RU2705250C2

RU2705250C2 - Lactobacillus fermentum u-21 strain, which produces complex of biologically active substances which neutralize superoxide anion induced by chemical agents

Info

Publication number: RU2705250C2
Application number: RU2018104322A
Authority: RU
Inventors: Валерий Николаевич Даниленко; Мария Викторовна Марсова; Елена Ульриховна Полуэктова; Майя Валерьевна Одорская; Роман Абдаллаевич Юнес
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2019-11-06
Also published as: RU2018104322A; RU2018104322A3

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention relates to pharmacology, medicine and cosmetology, in particular for the accompanying therapy of neurodegenerative diseases, in particular parkinsonism syndrome, induced by oxidative stress, and is a Lactobacillus fermentum B-12075 strain having antioxidant properties, particularly with respect to a peroxide-induced superoxide anion, deposited in the international collection of Russian National Collection of Industrial Microorganisms (Moscow) under number V-12075 dated October 08, 2014, the genome nucleotide sequence is deposited in GenBank under number WGS PNBB00000000.1.EFFECT: disclosed is lactobacillus fermentum u-21, which produces a complex of biologically active substances which neutralize superoxide anion induced by chemical agents.1 cl, 3 dwg, 2 tbl, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к фармакологии, медицине и косметологии, в частности, может быть использовано для предотвращения негативных последствий, вызванных воздействием химических веществ - продуцентов супероксид-аниона, в том числе гербицидов, в частности параквата, а также для профилактики и в комплексном лечении состояний, обусловленных окислительным стрессом (симптомы паркинсонизма) и касается штамма Lactobacillus, способного синтезировать комплекс антиоксидантов, обладающих высокой активностью в отношении супероксид-аниона, продуцируемого паракватом.The invention relates to pharmacology, medicine and cosmetology, in particular, can be used to prevent the negative effects caused by exposure to chemicals - producers of superoxide anion, including herbicides, in particular paraquat, as well as for prevention and in the complex treatment of conditions caused by oxidative stress (symptoms of parkinsonism) and concerns the Lactobacillus strain, which is able to synthesize a complex of antioxidants with high activity against superoxide anion, we produce of paraquat.

Уровень техникиState of the art

Пробиотические микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Микробном играет в жизнедеятельности организма огромную роль - совокупность населяющих его микроорганизмов (преимущественно бактерий) образуют сбалансированное, стабильное сообщество, непосредственно и многосторонне влияющее на здоровье и развитие организма. Бактерии, составляющие кишечную микробиоту, выполняют многочисленные функции: подавляют патогенную микрофлору, участвуют в переваривании пищи, выделяют ряд биологически активных веществ, проявляет иммуномодулирующие свойства. (Role of the normal gut microbiota. Jandhyala S.M., Talukdar R., et. al // World J Gastroenterol 2015 August 7; 21(29): 8787-8803; Gut microbiota and gastrointestinal health: current concepts and future directions. Aziz Q,

J et. al. // Neurogastroenterol Motil (2013) 25:4-15; Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Krishnan S., Alden N., Lee K. // Current Opinion in Biotechnology 2015, 36. P:137-145; The gut microbiota and host health: a new clinical frontier. Marchesi J.R., Adams D.H, et. al // Gut 2015; Sep. 2 P: 1-10)Probiotic microorganisms are representatives of the normal microflora of the gastrointestinal tract of humans and animals. The microbial plays a huge role in the life of the body - the totality of the microorganisms that inhabit it (mainly bacteria) form a balanced, stable community that directly and multilaterally affects the health and development of the body. The bacteria that make up the intestinal microbiota perform numerous functions: suppress pathogenic microflora, participate in the digestion of food, secrete a number of biologically active substances, and exhibit immunomodulating properties. (Role of the normal gut microbiota. Jandhyala SM, Talukdar R., et. Al // World J Gastroenterol 2015 August 7; 21 (29): 8787-8803; Gut microbiota and gastrointestinal health: current concepts and future directions. Aziz Q ,

J et. al. // Neurogastroenterol Motil (2013) 25: 4-15; Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Krishnan S., Alden N., Lee K. // Current Opinion in Biotechnology 2015, 36. P: 137-145; The gut microbiota and host health: a new clinical frontier. Marchesi JR, Adams DH, et. al // Gut 2015; Sep. 2 P: 1-10)

Ряд пробиотических компонентов микрофлоры кишечника обладает антиоксидантными (Probiotics and Oxidative Stress T. Kullisaar. E Songisepp and M. Zilmer. University of Tartu, Bio-competence Centre of Healthy Dairy products LCC, Estonia, 2012), антимутагенными и противоопухолевыми свойствами (Effects of Lactobacillus strains on cancer cell proliferation and oxidative stress in vitro. S.S. Choi, Y. Kim, K.S. Han, S. You, S. Oh and S.H. Kim. Letters in Applied Microbiology 42 (2006) 452-458). В частности, лактобациллы являются продуцентами аминокислот, витаминов и многих других биологически активных веществ, в том числе - антиоксидантов.A number of probiotic components of the intestinal microflora have antioxidant (Probiotics and Oxidative Stress T. Kullisaar. E Songisepp and M. Zilmer. University of Tartu, Bio-competence Center of Healthy Dairy products LCC, Estonia, 2012), antimutagenic and antitumor properties (Effects of Lactobacillus strains on cancer cell proliferation and oxidative stress in vitro. SS Choi, Y. Kim, KS Han, S. You, S. Oh and SH Kim. Letters in Applied Microbiology 42 (2006) 452-458). In particular, lactobacilli are producers of amino acids, vitamins and many other biologically active substances, including antioxidants.

Способность отдельных штаммов пробиотических бактерий снижать окислительный стресс доказана in vitro и in vivo. Антиокислительный эффект пробиотиков обусловлен способностью этих бактерий продуцировать антиоксидантные энзимы (супероксидисмутаза, тиоредоксин, глутатион), хелатирующие свободные ионы Fe⁺² и Cu⁺² соединения, витамины (B₁, B₁₂ и другие) и короткоцепочечные жирные кислоты, модулировать видовой состав КМ и т.д (Bacillus amyloliquefaciens SC06 alleviates the oxidative stress of IPEC-1 via modulating Nrf2/Keap1 signaling pathway and decreasing ROS production. Wang Y, Wu Y, Wang Y, Fu A, Gong L, Li W, Li Y. // AppI Microbiol Biotechnol. 2017 Apr; 101(7):3015-3026).The ability of individual strains of probiotic bacteria to reduce oxidative stress has been proven in vitro and in vivo. The antioxidant effect of probiotics is due to the ability of these bacteria to produce antioxidant enzymes (superoxide dismutase, thioredoxin, glutathione), chelating free ions Fe ^{+ 2} and Cu ^{+ 2} compounds, vitamins (B ₁ , B ₁₂ and others) and short chain fatty acids, modulate the species composition of CM and etc (Bacillus amyloliquefaciens SC06 alleviates the oxidative stress of IPEC-1 via modulating Nrf2 / Keap1 signaling pathway and decreasing ROS production. Wang Y, Wu Y, Wang Y, Fu A, Gong L, Li W, Li Y. // AppI Microbiol Biotechnol. 2017 Apr; 101 (7): 3015-3026).

Тиоредоксины - семейство маленьких белков, представленный во всех организмах от архей до человека ([Thioredoxin and glutaredoxin systems. Holmgren A. J Biol Chem. 1989. 264 (24): 13963-6). Они участвуют во многих важных биологических процессах, включая определение окислительно-восстановительного потенциала клетки и передачу сигнала, является важнейшим антиоксидантом, протектором против свободно радикального повреждения клеточных структур. Ряд экспериментальных работ подтверждают роль тиоредоксиновой системы в защите от окислительного стресса у лактобацилл и близких к ним грам-положительных микроорганизмов. Мутанты Lactococcus lactis с делецией гена тиоредоксина резко замедляют рост в присутствии перекиси водорода, диамида, параквата (5-20 mM) (Two Lactococcus lactis thioredoxin paralogues play different roles in responses to arsenate and oxidative stress. Efler P, Kilstrup M, Johnsen S, Svensson B,

