил)фенил-1,2-диол),
ДМСО - диметилсульфоксид,
ДЭД - 1,2-дифенилэтилендиамин,
ДОС - диапазон определяемых содержаний,
КА - катехоламин (катехоламины),
КФ - шифр классификации (кода) фермента, представляющий собой классификационный номер фермента по международной иерархической классификации,
НА - норадреналин (норэпинефрин, 4-[(1R)-2-амино-7-гидроксиэтил]фенил-1,2-диол),
НМН - норметанефрин (D,L-α-(аминометил)-4-гидрокси-3-метоксибензилметанол),
ПАВ - поверхностно-активное вещество,
ПО - предел обнаружения,
ПХ - пероксидаза из корней хрена,
ЦТМА - цетилтриметиламмоний бромид.
Химические символы / сокращения имеют свои обычные значения: °С (градус (градусы) Цельсия), нм (нанометр (нанометры)), мм (миллиметр (миллиметры)), мин (минута (минуты)), с (секунда (секунды)), мкл (микролитр (микролитры)), М (моль (моли) в литре), л (литр (литры)), мкл (микролитр (микролитры)), мг (миллиграмм (миллиграммы)), нмоль (наномоль (наномоли)), пмоль (пикомоль (пикомоли)), нМ (наномоль (наномоли) в литре), мкМ (микромоль (микромоли) в литре), мМ (миллимоль (миллимоли) в литре), % (об.%) (процент (проценты) по объему), мас. % (массовый процент (проценты)), В (вольт (вольты)).
Представленные ниже примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, но не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.
Все приведенные ниже реагенты и полистирольные планшеты являются коммерчески доступными. Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С; в ходе всех экспериментов для приготовления водных растворов использовали деионизированную воду высокой чистоты, очищенную с использованием установки «Milli-Q», «Millipore»; спектры флуоресценции зарегистрированы на спектрофлуориметре «Cary Eclipse», «Agilent» с использованием приставки для микропланшетов, с мощностью лампы 800 В, с шириной входной и выходной щелей 5 или 10 нм; взвешивание препаратов проводили с точностью ± 0.02 мг на аналитических весах «Discovery», «OHAUS»; точные объемы жидкостей отбирали с использованием автоматических дозаторов «Eppendorf» с диапазонами объемов: 2-20, 10-100, 20-200, 100-1000 и 500-5000 мкл.
Пример 1. Микропланшетный оптический биосенсор.
Микропланшетный оптический биосенсор представляет собой 96-луночный полистирольный планшет с чувствительным слоем в виде тонких пленок ПХ в хитозане в каждой ячейке (∅ 6.54 мм) (фиг. 1). Необходимое количество хитозана растворяют в 0.5 об. %-й уксусной кислоте для получения 1 мас. %-го раствора. В ячейки планшета заливали по 30 мкл 1 мас. %-го раствора хитозана, 10 мкл 15 мкМ раствора ПХ и 20 мкл деионизированной воды. Для получения тонких пленок высушивали планшет в течение суток на воздухе при температуре 23±3°С (фиг. 2). Планшеты с иммобилизованной ПХ хранили при температуре 4°С.
Способ определения маркеров нейромедиаторного обмена с помощью оптического биосенсенсора, описанного в заявляемом изобретении, включает в себя последовательное введение компонентов реакции: буферного раствора, водного раствора нейромедиатора или биологической жидкости (мочи, крови), дериватизирующего агента (ДЭД или БА) и пероксида водорода (фиг. 3, 4); детектирование образующегося дериватизированного производного с помощью флуориметра с приставкой для планшетов, выбор длин волн возбуждения и испускания в соответствии с природой и структурой образующихся производных (λex=305-356 нм, λem=420-480 нм), с последующей математической обработкой флуоресцентных сигналов с использованием производной спектрофлуориметрии 1-го и 2-го порядка.
Для детектирования анализируемых веществ с концентрациями 0.005-5 мкМ используют жидкие пробы объемом 10-40 мкл путем их введения в реакционную систему в ячейку планшета с чувствительным слоем. Для обеспечения высокой скорости анализа при большом отношении сигнал / шум и отсутствии появления ложной спектральной информации мощность излучения составляла 800 В при ширине входной и выходной щелей 5 или 10 нм.
