RU2707536C1 - Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor - Google Patents

Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor Download PDF

Info

Publication number
RU2707536C1
RU2707536C1 RU2018132086A RU2018132086A RU2707536C1 RU 2707536 C1 RU2707536 C1 RU 2707536C1 RU 2018132086 A RU2018132086 A RU 2018132086A RU 2018132086 A RU2018132086 A RU 2018132086A RU 2707536 C1 RU2707536 C1 RU 2707536C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
diclofenac
strain
diclofenac sodium
rhodococcus
iegm
Prior art date
Application number
RU2018132086A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ирина Борисовна Ившина
Елена Александровна Тюмина
Елена Владимировна Вихарева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" (ПГНИУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН), Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" (ПГНИУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН)
Priority to RU2018132086A priority Critical patent/RU2707536C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2707536C1 publication Critical patent/RU2707536C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Strain of Rhodococcus ruber IEGM 346 capable of completely destructing diclofenac sodium is deposited in the National Bioresource Center – Russian National Collection of Industrial Microorganisms (NBC VKPM) of FGBU State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" under registration number VKPM As-2106.
EFFECT: invention enables to reduce content of diclofenac sodium in waste waters of pharmaceutical enterprises.
1 cl, 2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности биодеструкции органических соединений с помощью микроорганизмов.The invention relates to the field of microbiology and biotechnology, in particular biodegradation of organic compounds using microorganisms.

В настоящее время остро стоит проблема фармацевтического загрязнения окружающей среды: в водных объектах 71 страны мира обнаружено более 600 химических веществ, относящихся к фармацевтическим препаратам. Чаще всего и в сравнительно значительных концентрациях (от нескольких сотен нанограмм до десятков-сотен микрограмм на литр) - это тотально применяемые антибиотики, анальгетики инестероидные противовоспалительные средства (НПВС), гормоны, спазмолитики, антидепрессанты, терапевтические средства для лечения рака, а также статины и противодиабетические препараты, все чаще потребляемые в связи с распространением малоподвижного образа жизни людей, обусловленного урбанизацией [Fatta-Kassinos D., Meric S., Nikolaou A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. V. 399. P. 251-275; aus der Beek Т., Weber F.A., Bergmann A., Hickmann S., Ebert I., Hein A.,

Figure 00000001
A. Pharmaceuticals in the environment - Global occurrences and perspectives // Environmental Toxicology and Chemistry. 2016. V. 35. P. 823-835].Currently, there is an acute problem of pharmaceutical environmental pollution: more than 600 chemicals related to pharmaceuticals have been found in water bodies in 71 countries of the world. Most often, and in relatively significant concentrations (from a few hundred nanograms to tens to hundreds of micrograms per liter), these are totally used antibiotics, analgesics and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), hormones, antispasmodics, antidepressants, therapeutic agents for treating cancer, as well as statins and antidiabetic drugs increasingly consumed due to the spread of sedentary lifestyle caused by urbanization [Fatta-Kassinos D., Meric S., Nikolaou A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. V. 399. P. 251-275; aus der Beek T., Weber FA, Bergmann A., Hickmann S., Ebert I., Hein A.,
Figure 00000001
A. Pharmaceuticals in the environment - Global occurrences and perspectives // Environmental Toxicology and Chemistry. 2016. V. 35. P. 823-835].

В связи с этим интерес представляет углубленное изучение степени биодоступности и токсического воздействия фармполлютантов на природные микроорганизмы, играющие роль системы первичного реагирования для включения специфических функций по утилизации поступающих ксенобиотиков, а также особенностей начальных этапов их разложения и кометаболизма.In this regard, it is of interest to study in depth the bioavailability and toxic effects of pharmaceutical pollutants on natural microorganisms, which play the role of the primary response system to include specific functions for the disposal of incoming xenobiotics, as well as the features of the initial stages of their decomposition and cometabolism.

Среди микроорганизмов, участвующих в процессах самоочищения природных экосистем, важная экологическая роль в биологической детоксикации и деконтаминации почв и воды принадлежит актинобактериям рода Rhodococcus - устойчивым обитателям загрязненных почв, водоемов, активных илов, сточных вод, обладающим высокой активностью оксидоредуктаз, богатыми адаптивными возможностями в отношении различных токсических соединений, а также высоким потенциалом для биоремедиации загрязненных объектов [Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko A.V. Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in eco-biotechnology and bioremediation // In: I.

Figure 00000002
(Ed.), Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press, Cambridge. 2017. pp. 121-148]. Актуальность использования метаболического потенциала родококков для биодеградации фармвеществ подтверждается все возрастающим числом их исследований [Yoshimoto Т., Nagai F., Fujimoto J., Watanabe K., Mizukoshi H., Makino Т., Kimura K., Saino H., Sawada H., Omura H. Degradation of estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolates from activated sludge in wastewater treatment plants // Applied and Environmental Microbiology. 2004. V. 70(9). P. 5283-5289; Gauthier H., Yargeau V., Cooper D.G. Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus niger by co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. V. 408. P. 1701-1706; Ivshina I.B., Vikhareva E.V., Richkova M.I., Mukhutdinova A.N., Karpenko Ju.N. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 //World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2012. V. 28(10). P. 2997-3006; Larcher S., Yargeau V. Biodegradation of 17-б-ethinilestradiol by heterotrophic bacteria // Environmental Pollution. 2013. V. 173. P. 17-22].Among the microorganisms involved in the processes of self-purification of natural ecosystems, an important ecological role in the biological detoxification and decontamination of soils and water belongs to actinobacteria of the genus Rhodococcus — resistant inhabitants of contaminated soils, reservoirs, activated sludge, wastewater with high activity of oxidoreductases, rich in adaptive capabilities for various toxic compounds, as well as high potential for bioremediation of contaminated objects [Ivshina IB, Kuyukina MS, Krivoruchko AV Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in eco- biotechnology and bioremediation // In: I.
Figure 00000002
(Ed.), Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press, Cambridge. 2017. pp. 121-148]. The relevance of using the metabolic potential of Rhodococcus for biodegradation of pharmaceutical substances is confirmed by an increasing number of their studies [Yoshimoto T., Nagai F., Fujimoto J., Watanabe K., Mizukoshi H., Makino T., Kimura K., Saino H., Sawada H. , Omura H. Degradation of estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolates from activated sludge in wastewater treatment plants // Applied and Environmental Microbiology. 2004.V. 70 (9). P. 5283-5289; Gauthier H., Yargeau V., Cooper DG Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus niger by co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. V. 408. P. 1701-1706; Ivshina IB, Vikhareva EV, Richkova MI, Mukhutdinova AN, Karpenko Ju.N. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2012.V. 28 (10). P. 2997-3006; Larcher S., Yargeau V. Biodegradation of 17-b-ethinilestradiol by heterotrophic bacteria // Environmental Pollution. 2013. V. 173. P. 17-22].

