RU2707640C1 - Bacterial strain escherichia coli as a control test strain for phenotypic and molecular studies of escherichia o144 serum group - Google Patents
Bacterial strain escherichia coli as a control test strain for phenotypic and molecular studies of escherichia o144 serum group Download PDFInfo
- Publication number
- RU2707640C1 RU2707640C1 RU2019101944A RU2019101944A RU2707640C1 RU 2707640 C1 RU2707640 C1 RU 2707640C1 RU 2019101944 A RU2019101944 A RU 2019101944A RU 2019101944 A RU2019101944 A RU 2019101944A RU 2707640 C1 RU2707640 C1 RU 2707640C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- escherichia coli
- escherichia
- phenotypic
- coli
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу биохимическая и серологическая идентификация штаммов Escherichia coli, вирулентность и патогенность микроорганизмов.The invention relates to microbiology (bacteriology), and in particular to the section of biochemical and serological identification of Escherichia coli strains, virulence and pathogenicity of microorganisms.
Согласно, МУ 04-723/3 по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями, штаммы Е. coli O144 являются возбудителями острых кишечных инфекций (ОКИ), относятся к группе энтероинвазивных Е. coli (EIEC), вызывающих дизентериеподобные заболевания. Эта патогруппа эшерихий характеризуется способностью к эпителиальной инвазии, которая подтверждается тестом Шереня, т.е. по способности вызывать кератоконъюктивит у морских свинок.According to MU 04-723 / 3 on the microbiological diagnosis of diseases caused by enterobacteria, E. coli O144 strains are causative agents of acute intestinal infections (OKI), belong to the group of enteroinvasive E. coli (EIEC) causing dysentery-like diseases. This pathogroup of Escherichia is characterized by the ability to epithelial invasion, which is confirmed by the Sheren test, i.e. by the ability to cause keratoconjunctivitis in guinea pigs.
По литературным данным известно, что популяция штаммов Е. coli O144 неоднородна по значительному числу свойств: среди них встречаются неподвижные (HNM) и подвижные варианты с Н антигенами 4, 18 и 25), аэрогенные и анаэрогенные, замедленно ферментирующие и не ферментирующие рамнозу, сорбит и дульцит. Штаммы с антигеном Н4 не вызывают кератоконъюнктивит у морских свинок - проба Шереня отрицательная, в отличие от штаммов с антигенами HNM, H18 и Н25. В 1975 году Киселевой Б.С. была предложена схема разделения эшерихий этой серогруппы на биовары по ферментативным свойствам с учетом серотиповой принадлежности и результатов пробы Шереня. В нашей стране, по настоящее время, схема биотипирования в клинико-диагностических лабораториях используется только с учетом ферментативных свойств штаммов.According to literature data, it is known that the population of strains of E. coli O144 is heterogeneous in a significant number of properties: among them there are motionless (HNM) and motile variants with H antigens 4, 18 and 25), aerogenic and anaerogenic, slow-fermenting and non-fermenting ramnose, sorbitol and dulcite. Strains with the H4 antigen do not cause keratoconjunctivitis in guinea pigs - the Sheren test is negative, in contrast to strains with the HNM, H18 and H25 antigens. In 1975, Kiseleva B.S. a scheme was proposed for the separation of the Escherichia of this serogroup into biovars according to enzymatic properties, taking into account the serotypic affiliation and the results of the Shereni test. In our country, to date, the biotyping scheme in clinical diagnostic laboratories is used only taking into account the enzymatic properties of the strains.
Важнейшим критерием дифференциации патогенных разновидностей эшерихий от непатогенных служат антигенные свойства их поверхностных структур (О-, К-, Н-антигены), а также наличие или отсутствие генов, кодирующих факторы патогенности и вирулентности. На территории РФ штаммы Escherichia coli O144:Н45, характеризующиеся сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами, отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичные для Shigella spp. и энтероинвазивных E.coli (EIEC): плазмидные (ipaH) и хромосомные (ial) гены инвазивности другими авторами ранее не изучены и не депонированы.The most important criterion for the differentiation of pathogenic varieties of Escherichia from non-pathogenic are the antigenic properties of their surface structures (O-, K-, H-antigens), as well as the presence or absence of genes encoding pathogenicity and virulence factors. In the Russian Federation, strains of Escherichia coli O144: H45, characterized by serovar-specific morphological and enzymatic properties, the absence of genes encoding pathogenicity factors specific for Shigella spp. and enteroinvasive E. coli (EIEC): plasmid (ipaH) and chromosomal (ial) invasive genes by other authors have not been previously studied or deposited.
Эпидемиологической особенностью современных эшерихиозов, вызванных Е. coli O144, является широкое распространение их среди здоровых лиц, обследованных с профилактической целью.The epidemiological feature of modern Escherichiosis caused by E. coli O144 is their widespread distribution among healthy individuals examined for prophylactic purposes.