Пример 2. Определение норадреналина (НА) с концентрацией в интервале 0.025-0.5 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с ДЭД или БА.
Для определения НА был использован биосенсор из примера 1. В ячейку планшета с чувствительным слоем последовательно вводили 140 мкл 0.5 М глицин-КОН буферного раствора рН 8 (120 мкл 0.1 М CAPS-KOH буферного раствора, рН 11), 10 мкл 30 мкМ раствора НА, 30 мкл 20 мМ раствора ДЭД (40 мкл 0.2 М раствора БА) и 10 мкл 2.0 мМ раствора Н2О2. После чего реакционную смесь тщательно перемешивали и измеряли интенсивность флуоресценции по истечении 5 мин. Контрольный опыт проводили аналогично вышеописанной методике за исключением того, что вместо НА вводили воду. Для обеспечения высокой скорости анализа при большом отношении сигнал / шум и отсутствии появления ложной спектральной информации мощность излучения составляла 800 В при ширине входной и выходной щелей 5 или 10 нм. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с НА проводили при λem=330 нм. Делали вывод о количественном содержании НА по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λex=455 нм (табл. 1).
Градуировочный график строился в координатах интенсивность флуоресцентного сигнала - концентрация нейромедиатора в максимуме характеристического пика (фиг. 5). В диапазоне определяемых содержаний соблюдалась линейная зависимость между интенсивностью флуоресценции максимума пика на спектрах и концентрацией КА и их метаболитов. Прямолинейность графика сохраняется только в интервале диапазона определяемых содержаний, указанных в табл. 1. Нахождение значения концентраций нейромедиаторов в испытуемом растворе по градуировочным зависимостям ниже и выше диапазона определяемых содержаний возможно, но не рекомендуется из-за большой погрешности. В целях установления неизвестного содержания маркеров нейромедиаторного обмена в растворе используют уравнение вида I=(а±Δа)×с+(b±Δb), в которое подставляется значение интенсивности флуоресцентного сигнала в максимуме характеристического пика (I), и вычисляется концентрация определяемого соединения (с). Также для более чувствительного и селективного определения катехоламинов и их метаболитов градуировочный график строился в координатах вторая производная интенсивности флуоресцентного сигнала по длине волны в экстремуме характеристического пика - концентрация нейромедиаторного соединения (фиг. 6, б). В целях нахождения неизвестного содержания нейромедиатора в испытуемом растворе использовали уравнение вида d2I/dλ2=(а±Δа)×с+(b±Δb), в которое подставляли значение второй производной интенсивности флуоресцентного сигнала по длине волны (d2I/dλ2), и вычисляли концентрацию определяемого соединения (табл. 3).
Figure 00000001
Figure 00000002
** - стандартное относительное отклонение для измерений при минимальной концентрации (с„) из диапазона определяемых содержаний
Пример 3. Определение дофамина (ДА) с концентрацией в интервале 0.25-2.5 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с ДЭД.
Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве дериватизирующего агента был использован ДЭД, а в качестве буфера - 0.5 М глицин-КОН рН 8.0. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с ДА проводили при λem=340 нм. Делали вывод о количественном содержании ДА по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λex=460 нм (табл. 1).
Пример 4. Определение ванилилминдальной кислоты (ВМК) с концентрацией в интервале 0.5-5 мкМ по реакции ее ферментативной дериватизации с ДЭД.
Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве дериватизирующего агента был использован ДЭД, а в качестве буфера - 0.5 М глицин-КОН рН 8.0. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с ВМК проводили при λem=305 нм. Делали вывод о количественном содержании ВМК по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λex=420 нм (табл. 1).
Пример 5. Определение гомованилиновой кислоты (ГВК) с концентрацией в интервале 0.5-5 мкМ по реакции ее ферментативной дериватизации с БА.
Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве дериватизирующего агента был использован БА, а в качестве буфера - 0.1 М CAPS-KOH рН 11.0. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с ГВК проводили при λem=315 нм. Делали вывод о количественном содержании ГВК по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λex=425 нм (табл. 1).
Пример 6. Определение адреналина (АД) с концентрацией в интервале 0.005-0.075 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с БА.
Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве дериватизирующего агента был использован БА, а в качестве буфера - 0.1 М CAPS-KOH рН 11. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с АД проводили при λem=356 нм. Делали вывод о количественном содержании ДА по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λex=480 нм (табл. 1).
Пример 7. Определение L-ДОФА с концентрацией в интервале 0.025 - 0.25 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с БА.
Анализ проводился аналогично примеру 6. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с L-ДОФА проводили при λem=335 нм. Делали вывод о количественном содержании L-ДОФА по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λех=458 нм (табл. 1).
Пример 8. Определение норметанефрина (НМН) с концентрацией в интервале 0.005-0.05 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с БА.
Анализ проводился аналогично примеру 6. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с НМН проводили при λem=340 нм. Делали вывод о количественном содержании НМН по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λех=463 нм (табл. 1).
Пример 9. Определение 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты (5-ГИУК) с концентрацией в интервале 0.1-1.0 мкМ по реакции ее ферментативной дериватизации с БА.
Анализ проводился аналогично примеру 6. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с 5-ГИУК проводили при λem=345 нм. Делали вывод о количественном содержании 5-ГИУК по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λех=475 нм (табл. 1).
Пример 10. Определение серотонина (5-гидрокситирамина, 5-ГТ) с концентрацией в интервале 0.5-7.5 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с БА.
Анализ проводился аналогично примеру 6. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с 5-ГТ проводили при λem=345 нм. Делали вывод о количественном содержании 5-ГТ по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λех=468 нм (табл. 1).
Пример 11. Определение ДА в моче здорового человека методом «введено-найдено» по реакции его ферментативной дериватизации с ДЭД.
Анализ проводился аналогично примеру 3 с отличием в том, что в качестве пробы вводили 10 мкл мочи (без предварительной пробоподготовки). О количественном содержании ДА судили по градуировочной зависимости (табл. 1). Полученные результаты согласовались с литературными данными о нормальных референсных содержаниях ДА в моче здорового человека (табл. 2) (Pussard Е., Neveux М., Guigueno N. Reference intervals for urinary catecholamines and metabolites from birth to adulthood. Clin. Biochem. 2009. V. 42. P. 536-539, Pagana K.D. Mosby's Manual of Diagnostic and Laboratory Tests. St. Louis: Mosby Inc., 1998.).
Figure 00000003
Пример 12. Определение НА, ДА, АД в смеси в тройной системе НА / ДА / АД по реакции их ферментативной дериватизации с ДЭД или БА.
Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве пробы вводили смесь, состоящую из НА, ДА и АД с концентрациями 0.1, 1.0 и 0.05 мкМ, соответственно.
На первом этапе регистрировали спектры флуоресценции индивидуальных производных катехоламинов и тройной системы с соотношениями компонентов, аналогичными для референсных содержаний катехоламинов в моче здорового человека (0.1, 1.0 и 0.05 мкМ для НА, ДА, АД, соответственно). На втором этапе, с использованием математической обработки данных, получали первые и вторые производные спектров флуоресценции системы катехоламинов и индивидуальных соединений (фиг. 5, 6). Математическая модель обработки спектров была аналогична модели производной спектрофотометрии. По спектрам первой и второй производной для разных концентраций индивидуальных соединений строили градуировочные зависимости и рассчитывали метрологические характеристики, чтобы сравнить их с метрологическими характеристиками для флуоресцентных спектров (табл. 3). Обнаружено, что ПО для предложенных методик, с использованием производных спектров, выше, но незначительно, однако дополнительно позволило использовать этот подход для обеспечения, главным образом, селективного, мультиплексного и, в то же время, высокочувствительного определения сразу нескольких катехоламинов в их сложной многокомпонентной смеси (фиг. 5, 6).
Figure 00000004
а - с использованием спектра флуоресценции флуоресцирующего производного КА;
б - с использованием производного спектра флуоресценции первого порядка флуоресцирующего производного КА;
в - с использованием производного спектра флуоресценции второго порядка флуоресцирующего производного КА.
Пример 13. Определение дофамина (ДА) с концентрацией в интервале 0.5-2.0 мкМ по реакции его ферментативной дериватизации с ДЭД с использованием пероксидазы из соевых бобов.
