RU2708558C1 - Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells - Google Patents

Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells Download PDF

Info

Publication number
RU2708558C1
RU2708558C1 RU2018144103A RU2018144103A RU2708558C1 RU 2708558 C1 RU2708558 C1 RU 2708558C1 RU 2018144103 A RU2018144103 A RU 2018144103A RU 2018144103 A RU2018144103 A RU 2018144103A RU 2708558 C1 RU2708558 C1 RU 2708558C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lymphocytes
cells
transduced
tcr
lymphoma cells
Prior art date
Application number
RU2018144103A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Дмитрий Борисович Казанский
Людмила Менделевна Хромых
Анастасия Андреевна Калинина
Юлия Юрьевна Силаева
Мария Анатольевна Замкова
Александра Владимировна Брутер
Надежда Александровна Персиянцева
Ирина Олеговна Чикилева
Лейла Хвичаевна Джолохава
Original Assignee
Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ filed Critical Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Priority to RU2018144103A priority Critical patent/RU2708558C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2708558C1 publication Critical patent/RU2708558C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Abstract

FIELD: biochemistry.
SUBSTANCE: invention relates to biochemistry, in particular to a method for producing anti-tumor immune defense of an organism to EL-4 lymphoma cells.
EFFECT: invention enables effective resistance to EL-4 lymphoma cells.
1 cl, 1 dwg, 3 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и касается Т-лимфоцитов, имеющих новый рецептор.The invention relates to the field of molecular biotechnology and relates to T-lymphocytes having a new receptor.

В процессе иммунного ответа на антигены бактерий, вирусов и опухолей в организме формируется популяция клеток памяти - лимфоцитов, способных к ускоренному и усиленному ответу на тот же антиген, введенный повторно. Встреча организма с антигеном ведет к дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в эффекторные клетки, а затем в клетки памяти. Это пул клеток, составляющий около 5% от общего количества лимфоцитов, способных длительно персистировать и осуществлять эффективный иммунный ответ при повторной встрече организма с антигеном (Rocha В., 1997; Jacob J. et al., 1997, Rocha В., 1999, Murali K.K. et al., 1998). Все известные методы вакцинации основаны на возникновении клеток памяти.In the process of an immune response to antigens of bacteria, viruses and tumors in the body, a population of memory cells is formed - lymphocytes capable of an accelerated and enhanced response to the same antigen, re-introduced. The meeting of an organism with an antigen leads to the differentiation of naive T-lymphocytes into effector cells, and then into memory cells. This is a pool of cells that makes up about 5% of the total number of lymphocytes capable of long-term persisting and an effective immune response when the body meets the antigen again (Rocha B., 1997; Jacob J. et al., 1997, Rocha B., 1999, Murali KK et al., 1998). All known vaccination methods are based on the emergence of memory cells.

Специфическое узнавание антигена Т-лимфоцитами происходит благодаря наличию Т-клеточного рецептора (ТКР). ТКР состоит из α- и β-цепей, которые являются уникальными для каждого клона Т-лимфоцитов. Пул Т-лимфоцитов организма представляют собой смесь клеток, на поверхности каждой из которых присутствует своя уникальная комбинация α- и β-цепей ТКР, которая передается ее потомкам, образующимся в результате деления (клонам).Specific antigen recognition by T-lymphocytes occurs due to the presence of a T-cell receptor (TCR). TCR consists of α- and β-chains, which are unique for each clone of T-lymphocytes. The pool of body T-lymphocytes is a mixture of cells, on the surface of each of which there is a unique combination of α and β TCR chains, which is transmitted to its descendants resulting from division (clones).

Получение Т-лимфоцитов с ТКР нужной специфичности происходит в несколько этапов:Obtaining T-lymphocytes with TCR of the desired specificity occurs in several stages:

1. Проведение Т-клеточного клонирования. В пуле Т-лимфоцитов индуцируют размножение отдельных клеток с нужной специфичностью ТКР путем добавления к ним специфического антигена. Чтобы получить достаточное количество таких клеток, проводят несколько раундов рестимуляции их пролиферации специфическим антигеном. В результате получают необходимое количество Т-лимфоцитов, несущих ту же комбинацию α- и β-цепей ТКР, что и исходная клетка (клон). Данная процедура требует значительных временных и технических затрат, связанных с длительностью роста индивидуальных клонов и необходимостью подбора и обеспечения достаточно сложных (иногда индивидуальных) условий их поддержания и дальнейшего тестирования.1. Carrying out T-cell cloning. In the pool of T-lymphocytes, the multiplication of individual cells with the desired TCR specificity is induced by adding a specific antigen to them. To obtain a sufficient number of such cells, several rounds of restimulation of their proliferation by a specific antigen are carried out. As a result, the required number of T lymphocytes is obtained that carry the same combination of α and β TCR chains as the original cell (clone). This procedure requires significant time and technical costs associated with the duration of growth of individual clones and the need to select and provide fairly complex (sometimes individual) conditions for their maintenance and further testing.

2. Проведение генного клонирования, идентификация и определение нуклеотидных последовательностей α- и β-цепей каждого клона Т-лимфоцитов. Полученные генетические последовательности при помощи экспрессионных векторов вводят в активированные Т-лимфоциты, в результате чего их потомки приобретают способность к экспрессии ТКР с новой заданной специфичностью.2. Gene cloning, identification and determination of the nucleotide sequences of the α and β chains of each T lymphocyte clone. The obtained genetic sequences are introduced into the activated T-lymphocytes using expression vectors, as a result of which their descendants acquire the ability to express TCR with a new specified specificity.