P. // Microbiology. 2015 Mar; 161(Pt 3):528-38). Мутант Lactobacillus casei с делецией гена тиоредоксин редуктазы снижал скорость роста в анаэробных условиях и был нежизнеспособен в аэробных условиях (Roles of thioredoxin and thioredoxin reductase in the resistance to oxidative stress in Lactobacillus casei. Serata M, Iino T, Yasuda E, Sako T. // Microbiology. 2012 Apr; 158(Pt 4):953-62). Суперпродукция тиоредоксин редуктазы у Lactobacillus plantarum WCFS1 увеличивает устойчивость бактерий к окислительному стрессу (Thioredoxin reductase is a key factor in the oxidative stress response of Lactobacillus plantarum WCFS1. Serrano L.M., Molenaar D., Wels M., Teusink В., Bron P.A., de Vos W.M., Smid E.J. // Microb Cell Fact. 2007 Aug 28; 6:29.). Сохранение оптимального для клетки уровня восстановленного тиоредоксина является важным условием ее жизнеспособности. В последнее время, развитие многих системных заболеваний, помимо генетических и экологических факторов, связывают с изменением антиоксидантного статуса организма. Оксидативный стресс, воспаление и абиотические факторы во многих случаях индуцируют развитие таких заболеваний, как БП, Б Альгеймера, Хатингтона, др.Thioredoxins are a family of small proteins found in all organisms from archaea to humans ([Thioredoxin and glutaredoxin systems. Holmgren A. J Biol Chem. 1989. 264 (24): 13963-6). They participate in many important biological processes, including determining the redox potential of a cell and signal transmission, is an important antioxidant, a protector against free radical damage to cellular structures. A number of experimental studies confirm the role of the thioredoxin system in protecting against oxidative stress in lactobacilli and related gram-positive microorganisms. Thioredoxin gene deletion mutants Lactococcus lactis dramatically slow down growth in the presence of hydrogen peroxide, diamide, paraquat (5-20 mM) (Two Lactococcus lactis thioredoxin paralogues play different roles in responses to arsenate and oxidative stress. Efler P, Kilstrup M, Johnsen S, Svensson B,

P. // Microbiology. 2015 Mar; 161 (Pt 3): 528-38). The mutant Lactobacillus casei with a deletion of the thioredoxin reductase gene reduced the growth rate under anaerobic conditions and was not viable under aerobic conditions (Roles of thioredoxin and thioredoxin reductase in the resistance to oxidative stress in Lactobacillus casei. Serata M, Iino T, Yasuda T., S Yasuda E. / Microbiology. 2012 Apr; 158 (Pt 4): 953-62). The overproduction of thioredoxin reductase in Lactobacillus plantarum WCFS1 increases the resistance of bacteria to oxidative stress (Thioredoxin reductase is a key factor in the oxidative stress response of Lactobacillus plantarum WCFS1. Serrano LM, Molenaar D., Wels M., Teusink B., Bron PA, de Vos WM, Smid EJ // Microb Cell Fact. 2007 Aug 28; 6:29.). Maintaining the optimal level of reduced thioredoxin for the cell is an important condition for its viability. Recently, the development of many systemic diseases, in addition to genetic and environmental factors, has been associated with a change in the antioxidant status of the body. Oxidative stress, inflammation and abiotic factors in many cases induce the development of diseases such as PD, Alheimer B, Hatington, etc.

Использование микроорганизмов, являющихся естественными симбионтами человека, в качестве источника антиоксидантов (АО), имеет ряд преимуществ перед другими способами повышения антиоксидантного статуса организма, в частности их относительная безвредность и физиологичность по сравнению с химическими препаратами. Они широко используются в функциональных пищевых продуктах, биологически активных добавках, лекарственных средствах. Пробиотики, и лактобациллы в частности, все чаще используются в комбинированном лечении начальных стадий различных заболеваний, таких как язвенный колит, синдром воспаленного кишечника, аллергические заболевания. Существует большой интерес к пробиотикам, синтезирующим биологически активные вещества, в том числе антиоксиданты. Для комплексного решения проблем, связанных с оксидативным стрессом, воспалением и дисбактериозом, предложено использование нескольких штаммов Lactobacillus, обладающих антиоксидантным действием (Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria: in vitro and in vivo activities. A. Amaretti, M. di Nunzio, A. Pompei et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. 97. P. 809-81), а так же проявляющих иммуногенные свойства (И.А. Федорова, В.Н. Даниленко. // Успехи соврем, биол. 2014, Т. 134. №2. С. 99-110).The use of microorganisms, which are natural symbionts of man, as a source of antioxidants (AO), has several advantages over other methods of increasing the antioxidant status of an organism, in particular, their relative harmlessness and physiology compared to chemical preparations. They are widely used in functional foods, dietary supplements, and medicines. Probiotics, and lactobacilli in particular, are increasingly used in the combined treatment of the initial stages of various diseases, such as ulcerative colitis, inflammation of the intestines, allergic diseases. There is great interest in probiotics synthesizing biologically active substances, including antioxidants. To comprehensively solve the problems associated with oxidative stress, inflammation and dysbiosis, the use of several strains of Lactobacillus with antioxidant effects (Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria: in vitro and in vivo activities. A. Amaretti, M. di Nunzio, A. Pompei et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. 97. P. 809-81), as well as those exhibiting immunogenic properties (I.A. Fedorova, V.N. Danilenko. // Successful lies, biol. 2014, T. 134. No. 2. S. 99-110).

Существует ряд патентов на пробиотические организмы с антиоксидантной активностью: Probiotic bacteria having antioxidant activity and use thereof, Mogna, G.; Strozzi, GP.; Mogna L., US 20140065116 A1, 2014; Lactobacilli with Anti-Oxidant Action. Grompone G., Degivry M-C, Legrain-Raspaud S., Chambaud I., Bourdet-Sicard R. US 20130171117 A1, 2013; Human lactobacillus casei gr x 12 with antioxidant function and application thereof. Ruixia G. Dong. L, CN 103343107 (A), 2013; A Novel lactobacillus plantarum, composition with antibacterial and antioxidant activity comprising the same and use of thereof. Ki K.S., Kyung CH. W. // KR 20120023480 (A) 2012; KR 101197203 2012; Method of treatment using Lactobacillus fermentum ME-3. Kullisaar Т., Zilmer M. SG11201504787V (А), 2015). Описанные в них штаммы являются ближайшим аналогом изобретения.There are a number of patents for probiotic organisms with antioxidant activity: Probiotic bacteria having antioxidant activity and use thereof, Mogna, G .; Strozzi, GP .; Mogna L., US 20140065116 A1, 2014; Lactobacilli with Anti-Oxidant Action. Grompone G., Degivry M-C, Legrain-Raspaud S., Chambaud I., Bourdet-Sicard R. US 20130171117 A1, 2013; Human lactobacillus casei gr x 12 with antioxidant function and application thereof. Ruixia G. Dong. L, CN 103343107 (A), 2013; A Novel lactobacillus plantarum, composition with antibacterial and antioxidant activity comprising the same and use of thereof. Ki K.S., Kyung CH. W. // KR 20120023480 (A) 2012; KR 101 197 7203 2012; Method of treatment using Lactobacillus fermentum ME-3. Kullisaar T., Zilmer M. SG11201504787V (A), 2015). The strains described therein are the closest analogue of the invention.

Метагеномные исследования видового состава кишечной микробиоты (КМ) пациентов с различными заболеваниями (например, диабет, аутизм, болезнь Паркинсона (БП)) подтверждают, что она терпит количественные и качественные изменения, если за норму брать микробиоту здоровых людей (Analysis of gut microbiota in patients with Parkinson's disease. Petrov, V.A. et al. // Bull. Exp. Biol. Med. 2017. 162, 734-737; Functional implications of microbial and viral gut metagenome changes in early stage

Parkinson's disease patients. Bedarf, J.R. et al. // Genome Med. 2017. 9; Gut microbiota are related to Parkinson's disease and clinical phenotype. Scheperjans, F. et al. // Mov. Disord. 2015. 30, 350-358). Обнаруживаются корреляции между видовым составом КМ и различными аспектами нарушений здоровья. Например, при БП от состава микробиоты зависят такие проявления, как эмоционально-аффективные нарушения, обонятельная дисфункция, время толстокишечного транзита и другие (Correlation between emotional-affective disorders and gut microbiota composition in patients with Parkinson's disease. Alifirova, V.M. et al. // Vetn Ross Akad Nauk. 2016. 71, 427-435; Кострюкова и др., 2016; More than constipation - bowel symptoms in Parkinson's disease and their connection to gut microbiota. Mertsalmi, Т.H. et al. // Eur. J. Neurol. 2017. 24, 1375-1383). Наибольшее внимание заслуживает работа Сампсона и др. опубликованная в 2016, в которой была продемонстрирована способность "патологической микробиоты" полученной от людей с БП и пересаженной стерильным мышам, вызвать у последних моторные нарушения характерные для БП (Gut Microbiota Regulate Motor Deficits and Neuroinflammation in a Model of Parkinson's Disease. Sampson TR, Debelius JW. et al. Cell. 2016 Dec 1; 167(6): 1469-1480).Metagenomic studies of the species composition of the intestinal microbiota (CM) of patients with various diseases (e.g., diabetes, autism, Parkinson's disease (PD)) confirm that it undergoes quantitative and qualitative changes if we take the normal microbiota of healthy people (Analysis of gut microbiota in patients with Parkinson's disease. Petrov, VA et al. // Bull. Exp. Biol. Med. 2017. 162, 734-737; Functional implications of microbial and viral gut metagenome changes in early stage

Parkinson's disease patients. Bedarf, JR et al. // Genome Med. 2017.9; Gut microbiota are related to Parkinson's disease and clinical phenotype. Scheperjans, F. et al. // Mov. Disord 2015.30, 350-358). There are correlations between the species composition of CM and various aspects of health disorders. For example, in PD, such manifestations as emotional affective disorders, olfactory dysfunction, colonic transit time, and others (Correlation between emotional-affective disorders and gut microbiota composition in patients with Parkinson's disease. Alifirova, VM et al. // depend on the composition of the microbiota). Vetn Ross Akad Nauk. 2016. 71, 427-435; Kostryukova et al., 2016; More than constipation - bowel symptoms in Parkinson's disease and their connection to gut microbiota. Mertsalmi, T. H. et al. // Eur. J Neurol. 2017.24, 1375-1383). The most noteworthy is the work of Sampson et al. Published in 2016, which demonstrated the ability of “pathological microbiota” obtained from people with PD and transplanted to sterile mice to cause motor disorders characteristic of PD in the latter (Gut Microbiota Regulate Motor Deficits and Neuroinflammation in a Model of Parkinson's Disease. Sampson TR, Debelius JW. et al. Cell. 2016 Dec 1; 167 (6): 1469-1480).

