RU2703545C1 - Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes - Google Patents

Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes Download PDF

Info

Publication number
RU2703545C1
RU2703545C1 RU2019117208A RU2019117208A RU2703545C1 RU 2703545 C1 RU2703545 C1 RU 2703545C1 RU 2019117208 A RU2019117208 A RU 2019117208A RU 2019117208 A RU2019117208 A RU 2019117208A RU 2703545 C1 RU2703545 C1 RU 2703545C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hla
drb1
dqb1
sec
sequence
Prior art date
Application number
RU2019117208A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Евгеньевич Павлов
Мария Александровна Глушкова
Тамара Сергеевна Симакова
Сергей Сергеевич Мозгов
Мария Александровна Логинова
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ПАРСЕК ЛАБ"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ПАРСЕК ЛАБ" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ПАРСЕК ЛАБ"
Priority to RU2019117208A priority Critical patent/RU2703545C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2703545C1 publication Critical patent/RU2703545C1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biochemistry.SUBSTANCE: invention relates to the field of biochemistry and molecular biology. What is presented is a set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of genes of the main histocompatibility complex HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 during PCR with further visualization of reaction products by agarose gel electrophoresis.EFFECT: invention provides creation of a new typing system HLA.1 cl, 4 dwg, 7 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Набор предназначен для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и состоит из следующих праймеров: The invention relates to the field of biochemistry and molecular biology, in particular to a set of synthetic oligonucleotides. The kit is designed to determine the sequence of genes of the main histocompatibility complex - HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 by polymerase chain reaction (PCR) and consists of the following primers:

HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTCHLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC

HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGGHLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG

HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACTHLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT

HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATGHLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG

HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCTHLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT

HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGCHLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC

HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTAHLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA

HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTGHLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTGHLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATAHLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA

HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCTHLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCTHLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCTHLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTATHLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT

HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT.HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT.

Цель изобретения – разработка набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости. The purpose of the invention is the development of a set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 of the main histocompatibility complex.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – метод клеточной терапии, применяющийся для лечения гематологических, онкологических, генетических и ряда других заболеваний путем пересадки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), способных полностью восстановить систему гемопоэза и иммунитета в организме после высокодозной химиотерапии [1, 2, 3].Hematopoietic stem cell transplantation is a cell therapy method used to treat hematologic, oncological, genetic and some other diseases by transplanting hematopoietic stem cells (HSCs), which can completely restore the hematopoietic system and immunity in the body after high-dose chemotherapy [1, 2, 3].

Риски отторжения трансплантата и возникновения реакции «трансплантат против хозяина» зависят от качества подбора донора ГСК, совместимого по HLA-системе, характеризующейся высокой вариабельностью [4].The risks of transplant rejection and the occurrence of a graft versus host reaction depend on the quality of the selection of an HSC donor compatible with the HLA system, which is characterized by high variability [4].

По состоянию на 07 февраля 2019 г., число потенциальных доноров ГСК, зарегистрированных в объединенной базе данных о российских донорах BMDS (Bone Marrow Donor Search), составляет 94 204 человека, в неё включены 15 регистров из 11 регионов Российской Федерации [5]. Такое количество безвозмездных доноров на сегодняшний день обеспечило 282 трансплантации ГСК для пациентов российских клиник [6]. As of February 7, 2019, the number of potential GCW donors registered in the joint database of Russian BMDS donors (Bone Marrow Donor Search) is 94 204 people, it includes 15 registers from 11 regions of the Russian Federation [5]. Such a number of donated donors to date has provided 282 HSC transplants for patients in Russian clinics [6].

В последние пять лет наметился явный прогресс во взаимодействии трансплантационных клиник с BMDS, однако многие российские пациенты по-прежнему зависят от донорского материала, получаемого из-за рубежа, либо вообще остаются без совместимого неродственного донора [6].Over the past five years, there has been clear progress in the interaction of transplant clinics with BMDS, but many Russian patients still depend on donor material received from abroad, or even remain without a compatible unrelated donor [6].