Этот подход был использован для адоптивной иммунотерапии опухолей в онкологии [Robbins PF, Morgan RA, Feldman SA., Yang JC, Sherry RM, Dudley ME, Wunderlich JR, Nahvi AV, Helman LJ, Mackall CL, Kammula US, Hughes MS, Restifo NP, Raffeld M, Lee CC, Levy CL, Li YF, El-Gamil M, Schwarz SL, Laurencot C, Rosenberg SA.Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1.J Clin Oncol. 2011 Mar 1; 29(7):917-24.; Blankenstein T, Leisegang M, Uckert W, Schreiber H. Targeting cancer-specific mutations by T cell receptor gene therapy. Curr Opin Immunol. 2015; 33:112-9].This approach has been used for adoptive tumor immunotherapy in oncology [Robbins PF, Morgan RA, Feldman SA., Yang JC, Sherry RM, Dudley ME, Wunderlich JR, Nahvi AV, Helman LJ, Mackall CL, Kammula US, Hughes MS, Restifo NP , Raffeld M, Lee CC, Levy CL, Li YF, El-Gamil M, Schwarz SL, Laurencot C, Rosenberg SA. Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1. J Clin Oncol. 2011 Mar 1; 29 (7): 917-24 .; Blankenstein T, Leisegang M, Uckert W, Schreiber H. Targeting cancer-specific mutations by T cell receptor gene therapy. Curr Opin Immunol. 2015; 33: 112-9].

Недостатки данного подхода: необходимость проведения процедуры клеточного клонирования. Использована полная конфигурация ТКР, состоящая из α- и β-цепей.The disadvantages of this approach: the need for a cell cloning procedure. The complete TCR configuration consisting of α and β chains was used.

Ранее мы обнаружили, что среди Т-лимфоцитов присутствуют Т-лимфоциты с ТКР, специфичность которых к заданному антигену определяет только α-цепь [Казанский Д.Б. Трансгенные технологии создания иммунологической защиты организма. В сборнике докладов семинара Фонда перспективных исследований "Проблемные вопросы иммунологии", 03 октября 2014 г., Москва, ООО "Б-принт", 2015, С. 17-25]. Такие ТКР распознают антиген вне зависимости от того, в комбинации с какой β-цепью он присутствует на мембране Т-лимфоцита. Это дает возможность избежать процедуры клеточного клонирования и отказаться от трансгенного переноса α-цепей при получении ТКР с нужной специфичностью. В данном способе технология идентификации нужного рецептора сводится к получению библиотек кДНК из поликлональных клеток памяти и определению и секвенированию генов биологически активных α-цепей методом секвенирования нового поколения (NGS-секвенирования). Данный подход позволяет значительно сократить процедуру поиска и идентификации нужных рецепторов и облегчает техническое выполнение переноса в клеточный геном генетических конструкций благодаря уменьшению их размеров. Этот способ предполагает использование индивидуальных трансгенных α-цепей, которые при взаимодействии с эндогенными β-цепями, присутствующими в клетке, формируют ТКР для защиты от онкологических заболеваний.Earlier, we found that among T-lymphocytes there are T-lymphocytes with TCR, the specificity of which for a given antigen is determined only by the α-chain [Kazan DB Transgenic technologies for creating an immunological defense of the body. In the collection of reports of the seminar of the Foundation for Advanced Research "Problematic issues of immunology", October 3, 2014, Moscow, B-print LLC, 2015, pp. 17-25]. Such TCRs recognize an antigen, regardless of which combination with which β-chain it is present on the T-lymphocyte membrane. This makes it possible to avoid the cell cloning procedure and refuse transgenic transfer of α-chains upon receipt of TCR with the desired specificity. In this method, the technology for identifying the desired receptor is reduced to obtaining cDNA libraries from polyclonal memory cells and determining and sequencing the genes of biologically active α-chains by new generation sequencing (NGS sequencing). This approach significantly reduces the search and identification of the desired receptors and facilitates the technical implementation of the transfer of genetic constructs into the cellular genome due to the reduction of their size. This method involves the use of individual transgenic α-chains, which, when interacting with endogenous β-chains present in the cell, form TCR to protect against cancer.

В качестве одного из подходов для лечения некоторых раковых заболеваний (меланомы, лейкозов) используют лимфоциты с генетически модифицированным химерным рецептором (CAR) (С.Slaney, B.Scheidt, А. Davenport, P.Beavis, J.Westwood, S.Mardiana, D.Tscharke, S.Ellis, H. M. Prince, J.Trapani, R. Johnstone, M. Smyth, M.Teng, A. Ali, Z.Yu, S. Rosenberg, N. Restifo, P. Neeson, P. Darcy, M.Kershaw. Dual-specific Chimeric Antigen Receptor T Cells and an Indirect Vaccine Eradicate a Variety of Large Solid Tumors in an Immunocompetent, Self-antigen Setting. Clin Cancer Res; 23(10) May 15, 2017; Kershaw MH, Westwood JA, Darcy PK. Gene-engineered T cells for cancertherapy. Nat Rev Cancer 2013; 13:525-41.).As one of the approaches for the treatment of certain cancers (melanoma, leukemia), lymphocytes with a genetically modified chimeric receptor (CAR) are used (C. Slaney, B. Scheidt, A. Davenport, P. Beavis, J. Westwood, S. Mardiana, D.Tscharke, S. Ellis, HM Prince, J.Trapani, R. Johnstone, M. Smyth, M.Teng, A. Ali, Z. Yu, S. Rosenberg, N. Restifo, P. Neeson, P. Darcy , M. Kershaw. Dual-specific Chimeric Antigen Receptor T Cells and an Indirect Vaccine Eradicate a Variety of Large Solid Tumors in an Immunocompetent, Self-antigen Setting. Clin Cancer Res; 23 (10) May 15, 2017; Kershaw MH, Westwood JA, Darcy PK. Gene-engineered T cells for cancertherapy. Nat Rev Cancer 2013; 13: 525-41.).

Недостаток данного подхода: CAR - это полностью искусственный рецептор, сочетающий элементы Т- и В-клеточных рецепторов. Для изготовления химерного рецептора приходится использовать фрагменты нескольких различных молекул и результирующий белок часто становится иммуногенным [Maus MV, Haas AR, Beatty GL, Albelda SM, Levine BL, Liu X, Zhao Y, Kalos M, June CH. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol Res. 2013 Jul; 1(1):26-31. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0006].The disadvantage of this approach: CAR is a completely artificial receptor that combines the elements of T and B cell receptors. Fragments of several different molecules have to be used to make a chimeric receptor, and the resulting protein often becomes immunogenic [Maus MV, Haas AR, Beatty GL, Albelda SM, Levine BL, Liu X, Zhao Y, Kalos M, June CH. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol Res. 2013 Jul; 1 (1): 26-31. doi: 10.1158 / 2326-6066.CIR-13-0006].