Отсутствие к настоящему времени контрольных штаммов для фенотипических и молекулярных методов идентификации непатогенных вариантов Escherichia coli, принадлежащих к серологической группе O144, широко распространенных среди здорового населения, обусловило необходимость депонирования контрольного штамма Escherichia coli O144:Н45 В8656.Currently, the absence of control strains for phenotypic and molecular methods for identifying non-pathogenic variants of Escherichia coli, belonging to the serological group O144, which are widespread among a healthy population, necessitated the deposit of the control strain Escherichia coli O144: H45 B8656.
Полная ферментативная характеристика, расшифровка антигенной формулы, детекция генов и факторов патогенности и вирулентности является необходимым условием правильности эпидемиологических заключений, от которых зависит эффективность профилактической и противоэпидемической работы. Предложенный штамм Escherichia coli O144:Н45 В8656, характеризующийся наличием генов rfb144, fliC45, определяющих серотиповую принадлежность, сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами и отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичные для Shigella spp. и энтероинвазивных E.coli (EIEC): плазмидные (ipaH) и хромосомные (ial) гены инвазивности может быть использован в качестве контрольного тест-штамма.Complete enzymatic characterization, decoding of the antigenic formula, detection of genes and factors of pathogenicity and virulence is a necessary condition for the correctness of the epidemiological conclusions on which the effectiveness of preventive and anti-epidemic work depends. The proposed strain of Escherichia coli O144: H45 B8656, characterized by the presence of rfb 144 , fliC 45 genes that determine serotype affiliation, serovarspecific morphological and enzymatic properties and the absence of genes encoding pathogenicity factors specific for Shigella spp. and enteroinvasive E. coli (EIEC): plasmid (ipaH) and chromosomal (ial) invasive genes can be used as a control test strain.
Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является штамм Escherichia coli O144:Н4, описанный Киселевой Б.С. в 1975 году [Киселева Б.С., Скибенко Л.В., Гедзе Г.И. и др., Характеристика эшерихий серологической группы O144:К?, выделенных при острых кишечных заболеваниях. // Ж. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 1975; 5:49-52.], который не обладает инвазивными свойствами, как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения.The closest in essence to the claimed invention is a strain of Escherichia coli O144: H4, described Kiseleva B.S. in 1975 [Kiseleva B.S., Skibenko L.V., Gedze G.I. et al., Characterization of the Escherichia serologic group O144: K?, isolated in acute intestinal diseases. // J. Microbiology of epidemiology and immunobiology. 1975; 5: 49-52.], Which does not have invasive properties, like the strain proposed as an invention.
Изобретение направлено на разработку контрольного тест-штамма Escherichia coli O144:Н45 В8656, необходимого для качественного проведения бактериологических и молекулярно-генетических исследований, необходимых для подтверждения этиологической значимости штаммов, предъявляемых СП 3.1.1.3108-13 «Профилактика острых кишечных инфекций».The invention is directed to the development of a control test strain of Escherichia coli O144: H45 B8656, necessary for high-quality bacteriological and molecular genetic studies necessary to confirm the etiological significance of the strains presented by SP 3.1.1.3108-13 "Prevention of acute intestinal infections."
Авторами получен контрольный штамм, для бактериологической и молекулярно-генетической идентификации непатогенного варианта Escherichia coli, принадлежащего к серологической группе O144, использование которого поможет минимизировать ошибки при этиологической расшифровке острых кишечных инфекций, а также позволит получить достоверные результаты необходимые для рациональной терапии пациентов, проведения целенаправленных профилактических и противоэпидемических мероприятий.The authors obtained a control strain for bacteriological and molecular genetic identification of a non-pathogenic variant of Escherichia coli belonging to the serological group O144, the use of which will help minimize errors in the etiological decoding of acute intestinal infections, and will also provide reliable results necessary for the rational treatment of patients, targeted preventive and anti-epidemic measures.
Однако, данный штамм характеризуется наличием Н45, сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами, а также отсутствием генов патогенности. Предлагаемый в качестве изобретения штамм Escherichia coli O144:Н45 В8656 помогает расширить аналитические и диагностические возможности лабораторий, использующих для диагностики не только классические бактериологические, но и современные генетические методы исследования.However, this strain is characterized by the presence of H45, serovarspecific morphological and enzymatic properties, as well as the absence of pathogenicity genes. The strain of Escherichia coli O144: H45 B8656 proposed as an invention helps to expand the analytical and diagnostic capabilities of laboratories that use not only classical bacteriological, but also modern genetic research methods for diagnosis.