Одним из наиболее часто детектируемых в среде фармполлютантов является диклофенак (C14H11Cl2NO2; 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусная кислота; син. Вольтарен®, Ортофен®), широко доступный и часто применяемый в мировой медицинской практике и в ветеринарии полициклический НПВС из группы производных фенилуксусной кислоты, обладающий выраженным противовоспалительным действием, а также мощным анальгетическим, антипиретическим и противоопухолевым эффектом [Altman R., Bosch В., Brune K., Patrignani P., Young C. Advances in NSAID development: evolution of diclofenac products using pharmaceutical technology // Drugs. 2015. V. 75. P. 859-877].One of the most commonly detected among pharmaceutical pollutants is diclofenac (C 14 H 11 Cl 2 NO 2 ; 2- [2- (2 ', 6'-dichlorophenylamino) phenyl] acetic acid; synonym Voltaren®, Ortofen®), widely available and often used in world medical practice and in veterinary medicine, a polycyclic NSAID from the group of phenylacetic acid derivatives that has a pronounced anti-inflammatory effect, as well as a powerful analgesic, antipyretic and antitumor effect [Altman R., Bosch B., Brune K., Patrignani P., Young C. Advances in NSAID development: evolution of diclofenac products using pharmaceutical technology // Drugs. 2015. V. 75. P. 859-877].

Диапазон фактических концентраций диклофенака в грунтовых, поверхностных (в том числе морских), сточных водах и даже питьевых водах по всему миру варьирует от 0,02 нг/л до 20,00 мкг/л [Khan U., Nicell J. Human health relevance of pharmaceutically active compounds in drinking water // AAPS Journal. 2015. V. 17. P. 558-585; Sui G., Cao X., Lu S., Zhao W., Qiu Z, Yu G. Occurrence, sources and fate of pharmaceuticals and personal care product in the ground water: A review // Emerging Contaminants. 2015. V. 1. P. 14-24; Alygizakis N.A., Gago-Ferrero P., Borova V.L., Pavlidou A., Hatzianestis I., Thomaidis N.S. Occurrence and spatial distribution of 158 pharmaceuticals, drugs of abuse and related metabolites in offshore seawater // Science of the Total Environment. 2016. V. 54. P. 1097-1105; Rivera-Jaimes J.A., Postigo C.,

Figure 00000003
R.M.,
Figure 00000004
J.,
Figure 00000005
D.,
Figure 00000006
de Alda M. Study of pharmaceuticals in surface and wastewater from Cuernavaca, Morelos, Mexico: Occurrence and environmental risk assessment // Science of the Total Environment. 2018. V. 613-614. P. 1263-1274].The range of actual concentrations of diclofenac in groundwater, surface water (including sea water), wastewater, and even drinking water worldwide varies from 0.02 ng / L to 20.00 μg / L [Khan U., Nicell J. Human health relevance of pharmaceutically active compounds in drinking water // AAPS Journal. 2015. V. 17. P. 558-585; Sui G., Cao X., Lu S., Zhao W., Qiu Z, Yu G. Occurrence, sources and fate of pharmaceuticals and personal care product in the ground water: A review // Emerging Contaminants. 2015. V. 1. P. 14-24; Alygizakis NA, Gago-Ferrero P., Borova VL, Pavlidou A., Hatzianestis I., Thomaidis NS Occurrence and spatial distribution of 158 pharmaceuticals, drugs of abuse and related metabolites in offshore seawater // Science of the Total Environment. 2016. V. 54. P. 1097-1105; Rivera-Jaimes JA, Postigo C.,
Figure 00000003
RM
Figure 00000004
J.,
Figure 00000005
D.,
Figure 00000006
de Alda M. Study of pharmaceuticals in surface and wastewater from Cuernavaca, Morelos, Mexico: Occurrence and environmental risk assessment // Science of the Total Environment. 2018.V. 613-614. P. 1263-1274].

Наличие двух ароматических колец и двух атомов хлора в химической структуре диклофенака, термодинамическая стабильность бензольного кольца обусловливают высокую устойчивость этого ароматического хлорированного азотсодержащего соединения к биоразложению, токсичность, способность к персистированию и, следовательно, опасность для окружающей среды [

Figure 00000007
М., Zezulka
Figure 00000008
., Babula P.,
Figure 00000009
J. Possible ecological risk of two pharmaceuticals diclofenac and paracetamol demonstrated on a model plant Lemna minor // Journal of Hazardous Materials. 2015. V. 302. P. 351-361].The presence of two aromatic rings and two chlorine atoms in the chemical structure of diclofenac, the thermodynamic stability of the benzene ring determine the high biodegradability of this aromatic chlorinated nitrogen-containing compound, toxicity, persistence, and therefore environmental hazard [
Figure 00000007
M., Zezulka
Figure 00000008
., Babula P.,
Figure 00000009
J. Possible ecological risk of two pharmaceuticals diclofenac and paracetamol demonstrated on a model plant Lemna minor // Journal of Hazardous Materials. 2015. V. 302. P. 351-361].

Поскольку использование традиционных физико-химических методов и новых окислительных технологий утилизации фармацевтических загрязнителей экологически не безопасно и трудозатратно, остается потребность в инновационных технологиях, направленных на эффективную детоксикацию и выведение органических микрозагрязнителей из водных и сухопутных экосистем.Since the use of traditional physicochemical methods and new oxidative technologies for the disposal of pharmaceutical pollutants is environmentally unsafe and labor-intensive, there remains a need for innovative technologies aimed at the effective detoxification and removal of organic microcontaminants from aquatic and terrestrial ecosystems.

Приоритет по показателям эффективности, безопасности и экономичности признается за биотехнологическими способами конверсии этих экологических стрессоров. Однако работы по биоконверсии диклофенака пока немногочисленны и в основном проведены с использованием эукариотных организмов, в частности базидиомицетов (Bjerkandera, Trametes, Phanerohaete), зигомицетов (Cunninghamella) и энтомопатогенных (Beauveria). Малоизвестно о бактериальной деградации диклофенака, за исключением единичных работ биотрансформации диклофенака Грамположительными бактериями Actinoplanes и Brevibacterium, Грамотрицательными бактериями Labrys, а также микроорганизмами активного ила [Domaradzka D., Guzik U., Wojcieszyn'ska D. Biodergadation and biotransformation of polycyclic non-steroidal anti-inflammatory drugs // Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 2015. V. 14. P. 229-239; Moreira S., Bessa V.S., Murgolo S., Piccirillo C., Mascolo G., Castro P.M.L. Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2018. V. 152. P. 104-113]. Недостаточно информации о метаболических путях диклофенака натрия: описаны лишь первичные продукты биодеструкции фармвещества, конечные же продукты метаболизации диклофенака до сих пор остаются неизвестными. Однако характеристика метаболитов, образующиеся в процессе деградации диклофенака, и их свойств необходимы для эффективной работы систем очистки сточных вод и оценки экологической ситуации в окружающей среде.The priority in terms of efficiency, safety and efficiency is recognized for biotechnological methods of conversion of these environmental stressors. However, the work on the bioconversion of diclofenac is still scarce and mainly carried out using eukaryotic organisms, in particular, basidiomycetes (Bjerkandera, Trametes, Phanerohaete), zygomycetes (Cunninghamella) and entomopathogenic (Beauveria). Little is known about the bacterial degradation of diclofenac, with the exception of a few biotransformation studies of diclofenac by Gram-positive bacteria Actinoplanes and Brevibacterium, Gram-negative bacteria Labrys, as well as microorganisms of activated sludge [Domaradzka D., Guzik U. -inflammatory drugs // Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 2015. V. 14. P. 229-239; Moreira S., Bessa V.S., Murgolo S., Piccirillo C., Mascolo G., Castro P.M.L. Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2018. V. 152. P. 104-113]. There is not enough information about the metabolic pathways of diclofenac sodium: only the primary products of biodegradation of the pharmaceutical substance are described, but the final metabolic products of diclofenac are still unknown. However, the characteristics of the metabolites formed during the degradation of diclofenac and their properties are necessary for the effective operation of wastewater treatment systems and environmental assessment of the environment.