В соответствии с современными представлениями, большая часть патологических процессов в организме и развитие многих «возрастных» заболеваний, в частности Болезни Паркинсона, связано с воздействием активных форм кислорода (АФК), образующихся в процессе жизнедеятельности клетки и свободнорадикального окисления (СРО) биомолекул - белков, липидов, нуклеиновых кислот (Oxidants, antioxidants and the current incurability of metastatic cancers. Watson J. // Open Biol 2013, 3 120-144). В небольших количествах АФК образуются, как побочный продукт внутри клеток, при естественном метаболизме кислорода, при осуществлении клеточного дыхания митохондриями. Однако при повреждении митохондрий количество АФК резко возрастает. Состояние оксидативного стресса может быть индуцировано негативными факторами внешней среды, такими, как гербициды, продукты неполного сгорания и другие, ведущие к образованию в организме избыточного количества активных форм кислорода (АФК), радикалов и других агрессивных частиц.In accordance with modern concepts, most of the pathological processes in the body and the development of many “age-related” diseases, in particular Parkinson’s disease, are associated with exposure to reactive oxygen species (ROS) formed during cell activity and free radical oxidation (SRO) of protein biomolecules, lipids, nucleic acids (Oxidants, antioxidants and the current incurability of metastatic cancers. Watson J. // Open Biol 2013, 3 120-144). In small amounts, ROS are formed as a by-product inside the cells, during the natural metabolism of oxygen, during the implementation of cellular respiration by mitochondria. However, with mitochondrial damage, the amount of ROS increases sharply. The state of oxidative stress can be induced by negative environmental factors, such as herbicides, products of incomplete combustion, and others, leading to the formation in the body of an excessive amount of reactive oxygen species (ROS), radicals, and other aggressive particles.

Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в мозгу связано, в первую очередь, с метаболизмом дофамина, нарушением работы митохондрий и нейровсопалением обусловленном активацией микроглий, астроцитов и других клеток мозга (Aging and Parkinson's Disease: Inflammaging, Neuroinflammation and Biological Remodelling As Key Factors in Pathogenesis. Calabrese, V. et al.. // Free Radio. Biol. Med. 2017. 115, 80-91). Экспериментально доказано, что в ответ на окислительный стресс в микроглий появляются и накапливаются медиаторы воспаления. Выработка цитокинов, в свою очередь, провоцирует выработку активных форм кислорода. Т.е. окислительный стресс и воспаление могут быть и пусковым и усиливающим фактором друг для друга (Oxidizing stress in patogeneza of neurodegenerate diseases: possibilities of therapy. Vasenina E.E., Levin O.S.// Современная терапия в психиатрии и неврологии (СТПН) 2013, 3-4, рр. 39-46).An increase in the level of reactive oxygen species (ROS) in the brain is primarily associated with dopamine metabolism, disruption of mitochondria and neuro-burning caused by the activation of microglia, astrocytes and other brain cells (Aging and Parkinson's Disease: Inflammaging, Neuroinflammation and Biological Remodelling As Key Factors in Pathogenesis. Calabrese, V. et al .. // Free Radio. Biol. Med. 2017. 115, 80-91). It has been experimentally proven that in response to oxidative stress, inflammatory mediators appear and accumulate in microglia. The production of cytokines, in turn, provokes the production of reactive oxygen species. Those. oxidative stress and inflammation can be both triggering and enhancing factors for each other (Oxidizing stress in patogeneza of neurodegenerate diseases: possibilities of therapy. Vasenina EE, Levin OS // Modern therapy in psychiatry and neurology (STPN) 2013, 3-4, pp . 39-46).

Кроме того, нейровсопаление может быть результатом проникновения эндотоксинов в проток крови; липополисахарид (ЛПС), основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, вызывает воспаление и гибель нейронов черной субстанции.In addition, neuroinflammation may result from the penetration of endotoxins into the blood duct; lipopolysaccharide (LPS), the main component of the cell wall of gram-negative bacteria, causes inflammation and death of neurons of the substantia nigra.

Такие токсические вещества как ЛПС, паракват и другие используются в моделях изучения БП, так как их введение модельным животным вызывает те же изменения, что наблюдаются при БП. Причиной попадания эндотоксинов в кровь может стать нарушенный кишечный барьер (КБ), нормальное функционирование которого, в первую очередь зависит от деятельности кишечной микробиоты (The role of oxidative stress in parkinson's disease. Dias, V., Junn, E., Mouradian, M.M. // Journal of Parkinson's Disease. 2013. 3, 461-491).Toxic substances such as LPS, paraquat, and others are used in BP study models, since their introduction into model animals causes the same changes that are observed in PD. The cause of endotoxin getting into the bloodstream may be a broken intestinal barrier (CB), the normal functioning of which primarily depends on the activity of the intestinal microbiota (The role of oxidative stress in parkinson's disease. Dias, V., Junn, E., Mouradian, MM / / Journal of Parkinson's Disease. 2013.3, 461-491).

Избыток активных форм кислорода и других оксидантов в цитозоле нейрона приводит к необратимой олигомеризации α-синуклеинов, образованию так называемых телец Леви и гибели нейрона (Role of cytochrome с in α-synuclein radical formation: implications of α-synuclein in neuronal death in Maneb- and paraquat-induced model of Parkinson's disease. Kumar A, Ganini D, Mason RP. // Mol Neurodegener. 2016 Nov 24; 11(1):70). Многие исследования указывают на определяющую роль митохондриальных нарушений в развитии PD (Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Ved R., Saha S., Westlund В., et. al // J Biol Chem. 2005 Dec 30; 280(52):42655-42668; Mfn2 protects dopaminergic neurons exposed to paraquat both in vitro and in vivo: Implications for idiopathic Parkinson's disease. Zhao F, Wang W, Wang C, Siedlak SL, Fujioka H, Tang B, Zhu X. // Biochim Biophys Acta. 2017 Jun; 1863(6):1359-1370; Pharmacological manipulations of autophagy modulate paraquat-induced cytotoxicity in PC12 cells. Zhou Q1, Zhang H1, Wu Q1, Shi J1, Zhou S1. Int J Biochem Mol Biol. 2017 Jun 15; 8(2):13-22)An excess of active oxygen species and other oxidants in the cytosol of the neuron leads to irreversible oligomerization of α-synucleins, the formation of the so-called Levy bodies and death of the neuron (Role of cytochrome with in α-synuclein radical formation: implications of α-synuclein in neuronal death in Maneb- and paraquat-induced model of Parkinson's disease. Kumar A, Ganini D, Mason RP. // Mol Neurodegener. 2016 Nov 24; 11 (1): 70). Many studies indicate the decisive role of mitochondrial disorders in the development of PD (Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Ved R., Saha S., Westlund B., et. al // J Biol Chem. 2005 Dec 30; 280 (52): 42655-42668; Mfn2 protects dopaminergic neurons exposed to paraquat both in vitro and in vivo: Implications for idiopathic Parkinson's disease. Zhao F, Wang W, Wang C , Siedlak SL, Fujioka H, Tang B, Zhu X. // Biochim Biophys Acta. 2017 Jun; 1863 (6): 1359-1370; Pharmacological manipulations of autophagy modulate paraquat-induced cytotoxicity in PC12 cells. Zhou Q1, Zhang H1, Wu Q1, Shi J1, Zhou S1. Int J Biochem Mol Biol. 2017 Jun 15; 8 (2): 13-22)