Заявляемый штамм выделен от взрослого жителя Санкт-Петербурга без признаков острой кишечной инфекции, обследованного с профилактической целью. Идентифицирован до вида Escherichia coli серогруппы O144 бактериологическим и серологическим методами. Полная антигенная характеристика штамма Escherichia coli O144:Н45 установлена при анализе данных полногеномного секвенировании на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeqReagentKit v2 и Nextera XT (Illumina, США) при помощи веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org). Маркеры вирулентности выявляли в ПЦР со специфическими праймерами к хромосомным (ial) и плазмидным (ipaH) генам патогенности, кодирующим способность к инвазии. Штамм не вызывал гнойно-язвенного воспаления роговицы и конъюнктивы у морской свинки после введения бактерий в дозе 109 КОЕ в конъюнктивальную полость, что свидетельствовало об отсутствии способности к инвазии и отрицательной пробе Шереня.The inventive strain isolated from an adult resident of St. Petersburg without signs of acute intestinal infection, examined for preventive purposes. Identified to the species Escherichia coli serogroup O144 by bacteriological and serological methods. The complete antigenic characterization of the strain Escherichia coli O144: H45 was established by analyzing the data of genome sequencing on a MiSeq instrument using the MiSeqReagentKit v2 and Nextera XT reagent kits (Illumina, USA) using the SerotypeFinder web database (http://www.genomicepidemiology.org). Virulence markers were detected in PCR with specific primers for chromosomal (ial) and plasmid (ipaH) pathogenicity genes encoding invasive ability. The strain did not cause purulent-ulcerative inflammation of the cornea and conjunctiva in the guinea pig after the introduction of bacteria at a dose of 10 9 CFU into the conjunctival cavity, which indicated a lack of invasion ability and a negative Sheren test.
Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8656.The strain is deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM-Obolensk" under the number B-8656.
Характеристика штамма Escherichia coli O144:Н45 В-8656.Characterization of the strain Escherichia coli O144: H45 B-8656.
Морфологические признаки: грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образуют спор, капсулу и пигмент, неподвижные.Morphological signs: gram-negative rods with rounded ends, do not form spores, capsule and pigment, motionless.
Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, IV группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.Pathogenic properties: pathogenic strain for humans, group IV pathogenicity according to SP 1.2.036-95 and SP 1.3.2322-08.
Культуральные свойства: факультативный анаэроб, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, не прихотлив к питательным средам. Температурный оптимум 37°С при рН 7,2…7,4. На жидких средах дает обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легко разбивающийся. Пристеночное кольцо и пленку на поверхности среды не образует. На плотных питательных средах (МПА, Эндо, Плоскирева, Левина) колонии круглые выпуклые, средней величины влажные с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем, цвета, соответствующего окраске среды.Cultural properties: facultative anaerobic, catalase-positive, oxide-negative, not whimsical to nutrient media. The temperature optimum is 37 ° C at a pH of 7.2 ... 7.4. On liquid media it gives abundant growth with significant turbidity of the medium; the sediment is small, grayish in color, easily broken. The parietal ring and the film on the surface of the medium does not form. On dense nutrient media (MPA, Endo, Ploskirev, Levin), the colonies are round convex, medium-sized wet with a smooth shiny surface and even edge, color corresponding to the color of the medium.
Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм имеет О - антиген 144, К - антиген, Н - антиген 45. Полная антигенная формула Escherichia coli O144:К:Н45.Antigenic characteristics: according to the results of a serological study, the strain has O - antigen 144, K - antigen, H - antigen 45. The complete antigenic formula of Escherichia coli O144: K: H45.
Основные свойства штамма:The main properties of the strain:
- характеризуется сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами (неподвижный, ферментирует до молочной кислоты без газа глюкозу и сорбит, замедленно ферментирует лактозу, не утилизирует дульцит и салицин, не декарбоксилирует лизин;- It is characterized by serovarspecific morphological and enzymatic properties (immovable, ferments glucose and sorbitol to lactic acid without gas, fermented lactose, does not utilize dulcite and salicin, does not decarboxylate lysine;
- наличие Н-антигена 45;- the presence of H-antigen 45;
- не вызывает гнойно-язвенное воспаления роговицы и конъюнктивы у морской свинки- проба Шереня отрицательная;- does not cause purulent-ulcerative inflammation of the cornea and conjunctiva in guinea pigs - Sheren test is negative;
- не имеет плазмидные (ipaH) и хромосомные (ial) гены инвазивности.- does not have plasmid (ipaH) and chromosomal (ial) invasive genes.
- не является возбудителем острой кишечной инфекции- is not a causative agent of acute intestinal infection
Изобретение реализуется следующим образом.The invention is implemented as follows.