Таким образом, важной технической проблемой является поиск активного штамма-биодеструктора экофармполлютанта диклофенака натрия.Thus, an important technical problem is the search for an active strain of biodestructor of the ecofarmollutant diclofenac sodium.

Для решения этой проблемы были использованы биоресурсы Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов [акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, http://www.iegmcol.ru; реестровый номер УНУ www.ckp-rf.ru/usu/73559] и осуществлен поиск наиболее активных штаммов-биодеструкторов диклофенака натрия. Отобран штамм Rhodococcus rubber ИЭГМ 346, характеризующийся выраженной эмульгирующей и биодеструктивной способностью в отношении индивидуальных углеводородов и нефтепродуктов, устойчивостью к Cu2+, Мо6+, Pb2+ (5,0 мМ), а также стабильной активностью в условиях экстремальной кислотности (рН 2-6) и засоленности (2-6% NaCl) среды (http://www.iegmcol.ru/strains/rhodoc/ruber/r_ruber346.html).To solve this problem, we used the biological resources of the Regional profiled collection of alkanotrophic microorganisms [acronym of the IEGM collection, number in the World Federation of Culture Collection 768, http://www.iegmcol.ru; UNU registry number www.ckp-rf.ru/usu/73559] and a search was made for the most active sodium diclofenac biodestructor strains. A strain of Rhodococcus rubber IEGM 346 was selected, characterized by pronounced emulsifying and biodestructive ability against individual hydrocarbons and petroleum products, resistance to Cu 2+ , Mo 6+ , Pb 2+ (5.0 mM), as well as stable activity under extreme acidity (pH 2-6) and salinity (2-6% NaCl) of the medium (http://www.iegmcol.ru/strains/rhodoc/ruber/r_ruber346.html).

Технический результат описываемого изобретения заключается в эффективной биодеструкции штаммом R. ruber ИЭГМ 346 диклофенака натрия. Следует особо отметить, что в результате биоконверсии фармполлютанта данным штаммом происходит разрыв C-N связи и раскрытие хинонового цикла.The technical result of the described invention is effective biodegradation with a strain of R. ruber IEGM 346 diclofenac sodium. It should be specially noted that as a result of the bioconversion of the pharmaceutical pollutant with this strain, the C-N bond is broken and the quinone ring opens.

Штамм Rhodococcus rubber ИЭГМ 346 выделен в естественных условиях из бытовой сточной воды в г. Харбин, КНР. Штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) под номером ВКПМ АС-2106.The strain Rhodococcus rubber IEGM 346 isolated in vivo from domestic wastewater in Harbin, China. The strain is deposited at the National Bioresource Center - the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (NBC VKPM) under the VKPM number AC-2106.

Данный штамм характеризуется следующими признаками:This strain is characterized by the following features:

- Культурально-морфологические признаки: Грамположительные неподвижные плеоморфные одиночные клетки с закругленными концами размером 0,5-1,0×4,1-6,0 мкм, неспороносные, не образующие эндоспор. Клетки ветвятся, ветвление является рудиментарным (ограниченным Y-T-V или L-формами). Формируются первичные гифы, которые фрагментируются. В результате фрагментации образуются палочки. Конидий не образуют.- Cultural and morphological characteristics: Gram-positive motionless pleomorphic single cells with rounded ends 0.5-1.0 × 4.1-6.0 μm in size, non-spore-bearing, not forming endospores. Cells branch, branching is rudimentary (limited to Y-T-V or L-forms). Primary hyphae are formed that are fragmented. As a result of fragmentation, sticks are formed. Conidia do not form.

Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе смеси мясного экстракта и пептонов. На агаре образует колонии размером 2-3 мм (через неделю 4-5 мм). Колонии выпуклые, круглые с ровным краем, не прозрачные, маслянистой консистенции. Клетки содержат каротиноидные пигменты, образование которых стимулируется светом. Поверхность колонии гладкая и блестящая. Сплошной рост на агаре происходит через неделю, рост в жидкой среде в виде поверхностной пленки.The strain grows well in rich nutrient media based on a mixture of meat extract and peptones. On agar, it forms colonies 2-3 mm in size (4-5 mm in a week). The colonies are convex, round with a smooth edge, not transparent, oily consistency. Cells contain carotenoid pigments, the formation of which is stimulated by light. The surface of the colony is smooth and shiny. Continuous growth on agar occurs after a week, growth in a liquid medium in the form of a surface film.

Клетки характеризуются наличием включений крахмала, поли-3-бета-1-оксимасляной кислоты, полифосфата (волютина), гликогена, липидных глобул.Cells are characterized by the presence of inclusions of starch, poly-3-beta-1-hydroxybutyric acid, polyphosphate (volutin), glycogen, lipid globules.

- Физиолого-биохимические признаки: культура растет на синтетических минеральных средах в отсутствии витаминов (ростовых факторов) и органических соединений азота при условии обеспечения другими источниками углерода и энергии. В качестве единственного источника азота могут служить нитраты и соли аммония. Катаболизирует D-глюкозу, пируват, лактат, D-фруктозу, L-рамнозу, D-маннозу, мальтозу, сахарозу, D-маннит, D-сорбит. Использует 1-бутанол, 2-бутанол, 1-октанол, этанол; уксусную, капроновую, масляную, янтарную, DL-молочную, лимонную, пировиноградную, бензойную, мета-оксибензойную, пара-оксибензойную, гамма-аминомасляную и фумаровую кислоты. Использует в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как н-пропан (С3), н-бутан (С4), н-пентан (С5), н-нонан (С9), н-декан (С10), н-ундекан (С11), н-додекан (С12), н-тридекан (С13), н-тетрадекан (С14), н-пентодекан (С15), н-гексадекан (С16). Не катаболизирует L-арабинозу, D-ксилозу, D-галактозу, L-сорбозу, альфа-метил-D-глюкозид, целлобиозу, лактозу, раффинозу, крахмал, метанол, дульцит; муравьиную, пальмитиновую, альфа-кетоглутаровую, фталевую, терефталевую, изофталевую кислоты. Нитраты восстанавливает до нитритов, разлагает перекись водорода.- Physiological and biochemical characteristics: the culture grows on synthetic mineral media in the absence of vitamins (growth factors) and organic nitrogen compounds, provided that other sources of carbon and energy are provided. Nitrates and ammonium salts can serve as the sole source of nitrogen. It catabolizes D-glucose, pyruvate, lactate, D-fructose, L-rhamnose, D-mannose, maltose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol. Uses 1-butanol, 2-butanol, 1-octanol, ethanol; acetic, caproic, butyric, succinic, DL-lactic, citric, pyruvic, benzoic, meta-hydroxybenzoic, para-hydroxybenzoic, gamma-aminobutyric and fumaric acids. Uses hydrocarbons such as n-propane (C 3 ), n-butane (C 4 ), n-pentane (C 5 ), n-nonane (C 9 ), n-decane (C 10 ) as the sole carbon source n-undecane (C 11 ), n-dodecane (C 12 ), n-tridecane (C 13 ), n-tetradecane (C 14 ), n-pentodecane (C 15 ), n-hexadecane (C 16 ). Does not catabolize L-arabinose, D-xylose, D-galactose, L-sorbose, alpha-methyl-D-glucoside, cellobiose, lactose, raffinose, starch, methanol, dulcite; formic, palmitic, alpha-ketoglutaric, phthalic, terephthalic, isophthalic acids. Reduces nitrates to nitrites, decomposes hydrogen peroxide.