Известен подход, направленный на усиление иммунного ответа при помощи получения высокоаффинных ТКР путем отбора и мутагенеза цепей ТКР [Schendel D, Wilde S, Frankenberger В, Uckert W. High affinity T cell receptor and use thereof. Patent US 8697854 B2. Priority date 2008-11-24; Jakobsen BK, Harwood N, Liddy NR T cell receptors. Patent WO 2011001152 A1; Priority date 2009-07-03].A known approach aimed at enhancing the immune response by obtaining high-affinity TKR by selection and mutagenesis of TKR chains [Schendel D, Wilde S, Frankenberger B, Uckert W. High affinity T cell receptor and use thereof. Patent US 8697854 B2. Priority date 2008-11-24; Jakobsen BK, Harwood N, Liddy NR T cell receptors. Patent WO 2011001152 A1; Priority date 2009-07-03].

Отличие данного подхода от заявляемого состоит в использовании полной конфигурации ТКР, состоящей из α- и β-цепей.The difference between this approach and the claimed one consists in using the full configuration of TCR, consisting of α and β chains.

Еще один способ терапии опухолей трансгенными ТКР - ретровирусная трансдукция Т-лимфоцитов в культуре in vitro с их последующей активацией и получением лимфокинактивированных киллеров [Schendel DJ. Expression of transgenic t cell receptors in lak-t cells. Patent US 20110020308 Al. Priority date: 2006-12-12].Another method of treating tumors with transgenic TCR is retroviral transduction of T-lymphocytes in an in vitro culture with their subsequent activation and production of lymphokinactivated killers [Schendel DJ. Expression of transgenic t cell receptors in lak-t cells. Patent US 20110020308 Al. Priority date: 2006-12-12].

Отличие данного подхода от предлагаемого в использовании полной конфигурации ТКР, состоящей из α- и β-цепей.The difference between this approach and the one proposed in using the full TCR configuration, consisting of α and β chains.

Известен метод усиления иммунного ответа на раковые опухоли и патогены, где описаны модифицированные Т-лимфоциты, одновременно экспрессирующие ТКР или химерный антигенный рецептор и антитело (Патент WO 2017147383A1 (2017-08-31)).A known method of enhancing the immune response to cancerous tumors and pathogens, which describes modified T-lymphocytes simultaneously expressing TCR or a chimeric antigenic receptor and antibody (Patent WO 2017147383A1 (2017-08-31)).

Недостатком данного метода в необходимости экспрессии трансгенной β-цепи ТКР и процедуры Т-клеточного клонирования для идентификации α- и β-цепей таких ТКР.The disadvantage of this method is the need for the expression of the transgenic TCR β-chain and the T-cell cloning procedure to identify the α and β chains of such TCR.

Предлагается метод усиления иммунного ответа путем модификации различных ТКР, приводящей к увеличению уровня их экспрессии на поверхности Т-лимфоцита (Патент WO 2016170320 A1 (2016-10-27)).A method is proposed for enhancing the immune response by modifying various TCRs, leading to an increase in their expression on the surface of a T-lymphocyte (Patent WO 2016170320 A1 (2016-10-27)).

Недостатком данного метода является необходимость присутствия в генетической конструкции ТКР β-цепи и необходимость процедуры Т-клеточного клонирования для идентификации α- и β-цепей таких ТКР.The disadvantage of this method is the need for the presence of a β-chain in the TKR genetic construct and the need for T-cell cloning to identify α and β-chains of such TKR.

Задачей заявляемого изобретения является: разработка нового способа создания противоопухолевой иммунологической защиты с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов в системе in vitro и in vivo.The objective of the invention is: the development of a new method of creating antitumor immunological protection using transgenesis of T-lymphocytes in vitro and in vivo.

Задача решается получением Т-лимфоцитов с экспрессией α-цепи ТКР. Трансдукцию Т-лимфоцитов мыши проводили ретровирусными частицами, содержащими ген α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1, GenBank: DQ983579.1) с последующим адоптивным переносом модифицированных клеток мышам -реципиентам с целью оценки функциональной активности трансдуцированных клеток in vitro и in vivo.The problem is solved by obtaining T-lymphocytes with expression of the TCR α-chain. Mouse T-lymphocytes were transduced with retroviral particles containing the TKR 1D1 α-chain gene (SEQ ID NO 1, GenBank: DQ983579.1), followed by adaptive transfer of the modified cells to the recipient mice in order to evaluate the functional activity of the transduced cells in vitro and in vivo.

Технический результат изобретения: разработан способ создания противоопухолевой иммунологической защиты с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов.The technical result of the invention: a method for creating anti-tumor immunological protection using transgenesis of T-lymphocytes.

Изобретение иллюстрируется фиг. 1, табл. 1-3 и перечнем использованных последовательностей.The invention is illustrated in FIG. 1, tab. 1-3 and a list of sequences used.

На фиг. 1 представлена оценка уровня трансдукции клеток вирусом Migr1-PGK-1-GFP методом проточной цитофлуориметрии. А- нетрансдуцированные клетки (контроль); Б- Т-клетки, трансдуцированные вирусом.In FIG. Figure 1 presents an assessment of the level of cell transduction by Migr1-PGK-1-GFP virus by flow cytometry. A- non-transduced cells (control); B-T cells transduced by the virus.

На табл. 1 представлена оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vitro. Соотношение киллер-мишень 10:1.On the table. 1 presents an assessment of the functional activity of transduced T-lymphocytes in the in vitro system. The killer-target ratio is 10: 1.

Figure 00000001
Figure 00000001

На табл. 2 представлена оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vivo. Абсолютное количество клеток лимфомы EL-4 на 6 день после адоптивного переноса Т-лимфоцитов. Соотношение киллер-мишень 10:1.On the table. 2 presents an assessment of the functional activity of transduced T-lymphocytes in the in vivo system. The absolute number of EL-4 lymphoma cells on day 6 after adoptive transfer of T-lymphocytes. The killer-target ratio is 10: 1.