Анализ проводился аналогично примеру 3 с отличием в том, что в качестве пероксидазы растительного происхождения использовалась пероксидаза из соевых бобов. Возбуждение флуоресценции для регистрации сигналов в пробе с ДА проводили при λem=340 нм. Делали вывод о количественном содержании ДА по градуировочной зависимости, построенной для сигнала флуоресценции при λex=460 нм (табл. 4).
Figure 00000005
Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение решает задачу одновременного определения сразу нескольких маркеров нейромедиаторного обмена в большом количестве проб биологических жидкостей за счет получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов: норадреналина, дофамина, адреналина, гомованилиновой и ванилилминдальной кислот, а также других низкомолекулярных нейромедиаторов - биогенных аминов: L-ДОФА, норметанефрина, серотонина и 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты. Решена задача получения соответствующих более интенсивно флуоресцирующих производных за короткий промежуток времени (3-5 мин), что позволило проводить единичный анализ за промежуток времени до 12.5 с (96 проб за 20 мин) при одновременном уменьшении необходимого объема пробы биологической жидкости (например, плазмы крови) до 10-30 мкл за счет проведения анализа в лунке планшета. Кроме того, решена задача нестабильности раствора фермента, устранения мешающего влияния матрицы реальных образцов и возможности предконцентрирования целевых аналитов за счет использования тонкой пленки оптически прозрачного биосовместимого природного полимера - хитозана, в структуру которого иммобилизован фермент, катализирующий реакции окисления и дериватизации - пероксидаза. Обнаруженный эффект нивелирования матричного влияния на интенсивность, разрешение и стабильность регистрируемых сигналов благодаря оптически прозрачной пленке хитозана, способной крепиться в лунках планшета, иммобилизовать в своей структуре фермент, набухать при внесении водных растворов, осуществлять транспорт биогенных аминов - низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена, и предконцентрировать их, позволил осуществлять высокочувствительное и селективное определение катехоламинов и их метаболитов в биологических образцах малого объема. В совокупности перечисленные улучшения технологичности процесса за счет сокращения времени, отказа от нестабильного при хранении раствора фермента нагревания и термостатирования, использования токсичных или агрессивных органических растворителей и ПАВ, позволили повысить удобство и экспрессность единичного анализа (с 10 мин до 12.5 с) и воспроизводимость (с 93 до 99%) определения катехоламинов и их метаболитов в биообъектах, а применение производной спектрофлуориметрии позволяет повысить селективность, достоверность и правильность определения катехоламинов и их метаболитов вплоть до полного их разделения. Это позволяет использовать предлагаемое изобретение для определения молекул нейромедиаторов в биологических жидкостях с целью диагностики нейродегенеративных и нейроэнокринных заболеваний.

Claims (15)

1. Тест-система для экспресс-определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, а именно катехоламинов и их метаболитов, представляющая собой планшет с нанесенной на поверхность лунок пленки хитозана с иммобилизованной пероксидазой растительного происхождения толщиной от 0,5 до 1,5 мкм, при этом пероксидаза содержится в количестве от 2 до 16 пмоль на 1 мм2 площади пленки, а хитозан - от 15 до 60 мг на 1 мм2 площади пленки, и хитозан имеет распределение молекулярных масс 50-220 кДа и степень дезацетилирования не менее 75%.
2 Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что в качестве пероксидазы растительного происхождения используют пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм.
3. Способ получения тест-системы по п. 1, включающий приготовление 0,5-2 мас. % водного растворов хитозана и 15-20 мкМ водного раствора пероксидазы растительного происхождения с последующим их нанесением на лунки планшета в объемном соотношении растворов хитозана и пероксидазы от 1:1 до 6:1 и высушиванием не менее 12 часов на воздухе при температуре до 23±3°С до образования пленки толщиной от 0,5 до 1,5 мкм и содержанием пероксидазы в количестве от 2 до 16 пмоль на 1 мм2 площади пленки и хитозана в количестве от 15 до 60 мг на 1 мм2 площади пленки, при этом используют хитозан с распределением молекулярных масс 50-220 кДа и степенью дезацетилирования не менее 75%.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что для приготовления водного раствора хитозана используют водные растворы кислот с рН не менее 2 в количестве, достаточном для растворения хитозана в воде, при этом предотвращающем реакцию сшивания хитозана.