На стандартных лабораторных средах оптимум роста - при температуре 28°С, рН 6,8-7,0. Углеводородокисляющая активность (в минеральной среде Киевская (Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. - М.: Наука, 1994. - 163 с.) с добавлением 3 об. % н-гексадекана (C16), условия культивирования: 28°С, 160 об/мин, 5 сут).On standard laboratory media, the optimum growth is at a temperature of 28 ° C, pH 6.8-7.0. Hydrocarbon-oxidizing activity (in the Kievskaya mineral medium (Catalog of strains of the Regional profiled collection of alkanotrophic microorganisms / Ed. By I.B. Ivshina. - M .: Nauka, 1994. - 163 p.) With the addition of 3 vol.% N-hexadecane (C 16 ), cultivation conditions: 28 ° C, 160 rpm, 5 days).

Изобретение поясняется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Динамика биодеструкции диклофенака натрия клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 в присутствии глюкозы.Example 1. The dynamics of the biodegradation of diclofenac sodium by cells of Rhodococcus ruber IEGM 346 in the presence of glucose.

В работе использовали 104 штамма родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов [ИЭГМ, www.iegmcol.ru/strains/index.html]. Культуры принадлежали к десяти видам Rhodococcus: R. cercidiphylli (1 штамм), R. corynebacterioides (2 штамма), R. erythropolis (41 штамм), R. jostii (3 штамма), R. koreensis (1 штамм), R. pyridinivorans (2 штамма), R. qingshengii (4 штамма), R. rhodochrous (8 штаммов), R. ruber (41 штамм), R. wratislaviensis (1 штамм). Выбор штаммов обоснован географией и источником выделения, а также известной каталитической активностью родококков по отношению к сложным органическим соединениям.We used 104 strains of Rhodococcus from the Regional profiled collection of alkanotrophic microorganisms [IEGM, www.iegmcol.ru/strains/index.html]. The cultures belonged to ten species of Rhodococcus: R. cercidiphylli (1 strain), R. corynebacterioides (2 strains), R. erythropolis (41 strains), R. jostii (3 strains), R. koreensis (1 strain), R. pyridinivorans (2 strains), R. qingshengii (4 strains), R. rhodochrous (8 strains), R. ruber (41 strains), R. wratislaviensis (1 strain). The choice of strains is justified by the geography and source of isolation, as well as the known catalytic activity of rhodococci with respect to complex organic compounds.

Диклофенак натрия (C14H10Cl2NNaO2, CAS 15307-86-5, 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусная кислота в виде натриевой соли) использовали в виде фармацевтической субстанции (светло-бежевый кристаллический порошок без запаха, чистота - 99,0% в пересчете на сухое вещество, умеренно растворимый в воде, производство Kairav Chemicals Ltd, Индия).Diclofenac sodium (C 14 H 10 Cl 2 NNaO 2 , CAS 15307-86-5, 2- [2- (2 ', 6'-dichlorophenylamino) phenyl] acetic acid in the form of sodium salt) was used as a pharmaceutical substance (light odorless beige crystalline powder, purity 99.0% based on dry matter, sparingly soluble in water, manufactured by Kairav Chemicals Ltd, India).

Химические реагенты, в том числе ацетонитрил, метанол, хлороформ, этанол имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или о.с.ч. (Криохром, Россия; Merck, Германия; Sigma-Aldrich, США). Для получения ультрачистой воды для высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали Millipore Simplicity Personal Ultrapure Water System (Millipore, США).Chemical reagents, including acetonitrile, methanol, chloroform, ethanol had the qualification of chemically pure, analytical grade. or o.s.ch. (Cryochrom, Russia; Merck, Germany; Sigma-Aldrich, USA). To obtain ultrapure water for high performance liquid chromatography, the Millipore Simplicity Personal Ultrapure Water System (Millipore, USA) was used.

Минимальные подавляющие концентрации диклофенака в отношении культур родококков определяли методом серийных разведении. Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 отличался выраженной устойчивостью к диклофенаку (МПК ≥200 мг/л).Minimum inhibitory concentrations of diclofenac in relation to rhodococcal cultures were determined by serial dilution. The strain Rhodococcus ruber IEGM 346 was characterized by pronounced resistance to diclofenac (MIC ≥200 mg / l).