Figure 00000002
Figure 00000002

На табл. 3 представлена оценка защитной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vivo. Анализ клеток EL-4 в перитонеальной полости мышей B10.D2(R101) с адоптивно перенесенными трансдуцированными Т-лимфоцитами за 7, 14 и 28 дней до введения клеток опухоли. Соотношение киллер-мишень 10:1.On the table. 3 presents an assessment of the protective activity of transduced T-lymphocytes in an in vivo system. Analysis of EL-4 cells in the peritoneal cavity of B10.D2 mice (R101) with adoptively transferred transduced T-lymphocytes 7, 14 and 28 days before the introduction of tumor cells. The killer-target ratio is 10: 1.

Figure 00000003
Figure 00000003

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

1. Создание генетических конструкций.1. Creation of genetic constructs.

В работе для сборки частиц ретровируса использовали два ДНК-вектора с генетическими конструкциями. Для получения первого ДНК-вектора коммерческую генетическую конструкцию MigR1 (Addgene, США), содержащую ген зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP), модифицировали путем удаления из нее последовательности гена GFP и введения промотора PGK и гена α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1). Созданный вектор получил название MigR1-PGK-1D1a. Так как к цепи 1D1a не существует коммерческих антител, то для оценки уровня трансдукции была создана вторая генетическая конструкция, которая была получена также на основе MigR1 (Addgene, США) путем вставки промотора PGK в область сайта для множественного клонирования этой плазмиды. Полученный таким образом вектор MigR1-PGK-GFP, содержащий ген GFP, использовали в дальнейшей работе для контроля эффективности процедуры введения генетических конструкций в целевые клетки.Two DNA vectors with genetic constructs were used in the work to assemble particles of a retrovirus. To obtain the first DNA vector, the commercial MigR1 genetic construct (Addgene, USA) containing the green fluorescent protein (GFP) gene was modified by removing the GFP gene sequence from it and introducing the PGK promoter and TCR 1D1 α-chain gene (SEQ ID NO 1). The created vector is called MigR1-PGK-1D1a. Since there are no commercial antibodies to the 1D1a chain, a second genetic construct was created to evaluate the level of transduction, which was also obtained on the basis of MigR1 (Addgene, USA) by inserting the PGK promoter into the region of the site for multiple cloning of this plasmid. Thus obtained vector MigR1-PGK-GFP containing the GFP gene was used in further work to control the effectiveness of the procedure for introducing genetic constructs into target cells.

В качестве второго ДНК-вектора использовали коммерческую генетическую конструкцию pCL-Eco (Addgene, США). Данная плазмида содержит все гены белков, необходимых для сборки вирусной частицы с экотропной оболочкой (белок оболочки (env), полимераза (pol), ревертаза (rev), интеграза).The pCL-Eco commercial genetic construct (Addgene, USA) was used as the second DNA vector. This plasmid contains all the protein genes necessary for the assembly of a viral particle with an ecotropic membrane (membrane protein (env), polymerase (pol), revertase (rev), integrase).

2. Получение частиц ретровирусов.2. Obtaining particles of retroviruses.

2.1. Трансфекция клеток линии HEK293T и получение среды, содержащей вирусные частицы.2.1. Transfection of HEK293T cells and production of a medium containing viral particles.

2.1.1 Подготовка клеток HEK293T, пакующей вирусные частицы.2.1.1 Preparation of HEK293T cells packaging viral particles.

Клетки пакующей линии HEK293T выращивали в культуральном флаконе площадью 75 см2(Costar, США) в 12 мл стандартной ростовой среды DMEM (Панэко, Россия), содержащей с 4,5 г/л глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Панэко, Россия) до достижения конфлюэнтности 60-80%.HEK293T packaging line cells were grown in a 75 cm 2 culture vial (Costar, USA) in 12 ml of DMEM standard growth medium (Paneko, Russia) containing 4.5 g / l glucose and 10% fetal calf serum (Paneko, Russia) until confluence of 60-80% is reached.

2.1.2. Трансфекция HEK293T, получение вирус-содержащей среды.2.1.2. Transfection of HEK293T, obtaining a virus-containing medium.

В 1,5 мл стерильной воды смешивали плазмиды MigR1-PGK-1D1a, содержащую ген α-цепи ТКР 1D1(SEQ ID NO 1), и pCl-Есо в соотношении 1:1 по 20 мкг каждой плазмиды. К смеси добавляли 75 мкл 2М CaCl2 и перемешивали путем пипетирования. Затем по каплям при помешивании вносили 750 мкл двукратного HBS буфера (50 мМ HEPES, рН 7.05; 10 мМ KCl, 12 мМ декстроза, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HPO4). Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре и по каплям вносили в среду роста, содержащуюся в культуральных флаконах с клетками пакующей линии. Трансфекцию клеток HEK293T проводили в течение 24 часов, после чего удаляли модифицированную ростовую среду и заменяли на стандартную среду роста DMEM.MigR1-PGK-1D1a plasmids containing the TCR 1D1 α-chain gene (SEQ ID NO 1) and pCl-Eco in a 1: 1 ratio of 20 μg of each plasmid were mixed in 1.5 ml of sterile water. To the mixture was added 75 μl of 2M CaCl 2 and stirred by pipetting. Then, 750 μl of double HBS buffer (50 mM HEPES, pH 7.05; 10 mM KCl, 12 mM dextrose, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na 2 HPO 4 ) was added dropwise with stirring. The mixture was incubated for 5 min at room temperature and was added dropwise to the growth medium contained in culture bottles with cells of the packaging line. HEK293T cells were transfected for 24 hours, after which the modified growth medium was removed and replaced with standard DMEM growth medium.