5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве кислот используют уксусную, соляную, угольную.
6. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что в качестве пероксидазы растительного происхождения используют пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм.
7. Способ экспресс-определения катехоламинов и их метаболитов в образцах биологических жидкостей, включающий нанесение пробы биологической жидкости на лунку тест-системы по п. 1, полученной способом по п. 3, с последующим внесением пероксида водорода и дериватизирующего агента в количестве, обеспечивающем проведения реакции дериватизации с образованием флуоресцирующих производных, возбуждение флуоресценции в пробе с регистрацией полученных сигналов, и при выявлении максимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце.
8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что вывод о наличии в образце биологической жидкости норадреналина делают при выявлении максимума в диапазоне от 452 до 458 нм, дофамина - в диапазоне от 455 до 465 нм, адреналина - в диапазоне от 475 до 485 нм, ванилилминдальной кислоты - в диапазоне от 417 до 423 нм, гомованилиновой кислоты - в диапазоне от 422 до 428 нм, L-ДОФА - в диапазоне от 456 до 460 нм, норметанефрина - в диапазоне от 460 до 463 нм, серотонина - в диапазоне от 463 до 473 нм, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты - в диапазоне от 470 до 480 нм.
9. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что в качестве дериватизирующего агента используют ароматические амины.
10. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что в качестве ароматического амина используют бензил амин или 1,2-дифенилэтилендиамин.
11. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что для определения количественного содержания аналитов в образцах биологических жидкостей измеряют интенсивность полученного сигнала, вывод о количественном содержании делают по предварительно рассчитанным градуировочным зависимостям.
12. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что дополнительно проводят обработку полученных сигналов путем вычисления второй производной интенсивности флуоресцентных сигналов и при выявлении минимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце: вывод о наличии в образце биологической жидкости норадреналина делают при выявлении минимума в диапазоне от 452 до 458 нм, дофамина - в диапазоне от 455 до 465 нм, адреналина - в диапазоне от 475 до 485 нм, ванилилминдальной кислоты - в диапазоне от 417 до 423 нм, гомованилиновой кислоты - в диапазоне от 422 до 428 нм, L-ДОФА - в диапазоне от 456 до 460 нм, норметанефрина - в диапазоне от 460 до 463 нм, серотонина - в диапазоне от 463 до 473 нм, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты - в диапазоне от 470 до 480 нм.
13. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что пробу биологической жидкости используют объемом 10-30 мкл.
14. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что для получения сигнала флуоресценции пробу облучают монохроматичным излучением с длиной волны в диапазоне 300-370 нм.
15. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что на 1 объемную часть пробы используют 3-5 об. частей дериватизирующего агента и 1-5 об. частей пероксида водорода.
RU2017133992A 2017-09-29 2017-09-29 Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием RU2708917C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017133992A RU2708917C2 (ru) 2017-09-29 2017-09-29 Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017133992A RU2708917C2 (ru) 2017-09-29 2017-09-29 Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017133992A RU2017133992A (ru) 2019-04-01
RU2017133992A3 RU2017133992A3 (ru) 2019-04-01
RU2708917C2 true RU2708917C2 (ru) 2019-12-12

Family

ID=66089441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017133992A RU2708917C2 (ru) 2017-09-29 2017-09-29 Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2708917C2 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112858233A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 天津科技大学 一种新型的水体中锌离子的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2554499C2 (ru) * 2013-05-23 2015-06-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ определения катехоламинов и их метаболитов с использованием твердофазного флуоресцентного биосенсора

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2554499C2 (ru) * 2013-05-23 2015-06-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ определения катехоламинов и их метаболитов с использованием твердофазного флуоресцентного биосенсора

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RODIONOV P. V. et al. "A solid-phase fluorescent biosensor for the determination of phenolic compounds and peroxides in samples with complex matrices". Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 406(5), p.1531-1540. doi:10.1007/s00216-013-7538-1. *