В экспериментах по биодеструкции диклофенака натрия применяли минеральную среду RS (г/л): K2HPO4 2,0; KH2PO4 2,0; KNO3 1,0; (NH4)2SO4 2,0; NaCl 1,0; MgSO4 × 7H2O 0,2; CaCl2 × 2H2O 0,02; FeCl3 × 7H2O 0,001 [http://www.iegmcol.ru/medium/med11.html]. При выборе исходной концентрации диклофенака учитывали большой объем его использования, интенсивность выброса в окружающую среду и персистентность в окружающей среде. При этом исходили из фактической концентрации диклофенака, детектируемого в водных и почвенных средах, а также из предположения о том, что большие дозы приносят негативные эффекты, но стимулируют защитные механизмы организма, тогда как малые дозы вызывают негативные эффекты, но не стимулируют защитные механизмы организма. Диклофенак использовали в концентрации 50 мг/л и 50 мкг/л в виде порошка или раствора в этаноле (1 мг/1 мл). До инокуляции исходное значение рН среды составляло 7,0. Клетки, предварительно выращенные в течение 2-х сут в бульоне LB (Sigma-Aldrich, США) и отмытые дважды фосфатным буфером (рН 7,0), вносили в среду культивирования до конечной концентрации 3,8×108 кл/мл. Для экспериментов по биодеструкции родококки предварительно выращивали в присутствии низкой (5 мкг/л) концентрации диклофенака. В качестве косубстрата использовали D-глюкозу (0,5%). Процесс биодеструкции вели при температуре 28°С. Во избежание фотоинициированного окисления диклофенака содержимое колб защищали от действия света с помощью светонепроницаемого материала. Ввиду большой (более 60 сут) продолжительности лабораторных экспериментов во времени полученные значения корректировали с учетом поправки на испарение воды с помощью уравнений [Gauthier Н., Yargeau V., Cooper D.G. Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus nigerby co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. V. 408. P. 1701-1706].In the experiments on biodegradation of sodium diclofenac, the RS mineral medium (g / l) was used: K 2 HPO 4 2.0; KH 2 PO 4 2.0; KNO 3 1.0; (NH 4 ) 2 SO 4 2.0; NaCl 1.0; MgSO 4 × 7H 2 O 0.2; CaCl 2 × 2H 2 O 0.02; FeCl 3 × 7H 2 O 0.001 [http://www.iegmcol.ru/medium/med11.html]. When choosing the initial concentration of diclofenac, the large volume of its use, the intensity of release into the environment, and persistence in the environment were taken into account. In this case, we proceeded from the actual concentration of diclofenac detected in water and soil media, as well as from the assumption that large doses bring negative effects, but stimulate the body's defense mechanisms, while small doses cause negative effects, but they do not stimulate the body's defense mechanisms. Diclofenac was used at a concentration of 50 mg / L and 50 μg / L in the form of a powder or solution in ethanol (1 mg / 1 ml). Prior to inoculation, the initial pH of the medium was 7.0. Cells previously grown for 2 days in LB broth (Sigma-Aldrich, USA) and washed twice with phosphate buffer (pH 7.0) were added to the culture medium to a final concentration of 3.8 × 10 8 cells / ml. For biodegradation experiments, Rhodococci were pre-grown in the presence of a low (5 μg / L) diclofenac concentration. As cosubstrate, D-glucose (0.5%) was used. The biodegradation process was carried out at a temperature of 28 ° C. To avoid photoinduced oxidation of diclofenac, the contents of the flasks were protected from the action of light with a lightproof material. Due to the long (over 60 days) duration of laboratory experiments in time, the obtained values were adjusted taking into account the correction for water evaporation using the equations [Gauthier N., Yargeau V., Cooper DG Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus nigerby co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. V. 408. P. 1701-1706].

В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор диклофенака в минеральной среде (для оценки абиотической деструкции фармвещества); (2) стерильный раствор диклофенака в минеральной среде с инактивированными клетками родококков (для оценки степени адсорбции диклофенака на бактериальных клетках), при этом бактериальные клетки инактивировали автоклавированием при 1,0 атм. трехкратно; (3) минеральную среду, содержащую глюкозу с бактериальными клетками, без лекарственного вещества (контроль для разграничения метаболитов, появляющихся в результате разложения диклофенака).As controls, (1) a sterile solution of diclofenac in a mineral medium was used (for assessing abiotic destruction of a pharmaceutical substance); (2) a sterile solution of diclofenac in a mineral medium with inactivated Rhodococcus cells (to assess the degree of adsorption of diclofenac on bacterial cells), while the bacterial cells were inactivated by autoclaving at 1.0 atm. three times; (3) mineral medium containing glucose with bacterial cells, without a drug substance (control to distinguish between metabolites resulting from the decomposition of diclofenac).

Концентрацию диклофенака натрия регистрировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью хроматографа LC Prominence (Shimadzu, Япония), оборудованного колонкой с обращенно-фазовым сорбентом Phenomenex Jupiter® 5u C18 300 A, 250×4,60 mm 5 micron (Phenomenex, США) и диодноматричным детектором. Подвижная фаза: фосфатный буферный раствор (рН 3,5) - ацетонитрил в соотношении 60:40. Режим элюирования изократический, скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин, длина волны детектирования - 273 нм; объем вводимой пробы - 20 мкл; температура термостата колонки - 40°С. Время удерживания диклофенака 18,70±0,02 мин. Подготовку проб для данного анализа осуществляли посредством их центрифугирования в течение 5 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранный фильтр (Whatman, UK) с диаметром пор 0,20 мкм.The concentration of diclofenac sodium was recorded by high performance liquid chromatography (HPLC) using an LC Prominence chromatograph (Shimadzu, Japan) equipped with a Phenomenex Jupiter® 5u C18 300 A, 250 × 4.60 mm 5 micron reverse phase sorbent column (Phenomenex, USA) and a diode array detector. Mobile phase: phosphate buffered saline (pH 3.5) - acetonitrile in a ratio of 60:40. The elution mode is isocratic, the flow rate of the mobile phase is 1.0 ml / min, the detection wavelength is 273 nm; the volume of the injected sample is 20 μl; column thermostat temperature - 40 ° С. Diclofenac retention time 18.70 ± 0.02 min. Samples were prepared for this analysis by centrifuging them for 5 minutes at 10,000 rpm. The supernatant was filtered through a membrane filter (Whatman, UK) with a pore diameter of 0.20 μm.

Процесс разложения диклофенака штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 346в высокой концентрации (50 мг/л) протекал медленно, что свидетельствовало о высокой химической устойчивости молекулы исходного экофармполлютанта (Фиг. 1А): остаточное содержание фармпрепарата в постферментационной культуральной среде родококков на 60 сут составляло еще примерно 50%. Средняя скорость биодеградации диклофенака на протяжении эксперимента составляла 0,4 мг/сут. Максимальные (0,7 мг/сут) показатели скорости биодеградации наблюдались в первые 10 сут эксперимента. На 10 сут регистрировалось увеличение роста родококков и постепенное снижение концентрации диклофенака при условии дробного внесения глюкозы в качестве легко деструктируемого источника углерода. Измеряемая абиотическая деструкции диклофенака варьировала в пределах от 2 до 5%. В контрольном варианте с инактивированными клетками зафиксировано незначительное (до 10%) снижение исходной концентрации диклофенака, что свидетельствовало о возможной частичной сорбции вещества на поверхности бактериальных клеток.The process of decomposition of diclofenac with Rhodococcus ruber IEGM 346 strain in high concentration (50 mg / l) proceeded slowly, which testified to the high chemical stability of the molecule of the initial ecofarmollutant (Fig. 1A): the residual pharmaceutical content in the post-fermentation culture medium of Rhodococcus for another 60 days was approximately 50% . The average rate of diclofenac biodegradation during the experiment was 0.4 mg / day. The maximum (0.7 mg / day) indicators of the rate of biodegradation were observed in the first 10 days of the experiment. On day 10, an increase in rhodococcal growth and a gradual decrease in the concentration of diclofenac was recorded under the condition of fractional glucose supplementation as an easily destructible carbon source. Measured abiotic destruction of diclofenac ranged from 2 to 5%. In the control variant with inactivated cells, a slight (up to 10%) decrease in the initial concentration of diclofenac was recorded, indicating a possible partial sorption of the substance on the surface of bacterial cells.