Контроль эффективности трансфекции осуществляли при помощи белка GFP. Для этого параллельно при тех же условиях проводили трансфекцию клеток HEK293T плазмидами MigR1-PGK-GFP, содержащей ген GFP, и pCL-Eco. Наличие экспрессии белка GFP в клетках HEK293T оценивали при помощи флюоресцентного микроскопа (Nikon, Япония). Уровень трансфекции экстраполировали на клетки HEK293T с 1D1 геном (SEQ ID NO 1). Трансфекцию считают успешной, если не менее, чем у 60% клеток пакующей линии наблюдают флюоресценцию GFP. Сбор ростовой среды клеток HEK293T проводили через 48 и 72 часа после заражения клеток HEK293T плазмидами MigR1-PGK-1D1a и pCl-Есо. Полученную таким образом вирус-содержащую среду в свежем виде использовали для трансдукции Т-клеток мыши. Возможно замораживание вирус-содержащей среды при температуре -70°С. Допускается однократное размораживание.Transfection efficiency was monitored using GFP protein. For this, under the same conditions, HEK293T cells were transfected with the plasmids MigR1-PGK-GFP containing the GFP gene and pCL-Eco. The presence of GFP protein expression in HEK293T cells was evaluated using a fluorescence microscope (Nikon, Japan). The transfection level was extrapolated to HEK293T cells with the 1D1 gene (SEQ ID NO 1). Transfection is considered successful if GFP fluorescence is observed in at least 60% of the cells of the packaging line. The growth medium of HEK293T cells was collected 48 and 72 hours after infection of HEK293T cells with plasmids MigR1-PGK-1D1a and pCl-Eco. The freshly obtained virus-containing medium was used for transduction of mouse T cells. It is possible to freeze the virus-containing medium at a temperature of -70 ° C. Single defrosting is allowed.

3. Получение лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мыши.3. Obtaining lymphocytes from the spleen and lymph nodes of the mouse.

Мышей линии B10.D2(R101) умерщвляли путем цервикальной дислокации и извлекали селезенку и лимфоузлы (мезентериальный, 2 подмышечных и 2 паховых). Селезенку помещали в гомогенизатор Поттера с 3 мл питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия), содержащей 10 мкг/мл ципрофлоксацина (KRK, Словения). После гомогенизации селезенки суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали и проводили гипотонический лизис эритроцитов. Для этого к осадку спленоцитов добавляли 360 мкл стерильной дистиллированной воды, пробирку встряхивали в течение 10-20 сек и добавляли 40 мкл 10-кратного фосфатно-солевого буфера и 6-7 мл 1-кратного фосфатно-солевого буфера. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в 3 мл питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия), содержащей 10 мкг/мл ципрофлоксацина (KRK, Словения).B10.D2 (R101) mice were sacrificed by cervical dislocation and the spleen and lymph nodes (mesenteric, 2 axillary and 2 inguinal) were removed. The spleen was placed in a Potter homogenizer with 3 ml of RPMI-1640 growth medium (Paneko, Russia) containing 10 μg / ml of ciprofloxacin (KRK, Slovenia). After homogenization of the spleen, the cell suspension was transferred to a centrifuge tube and precipitated by centrifugation at 1500 rpm for 5 min at 4 ° C. The supernatant was removed, the cell pellet was resuspended, and hypotonic erythrocyte lysis was performed. For this, 360 μl of sterile distilled water was added to the splenocyte pellet, the tube was shaken for 10-20 seconds, and 40 μl of 10-fold phosphate-saline buffer and 6-7 ml of 1-fold phosphate-saline buffer were added. Then the cells were precipitated by centrifugation at 1500 rpm for 5 min at 4 ° C, the supernatant was removed, and the pellet was resuspended in 3 ml of RPMI-1640 growth medium (Paneko, Russia) containing 10 μg / ml ciprofloxacin (KRK, Slovenia).

Лимфатические узлы гомогенизировали описанным выше образом, осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали в 2 мл питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия) и вносили в суспензию спленоцитов. Полученную смесь клеток осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали в 3 мл полной среды (ПС) для культивирования лимфоцитов, состоящей из питательной среды RPMI 1640 (Панэко, Россия) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (Панэко, Россия), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Merck, США), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 20 мМ HEPES (Панэко, Россия) и 10 мкг/мл ципрофлоксацина (KRK, Словения). Количество спленоцитов в суспензии подсчитывали в камере Горяева в присутствии смеси красителей 1% трипанового синего и 1% эозина в соотношении 1:1 и доводили до концентрации 107кл/мл.Lymph nodes were homogenized as described above, precipitated by centrifugation at 1500 rpm for 5 min at 4 ° C. The supernatant was removed, the cell pellet was resuspended in 2 ml of RPMI-1640 growth medium (Paneko, Russia) and introduced into the splenocyte suspension. The resulting cell mixture was precipitated by centrifugation at 1500 rpm for 5 min at 4 ° C, the supernatant was removed and resuspended in 3 ml of complete medium (PS) for culturing lymphocytes consisting of RPMI 1640 growth medium (Paneko, Russia) with the addition of 10 % serum of cattle embryos (Paneko, Russia), 5 × 10 -5 M 2-mercaptoethanol (Merck, USA), 2 mM L-glutamine (Sigma, USA), 20 mM HEPES (Paneko, Russia) and 10 μg / ml of ciprofloxacin (KRK, Slovenia). The number of splenocytes in the suspension was calculated in a Goryaev chamber in the presence of a 1: 1 ratio of 1% trypan blue and 1% eosin dyes and adjusted to a concentration of 10 7 cells / ml.

3.1. Активация лимфоцитов мыши.3.1. Mouse lymphocyte activation.

Смесь клеток селезенки и лимфатических узлов мыши в количестве 5×107 клеток помещали в 5 мл ПС в культуральные флаконы с площадью роста 25 см2 (Costar, США). В среду дополнительно вносили митоген Т-лимфоцитов конканавалин А (КонА, Sigma, США) до конечной концентрации 3 мкг/мл и интерлейкин-2 (ИЛ-2) до конечной концентрации 10 МЕ/мл (Neto Е.Н., Coelho A.L., Sampaio A.L. и др. Activation of human T lymphocytes via integrin signaling induced by RGD-disintegrins. Biochim.Biophys. Acta.2007, 1773(2): 176-84). Лимфоциты культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 24 часов. Данный подход обеспечивал активацию и пролиферацию только Т-лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов мыши (Neveu P.J., Perdoux D. Polyclonal activation of guinea pig spleen lymphocytes- Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. 1985; 78(4):401-405).A mixture of spleen cells and mouse lymph nodes in an amount of 5 × 10 7 cells was placed in 5 ml of PS in culture bottles with a growth area of 25 cm 2 (Costar, USA). On Wednesday, concanavalin A mitogen T-lymphocytes (ConA, Sigma, USA) were additionally introduced to a final concentration of 3 μg / ml and interleukin-2 (IL-2) to a final concentration of 10 IU / ml (Neto E.N., Coelho AL, Sampaio AL et al. Activation of human T lymphocytes via integrin signaling induced by RGD-disintegrins. Biochim. Biophys. Acta.2007, 1773 (2): 176-84). Lymphocytes were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C, 5% CO 2 for 24 hours. This approach provided activation and proliferation of only spleen T-lymphocytes and mouse lymph nodes (Neveu PJ, Perdoux D. Polyclonal activation of guinea pig spleen lymphocytes - Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. 1985; 78 (4): 401-405 )

4. Трансдукция Т-лимфоцитов мыши вирусными частицами.4. Transduction of mouse T-lymphocytes by viral particles.