Пример 1. Определение сероварспецифичных морфологических и ферментативных свойств бактериологическим методом штаммов Escherichia coli O144:Н45.Example 1. Determination of serovar-specific morphological and enzymatic properties by the bacteriological method of strains of Escherichia coli O144: H45.
Морфологические и ферментативные свойства изучали согласно МУ 04-723/3 Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями. При определении подвижности посев производили уколом петли по центру столбика 0,3-0,4% полужидкого агара, не доходя до дна пробирки. Штамм характеризовался ростом строго по уколу без помутнения среды (подвижные штаммы растут диффузно, вызывая помутнение среды, слабоподвижные штаммы вызывают помутнение отдельных участков агара вблизи укола). Для определения ферментации глюкозы и сорбита использовали полужидкие среды Гисса, посев производили уколом петли в центр столбика. Учет результатов проводили по изменению цвета среды, в зависимости от индикатора, после инкубации через 18-20 часов при температуре 37°С. Штамм характеризовался способностью к ферментации глюкозы и сорбита до молочной кислоты без газа. Для определения замедленной ферментации лактозы использовали жидкую среду Гисса. Окончательный учет результатов проводили на 10 сутки после инкубации при температуре 37°С с ежедневным просмотром посевов. Штамм характеризовался замедленной ферментацией лактозы на 6 сутки (лактозоположительные штаммы ферментируют лактозу с изменением цвета среды в течение 16-18 часов, лактозоотрицательные штаммы не изменяют цвет среды до 10 суток при инкубации при температуре 37°С. Для определения утилизационной способности дульцита и салицина использовали жидкие питательные среды. Штамм характеризовался отсутствием изменения цвета среды после инкубации 18-20 часов при температуре 37°С. При определении декарбоксилазы лизина параллельно с посевом в среду с аминокислотой производили посев в контрольную пробирку, содержащую основу без аминокислоты. После посева во все пробирки, вносили стерильное вазелиновое масло слоем 4-5 мм. Учет результатов проводили по изменению цвета среды после инкубации 18-20 часов при температуре 37°С.Morphological and enzymatic properties were studied according to MU 04-723 / 3 Guidelines for the microbiological diagnosis of diseases caused by enterobacteria. When determining the mobility, sowing was performed by pricking a loop in the center of a column of 0.3-0.4% semi-liquid agar, not reaching the bottom of the tube. The strain was characterized by strict injection growth without turbidity (mobile strains grow diffusely, causing turbidity of the medium, weakly mobile strains cause clouding of individual agar sites near the injection). Semi-liquid Hiss media were used to determine the fermentation of glucose and sorbitol; inoculation was performed by pricking the loop in the center of the column. The results were taken into account by changing the color of the medium, depending on the indicator, after incubation after 18-20 hours at a temperature of 37 ° C. The strain was characterized by the ability to ferment glucose and sorbitol to lactic acid without gas. To determine the delayed fermentation of lactose, Guissa liquid medium was used. The final analysis of the results was carried out on the 10th day after incubation at a temperature of 37 ° C with daily viewing of crops. The strain was characterized by delayed lactose fermentation on day 6 (lactose-positive strains ferment lactose with a color change of the medium for 16-18 hours, lactose-negative strains do not change the color of the medium until 10 days when incubated at 37 ° C. To determine the utilization capacity of dulcite and salicin used liquid nutrient medium. The strain was characterized by the absence of color change of the medium after incubation for 18-20 hours at a temperature of 37 ° C. When determining lysine decarboxylase in parallel with plating in medium with am the inoculum was inoculated into a control tube containing a base without amino acids, after inoculation into all tubes, sterile paraffin oil was added with a layer of 4-5 mm, the results were taken into account by changing the color of the medium after incubation for 18-20 hours at a temperature of 37 ° C.
Стабильность морфологических и ферментативных свойств штамма Escherichia coli O144:Н45 проверялась путем трехкратного повторения с питательными средами различных производителей: ФБУН ГНЦ ПМБ (Россия), НИЦФ (Россия), Oxoid (Великобритания), BioRad (США), установлено, что штамм давал стабильные результаты на питательных средах всех производителей.The stability of the morphological and enzymatic properties of the strain Escherichia coli O144: H45 was tested by repeating three times with nutrient media of various manufacturers: FBUN SSC PMB (Russia), Research Center (Russia), Oxoid (Great Britain), BioRad (USA), it was found that the strain gave stable results on nutrient media of all manufacturers.
Пример 2. Определение антигена Н45 фенотипическим методом в реакции агглютинации на стекле.Example 2. Determination of H45 antigen by phenotypic method in an agglutination reaction on glass.
Идентификацию жгутикового (Н45) антигена штамма Escherichia coli O144 В8656 проводили согласно МУ 3214-85 Методические указания по серотипированию бактерий Escherichia coli по жгутиковому (Н) антигену упрощенным, ускоренным способом.Identification of the flagellar (H45) antigen of the strain Escherichia coli O144 B8656 was carried out according to MU 3214-85 Guidelines for serotyping Escherichia coli bacteria using the flagellum (H) antigen in a simplified, expedited manner.