Другая картина наблюдалась в случае использования диклофенака в низкой концентрации (50 мкг/л). В этом случае значительную убыль диклофенака регистрировали в первые 2 сут (Фиг. 1Б). При этом средняя скорость биодеструкции составляла 8,3 мкг/сут. На фоне достижения максимальной скорости биодеградации диклофенака (13 мкг/сут) происходил постепенный стабильный прирост клеточной биомассы. На 5-ые сут увеличение численности родококков сопровождалось значительной убылью диклофенака, полное разложение которого достигалось на 6 сут эксперимента.A different picture was observed when diclofenac was used in a low concentration (50 μg / L). In this case, a significant decrease in diclofenac was recorded in the first 2 days (Fig. 1B). Moreover, the average biodegradation rate was 8.3 μg / day. Against the background of achieving the maximum biodegradation rate of diclofenac (13 μg / day), a gradual stable increase in cell biomass occurred. On the 5th day, an increase in the number of rhodococci was accompanied by a significant decrease in diclofenac, the complete decomposition of which was achieved on the 6th day of the experiment.

Пример 2. Пути биодеструкции диклофенака натрия клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 346.Example 2. Ways of biodegradation of diclofenac sodium by Rhodococcus ruber cells IEGM 346.

Состав продуктов разложения диклофенака анализировали методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на хроматографе Agilent 6890-5973N (Agilent Technologies, США), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. В качестве газа-носителя использовали гелий (1 мл/мин). Температура инжектора и интерфейса составляла 260 и 290°С, соответственно. Температура колонки программировалась от 130 до 300°С с повышением температуры со скоростью 10°С/мин. Ввод хлороформного экстракта в количестве 1 мкл осуществляли без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 40 до 500 m/z. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами библиотеки NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Version 1.7) For Use with Microsoft® Windows™ Users' Guide. Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечными с коэффициентом подобия, превышающим 90%. Для выделения диклофенака и его возможных метаболитов среду ферментации подкисляли 10%-ным водным раствором HCl до рН 2,0 и трижды экстрагировали эквивалентным (10 мл) объемом хлороформа. Объединенные экстракты сушили над Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе (Heidolph, Германия).The composition of diclofenac decomposition products was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) on an Agilent 6890-5973N chromatograph (Agilent Technologies, USA) equipped with an HP-5MS capillary column 30 m long with an inner diameter of 0.25 mm and operating in the mode electron impact ionization at 70 eV. Helium (1 ml / min) was used as the carrier gas. The injector and interface temperatures were 260 and 290 ° C, respectively. The column temperature was programmed from 130 to 300 ° C with increasing temperature at a rate of 10 ° C / min. The introduction of chloroform extract in an amount of 1 μl was carried out without dividing the flow of carrier gas. The mass spectrometer worked in the mode of taking mass spectra in the range from 40 to 500 m / z. The mass spectra obtained were compared with the mass spectra of the NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Version 1.7) For Use with Microsoft ® Windows ™ Users' Guide. Mass spectra were considered identified when the mass spectra of the test substance coincided with the library ones with a similarity coefficient exceeding 90%. To isolate diclofenac and its possible metabolites, the fermentation medium was acidified with a 10% aqueous HCl solution to a pH of 2.0 and extracted three times with an equivalent (10 ml) volume of chloroform. The combined extracts were dried over Na 2 SO 4 , the solvent was removed on a rotary evaporator (Heidolph, Germany).

По результатам ГХ-МС, бактериальная деградация диклофенака сопровождалась образованием метаболитов. На Фиг. 2 представлена схема разложения диклофенака натрия (соединение 1) клетками Rhodococcus ruber IEGM 346. В первые 5-10 сут инкубации родококков в присутствии высоких (50 мг/л) концентраций диклофенака (соединение 2) среди продуктов его биодеструкции детектировались первичные моногидроксиметаболиты - 2-[4'-гидрокси-2',6'-дихлорфенил]-амино)-фенилуксусная кислота (4'-ОН-диклофенак, соединение 3), 5-гидрокси-2-[2',6'-дихлорфенил]-амино)-фенилуксусная кислота (5-ОН-диклофенак, соединение 4), а также соединение 5 бензохинониминовой структуры и его дигидроксипроизводное (соединение 16). Позднее в среде инкубации обнаруживались моно- и дигидроксипроизводные 2,6-дихлоранилина (соединения 6 и 8), образующиеся в результате разрушения связи C-N у второго атома углерода в нехлорированном ароматическом кольце соединений 3 и 4; а также фенилуксусная кислота (соединение 7) и ее гидроксилированное производное - 3-гидроксифенилуксусная кислота (соединение 9).According to the results of GC-MS, the bacterial degradation of diclofenac was accompanied by the formation of metabolites. In FIG. Figure 2 shows the decomposition scheme of diclofenac sodium (compound 1) by Rhodococcus ruber IEGM 346 cells. In the first 5-10 days of incubation of rhodococci in the presence of high (50 mg / L) concentrations of diclofenac (compound 2), primary monohydroxymethabolites were detected among its biodegradation products - 2- [ 4'-hydroxy-2 ', 6'-dichlorophenyl] amino) phenylacetic acid (4'-OH-diclofenac, compound 3), 5-hydroxy-2- [2', 6'-dichlorophenyl] amino) - phenylacetic acid (5-OH-diclofenac, compound 4), as well as compound 5 of the benzoquinoneimine structure and its dihydroxy derivative (compound inenia 16). Later, mono- and dihydroxy derivatives of 2,6-dichloroaniline (compounds 6 and 8) were formed in the incubation medium, resulting from the destruction of the C-N bond at the second carbon atom in the non-chlorinated aromatic ring of compounds 3 and 4; as well as phenylacetic acid (compound 7) and its hydroxylated derivative 3-hydroxyphenylacetic acid (compound 9).

При использовании более низкой (50 мкг/л) концентрации диклофенака вышеперечисленные продукты обнаруживались в первые 2 сут инкубации родококков. На 4-е сут в среде регистрировались метаболиты со спектроскопическими характеристиками гомогентизиновой (2,5-дигидроксифенилуксусной) кислоты, m/z=168 (соединение 10) и продукта ее окисления 2-(p-бензохинон-2)уксусной кислоты, m/z=166 (соединение 11), а также фумарилацетоуксусной кислоты, m/z=200 (соединение 12) и продуктов ее гидролиза - ацетоуксусной, m/z=102 и фумаровой кислот, m/z=116 (соединения 13, 14 соответственно). Кроме того, наблюдался интенсивный пик соединения 15 (m/z=214), которое, по-видимому, образовалось в результате реакции окисления соединения 12 по седьмому атому углерода за счет подвижности атомов водорода, находящихся между карбоксильной и кетонной группами. Диклофенак и вышеуказанные соединения к концу ферментации (на 6 сут эксперимента) не обнаруживались в среде инкубации родококков, что свидетельствовало о дальнейшем превращении метаболитов. В контрольных экспериментах метаболиты диклофенака не выявлялись.When using a lower (50 μg / L) concentration of diclofenac, the above products were detected in the first 2 days of incubation of Rhodococcus. On the 4th day, metabolites with spectroscopic characteristics of homogentisic (2,5-dihydroxyphenylacetic) acid, m / z = 168 (compound 10) and the product of its oxidation of 2- (p-benzoquinone-2) acetic acid, m / z were recorded = 166 (compound 11), as well as fumaryl acetoacetic acid, m / z = 200 (compound 12) and its hydrolysis products - acetoacetic, m / z = 102 and fumaric acid, m / z = 116 (compounds 13, 14, respectively). In addition, there was an intense peak of compound 15 (m / z = 214), which, apparently, was formed as a result of the oxidation of compound 12 at the seventh carbon atom due to the mobility of hydrogen atoms located between the carboxyl and ketone groups. Diclofenac and the above compounds at the end of fermentation (on the 6th day of the experiment) were not found in the incubation medium of rhodococci, which indicated the further conversion of metabolites. In control experiments, diclofenac metabolites were not detected.