Трансдукцию активированных Т-лимфоцитов мыши вирусными частицами, содержащими ген α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1), проводили в два этапа.The transduction of activated mouse T-lymphocytes with viral particles containing the TCR 1D1 α-chain gene (SEQ ID NO 1) was carried out in two stages.

1) Через 24 часа после активации подсчитывали количество спленоцитов с помощью камеры Горяева и переносили в 6-луночный планшет (Costar, США) из расчета 12×106 клеток на лунку. Затем среду отбирали и добавляли вирус-содержащую среду роста клеток HEK293T из расчета 6 мл среды на одну лунку и 3 мл ПС. Конечный объем среды в каждой лунке составлял 9 мл. В лунки планшета также вносили КонА (3 мкг/мл), ИЛ-2 (10МЕ/мл) и полибрен до конечной концентрации 8 мкг/мл. Клетки центрифугировали (спинокулировали) при 2000 g в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем лимфоциты помещали в СО2-инкубатор.1) 24 hours after activation, the number of splenocytes was counted using a Goryaev camera and transferred to a 6-well plate (Costar, USA) at a rate of 12 × 10 6 cells per well. Then the medium was selected and the virus-containing HEK293T cell growth medium was added at the rate of 6 ml of medium per well and 3 ml of PS. The final volume of medium in each well was 9 ml. ConA (3 μg / ml), IL-2 (10 IU / ml) and polybrene to a final concentration of 8 μg / ml were also added to the plate wells. Cells were centrifuged (spinoculated) at 2000 g for 90 min at room temperature. Then the lymphocytes were placed in a CO 2 incubator.

2) По истечении 16-20 часов культивирования проводили еще одну смену среды роста спленоцитов на вирус содержащую среду и повторно выполняли трансдукцию спленоцитов при тех же параметрах спинокуляции. По окончании второй спинокуляции спленоциты культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 2 часов, после чего проводили замену вирус-содержащей среды на свежую ПС, содержащую ИЛ-2 и КонА в указанных выше концентрациях, и продолжали культивирование в течение 48 часов при тех же условиях.2) After 16-20 hours of cultivation, another change of the splenocyte growth medium to a virus containing medium was carried out and transduction of splenocytes was repeated with the same spinoculation parameters. At the end of the second spinoculation, splenocytes were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C, 5% CO 2 for 2 hours, after which the virus-containing medium was replaced with fresh PS containing IL-2 and ConA in the above concentrations, and continued cultivation for 48 hours under the same conditions.

5. Оценку уровня трансдукции Т- лимфоцитов проводили путем анализа методом проточной цитометрии (FacsCantoII, Beckton Dickenson, США) с использованием флуоресцентно меченных антител к молекуле CD3, которая является специфическим маркером Т- лимфоцитов. Уровень трансдукции определяли по экспрессии белка GFP.5. The level of transduction of T-lymphocytes was assessed by flow cytometry analysis (FacsCantoII, Beckton Dickenson, USA) using fluorescently labeled antibodies to the CD3 molecule, which is a specific marker of T-lymphocytes. The level of transduction was determined by expression of the GFP protein.

Анализ клеток на проточном цитофлуориметре. При анализе на проточном цитофлуориметре исключали слипшиеся клетки, а также мертвые клетки, окрашенные пропидий йодидом. Среди одиночных живых лимфоцитов определяли Т-лимфоциты по наличию маркера CD3, для которых оценивают уровень экспрессии белка GFP по флуоресценции в области спектра 520 нм.Analysis of cells on a flow cytometer. When analyzed on a flow cytometer, adherent cells were excluded, as well as dead cells stained with propidium iodide. Among single living lymphocytes, T-lymphocytes were determined by the presence of a CD3 marker, for which the level of expression of GFP protein by fluorescence in the spectral region of 520 nm was evaluated.

5.1. Обработка результатов цитофлюориметрического анализа.5.1. Processing the results of cytofluorimetric analysis.

Результаты анализа клеток на проточном цитофлуориметре обрабатывали при помощи программного обеспечения FlowJo (Beckton Dickenson, США). Функциональную эффективность трансдуцированных Т-лимфоцитов определяли при уровне трансдукции не менее 50% (Фиг.).The results of cell analysis on a flow cytometer were processed using FlowJo software (Beckton Dickenson, USA). The functional efficacy of transduced T-lymphocytes was determined with a transduction level of at least 50% (Fig.).

6. Оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vitro.6. Assessment of the functional activity of transduced T-lymphocytes in the in vitro system.

Т-лимфоциты, трансдуцированные геном α-цепи 1D1 (SEQ ID NO 1), в количестве 500×103 клеток помещали в культуру с клетками лимфомы EL-4 в соотношении трансдуцированные Т-лимфоциты: EL-4 = 10:1. Культивирование проводили в 96 луночных пластиковых планшетах (Costar, США) в ПС во влажной атмосфере в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 48 часов. В качестве контроля использовали активированные нетрансдуцированные клетки, а также Т-клетки, трансдуцированные GFP, в аналогичном соотношении.T-lymphocytes transduced with the 1D1 α-chain gene (SEQ ID NO 1), in an amount of 500 × 10 3 cells, were placed in a culture with EL-4 lymphoma cells in the ratio of transduced T-lymphocytes: EL-4 = 10: 1. Cultivation was carried out in 96 well plastic plates (Costar, USA) in PS in a humid atmosphere in a CO 2 incubator at 37 ° C, 5% CO 2 for 48 hours. As control, activated non-transduced cells were used, as well as T cells transduced with GFP, in a similar ratio.