Штамм O144:Н45 по морфологическим признакам неподвижный. Для повышения флагеллированности (Н-агглютинабельности) проводили многократное последовательное пассирование через полужидкий агар в V-образных пробирках Крейджи с добавлением глицерина и глюкозы. Исследуемый штамм при первом пассаже в пробирку Крейджизасевали глубоким уколом петли до дна пробирки. Повторные пассажи делали на глубину 10 мм. Восстановление подвижности (помутнение всей среды, в т.ч. снаружи от внутренней трубки в пробирке Крейджи) удалось в результате 8 пассажей. Подвижные клетки пересевали на скошенный агар с глицерином, инкубировали при 30°С в течение 24 часов. Выросший газон смывали изотоническим раствором, содержащим 0,5% формалина. Подготовленную бактериальную взвесь исследовали в реакции агглютинации на стекле моновалентной Н- сывороткой 45 Statens serum institute, Дания. При смешивании равных объемов сыворотки и бактериальной взвеси (0,05 мл) в течение 1 минуты наблюдалось формирование хорошо различимого агглютината.Strain O144: H45 is morphologically motionless. To increase flagellation (H-agglutinability), multiple sequential passages were carried out through semi-liquid agar in Craigie V-shaped tubes with the addition of glycerol and glucose. The test strain at the first passage into the Krejiziz tube was seeded with a deep prick of a loop to the bottom of the tube. Repeated passages were made to a depth of 10 mm. The restoration of mobility (turbidity of the whole medium, including outside the inner tube in the Craigie tube) was achieved as a result of 8 passages. Mobile cells were subcultured on mowed agar with glycerol, incubated at 30 ° C for 24 hours. The grown lawn was washed off with an isotonic solution containing 0.5% formalin. The prepared bacterial suspension was investigated in a glass agglutination reaction with monovalent H serum 45 Statens serum institute, Denmark. When mixing equal volumes of serum and bacterial suspension (0.05 ml) for 1 minute, the formation of clearly distinguishable agglutinate was observed.
Стабильность полученных результатов определения антигена Н45 штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 проверялась путем трехкратного восстановления подвижности. Установлено, что штамм давал стабильные результаты независимо от кратности последовательного пассирования через полужидкий агар.The stability of the results of determination of the H45 antigen of the Escherichia coli strain O144: K: H45 B8656 was checked by triple restoration of mobility. It was found that the strain gave stable results regardless of the multiplicity of sequential passage through semi-liquid agar.
Пример 3. Определение антигена Н45 молекулярным методом.Example 3. Determination of H45 antigen by the molecular method.
Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 проводили с использованием набора QIAampDNAMiniKit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5×ТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле. Количество ДНК (длина волны 260 нм) титровали с помощью спектрофотометра QIAxpert. Подготовку геномных библиотек для полногеномногосеквенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Для установления серотиповой принадлежности штаммов, полученные нуклеотидные последовательности были анализированы с использованием веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org).DNA isolation from the studied strain of Escherichia coli O144: K: H45 B8656 was performed using the QIAampDNAMiniKit kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. The quality of the obtained DNA was evaluated by electrophoresis in 0.5 × TBE buffer in a 1.5% agarose gel. The amount of DNA (wavelength 260 nm) was titrated using a QIAxpert spectrophotometer. The preparation of genomic libraries for genome-wide sequencing was carried out by reverse-synthesis synthesis of Illumina, (USA), according to the manufacturer's instructions. Genome sequencing was performed using a Miseq sequencer (USA). The quality of the reads was evaluated using the FastQC program. To establish the serotype affiliation of the strains, the obtained nucleotide sequences were analyzed using the SerotypeFinder web base (http://www.genomicepidemiology.org).
Стабильность наличия гена fliC45, кодирующего продукцию антигена Н45 в геноме Escherichia coli O144:Н45 В8656 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности.The stability of the presence of the fliC 45 gene encoding the production of H45 antigen in the genome of Escherichia coli O144: H45 B8656 was confirmed by repeated sequencing of the DNA strain and analysis of the nucleotide sequence.
Пример 4. Определение вирулентности штаммов Escherichia coli O144 на экспериментальных животных.Example 4. Determination of virulence of strains of Escherichia coli O144 in experimental animals.
Для определения пенетрационной (инвазивной) способности штаммов Escherichia coli O144 и Shigella sp.и спользовали экспериментальную модель предложенную Sereny, 1956.To determine the penetration (invasive) ability of the strains of Escherichia coli O144 and Shigella sp. And used the experimental model proposed by Sereny, 1956.