Особо следует особо отметить два события: (1) разрыв связи C-N в структуре DCF с образованием фенилуксусной кислоты и (2) раскрытие хинонового цикла с образованием фумарилацетоуксусной кислоты и продуктов ее гидролиза - ацетоуксусной и фумаровой кислот, которые могут считаться продуктами, свидетельствующими о детоксикации диклофенака.Two events should be especially noted: (1) the breaking of the CN bond in the DCF structure with the formation of phenylacetic acid and (2) the opening of the quinone ring with the formation of fumarylacetoacetic acid and the products of its hydrolysis, acetoacetic and fumaric acids, which can be considered products indicative of diclofenac detoxification .

В процессе работы определены 16 метаболитов, продуцируемых R. ruber IEGM 346, 4 из которых (4'-ОН-диклофенак, 5-ОН-диклофенак и два соединения бензохинониминовой структуры) аналогичны таковым, полученным ранее при изучении метаболизма диклофенака (1,7 и 34,0 мкМ) у альфа-протеобактерий Labrys portucalensis F11 [Moreira S., Bessa V.S., Murgolo S., Piccirillo C., Mascolo G., Castro P.M.L. Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2018. V. 152. P. 104-113], и 2 метаболита (4'-OH-диклофенак и 5-ОН-диклофенак), полученные ранее с использованием грамположительных бактерий Actinoplanes [Osorio-Lozada A., Surapaneni S., Skiles G.L., Subramanian R. Biosynthesis of drug metabolites using microbes in hollow fiber cartridge reactors: case study of diclofenac metabolism by Actinoplanes species // Drug Metabolism and Disposition. 2008. V. 36. P. 234-240]. Однако во всех обнаруженных авторами метаболитах сохранялась связь C-N при втором атоме углерода в нехлорированном ароматическом кольце диклофенака. При этом отсутствовали сведения, подтверждающие факт раскрытия ароматического цикла в структуре образующихся соединений.In the process, 16 metabolites produced by R. ruber IEGM 346 were identified, 4 of which (4'-OH-diclofenac, 5-OH-diclofenac and two compounds of the benzoquinoneimine structure) are similar to those obtained previously in the study of diclofenac metabolism (1.7 and 34.0 μM) in the alpha proteobacteria Labrys portucalensis F11 [Moreira S., Bessa VS, Murgolo S., Piccirillo C., Mascolo G., Castro PML Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2018. V. 152. P. 104-113], and 2 metabolites (4'-OH-diclofenac and 5-OH-diclofenac), previously obtained using gram-positive bacteria Actinoplanes [Osorio-Lozada A., Surapaneni S., Skiles GL, Subramanian R. Biosynthesis of drug metabolites using microbes in hollow fiber cartridge reactors: case study of diclofenac metabolism by Actinoplanes species // Drug Metabolism and Disposition. 2008. V. 36. P. 234-240]. However, in all the metabolites discovered by the authors, the C – N bond was retained at the second carbon atom in the unchlorinated aromatic ring of diclofenac. Moreover, there was no information confirming the fact of the opening of the aromatic cycle in the structure of the resulting compounds.

Таким образом, заявленный штамм Rhodococcus ruber IEGM 346, депонированный под номером ВКПМ АС-2106, может рассматриваться как эффективный биодеструктор токсичного экофармполлютанта диклофенака натрия.Thus, the claimed strain of Rhodococcus ruber IEGM 346, deposited under the number VKPM AC-2106, can be considered as an effective biodestructor of toxic eco-pharmaceutical pollutant diclofenac sodium.

Изобретение поясняется нижеследующими графическими материалами, на которых отображены:The invention is illustrated by the following graphic materials on which are displayed:

на Фиг. 1. Динамика биодеградации 50 мг/л (А) и 50 мкг/л (Б) диклофенака натрия клетками Rhodococcus ruber IEGM 346

Figure 00000010
в присутствии глюкозы.
Figure 00000011
контроль абиотической деструкции,
Figure 00000012
контроль биосорбции,
Figure 00000013
сухая биомасса родококков в присутствии диклофенака и глюкозы и
Figure 00000014
сухая биомасса родококков в присутствии глюкозы. Стрелками обозначено довнесение (дробное внесение) глюкозы.in FIG. 1. Biodegradation dynamics of 50 mg / L (A) and 50 μg / L (B) of diclofenac sodium by Rhodococcus ruber IEGM 346 cells
Figure 00000010
in the presence of glucose.
Figure 00000011
abiotic destruction control,
Figure 00000012
biosorption control,
Figure 00000013
dry biomass of Rhodococcus in the presence of diclofenac and glucose and
Figure 00000014
Rhodococcus dry biomass in the presence of glucose. The arrows indicate the addition (fractional application) of glucose.

на Фиг. 2. Предположительные пути биодеструкции диклофенака натрия с использованием Rhodococcus ruber IEGM 346. 1 - натриевая соль 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусной кислоты; 2 - 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусная кислота; 3 - (2-[4'-гидрокси-2',6'-дихлорфенил]амино)фенилуксусная кислота; 4 - (5-гидрокси-2-[2',6'-дихлорфенил]амино)фенилуксусная кислота; 5 - 2-(1-(5-оксо-циклогекса-1,3-диенил-2-(2',6'-дихлор-фенилимино)уксусная кислота; 6 - 4-амино-3,5-дихлорфенол; 7 - фенилуксусная кислота; 8 - 5-амино-4,6-дихлорбензол-1,2-диол; 9 - 3-гидроксифенилуксусная кислота; 10 - 2,5-дигидрокси-фенилуксусная кислота (гомогентизиновая кислота); 11 - 2-(р-бензохинон-2)-уксусная кислота; 12 - фумарилацетоуксусная кислота; 13 - ацетоуксусная кислота; 14 - фумаровая кислота; 15 - 4,6,7-триоксоокт-2-ендиовая кислота; 16 - 2-[1-(5-оксициклогекса-1,3-диенил-2-(3',4'-дигидрокси-2',6'-дихлорфенил)имино]уксусная кислота.in FIG. 2. Presumptive ways of biodegradation of diclofenac sodium using Rhodococcus ruber IEGM 346. 1 - sodium salt of 2- [2- (2 ', 6'-dichlorophenylamino) phenyl] acetic acid; 2 - 2- [2- (2 ', 6'-dichlorophenylamino) phenyl] acetic acid; 3 - (2- [4'-hydroxy-2 ', 6'-dichlorophenyl] amino) phenylacetic acid; 4 - (5-hydroxy-2- [2 ', 6'-dichlorophenyl] amino) phenylacetic acid; 5 - 2- (1- (5-oxo-cyclohexa-1,3-dienyl-2- (2 ', 6'-dichloro-phenylimino) acetic acid; 6 - 4-amino-3,5-dichlorophenol; 7 - phenylacetic acid; 8 - 5-amino-4,6-dichlorobenzene-1,2-diol; 9 - 3-hydroxyphenylacetic acid; 10 - 2,5-dihydroxy-phenylacetic acid (homogentisinic acid); 11 - 2- (p- benzoquinone-2) -acetic acid; 12 - fumarylacetoacetic acid; 13 - acetoacetic acid; 14 - fumaric acid; 15 - 4,6,7-trioxoct-2-endioic acid; 16 - 2- [1- (5-hydroxycyclohexa- 1,3-dienyl-2- (3 ', 4'-dihydroxy-2', 6'-dichlorophenyl) imino] acetic acid.