Сегодня известно, что агрегация альфа синуклеинов у людей с БП наблюдается не только в центральной нервной системе (ЦНС), но и в энтеральной нервной системе (ЭНС) (Holmqvist et al., 2014). Дофаминергические нейроны составляют 14-20% энтеральных нейронов верхнего отдела ЖКТ и 1-6% всех энтеральных нейронов нижних его отделов (Anlauf, 2003). Энтеральные глиальные клетки являются другой потенциальной мишенью БП (Clairembault, 2015). По некоторым данным, поражение ЭНЦ является первичным и предшествует появлению нарушений в ЦНС (Colonic biopsies to assess the neuropathology of Parkinson's disease and its relationship with symptoms. Lebouvier, T. et al. // PLoS One. 2010. 5, 1-9; Activity-dependent secretion of alpha-synuclein by enteric neurons. Paillusson, S., Clairembault, Т., Biraud, M., Neunlist, M. & Derkinderen, P. II J. Neurochem. 2013. 125, 512-517; Mind the gut: Secretion of α-synuclein by enteric neurons. Grathwohl, S. A., Steiner, J. A., Britschgi, M. & Brundin, P. // Journal of Neurochemistry 2013. 125, 487-490).Today, it is known that alpha synuclein aggregation in people with PD is observed not only in the central nervous system (CNS), but also in the enteric nervous system (ENS) (Holmqvist et al., 2014). Dopaminergic neurons make up 14-20% of enteric neurons in the upper gastrointestinal tract and 1-6% of all enteric neurons in its lower divisions (Anlauf, 2003). Enteral glial cells are another potential target for PD (Clairembault, 2015). According to some reports, damage to the ECC is primary and precedes the appearance of disorders in the central nervous system (Colonic biopsies to assess the neuropathology of Parkinson's disease and its relationship with symptoms. Lebouvier, T. et al. // PLoS One. 2010. 5, 1-9; Activity-dependent secretion of alpha-synuclein by enteric neurons. Paillusson, S., Clairembault, T., Biraud, M., Neunlist, M. & Derkinderen, P. II J. Neurochem. 2013.125, 512-517; Mind the gut: Secretion of α-synuclein by enteric neurons. Grathwohl, SA, Steiner, JA, Britschgi, M. & Brundin, P. // Journal of Neurochemistry 2013. 125, 487-490).

Болезнь Паркинсона (БП) является хроническим прогрессирующем нейродегенеративным расстройством протекающем без явных симптомов на начальных этапах. По данным ВОЗ, БП постигает 1-2% населения возрастом 60 лет и выше. Причиной является смерть дофаминовых нейронов. Характерным признаком для БП является нарушение фолдинга белка под названием альфа-синуклеин (α-syn), что приводит к формированию его нерастворимой формы с образованием Телец Леви. Среди факторов риска - экспозиция к пестицидам, генетические факторы (мутации в генах PINK1, PARKIN и α-syn или единичные полиморфизмы в гене LRRK2) и оксидативный стресс, провоцированный различными факторами (экология, воспаление) [Окислительный стресс в патогенезе нейродегенеративных заболеваний: возможности терапии. Васенина Е.Е., Левин О.С. // Современная терапия в психиатрии и неврологии. 2013. 3-4. с. 39-46].Parkinson's disease (PD) is a chronic progressive neurodegenerative disorder occurring without obvious symptoms in the initial stages. According to WHO, PD affects 1-2% of the population aged 60 years and above. The cause is the death of dopamine neurons. A characteristic feature of BP is a violation of the folding of a protein called alpha-synuclein (α-syn), which leads to the formation of its insoluble form with the formation of Taurus Levy. Among the risk factors are exposure to pesticides, genetic factors (mutations in the PINK1, PARKIN and α-syn genes, or single polymorphisms in the LRRK2 gene) and oxidative stress provoked by various factors (ecology, inflammation) [Oxidative stress in the pathogenesis of neurodegenerative diseases: treatment options . Vasenina E.E., Levin O.S. // Modern therapy in psychiatry and neurology. 2013 3-4. from. 39-46].

Явные поведенческие изменения и тесты на PD могут быть использованы для диагностики заболевания, когда дегенерация допаминергических нейров достигает 60-80% и лечение уже не эффективно. Помимо выявляемых нарушений в работе ЦНС, для больных БП характерны серьезные нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и энтеральной нервной системы, которые включают в себя: изменение видового состава кишечной микробиоты (КМ), запоры, дисфагию, вздутие, боли в животе, избыточный бактериальный рост в тонкой кишке, нарушение эвакуации желудочного содержимого из желудка в двенадцатиперстную кишку, воспалительные заболевания кишечника, агрегация α-syn в нейронах блуждающего нерва и другие (Gut dysfunction in Parkinson's disease. Mukherjee A., Biswas A., Das S.K. // World J Gastroenterol. 2016 Jul 7; 22(25):5742-52). Многие из этих нарушений предшествуют появлению моторных симптомов БП, и при этом явно связанны с KM (Idiopathic Parkinson's disease: Possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. Braak H.,

U., Gai W. P., Del Tredici KM J. Neural Transm. 2003. 110, 517-536). Для диагностики PD на ранних стадиях разрабатываются различные биохимические методы, определяются биоиндикаторы (Point-of-Care Devices Using Disease Biomarkers To Diagnose Neurodegenerative Disorders. Wei TY, Fu Y, Chang KH, Lin KJ, Lu YJ, Cheng CM. // Trends Biotechnol. 2017 Dec 11. pii: S0167-7799(17)30302-5). Хотя биомаркеры болезни, на сегодняшний день, отсутствуют, немоторные симптомы, в виде запоров, нарушения сна и обоняния, могут возникнут на ранней стадии болезни еще до появления моторных симптомов. А нейродегенеративный процесс может начаться еще за 2 десятка лет до проявления симптомов.Explicit behavioral changes and PD tests can be used to diagnose the disease when dopaminergic neurodegeneration reaches 60-80% and treatment is no longer effective. In addition to the revealed disorders in the central nervous system, PD patients are characterized by serious disorders of the gastrointestinal tract (GIT) and enteric nervous system, which include: a change in the species composition of the intestinal microbiota (CM), constipation, dysphagia, bloating, and abdominal pain , excessive bacterial growth in the small intestine, impaired evacuation of gastric contents from the stomach to the duodenum, inflammatory bowel disease, α-syn aggregation in the vagus neurons and others (Gut dysfunction in Parkinson's disease. Mukherjee A., Biswas A., Das SK / / World J Gastroenterol. 2016 Jul 7; 22 (25): 5742-52). Many of these disorders precede the onset of motor symptoms of PD, and are clearly associated with KM (Idiopathic Parkinson's disease: Possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. Braak H.,

U., Gai WP, Del Tredici KM J. Neural Transm. 2003.110, 517-536). For the diagnosis of PD at an early stage, various biochemical methods are developed, bio-indicators are determined (Point-of-Care Devices Using Disease Biomarkers To Diagnose Neurodegenerative Disorders. Wei TY, Fu Y, Chang KH, Lin KJ, Lu YJ, Cheng CM. // Trends Biotechnol 2017 Dec 11. pii: S0167-7799 (17) 30302-5). Although there are no biomarkers of the disease to date, non-motor symptoms, such as constipation, sleep disturbances, and olfaction, can occur at an early stage of the disease even before motor symptoms appear. And the neurodegenerative process can begin another 2 decades before the onset of symptoms.

Методы профилактики PD на ранних стадиях могут включать различные подходы, в том числе антиоксидантную Tepannio (Neuroprotective effects of coenzyme Q10 on Paraquat-induced Parkinson's disease in experimental animals. Attia H.N., Maklad Y.A. // Behav. Pharmacol. 2018. 29, 79-86).Early prevention methods for PD can include a variety of approaches, including the antioxidant Tepannio (Neuroprotective effects of coenzyme Q10 on Paraquat-induced Parkinson's disease in experimental animals. Attia HN, Maklad YA // Behav. Pharmacol. 2018. 29, 79-86 )

Поскольку окислительный стресс и нейровоспаление играют важную роль в разрушении дофаминергических нейронов в мозгу и развитии БП, сегодня активно ведется поиск антиоксидантов, способных оказать нейропротективный эффект (The role of oxidative stress in Parkinson's disease.. Review. Dias V, Junn E, Mouradian MM. // J Parkinsons Dis. 2013; 3(4):461-91). Применение пробиотиков, отобранных по их антиоксидантному потенциалу, является эффективной стратегией для уменьшения окислительного стресса, нейровоспаления а также укрепления КБ.Since oxidative stress and neuroinflammation play an important role in the destruction of dopaminergic neurons in the brain and the development of PD, an active search for antioxidants that can have a neuroprotective effect (The role of oxidative stress in Parkinson's disease .. Review. Dias V, Junn E, Mouradian MM. // J Parkinsons Dis. 2013; 3 (4): 461-91). The use of probiotics selected by their antioxidant potential is an effective strategy to reduce oxidative stress, neuroinflammation, and strengthen CB.

За рубежом опубликовано большое количество патентов, заявляющих интеллектуальную собственность на препараты-антиоксиданты в том числе и пробиотики для профилактического применения при нейродегенеративных расстройствах включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, и другие.A large number of patents have been published abroad claiming intellectual property on antioxidant drugs, including probiotics for the prophylactic use in neurodegenerative disorders, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and others.