Суточную агаровую культуру бактерий платиновой петлей диаметром 5 мм вводили под нижнее веко правого глаза морской свинки массой тела 200 г. Левый глаз не заражали, использовали как отрицательный внутренний контроль. В качестве положительного контроля использовали штамм Shigella flexneri 2а и Escherichia coli O144:К:Н25. Все свинки находились изолированно друг от друга. Через 2-4 суток оценивали выраженность кератоконъюнктивита по наличию помутнения роговицы, нагноения и изъязвления. Правая роговица и конъюнктива морских свинок, зараженных Escherichia coli O144:К:Н45 В8656, на протяжении всего периода наблюдения (7 дней), оставались без изменений, так же как и левая роговица и конъюнктива. Правая роговица морских свинок, зараженных Shigella flexneri 2а, на первые сутки помутнела, появились признаки гнойного конъюнктивита. На вторые сутки наблюдалось выраженное гнойно-язвенное воспаление роговицы и конъюнктивы. Левый глаз, на протяжении всего периода наблюдения оставался без патологических изменений. Правая роговица морских свинок, зараженных Escherichia coli O144:К:Н25, на первые сутки помутнела, появилось обильное слезотечение без признаков гнойного конъюнктивита. На вторые сутки наблюдалось выраженное гнойное воспаление конъюнктивы. Левый глаз, на протяжении всего периода наблюдения оставался без патологических изменений.The daily agar culture of bacteria with a platinum loop with a diameter of 5 mm was introduced under the lower eyelid of the right eye of a guinea pig with a body weight of 200 g. The left eye was not infected, it was used as a negative internal control. Shigella flexneri 2a and Escherichia coli O144: K: H25 strain were used as a positive control. All pigs were isolated from each other. After 2-4 days, the severity of keratoconjunctivitis was assessed by the presence of clouding of the cornea, suppuration and ulceration. The right cornea and conjunctiva of guinea pigs infected with Escherichia coli O144: K: H45 B8656, remained unchanged throughout the observation period (7 days), as did the left cornea and conjunctiva. The right cornea of guinea pigs infected with Shigella flexneri 2a became cloudy on the first day, signs of purulent conjunctivitis appeared. On the second day, there was a pronounced purulent-ulcerative inflammation of the cornea and conjunctiva. The left eye, during the entire observation period, remained without pathological changes. The right cornea of guinea pigs infected with Escherichia coli O144: K: H25 became cloudy on the first day, profuse lacrimation appeared without signs of purulent conjunctivitis. On the second day, severe suppurative inflammation of the conjunctiva was observed. The left eye, during the entire observation period, remained without pathological changes.
Стабильность отсутствия инвазивной способности в экспериментальной модели (отрицательная проба Шереня) штамма Escherichia coli O144:К:Н45 проверялась путем повторного заражения морских свинок. Установлено, что штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 может использоваться как отрицательный контрольный тест-штамм при проведении данной экспериментальной модели.The stability of the absence of invasive ability in the experimental model (negative Sherenin test) of the strain Escherichia coli O144: K: H45 was tested by re-infection of guinea pigs. It was found that the strain Escherichia coli O144: K: H45 B8656 can be used as a negative control test strain in this experimental model.
Пример 5. Детекция генов, вирулентности методом ПЦР с электрофоретической подвижностью.Example 5. Detection of genes, virulence by PCR with electrophoretic mobility.