Claims (1)

Штамм бактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 346, депонированный под номером ВКПМ Ас-2106, - биодеструктор экофармполлютанта диклофенака натрия.The bacterial strain Rhodococcus ruber IEGM 346, deposited under the number VKPM Ac-2106, is a biodestructor of the ecofarmollutant diclofenac sodium.
RU2018132086A 2018-09-06 2018-09-06 Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor RU2707536C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018132086A RU2707536C1 (en) 2018-09-06 2018-09-06 Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018132086A RU2707536C1 (en) 2018-09-06 2018-09-06 Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2707536C1 true RU2707536C1 (en) 2019-11-27

Family

ID=68653036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018132086A RU2707536C1 (en) 2018-09-06 2018-09-06 Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2707536C1 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637602A (en) * 2021-07-09 2021-11-12 中国科学院广州地球化学研究所 Labrys portucalensis P49-1 and application thereof
RU2762007C1 (en) * 2021-05-25 2021-12-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН) Ibuprofen biodestructor
RU2798871C1 (en) * 2022-12-09 2023-06-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН) Bioprotector to improve the conditional properties of seeds and reduce the phytotoxicity of heavy metals

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KYRIAKOS STYLIANOU, EVROULA HAPESHI, et. al., Diclofenac biodegradation by newly isolated Klebsiella sp. KSC: Microbial intermediates and ecotoxicological assessment, Journal of *
MORIERA IS., BESSA VS, et.al., Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F-11, Ecotoxicol. Environ Saf, Vay 2018, 15:152, p. 104-113. *
MORIERA IS., BESSA VS, et.al., Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F-11, Ecotoxicol. Environ Saf, Vay 2018, 15:152, p. 104-113. KYRIAKOS STYLIANOU, EVROULA HAPESHI, et. al., Diclofenac biodegradation by newly isolated Klebsiella sp. KSC: Microbial intermediates and ecotoxicological assessment, Journal of Environmental Chemical Engineering, aprel, 2018 (6), p. 3242-3248. ИВШИНА И.Б., ТЮМИНА Е.А., ВИХАРЕВА Е.В. Бактериальная деградация фармполлюантов группы обезболивающих и противовоспалительных средств, Микробные биотехнологии: Фундаментальные и прикладные аспекты, 2017, Минск, Беларусская навука, 63-76. DOROTA DOMARADZKA, et.al., Biodegradation and biotransformation of polycyclic non-steroidal anti-inflammatory drugs, Rev Environ Sci Biotechnol, 2015 (14), p.229-239. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2762007C1 (en) * 2021-05-25 2021-12-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН) Ibuprofen biodestructor
CN113637602A (en) * 2021-07-09 2021-11-12 中国科学院广州地球化学研究所 Labrys portucalensis P49-1 and application thereof
CN113637602B (en) * 2021-07-09 2023-02-03 中国科学院广州地球化学研究所 Labrys portucalensis P49-1 and application thereof
RU2798871C1 (en) * 2022-12-09 2023-06-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН) Bioprotector to improve the conditional properties of seeds and reduce the phytotoxicity of heavy metals

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ivshina et al. Features of diclofenac biodegradation by Rhodococcus ruber IEGM 346
Ghosh et al. Biodegradation of pyrene by a Pseudomonas aeruginosa strain RS1 isolated from refinery sludge
Jayapal et al. Sequential anaerobic-aerobic treatment using plant microbe integrated system for degradation of azo dyes and their aromatic amines by-products
Zhang et al. Aerobic degradation of bisphenol A by Achromobacter xylosoxidans strain B-16 isolated from compost leachate of municipal solid waste
Winkler et al. Selective degradation of ibuprofen and clofibric acid in two model river biofilm systems
Ivshina et al. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608
Hadibarata et al. Identification of metabolites from benzo [a] pyrene oxidation by ligninolytic enzymes of Polyporus sp. S133
Mulkiewicz et al. Metabolism of non-steroidal anti-inflammatory drugs by non-target wild-living organisms
US4877736A (en) Aerobic microorganism for the degradation of chlorinated aliphatic hydrocarbons
Ghosal et al. Characterization of the metabolic pathway involved in assimilation of acenaphthene in Acinetobacter sp. strain AGAT-W
Evangelista et al. The effect of structure and a secondary carbon source on the microbial degradation of chlorophenoxy acids
Żur et al. Degradation of diclofenac by new bacterial strains and its influence on the physiological status of cells
Elangovan et al. Polychlorinated biphenyls (PCBs): Environmental fate, challenges and bioremediation
RU2707536C1 (en) Strain of rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor
Xu et al. Isolation and characterization of a Pseudomonas oleovorans degrading the chloroacetamide herbicide acetochlor
Hemidouche et al. Successful biodegradation of a refractory pharmaceutical compound by an indigenous phenol-tolerant Pseudomonas aeruginosa strain
Duc et al. Biodegradation of acetochlor and 2-methyl-6-ethylaniline by Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorescens
Du et al. Anaerobic biotransformation mechanism of marine toxin domoic acid
Garbi et al. Biodegradation of oxadiazon by a soil isolated Pseudomonas fluorescens strain CG5: Implementation in an herbicide removal reactor and modelling
Li et al. Isolation of a malachite green-degrading Pseudomonas sp. MDB-1 strain and cloning of the tmr2 gene
RU2762007C1 (en) Ibuprofen biodestructor
KOBAYASHI et al. Isolation and characterization of microorganisms that degrade 4-chlorobiphenyl to 4-chlorobenzoic acid
Kamashwaran et al. Anaerobic biodegradation of pentachlorophenol in mixtures containing cadmium by two physiologically distinct microbial enrichment cultures
NOVIANTY et al. Naphthalene degradation by Pseudomonas sp. LBKURCC419 strain with addition of glucose as cosubstrate
Faisal et al. Characterization of a novel pathway for xanthene degradation by the engineered strain Sphingobium yanoikuyae B1DR