Пробиотики с высокими антиоксидантными свойствами выступают в роли перспективных кандидатов для профилактики БП. Механизмы действия таких штаммов достаточно многообразны и включают в себя: хелатирование токсичных йонов железа (Fe⁺²), синтез ферментов-антиоксидантов (супероксиддисмутаза, глютатион), продукцию веществ с антиокислительными свойствами (витамины B₁ и B₁₂, короткоцепочечные жирные кислоты), регуляцию внутренних систем сигнальной трансдукции эукариотических клеток и активацию транскрипции ферментов, нейтрализующих свободные радикалы (Nrf2-Keap1-ARE, NFκB, MAPK, PKC). На сегодняшний день, в странах зарубежья уже можно найти патенты заявляющие права на применение пробиотиков при БП (WO 2013190068 A1; US 20160199425 A1; WO 2011083354 A1; CN 102858948 В; US 9056123 B2; WO 2003002131 A1).Probiotics with high antioxidant properties are promising candidates for the prevention of PD. The mechanisms of action of such strains are quite diverse and include: chelation of toxic iron ions (Fe ^{+ 2} ), synthesis of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, glutathione), production of substances with antioxidant properties (vitamins B ₁ and B ₁₂ , short chain fatty acids), regulation internal systems of signal transduction of eukaryotic cells and activation of transcription of enzymes that neutralize free radicals (Nrf2-Keap1-ARE, NFκB, MAPK, PKC). Today, patents claiming the right to use probiotics in PD are already found in foreign countries (WO 2013190068 A1; US 20160199425 A1; WO 2011083354 A1; CN 102858948 V; US 9056123 B2; WO 2003002131 A1).

Аналоги разрабатываемого препарата на основе пробиотика/ов направленного/ых на снижение окислительного стресса в организме полностью отсутствуют в России.Analogues of the drug being developed on the basis of a probiotic (s) aimed at reducing oxidative stress in the body are completely absent in Russia.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention

Целью данного изобретения является представление штамма Lactobacillus fermentum U-21 с установленной последовательностью генома, обладающего антиоксидантными свойствами в отношении супероксид-аниона, продуцируемого паракватом.The aim of this invention is to provide a strain of Lactobacillus fermentum U-21 with an established sequence of a genome having antioxidant properties against superoxide anion produced by paraquat.

Источник выделения штамма.Source of strain isolation.

Штамм Lactobacillus fermentum U-21 выделен в 2010 г из фекалий здорового мужчины, жителя центрально-европейской части РФ (т.е. того географического района, где предполагается применять данный препарат-пробиотик), который на момент обследования был клинически здоров и не имел в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний. Была проведена видовая идентификация по биохимическим, морфологическим и генетическим признакам, позже подтвержденная определением нуклеотидной последовательности его ДНК. Штамм L. fermentum U-21 был депонирован в международной коллекции ВКПМ (Москва) под номером В-12075 от 08.10.14., нуклеотидная последовательность генома депонирована в GenBank под номером WGS PNBB00000000.1.The strain Lactobacillus fermentum U-21 was isolated in 2010 from the feces of a healthy man, a resident of the Central European part of the Russian Federation (i.e., the geographical area where this probiotic preparation is supposed to be used), which at the time of the examination was clinically healthy and did not have a history of infectious and somatic diseases. Species identification was carried out by biochemical, morphological and genetic characters, later confirmed by determining the nucleotide sequence of his DNA. The strain L. fermentum U-21 was deposited in the international VKPM collection (Moscow) under the number B-12075 dated 08.10.14., The nucleotide sequence of the genome was deposited in GenBank under the number WGS PNBB00000000.1.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма.The method, conditions and composition of the media for the propagation of the strain.

Штамм культивировали на жидкой и агаризованной средах MRS (Himedia) в течении 24-48 час. Состав среды MRS на 1 литр в граммах: протеозопептон - 10,0; мясной экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; полисорбат 80 - 1,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; сульфат магния - 0,1; сульфат марганца - 0,05; фосфат калия двузамещенный - 2,0. рН (при 25°С) 6,5. Культивирование осуществляли в анаэробных условиях с использованием анаэростата и системы GasPak+. Температура инкубации 37°С.The strain was cultured on liquid and agarized media MRS (Himedia) for 24-48 hours. The composition of the MRS medium per 1 liter in grams: proteozopeptone - 10.0; meat extract - 10.0; yeast extract - 5.0; glucose - 20.0; polysorbate 80 - 1.0; ammonium citrate - 2.0; sodium acetate - 5.0; magnesium sulfate - 0.1; manganese sulfate - 0.05; disubstituted potassium phosphate - 2.0. pH (at 25 ° C) 6.5. Cultivation was carried out under anaerobic conditions using an anaerostat and the GasPak + system. The incubation temperature is 37 ° C.

Продуктивность штаммаStrain productivity

В MRS бульоне продуктивность штамма через 24 часа достигала 10⁹ КОЕ/мл.In MRS broth, strain productivity after 24 hours reached 10 ⁹ CFU / ml.

Культурально-морфологические особенности штаммаCultural and morphological features of the strain

Штамм L. fermentum U-21 при культивировании в течение 48 часов на поверхности агаризованной среды MRS образует образует шероховатые выпуклые колонии кремового оттенка диаметром до 5 мм. При культивировании в жидкой среде MRS в течение 18-24 ч происходит равномерное помутнение среды по всему ее объему с образованием осадка. При микроскопировании обнаруживаются одиночные грамположительные бесспоровые палочки правильной формы с округлыми концами, 2-5 мкм.When cultured for 48 hours, the strain L. fermentum U-21 on the surface of the agarized medium MRS forms rough convex cream-colored colonies with a diameter of up to 5 mm. When cultured in liquid MRS for 18-24 hours, a uniform turbidity of the medium occurs over its entire volume with the formation of a precipitate. Microscopy reveals single gram-positive, non-spore rods of regular shape with rounded ends, 2-5 microns.

Характеристика свойств штаммаCharacterization of strain properties

Штамм чувствителен к хлорамфениколу (30 мг на диске), рифампицину (5 мг), тетрациклину (30 мг), эритромицину (25 мг), линкомицину (15 мг). Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом, измеряя зону ингибирования роста в см.The strain is sensitive to chloramphenicol (30 mg per disk), rifampicin (5 mg), tetracycline (30 mg), erythromycin (25 mg), lincomycin (15 mg). Sensitivity to antibiotics was determined by the disk diffusion method, measuring the zone of growth inhibition in cm.

Штамм ферментирует различные сахара и спирты, фенотипически апатогеннен, т.е. не обладает гемолитической, протеазной, ДНК-азной, РНК-азной и казеиназной активностью.The strain ferments various sugars and alcohols, phenotypically apatogenic, i.e. It does not have hemolytic, protease, DNAase, RNAse and caseinase activity.

Штамм охарактеризован в соответствии с требованиями по биобезопасности, опубликованными в Фармакопейной статье «Пробиотики для медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственный стандарт качества лекарственных средств). Штамм соответствует требованиям Продовольственной и Сельскохозяйственной Организации при ООН (Food and Agriculture organization of the United Nations, FAO) и ВОЗ (2002 г) и общих фармакопейных статей (ОФС) Министерства здравоохранения РФ (2016 год) (http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81), определяющих основные требования к штаммам микроорганизмов, используемым в производстве пробиотиков для медицинского применения.The strain is characterized in accordance with the requirements for biosafety published in the Pharmacopoeia article “Probiotics for medical use” of the Ministry of Health of the Russian Federation (State standard for the quality of medicines). The strain meets the requirements of the Food and Agriculture Organization of the United Nations (Food and Agriculture organization of the United Nations, FAO) and WHO (2002) and the general pharmacopoeial articles (OFS) of the Ministry of Health of the Russian Federation (2016) (http: //www.rosminzdrav. ru / docs / mzsr / regulation / 81), which define the basic requirements for microorganism strains used in the manufacture of probiotics for medical use.

Механизм антиоксидантной активности штамма L. fermentum U-21 установлен с использованием валидированных тест-систем и согласуется с результатами секвенирования и биоинформационного анализа генома. Эти данные позволяют считать, что антиоксидантные свойства обусловлены продукцией ряда биологически-активных веществ в т.ч. тиоредоксина - одного из основных внутриклеточных антиоксидантов - и ферментов его метаболизма.The mechanism of antioxidant activity of the strain L. fermentum U-21 was established using validated test systems and is consistent with the results of sequencing and bioinformation analysis of the genome. These data suggest that the antioxidant properties are due to the production of a number of biologically active substances, including thioredoxin - one of the main intracellular antioxidants - and enzymes of its metabolism.