Маркеры вирулентности выявляли в ПЦР со специфическими праймерами к хромосомным (ial) и плазмидным (ipaH) генам патогенности, кодирующим способность к инвазии. Выделение ДНК из исследуемых штаммов Escherichia coli O144:К:Н25, Shigellaflexneri 2а и контрольного тест-штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 проводили с использованием наборов «InstaGeneMatrix» (BioRad, США), «АмплиПраймРИБО-преп» (НексБио, Россия) согласно инструкциям производителей и методом кипячения. Хромосомные (ial) и плазмидные (ipaH) гены патогенности амплифицировали с помощью специфических праймеров PR1/PR2 и IpaH14a/IpaH14b, синтезируемые ЗАО «Евроген», (Россия). В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 10 мкл Taq MasterMix («ThermoFisher», США), по 1 мкл каждого праймера, 9 мкл Н2О и 2 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С - 15 мин; затем 35 циклов: 95°С - 15 сек, 55°С - 20 сек; финальная инкубация - 37°С - 3 мин. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярного веса использовали GeneRuler 100 bp DNALadder «Fermentas», (Литва). Исследуемые штаммы Escherichia coli O144:К:Н25 и Shigella flexneri 2а имели плазмидные и хромосомные гены инвазивности, контрольный тест-штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 характеризовался отсутствием генов инвазивности.Virulence markers were detected in PCR with specific primers for chromosomal (ial) and plasmid (ipaH) pathogenicity genes encoding invasive ability. DNA was isolated from the studied strains of Escherichia coli O144: K: H25, Shigellaflexneri 2a and the control test strain Escherichia coli O144: K: H45 B8656 was performed using InstaGeneMatrix kits (BioRad, USA), AmpliPrimRIBO prep (Russia, Nex ) according to manufacturers instructions and by boiling method. Chromosomal (ial) and plasmid (ipaH) pathogenicity genes were amplified using specific primers PR1 / PR2 and IpaH14a / IpaH14b, synthesized by ZAO Evrogen, (Russia). The composition of 25 μl of the PCR mixture included 10 μl of Taq MasterMix (ThermoFisher, USA), 1 μl of each primer, 9 μl of H 2 O and 2 μl of bacterial DNA. Amplification was carried out on a CFX-96 instrument (BioRad, USA) according to the protocol: initial denaturation of 95 ° С - 15 min; then 35 cycles: 95 ° С - 15 sec, 55 ° С - 20 sec; final incubation - 37 ° C - 3 min. Amplification products were analyzed by electrophoretic separation in a horizontal 2% agarose gel stained with ethidium bromide. GeneRuler 100 bp DNALadder “Fermentas” (Lithuania) was used as molecular weight markers. The studied strains of Escherichia coli O144: K: H25 and Shigella flexneri 2a had plasmid and chromosomal invasive genes, the control test strain Escherichia coli O144: K: H45 B8656 was characterized by the absence of invasive genes.
Стабильность отсутствия хромосомных (ial) и плазмидных (ipaH) генов патогенности, кодирующих способность к инвазии у контрольного тест-штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 подтверждалась повторным проведением исследования Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 с использованием набора реагентов для выявления и дифференциации ДНК диареегенных E.coli методом РВ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» (Россия).The stability of the absence of chromosomal (ial) and plasmid (ipaH) pathogenicity genes encoding the ability to invasion in the control test strain Escherichia coli O144: K: H45 B8656 was confirmed by repeated studies of Escherichia coli O144: K: H45 B8656 using a reagent kit to identify and differentiation of DNA of diarrheagenic E. coli by PB-PCR with hybridization-fluorescence detection "AmpliSens® Escherichiosis-FL" (Russia).
Установлено, что штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 давал стабильные результаты независимо от способа выделения ДНК, состава реакционной смеси и метода ПЦР.It was found that the strain Escherichia coli O144: K: H45 B8656 gave stable results regardless of the method of DNA isolation, the composition of the reaction mixture and PCR method.
Для обеспечения достоверной лабораторной диагностики эшерихиозов необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования. Предлагаемый штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать бактериологические (определение морфологичеких, ферментативных, серологических и вирулентных свойств штамма) и молекулярные исследования (определение генов, кодирующих серотиповую принадлежность и патогенность штамма).To ensure reliable laboratory diagnosis of Escherichiosis, it is necessary to conduct quality control at each stage of the study. The proposed strain of Escherichia coli O144: K: H45 B8656 has stable properties that allow you to control bacteriological (determination of morphological, enzymatic, serological and virulent properties of the strain) and molecular studies (determination of genes encoding the serotype and pathogenicity of the strain).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019101944A RU2707640C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Bacterial strain escherichia coli as a control test strain for phenotypic and molecular studies of escherichia o144 serum group |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019101944A RU2707640C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Bacterial strain escherichia coli as a control test strain for phenotypic and molecular studies of escherichia o144 serum group |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2707640C1 true RU2707640C1 (en) | 2019-11-28 |
Family
ID=68836266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019101944A RU2707640C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Bacterial strain escherichia coli as a control test strain for phenotypic and molecular studies of escherichia o144 serum group |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2707640C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756980C1 (en) * | 2020-10-15 | 2021-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Strain of escherichia coli serovar o26:h11 bacteria, producer of a shiga-like toxin, deposited in the state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "scpm-obolensk" under number b-8034 |