По истечении времени инкубации методом проточной цитофлуориметрии проводили анализ относительного количества опухолевых клеток, которые определяли при помощи флюоресцентно меченых антител к маркеру Кb (Табл. 1).After the incubation time, flow cytofluorimetry analyzed the relative number of tumor cells, which were determined using fluorescently labeled antibodies to marker K b (Table 1).

Было показано, что Т-лимфоциты, трансдуцированные геном α-цепи 1D1a (SEQ ID NO 1), значительно быстрее устраняют опухолевые клетки лимфомы EL-4 in vitro по сравнению с нетрансдуцированными клетками (контроль). При этом данный эффект являлся специфичным, т.к. в культуре с Т- лимфоцитами, трансдуцированными GFP, обнаруженное количество EL-4 было сопоставимо с контролем (14.1% и 17.2%, соответственно, Табл. 1).It has been shown that T lymphocytes transduced with the 1D1a α-chain gene (SEQ ID NO 1) significantly eliminate tumor cells of EL-4 lymphoma in vitro compared to non-transduced cells (control). Moreover, this effect was specific, because in a culture with T lymphocytes transduced by GFP, the detected amount of EL-4 was comparable with the control (14.1% and 17.2%, respectively, Table 1).

7. Оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vivo.7. Assessment of the functional activity of transduced T-lymphocytes in the in vivo system.

7.1. Адоптивный перенос трансдуцированных Т-лимфоцитов. После оценки уровня трансдукции Т-лимфоциты, трансдуцированные ретровирусными частицами, содержащими ген α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1), вводили внутрибрюшинно мышам линии B10.D2(R101) из расчета 5,0×106 трансдуцированных клеток в 1 мл фосфатно-солевого буфера. В качестве контроля использовали нетрансдуцированные Т-лимфоциты, которые активировали и культивировали аналогично клеткам, подвергшимся трансдукции. Контрольные Т-лимфоциты вводили в количестве, равном количеству адоптивно перенесенных трансдуцированных Т- лимфоцитов.7.1. Adaptive transfer of transduced T-lymphocytes. After assessing the level of transduction, T-lymphocytes transduced with retroviral particles containing the TCR 1D1 α-chain gene (SEQ ID NO 1) were injected intraperitoneally to B10.D2 (R101) mice at a rate of 5.0 × 10 6 transduced cells in 1 ml phosphate salt buffer. Non-transduced T-lymphocytes were used as a control, which were activated and cultured similarly to transduced cells. Control T lymphocytes were administered in an amount equal to the number of adoptively transferred transduced T lymphocytes.

7.2. Приготовление лаважа брюшной полости.7.2. Preparation of lavage of the abdominal cavity.

Через 6 дней после введения клеток опухоли и адоптивного переноса Т-лимфоцитов, мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации и извлекали клетки из брюшной полости. Для этого в перитонеальную полость мышей вводили 2 мл охлажденной среды RPMI-1640 и отбирали жидкость. Полученную клеточную суспензию отмывали центрифугированием (200×g, 5 мин) и подсчитывали количество клеток при помощи камеры Горяева в присутствии смеси красителей трипанового синего и эозина. Часть клеток (1×106) использовали для анализа на проточном цитофлуориметре, окрашивая флюоресцентно меченными антителами к молекуле Кb, для определения опухолевых клеток EL-4. Статистическую обработку данных проводили по статистическому критерию для малых выборок Манна-Уитни.6 days after the introduction of tumor cells and adoptive transfer of T-lymphocytes, mice were euthanized by cervical dislocation and cells were removed from the abdominal cavity. For this, 2 ml of chilled RPMI-1640 medium was introduced into the peritoneal cavity of mice and a liquid was taken. The resulting cell suspension was washed by centrifugation (200 × g, 5 min) and the number of cells was counted using a Goryaev chamber in the presence of a mixture of trypan blue and eosin dyes. Part of the cells (1 × 10 6 ) was used for analysis on a flow cytometer, staining with fluorescently labeled antibodies to the K b molecule to determine EL-4 tumor cells. Statistical data processing was performed according to the statistical criterion for small Mann-Whitney samples.

При адоптивном переносе трансдуцированных лимфоцитов в соотношении киллер: мишень 10:1 было обнаружено в 25 раз меньшее количество опухолевых клеток в лаваже мышей - реципиентов на 6 день после иммунизации EL-4 по сравнению с животными, которым вводили нетрансдуцированные лимфоциты (Табл. 2).Adoptive transfer of transduced lymphocytes in the killer: target ratio of 10: 1 showed 25 times less tumor cells in the lavage of recipient mice on day 6 after immunization with EL-4 compared with animals that were injected with non-transduced lymphocytes (Table 2).

8. Определение продолжительности сохранения состояния иммунологической памяти у животных с перенесенными трансгенными Т-лимфоцитами.8. Determination of the duration of maintaining the state of immunological memory in animals with transgenic T-lymphocytes transferred.

Для оценки защитного потенциала трансдуцированных Т-лимфоцитов проводили адоптивный перенос трансдуцированных или нетрансдуцированных (контрольных) Т-лимфоцитов в количестве 5,0×106 клеток/мышь. Через 7, 14 или 28 дней мышей иммунизировали клетками лимфомы EL-4 в дозе 5,0×105 клеток/мышь. Таким образом, соотношение введенных Т-клеток и клеток EL-4 составило 10:1. Группы были составлены из 5 животных.To assess the protective potential of transduced T-lymphocytes, adaptive transfer of transduced or non-transduced (control) T-lymphocytes was performed in an amount of 5.0 × 10 6 cells / mouse. After 7, 14, or 28 days, mice were immunized with EL-4 lymphoma cells at a dose of 5.0 × 10 5 cells / mouse. Thus, the ratio of introduced T cells to EL-4 cells was 10: 1. Groups were made up of 5 animals.