Технический результатTechnical result

Штамм Lactobacillus fermentum U-21 способный синтезировать комплекс антиоксидантов, обладающих доказанной высокой антиоксидантной активностью, в частности в отношении супероксид-аниона а так же биоактивные материалы, полученные из его биомассы и среды культивирования, обладающие антиоксидантной активностью, в частности в отношении супероксид-аниона, может найти применение в фармакологии и медицине, в частности для сопроводительной терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности синдрома паркинсонизма, индуцированных окислительным стрессом; в косметологии для для повышения антиоксидантного статуса организма и кожных покровов.The strain Lactobacillus fermentum U-21 capable of synthesizing a complex of antioxidants with proven high antioxidant activity, in particular against superoxide anion, as well as bioactive materials obtained from its biomass and culture medium, possessing antioxidant activity, in particular against superoxide anion, may find application in pharmacology and medicine, in particular for the accompanying therapy of neurodegenerative diseases, in particular, Parkinson's syndrome, induced by oxidative stress m; in cosmetology to increase the antioxidant status of the body and skin.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Рисунок 1. Снижение индуцированной паракватом люминесценции стандартными антиоксидантами (тролоксом, липоевой кислотой и глютатионом (в концентрациях 1,5 мМ, 4,5 мМ и 3 мМ соответственно) и культуральной жидкостью штамма L. fermenutm U-21.Figure 1. Decrease in paraquat-induced luminescence by standard antioxidants (trolox, lipoic acid and glutathione (at concentrations of 1.5 mM, 4.5 mM and 3 mM, respectively) and culture fluid of L. fermenutm U-21 strain.

Рисунок 2. Продолжительность жизни C. elegans в 50 мМ растворе параквата в присутствии разных видов лактобацилл в качестве корма по сравнению со стандартным кормом (E.coli ор50).Figure 2. Life expectancy of C. elegans in a 50 mM paraquat solution in the presence of different types of lactobacilli as feed compared to standard feed (E.coli op50).

Рисунок 3. Подавление активности DPPH радикала клетками и бесклеточными экстрактами штаммов лактобацилл.Figure 3. Inhibition of DPPH radical activity by cells and cell-free extracts of lactobacilli strains.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Выбор штаммаStrain selection

Штамм был отобран из коллекции штаммов лактобацилл (Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus и Bifidobacterium по их способности синтезировать гамма-аминомасляную кислоту - один из подходов в получении психобиотиков Юнее, Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С., Козловский Ю.Е., Орлова B.C., Даниленко В.Н. // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. 2016. - №4 - С. 67-79) в 2 этапа.The strain was selected from the collection of lactobacillus strains (Selection of symbiotic bacteria of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium by their ability to synthesize gamma-aminobutyric acid is one of the approaches to obtaining psychobiotics Yunee, R.A., Poluektova E.U., Dyachkova M.S., Kozlovsky Yu.E., Orlova BC, Danilenko VN // Bulletin of the Peoples' Friendship University of Russia, Series: Ecology and life safety. 2016. - No. 4 - P. 67-79) in 2 stages.

1. 89 штаммов 7-ми видов лактобацилл были исследованы с помощью биолюминесцентной тест-системы, где окисление индуцировалось паракватом. Было отобрано 17 штаммов проявивших максимальную антиоксидантную активность (Примеры 1, 2).1. 89 strains of 7 species of lactobacilli were studied using a bioluminescent test system, where oxidation was induced by paraquat. 17 strains with the highest antioxidant activity were selected (Examples 1, 2).

2. Полученные 17 штаммов были проверены на способность снимать паракват-индуцируемый окислительный стресс in vivo на валидированной модели С. elegans. На данном этапе отобранный штамм Lactobacillus fermentum U-21 по антиоксидантной активности значительно превосходил остальные штаммы (Пример 3).2. The resulting 17 strains were tested for their ability to relieve paraquat-induced oxidative stress in vivo in a validated C. elegans model. At this stage, the selected strain of Lactobacillus fermentum U-21 in antioxidant activity significantly superior to other strains (Example 3).

Антиоксидантная активность штаммаAntioxidant activity of the strain

1. Антиоксидантная активность штамма была проверена с помощью биолюминесцентной тест системы, основанной на генно-инженерных штаммах E.coli, несущих lux гены, находящиеся под контролем промоторов каталазы и супероксиддисмутазы. Исследовалась культуральная жидкость штаммов. Сначала к культуре штамма E.coli MG1655 добавляли добавляли культуральную жидкость штаммов лактобацилл, затем паракват, являющийся сильнейшим индуктором оксидативного стресса, обусловленного продукцией супероксид-аниона, что значительно увеличивало люминесценцию. Контролем служили стандартные антиоксиданты (липоевая кислота, глютатион). Определяли изменения индуцированной люминесценции в присутствии культуральных жидкостей и в контроле. Культуральная жидкость штамма Lactobacillus fermentum U-21 снижала индуцированную паракватом люминесценцию на 19,5% (максимальные значения для исследованных проб) (Пример 2).1. The antioxidant activity of the strain was tested using a bioluminescent test system based on genetically engineered E. coli strains carrying lux genes controlled by catalase and superoxide dismutase promoters. The culture fluid of the strains was investigated. First, culture fluid of lactobacillus strains was added to the culture of E. coli strain MG1655, then paraquat, which is the strongest inducer of oxidative stress due to the production of superoxide anion, which significantly increased luminescence. Standard antioxidants (lipoic acid, glutathione) served as a control. The changes in induced luminescence in the presence of culture fluids and in the control were determined. The culture fluid of the strain Lactobacillus fermentum U-21 reduced paraquat-induced luminescence by 19.5% (maximum values for the studied samples) (Example 2).

2. Антиоксидантная активность была исследована in vivo на модели свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans, обработанной раствором параквата (50 мМоль). Штамм L. fermentum U-21 увеличивал продолжительность жизни нематоды на 20-35% по сравнению с контрольными штаммами L.rhamnosus GG и E.coli ор50, а так же другими штаммами Lactobacillus (Пример 3).2. Antioxidant activity was studied in vivo using a model of free-living soil nematode Caenorhabditis elegans treated with a paraquat solution (50 mmol). The strain L. fermentum U-21 increased the nematode life by 20-35% compared with the control strains of L. rhamnosus GG and E. coli op50, as well as other strains of Lactobacillus (Example 3).

3. Общая антиоксидантная активность штамма L. fermentum U-21 была исследована по способности нейтрализовать стабильный радикал DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил). Клетки штамма L. fermentum U-21 подавляли активность радикала в большей степени, чем клетки штамма L. fermentum 279, не проявлявшего антиоксидантных свойств в других тестах, и известного пробиотического штамма L. rhamnosus GG, характеризующегося в том числе антиоксидантной активностью. Наибольшие отличие демонстрировали бесклеточные экстракты штамма U-21 - их активность превосходила активность экстрактов других штаммов в 4-10 раз (Пример 4).3. The total antioxidant activity of the strain L. fermentum U-21 was investigated by its ability to neutralize the stable radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). The cells of the strain L. fermentum U-21 suppressed the activity of the radical to a greater extent than the cells of the strain L. fermentum 279, which did not exhibit antioxidant properties in other tests, and the known probiotic strain L. rhamnosus GG, which was also characterized by antioxidant activity. The greatest difference was demonstrated by cell-free extracts of strain U-21 - their activity exceeded the activity of extracts of other strains by 4-10 times (Example 4).

Продукты, синтезируемые штаммом:Products synthesized by the strain:

При выращивании в питательном бульоне MRS патентуемый штамм синтезирует и секретирует в среду комплекс антиоксидантов, обладающий высокой антиоксидантной активностью в отношении параквата (супероксид-аниона).When grown in MRS nutrient broth, the patented strain synthesizes and secretes into the medium an antioxidant complex with high antioxidant activity against paraquat (superoxide anion).

Нуклеотидная последовательность ДНК штаммаThe nucleotide sequence of the DNA of the strain

Геном штамма был секвенирован с использованием технологий нового поколения на секвенаторе Illumina. Последовательность генома охарактеризована и депонирована в международную базу данных GenBank с номером WGS PNBB00000000.1.The genome of the strain was sequenced using new generation technologies on an Illumina sequencer. The genome sequence is characterized and deposited in the international GenBank database with WGS number PNBB00000000.1.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК штамма L. fermentum U-21 позволило подтвердить видовую принадлежность штамма, а также найти штаммоспецифичный маркер (ген кадмий-устойчивого белка, cadD). Данный ген присутствовал только у данного штамма по сравнению с 36 депонированными геномными последовательностями других штаммов того же вида. Этот ген был использован для создания пары штаммоспецифических праймеров (Пример 5).Determination of the nucleotide sequence of DNA of the strain L. fermentum U-21 made it possible to confirm the species affiliation of the strain and also to find a strain-specific marker (cadmium-resistant protein gene, cadD). This gene was present only in this strain in comparison with 36 deposited genomic sequences of other strains of the same species. This gene was used to create a pair of strain-specific primers (Example 5).