| RU2810320C1 (en) * | 2023-09-14 | 2023-12-26 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Diaregenic bacteria strain enteraggregative escherichia coli serovar ont:h30, deposited in state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures gkpm-obolensk under number b-8857 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1158582A1 (en) * | 1983-11-23 | 1985-05-30 | Алма-Атинский Государственный медицинский институт | Escheria coli 37 strain used as standard for checking antigen in intestinal bacteria |
| US5298392A (en) * | 1990-01-19 | 1994-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor |
-
2019
- 2019-01-24 RU RU2019101944A patent/RU2707640C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1158582A1 (en) * | 1983-11-23 | 1985-05-30 | Алма-Атинский Государственный медицинский институт | Escheria coli 37 strain used as standard for checking antigen in intestinal bacteria |
| US5298392A (en) * | 1990-01-19 | 1994-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| МАКАРОВА М.А. "Биологические свойства Escherichia coli серологических групп О1, О144 и О157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций" // Авто к.м.н., 2007, Санкт-Петербург, с.8,12,13,17. * |
| МАКАРОВА М.А. "Биологические свойства Escherichia coli серологических групп О1, О144 и О157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций" // Автореферат к.м.н., 2007, Санкт-Петербург, с.8,12,13,17. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756980C1 (en) * | 2020-10-15 | 2021-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Strain of escherichia coli serovar o26:h11 bacteria, producer of a shiga-like toxin, deposited in the state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "scpm-obolensk" under number b-8034 |
| RU2810320C1 (en) * | 2023-09-14 | 2023-12-26 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Diaregenic bacteria strain enteraggregative escherichia coli serovar ont:h30, deposited in state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures gkpm-obolensk under number b-8857 |
| RU2824562C1 (en) * | 2024-02-08 | 2024-08-12 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Bacterial strain escherichia coli serovar o164:h-, deposited in state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "gkpm-obolensk" under number b-11809 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Duremdez et al. | Isolation of Streptococcus agalactiae from cultured silver pomfret, Pampus argenteus (Euphrasen), in Kuwait. | |
| Lupindu | Isolation and characterization of Escherichia coli from animals, humans, and environment | |
| RU2385941C1 (en) | METHOD OF DETECTION BACTERIA Yersinia AND DIFFERENTIATION OF YERSINIA PATHOGENIC FOR HUMAN BY MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION | |
| CN112029696B (en) | Edwardsiella piscicola derived from turbot and application thereof | |
| CN110129280A (en) | Wide fragmentation pattern vibrio alginolyticus bacteriophage and combinations thereof, kit and application | |
| Stanton | The genus brachyspira | |
| RU2707640C1 (en) | Bacterial strain escherichia coli as a control test strain for phenotypic and molecular studies of escherichia o144 serum group | |
| CN112961805B (en) | Salmonella typhimurium with quinolone drug resistance genes gyrA and parE mutated simultaneously and application thereof | |
| Bhunia et al. | Alkaline phosphatase release assay to determine cytotoxicity for Listeria species | |
| Gomez‐Gil et al. | Isolation, enumeration, and preservation of the Vibrionaceae | |
| Varga et al. | Phenotypic and genotypic characterisation of Pasteurella multocida strains isolated from pigs in Hungary | |
| Lämmler et al. | Properties of serological group B streptococci of dog, cat and monkey origin | |
| RU2810320C1 (en) | Diaregenic bacteria strain enteraggregative escherichia coli serovar ont:h30, deposited in state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures gkpm-obolensk under number b-8857 | |
| RU2756980C1 (en) | Strain of escherichia coli serovar o26:h11 bacteria, producer of a shiga-like toxin, deposited in the state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "scpm-obolensk" under number b-8034 | |
| RU2824562C1 (en) | Bacterial strain escherichia coli serovar o164:h-, deposited in state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "gkpm-obolensk" under number b-11809 | |
| RU2787399C1 (en) | Method for identifying the pathogen of intestinal yersiniosis by the yersinia enterocolitica 2021 bacteriophage (fc-115) | |
| US20040229227A1 (en) | Oligonucleotide primers having SEQ ID NOs. 1 to 21 and a process for detection of parasite Salmonella using oligonucleotide primers | |
| RU2460802C1 (en) | Method for identifying yersinia enterocolitica | |
| Jaimes et al. | Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by nested-PCR of ovine fecal samples | |
| RU2085584C1 (en) | Method of preparing recombinant tularemia microorganisms - producers of virulence factors, recombinant strain of francisella tularensis subspecies, holarctica r5s - producer of virulence factor francisella tularensis nearctica shu, recombinant strain of francisella tularensis holarctica rn4 - a producer of virulence factor pseudomonas tularensis subspecies holarctica r1a - a producer of virulence factor francisella tularensis nearctica b 399 a cole | |
| RU2817419C1 (en) | Method of lactobacillus fermentum biofilm formation, recovered from periodontal pockets, on inert surfaces | |
| RU2347806C2 (en) | Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum bacteria strain for making diagnostic and preventive preparations against animal necrobacteriosis | |
| RU2268942C1 (en) | METHOD FOR INTRASPECIES DIFFERENTIATION OF Vibrio cholerae O139 | |
| Zakeri et al. | Differential diagnosis between ts-11 vaccine strain and field Mycoplasma gallisepticum isolates in clinical samples by PCR-RFLP. | |
| El-Naggar et al. | Molecular diagnosis of gram negative bacteria in urinary tract infections |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210125 |