RODIONOV P. V. et al. "A solid-phase fluorescent biosensor for the determination of phenolic compounds and peroxides in samples with complex matrices". Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 406(5), p.1531-1540. doi:10.1007/s00216-013-7538-1. VESELOVA I. A.et al. "Properties and analytical applications of the self-assembled complex { peroxidase-chitosan} ". Talanta. 2012. v.102. p.101-109. *
VESELOVA I. A.et al. "Properties and analytical applications of the self-assembled complex { peroxidase-chitosan} ". Talanta. 2012. v.102. p.101-109. *
ВЕСЕЛОВА И.А. и др. "Методы определения маркеров нейромедиаторного обмена в целях клинической диагностики". ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2016, т.71, no. 12, p.1235-1249. *
ВЕСЕЛОВА И.А. и др. "Методы определения маркеров нейромедиаторного обмена в целях клинической диагностики". ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2016, т.71, no. 12, p.1235-1249. ПОЛЯКОВ А. Е. "Пероксидазы хрена и сои для определения фенольных и эндопероксидных соединений в водных, водно-органических средах и гидрофильных ионных жидкостях", Автореферат, Москва - 2011, 27 с. *
ПОЛЯКОВ А. Е. "Пероксидазы хрена и сои для определения фенольных и эндопероксидных соединений в водных, водно-органических средах и гидрофильных ионных жидкостях", Автореферат, Москва - 2011, 27 с. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017133992A (ru) 2019-04-01
RU2017133992A3 (ru) 2019-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shi et al. A rapid and ultrasensitive tetraphenylethylene-based probe with aggregation-induced emission for direct detection of α-amylase in human body fluids
Liu et al. Sensing of carboxylate drugs in urine by a supramolecular sensor array
Houseman et al. Peptide chips for the quantitative evaluation of protein kinase activity
Kimble et al. Progress toward the development of a point-of-care photonic crystal ammonia sensor
Teerlink Determination of the endogenous nitric oxide synthase inhibitor asymmetric dimethylarginine in biological samples by HPLC
Zinellu et al. Quantification of neurotransmitter amino acids by capillary electrophoresis laser-induced fluorescence detection in biological fluids
Doong et al. Simultaneous determination of biomarkers for Alzheimer's disease using sol–gel-derived optical array biosensor
Tan et al. Direct detection of Δ9-tetrahydrocannabinol in aqueous samples using a homogeneous increasing fluorescence immunoassay (HiFi)
Pundir et al. Quantification of pyruvate with special emphasis on biosensors: A review
RU2708917C2 (ru) Тест-система для определения низкомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена в образцах биологических жидкостей, способ ее получения и способ определения катехоламинов и их метаболитов с ее использованием
CN103472239B (zh) 一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法
Swingle et al. Development and validation of a robust and sensitive assay for the discovery of selective inhibitors for serine/threonine protein phosphatases PP1α (PPP1C) and PP5 (PPP5C)
Leelasattarathkul et al. Combination of distance-based paper analytical devices with ionic liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction for enzyme-free bilirubin quantification
Aigner et al. Amperometric biosensor for total monoamines using a glassy carbon paste electrode modified with human monoamine oxidase B and manganese dioxide particles
Makedonskaya et al. Novel biosensing system for the simultaneous multiplex fluorescent determination of catecholamines and their metabolites in biological liquids
CN112816453A (zh) 蛋白在预测药物性能上的应用
JP4600787B2 (ja) クロマトデバイス
Ramaswamy et al. Application of protein lysate microarrays to molecular marker verification and quantification
KR101548454B1 (ko) 형광 센싱막, 이를 이용한 생물학적 검출키트 및 검출방법
WO2004016223A2 (en) Assaying compounds or agents for microsomal prostaglandin e synthase or hematopoietic prostaglandin d synthase activity
Abu-Hassan et al. Synergistic utility of NBD-Cl fluorogenic loading activity and salting-out assisted liquid–liquid extraction as sample pretreatment in rasagiline tracking in different matrices
JP2001525547A (ja) イムノアッセイ法及びキット
Jung et al. Real-time monitoring of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity using liquid droplet arrays and its application to human plasma samples
Nowicka et al. Exploring the Interactions of Biologically Active Compounds (Including Drugs) with Biomolecules: Utilizing Surface Plasmon Resonance and SwitchSense Techniques
Tatsukawa et al. Development of peptide-based biosensors for detecting cross-linking and deamidation activities of transglutaminases