Анализ нуклеоидной последовательности ДНК показал, что штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, а также не содержит генов лекарственной устойчивости, локализованных на мобильных генетических элемента. В геноме штамма были идентифицированы гены, определяющие синтез белков-антиоксидантов (Пример 6).Analysis of the nucleoid DNA sequence showed that the strain is not genetically modified and does not contain the genes of other organisms, and also does not contain drug resistance genes located on mobile genetic elements. In the genome of the strain, genes were identified that determine the synthesis of antioxidant proteins (Example 6).

Примеры определения свойств штамма L. fermentum U-21 по настоящему изобретению.Examples of determining the properties of the strain L. fermentum U-21 of the present invention.

Пример 1. Отбор штаммов лактобацилл. способных подавлять активность супероксид-аниона, на модели биолюминесценции.Example 1. The selection of strains of lactobacilli. capable of suppressing the activity of superoxide anion in a bioluminescence model.

Исследования антиоксидантной активности проводились на валидированной тест-системе (Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. Котова В.Ю., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. // Биотехнология, 2009, №6, С 16-25). Тест-система представляет собой штамм Escherichia coli К12 MG1655, несущий гибридную плазмиду с генами-репортерами люциферин-люциферазного комплекса бактерии Photorhabdus luminescens, подстроенными под промотор гена супероксиддисмутазы (soxS) E.coli. В присутствии супероксид-аниона ⋅O₂- промотор активируется белком-оператором SoxR, что приводит к люминесценции культуры E.coli. Добавление антиоксидантов снижает уровень люминесценции; снижение уровня люминесценции количественно характеризует антиоксидантные свойства исследуемого раствора. Для индукции люминесценции использовали паракват в концентрации 2 mM. Паракват (метилвиологен) является сильнейшим индуктором оксидативного стресса; попадая в клетку он действует как редокс-циклический агент, посредством клеточных ферментов активно продуцирующий супероксид-анион (Pesticides exposure as etiological factors of Parkinson'sdisease and other neurodegenerative diseases-A mechanistic approach. Baltazar M.T., Dinis-Oliveira R.J., Bastos M.L., Tsatsakis A.M., Duarte J.A., Carvalho F. // Toxicology Letters. 2014. 230. 85-103). Исследовали антиоксидантные свойства супернатанта суточной культуры штаммов лактобацилл, а также растворов стандартных антиоксидантов.Studies of antioxidant activity were carried out on a validated test system (Lux biosensors for detecting the SOS response, heat shock and oxidative stress. Kotova V.Yu., Manukhov IV, Zavilgelsky GB // Biotechnology, 2009, No. 6 C 16-25). The test system is a strain of Escherichia coli K12 MG1655, carrying a hybrid plasmid with reporter genes for the luciferin-luciferase complex of the Photorhabdus luminescens bacterium that is tuned to the E. coli superoxide dismutase (soxS) gene promoter. In the presence of the superoxide anion, the ⋅O ₂ - promoter is activated by the SoxR operator protein, which leads to luminescence of the E. coli culture. The addition of antioxidants reduces the level of luminescence; a decrease in luminescence quantitatively characterizes the antioxidant properties of the test solution. To induce luminescence, paraquat at a concentration of 2 mM was used. Paraquat (methyl viologen) is the strongest inducer of oxidative stress; when it enters the cell, it acts as a redox cyclic agent, actively producing a superoxide anion (Pesticides exposure as etiological factors of Parkinson'sdisease and other neurodegenerative diseases-A mechanistic approach. Baltazar MT, Dinis-Oliveira RJ, Bastos ML, Tsatsakis AM, Duarte JA, Carvalho F. // Toxicology Letters. 2014.230. 85-103). The antioxidant properties of the supernatant of the daily culture of lactobacilli strains, as well as solutions of standard antioxidants, were investigated.

Ночную культуру E.coli MG1655 разводили в LB-бульоне до концентрации 10⁷ кл/мл и выращивали при 37°С в течение 2-3 ч. Аликвоты по 180 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета, далее вносили по 10 мкл исследуемой пробы антиоксиданта и индуктора окислительного стресса (параквата). Инкубацию проводили при 37°С. Интенсивность биолюминесценции измеряли на планшетном люминометре Beckman coulter DTX880 через определенные интервалы времени. Для получения супернатанта суточные культуры лактобацилл, выросшие в жидкой среде MRS, осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 6000g.The overnight culture of E. coli MG1655 was diluted in LB broth to a concentration of 10 ⁷ cells / ml and grown at 37 ° C for 2-3 hours. 180 μl aliquots were added to the wells of a 96-well plate, then 10 μl of the test sample was added antioxidant and oxidative stress inducer (paraquat). Incubation was carried out at 37 ° C. The bioluminescence intensity was measured on a Beckman coulter DTX880 luminometer at specific time intervals. To obtain the supernatant, diurnal cultures of lactobacilli grown in MRS liquid medium were precipitated by centrifugation for 10 minutes at 6000 g.

В результате эксперимента были отобраны 17 штаммов лактобацилл, снижавших люминесценцию на 16-25% (Таблица 1).As a result of the experiment, 17 strains of lactobacilli were selected that reduced luminescence by 16–25% (Table 1).

Пример 2. Определение антиоксидантной активности штамма L. fermentum U-21 при помощи биолюминесцентной тест-системы.Example 2. Determination of the antioxidant activity of the strain L. fermentum U-21 using a bioluminescent test system.

Культуральная жидкость штамма Lactobacillus fermentum U-21 уменьшала индуцированную паракватом люминесценцию на 19% (максимальные значения для исследованных проб) (Рисунок 2). В ходе исследований штамм L. fermentum U-21 показал стабильные воспроизводимые результаты.The culture fluid of Lactobacillus fermentum U-21 strain reduced paraquat-induced luminescence by 19% (maximum values for the studied samples) (Figure 2). In the course of research, the strain L. fermentum U-21 showed stable reproducible results.

Пример 3. Влияние на продолжительность жизни нематоды Celegans в среде с паракватом.Example 3. The effect on the life expectancy of the Celegans nematode in a paraquat medium.

Свободноживущая почвенная нематода Celegans - небольшой круглый червь, до 1 мм в длину, обладает хорошо охарактеризованными клеточными линиями и широко используется в лабораторных исследованиях. Благодаря высокой степени гомологии генов Celegans и других организмов, в том числе - человека, эта модель применима для исследования различных экологических факторов, фармацевтических субстанций, отравляющих веществ и механизмов их действия. Мы исследовали действие параквата на продолжительность жизни нематод и влияние штаммов лактобацилл на этот процесс. Все стандартные среды, материалы и манипуляции с нематодами проводили по стандартным методикам (Maintenance of С.elegans. Stiernagle Т. 2006, WormBook ed., doi/10.1895/wormbook. 1.101.1).Celegans free-living soil nematode is a small round worm, up to 1 mm long, has well-characterized cell lines and is widely used in laboratory studies. Due to the high degree of homology of the Celegans genes and other organisms, including humans, this model is applicable for the study of various environmental factors, pharmaceutical substances, toxic substances and their mechanisms of action. We investigated the effect of paraquat on the life expectancy of nematodes and the effect of strains of lactobacilli on this process. All standard media, materials, and nematode manipulations were performed using standard techniques (Maintenance of C. elegans. Stiernagle T. 2006, WormBook ed., Doi / 10.1895 / wormbook. 1.101.1).

Синхронизированные стерильные яйца Celegans, полученные по стандартной методике, переносили на бактериальный газон, состоящий из смеси бактерий: стандартного для лабораторных условий штамма E.coli ор50 и исследуемого штамма лактобацилл и инкубировали в течение 3-х суток при 20°С. Полученные таким образом личинки стадии L4 осторожно переносили в буферный раствор и отмывали от налипших бактерий. В каждую лунку 96 луночной планшеты вносили аликвоты S-среды, 8-12 нематод и водный раствор индуктора оксидативного стресса - параквата. Наблюдения и подсчет активных нематод проводили каждые три часа до гибели 95% от их исходного количества. Исследования каждого штамма проводили при концентрациях параквата 0, 25 и 50 мМоль/литр и в сравнении с нематодами, выросшими в стандартных условиях. После статистической обработки строили график и вычисляли медианную продолжительность жизни нематод. Медианная продолжительность жизни нематод каждой экспериментальной группы сравнивалась с контрольной группой нематод, выращенных в стандартных условиях. Всего было исследовано 17 штаммов лактобацилл разных видов, отобранных с помощью lux-биосенсоров.Celegans synchronized sterile eggs obtained according to the standard method were transferred to a bacterial lawn consisting of a mixture of bacteria: the E. coli strain op50 strain standard for laboratory conditions and the studied lactobacilli strain and incubated for 3 days at 20 ° C. The thus obtained larvae of stage L4 were carefully transferred to the buffer solution and washed from adhering bacteria. Aliquots of S-medium, 8-12 nematodes, and an aqueous solution of an oxidative stress inducer — paraquat — were added to each well of a 96-well plate. Observations and counting of active nematodes were carried out every three hours until the death of 95% of their initial number. Studies of each strain were carried out at paraquat concentrations of 0, 25, and 50 mMol / liter and in comparison with nematodes grown under standard conditions. After statistical processing, a graph was constructed and the median lifespan of nematodes was calculated. The median nematode life span of each experimental group was compared with a control group of nematodes grown under standard conditions. In total, 17 strains of lactobacilli of various species, selected using lux biosensors, were studied.