Защитный эффект трансдуцированных Т-лимфоцитов проявлялся следующим образом: введение лимфоцитов за 7 и 14 дней до иммунизации EL-4 способствовало полному либо ускоренному отторжению клеток опухоли к 6 дню и не проявлялся в случае адоптивного переноса за 28 дней до иммунизации (Табл. 3). Аналогичный защитный эффект наблюдали при соотношении киллер: мишень = 20:1.The protective effect of transduced T-lymphocytes was manifested as follows: the introduction of lymphocytes 7 and 14 days before immunization with EL-4 contributed to complete or accelerated rejection of tumor cells by day 6 and did not appear in the case of adoptive transfer 28 days before immunization (Table 3). A similar protective effect was observed at a ratio of killer: target = 20: 1.

Таким образом, при внутрибрюшинном адоптивном переносе трансдуцированных Т-лимфоцитов в соотношении 10:1 или 20:1 к клеткам лимфомы EL-4 формируется иммунологическая защита мышей дикого типа B10.D2 (R101) сроком на 14 дней.Thus, with the intraperitoneal adoptive transfer of transduced T-lymphocytes in a ratio of 10: 1 or 20: 1 to EL-4 lymphoma cells, immunological protection of wild-type B10.D2 (R101) mice is formed for a period of 14 days.

Claims (1)

Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты организма к клеткам лимфомы EL-4 при помощи трансдукции Т-лимфоцитов ретровирусными частицами, содержащими ген ТКР, представленный последовательностью SEQ ID NO:1, характеризующийся тем, что трансгенез Т-лимфоцитов мыши in vitro проводится путем введения гена только α-цепи ТКР, специфичного к клеткам опухоли, а затем производится адоптивный перенос животным Т-лимфоцитов, модифицированных ретровирусными частицами, содержащими ген ТКР, представленный последовательностью SEQ ID NO:1, с последующей функциональной оценкой активности Т-лимфоцитов in vivo.A method of creating an antitumor immunological defense of an organism to EL-4 lymphoma cells by transduction of T-lymphocytes with retroviral particles containing the TCR gene represented by the sequence SEQ ID NO: 1, characterized in that transgenesis of mouse T-lymphocytes in vitro is carried out by introducing only the α gene -chain TKR-specific to tumor cells, and then adoptive transfer of T-lymphocytes modified by retroviral particles containing the TKR gene represented by the sequence SEQ ID NO: 1, followed by guide functional assessment of T-lymphocytes in vivo.
RU2018144103A 2018-12-13 2018-12-13 Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells RU2708558C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018144103A RU2708558C1 (en) 2018-12-13 2018-12-13 Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018144103A RU2708558C1 (en) 2018-12-13 2018-12-13 Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2708558C1 true RU2708558C1 (en) 2019-12-09

Family

ID=68836445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018144103A RU2708558C1 (en) 2018-12-13 2018-12-13 Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2708558C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
RU2478396C2 (en) * 2008-11-05 2013-04-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи MULTI-COMPONENT IMMUNOGENIC COMPOSITION FOR PREVENTING DOSEASE, CAUSED BY β-HEMOLYTIC STREPTOCCOCI (BHS)
RU2630656C2 (en) * 2011-09-12 2017-09-11 Джензим Корпорейшн ANTIBODIES AGAINST αβTCR

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2478396C2 (en) * 2008-11-05 2013-04-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи MULTI-COMPONENT IMMUNOGENIC COMPOSITION FOR PREVENTING DOSEASE, CAUSED BY β-HEMOLYTIC STREPTOCCOCI (BHS)
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
RU2630656C2 (en) * 2011-09-12 2017-09-11 Джензим Корпорейшн ANTIBODIES AGAINST αβTCR

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЗВЕЗДОВА Е.С. и др., КОРЕЦЕПТОРНАЯ ФУНКЦИЯ CD4 В ОТВЕТЕ НА МОЛЕКУЛУ MHC КЛАССА I, Молекулярная биология, том 42, N.4, с.662-672. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2670147C1 (en) Car expression vector and car-expressing t cells
US10577407B2 (en) Use of ICOS-based CARS to enhance antitumor activity and CAR persistence
RU2770812C2 (en) Immunocompetent cell and expression vector expressing regulatory factors of immune function
WO2017184553A1 (en) Cancer gene therapy targeting cd47
US20100316603A1 (en) Combination Immunogene Therapy
CN109776671B (en) Isolated T cell receptor, modified cell thereof, encoding nucleic acid, expression vector, preparation method, pharmaceutical composition and application
CN110857319B (en) Isolated T cell receptor, modified cell, encoding nucleic acid and application thereof
US9080152B2 (en) Methods for proliferation of antigen-specific T cells
CN105802909B (en) T cell preparation with HER2 specific TCR and uses thereof
Yang et al. Adoptive cellular therapy (ACT) for cancer treatment
CN113396215A (en) Chimeric Antigen Receptor (CAR) -expressing Myeloid Infiltrating Lymphocytes (MILs), methods of making the same, and methods of use in therapy
CN113896801A (en) Chimeric antigen receptor cell targeting human Claudin18.2 and NKG2DL, and preparation method and application thereof
CN108456247A (en) Target the T cell receptor and application thereof of NY-ESO-1
RU2708558C1 (en) Method for producing anti-tumor immunological protection to el-4 lymphoma cells
WO2023088437A1 (en) Recombinant armed oncolytic virus composition and use thereof in til adoptive therapy
US11718827B2 (en) LRFFT2 cell
KR20240026905A (en) Single vessel expansion of lymphocytes
CN114907485A (en) Chimeric antigen receptor with endogenous protein molecule replacing single domain antibody
US20210071142A1 (en) Species of mrfft1 cell
RU2706554C1 (en) Method for creating anti-infectious immunological protection against salmonella typhimurium and listeria monocytogenes using transgenesis of t-lymphocytes
KR20220031541A (en) Preparation of anti-BCMA CAR T cells
CN111286512A (en) Chimeric antigen receptor targeting humanized tyrosine kinase orphan receptor 1 and uses thereof
US11958892B2 (en) Use of ICOS-based cars to enhance antitumor activity and car persistence
AU2018283319B2 (en) Materials and methods for increasing immune responses
Immisch Exploring potential human cancer neoantigens as targets for adoptive T cell therapy

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210125

Effective date: 20210125