В присутствии параквата продолжительность жизни нематод сокращается с 10-15 суток до 20-45 часов. Все исследованные 17 штаммов, кроме L. fermentum U-21, изменяли медианную продолжительность жизни в диапазоне 3-7%, что близко к статистической погрешности. Штамм L. fermentum U21 в серии опытов продлевал ее на 16-24% относительно контрольных групп (Рис. 2).In the presence of paraquat, the nematode life span is reduced from 10-15 days to 20-45 hours. All studied 17 strains, except L. fermentum U-21, changed the median life expectancy in the range of 3-7%, which is close to the statistical error. The strain L. fermentum U21 in a series of experiments prolonged it by 16-24% relative to the control groups (Fig. 2).

Пример 4. Определение общей антиоксидантной активности по способности нейтрализовать радикал DPPH.Example 4. Determination of total antioxidant activity by the ability to neutralize the radical DPPH.

Была исследована общая антиоксидантная активность лизата штамма L. fermentum U-21 по способности нейтрализовать стабильный радикал DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил):The total antioxidant activity of the lysate of the strain L. fermentum U-21 was studied by its ability to neutralize the stable radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl):

DPPH* + АО → DPPH-H + АО*,DPPH * + AO → DPPH-H + AO *,

где АО - антиоксидант, АО* - его окисленная форма. В результате восстановления DPPH антиоксидантом снижается пурпурно-синяя окраска DPPH в метаноле, реакция контролируется по изменению оптической плотности спектрофотометрическим методом.where AO is an antioxidant, AO * is its oxidized form. The reduction of DPPH with an antioxidant decreases the purple-blue color of DPPH in methanol, and the reaction is monitored by changing the optical density by spectrophotometric method.

Бактериальную культуру промывали натрий-фосфатным буфером и ресуспендировали в том же буфере, доводили OD600 до 1 (10⁹ КОЕ). Для получения лизата клетки разрушали ультразвуком (Vibra-Cell, Sonic and Materials INC, USA) при 80% амплитуде 5 мин в ледяной бане. Дебрис удаляли центрифигированием 10 тыс g 10 мин. 500 мкл лизата смешивали с равным объемом свежеприготовленного раствора 0,2 mM DPPH (Aldrich) в метаноле, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и определяли OD517. Контроль - раствор DPPH с фосфатным буфером вместо бактерий. Антиоксидантную активность рассчитывали по формулеThe bacterial culture was washed with sodium phosphate buffer and resuspended in the same buffer, and the OD600 was adjusted to 1 (10 ⁹ CFU). To obtain a lysate, the cells were destroyed by ultrasound (Vibra-Cell, Sonic and Materials INC, USA) at 80% amplitude for 5 min in an ice bath. Debris was removed by centrifugation 10 thousand g 10 min. 500 μl of the lysate was mixed with an equal volume of a freshly prepared solution of 0.2 mM DPPH (Aldrich) in methanol, incubated for 30 min at room temperature, and OD517 was determined. Control - DPPH solution with phosphate buffer instead of bacteria. Antioxidant activity was calculated by the formula

Антиоксидантная активность (scavenging activity) (%) =Antioxidant activity (scavenging activity) (%) =

= [1 - (Аобразца/Аконтроля)] × 100= [1 - (Acquisition / Control)] × 100

(Antioxidant activity of various oral Lactobacillus strains. Chooruk et al. IIJ Appl Microbiol. 2017. doi: 10.1111/jam.l3482).(Antioxidant activity of various oral Lactobacillus strains. Chooruk et al. IIJ Appl Microbiol. 2017. doi: 10.1111 / jam.l3482).

Бесклеточные лизаты штамма L. fermentum U-21 подавляли активность радикала в большей степени, чем клетки штамма L. fermentum 279, не проявлявшего антиоксидантных свойств в опытах с люминисцентными биосенсорами и Celegans, и известного пробиотического штамма L. rhamnosus GG в 4-10 раз (Рис. 3).Cell-free lysates of the L. fermentum U-21 strain suppressed radical activity to a greater extent than the cells of the L. fermentum 279 strain, which did not exhibit antioxidant properties in experiments with luminescent biosensors and Celegans, and the well-known probiotic strain L. rhamnosus GG by 4-10 times ( Fig. 3).

Пример 5. Штаммоспецифичные праймеры.Example 5. Strain-specific primers.

Ниже приведена нуклеотидная последовательность уникального для штамма L. fermentum U-21 гена cadD; выделены нуклеотидные последовательности праймеров:The nucleotide sequence of the cadD gene unique to L. fermentum U-21 is shown below; the nucleotide sequences of the primers are highlighted:

Прямой праймер L. ferm. U-21-F

Direct primer L. ferm. U-21-F

Обратный праймер L. ferm. U-21-R

Reverse Primer L. ferm. U-21-R

Размер ПЦР-фрагмента - 267 пн.The size of the PCR fragment is 267 bp.

Данная пара праймеров может быть использована для идентификации штамма.This pair of primers can be used to identify the strain.

Пример 6. Идентификация генов, кодирующих белки-антиоксиданты. в геноме штамма.Example 6. Identification of genes encoding antioxidant proteins. in the genome of the strain.

Поиск генов, кодирующих белки с антиоксидантными свойствами, показал, что геном штамма не содержит генов супероксиддисмутазы, каталазы, синтеза глютатиона, а также его метаболизма (глютатион редуктазы и глютатион пероксидазы). Геном содержит 4 гена тиоредоксина (из них 3 определяют белки с каноническим для тиоредоксина активным сайтом WCGDC), гены тиол-пероксидазы, тиоредоксин редуктазы и пероксидероксина. Эти гены составляют тиоредоксиновую систему, являющуюся основной защитой от окислительного стресса. Работа системы осуществляется посредством дисульфидредуктазной активности, регуляции дитиол/дисульфидного баланса. Тиоредоксин поставляет электроны тиол-зависимой пероксидазе, взаимодействующей с реактивными формами кислорода. Окисленная форма тиоредоксина восстанавливается ферментом тиоредоксин редуктазой. Кроме того, L. fermentum имеет еще одну тиол-пероксидазу - пероксидероксин (субъединицу С щелочной гидропероксид редуктазы); его восстановление осуществляет субъединица F щелочной гидропероксид редуктазы (The thioredoxin antioxidant system. Lu J, Holmgren A. // Free Radic Biol Med. 2014. 66:75-87).A search for genes encoding proteins with antioxidant properties showed that the genome of the strain does not contain genes for superoxide dismutase, catalase, glutathione synthesis, and its metabolism (glutathione reductase and glutathione peroxidase). The genome contains 4 thioredoxin genes (3 of them are proteins with the canonical WCGDC active site for thioredoxin), thiol peroxidase genes, thioredoxin reductase and peroxideoxin. These genes constitute the thioredoxin system, which is the main defense against oxidative stress. The work of the system is carried out by means of disulfide reductase activity, regulation of dithiol / disulfide balance. Thioredoxin supplies electrons to a thiol-dependent peroxidase that interacts with reactive oxygen species. The oxidized form of thioredoxin is reduced by the enzyme thioredoxin reductase. In addition, L. fermentum has another thiol peroxidase, peroxideoxin (subunit C of alkaline hydroperoxide reductase); its recovery is carried out by the subunit F of alkaline hydroperoxide reductase (The thioredoxin antioxidant system. Lu J, Holmgren A. // Free Radic Biol Med. 2014. 66: 75-87).

В геноме идентифицирован также специфический для штамма оперон, состоящий из генов, кодирующих предполагаемую гем-зависимую пероксидазу, MFS (Major Facilitator Superfamily) транспортер и феррохелатазу (конечный фермент ситеза гема). Этот оперон является крайне редким у L. fermentum и обнаруживается только у 3-х из 36 штаммов этого вида из GenBank. Гены, составляющие оперон, могут участвовать в синтезе гема и гем-зависимых ферментов антиоксидантной защиты бактериальной клетки (Таблица 2).The strain-specific operon was also identified in the genome, consisting of genes encoding the putative heme-dependent peroxidase, MFS (Major Facilitator Superfamily) transporter, and ferrochelatase (the end enzyme of heme synthesis). This operon is extremely rare in L. fermentum and is found only in 3 out of 36 strains of this species from GenBank. The genes that make up the operon can be involved in the synthesis of heme and heme-dependent enzymes of the antioxidant defense of a bacterial cell (Table 2).

Claims

The strain Lactobacillus fermentum B-12075, with antioxidant properties, in particular against superoxide anion induced by paraquat, was deposited in the international VKPM collection (Moscow) under the number B-12075 dated 10.10.14, the nucleotide sequence of the genome was deposited in GenBank under the number WGS PNBB00000000.1.