Сложившаяся ситуация требует увеличения числа потенциальных доноров ГСК в короткие сроки, а трансплантационные центры диктуют необходимость HLA-типирования доноров молекулярно-генетическими методами как минимум по пяти HLA-локусам. Прогресс в расширении донорской базы ограничивается прежде всего высокой стоимостью реагентов, используемых для проведения массового HLA-типирования доноров и низкой производительностью анализа.The current situation requires an increase in the number of potential HSC donors in a short time, and transplantation centers dictate the need for HLA typing of donors by molecular genetic methods for at least five HLA loci. Progress in expanding the donor base is limited primarily by the high cost of the reagents used for mass HLA typing of donors and low analysis performance.

В настоящее время наибольшее распространение в практике получили четыре технологии HLA-типирования: SSP (Sequence Specific Primers), SSO (Sequence Specific Oligonucleotides), SBT (Sequence Based Typing) и NGS (Next Generation Sequence). Метод SSP характеризуется низкой производительностью, SSO – невозможностью определения отдельных точечных вариаций, что особенно актуально в условиях малоизученных популяций, к которым следует отнести и большинство популяций, проживающих на территории РФ [7]. Технология SBT признана «золотым стандартом» HLA-типирования, с точки зрения идентификации новых аллелей, а при использовании современных многокапиллярных секвенаторов обладает и высокой производительностью. Однако даже существенное масштабирование исследований, выполняемых методом SBT, практически не снижает стоимости типирования. При необходимости изучения дополнительных экзонов/интронов затраты на SBT-типирование возрастают. Наиболее перспективным, с точки зрения увеличения производительности и существенного снижения стоимости HLA-типирования, представляется применение технологии массового параллельного секвенирования (MPS - massive parallel sequencing).Currently, four HLA typing technologies are most widely used in practice: SSP (Sequence Specific Primers), SSO (Sequence Specific Oligonucleotides), SBT (Sequence Based Typing) and NGS (Next Generation Sequence). The SSP method is characterized by low productivity, SSO - the inability to determine individual point variations, which is especially important in conditions of poorly studied populations, which should include the majority of populations living in the Russian Federation [7]. SBT technology is recognized as the “gold standard” of HLA typing in terms of identifying new alleles, and when using modern multi-capillary sequencers, it also has high performance. However, even a significant scaling of studies performed by the SBT method, practically does not reduce the cost of typing. If it is necessary to study additional exons / introns, the cost of SBT typing increases. The most promising, from the point of view of increasing productivity and a significant reduction in the cost of HLA typing, seems to be the use of mass parallel sequencing (MPS) technology.

Стандартный протокол проведения таргетного MPS исследования включает в себя следующие этапы: таргетное обогащение генов, приготовление библиотек, секвенирование, анализ данных.The standard protocol for conducting targeted MPS research includes the following steps: targeted gene enrichment, library preparation, sequencing, data analysis.

Отдаленным аналогом предлагаемого изобретения является набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающего ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) [8]. A remote analogue of the present invention is a set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of 1 intron adjacent to 2 exon, genes of the HLA system of classes I and II (HLA-A and HLA-DRB1) [8].

Техническим результатом заявляемого изобретения является изучение последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости с целью создания системы типирования HLA. Использование предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов позволит проводить таргетную амплификацию при HLA-типировании потенциальных доноров ГСК в высоком разрешении, с возможностью выявления ранее незарегистрированных аллелей. The technical result of the claimed invention is the study of the gene sequences HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 of the main histocompatibility complex in order to create an HLA typing system. Using the proposed set of synthetic oligonucleotides will allow targeted amplification during HLA typing of potential HSC donors in high resolution, with the possibility of identifying previously unregistered alleles.

Для достижения указанного результата проводят ПЦР длинных фрагментов образца ДНК. В отличие от отдалённого аналога, позволяющего получать только последовательность первого интрона генов HLA-A и HLA-DRB1, предлагаемый набор праймеров позволяет определять последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1, что сводит число возможных неоднозначностей типирования к минимуму.To achieve this result, PCR of long fragments of a DNA sample is carried out. Unlike the distant analogue, which allows one to obtain only the sequence of the first intron of the HLA-A and HLA-DRB1 genes, the proposed set of primers allows one to determine the sequences of the entire gene of the HLA-A, HLA-B, HLA-C loci (except for the 3'-UTR site) , the gene region from the first to fifth exon of the HLA-DQB1 locus, the gene region from the second to fourth exon of the HLA-DRB1 locus, which minimizes the number of possible typing ambiguities.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.In the process of conducting a patent information search, no sources were found discrediting the novelty of the alleged invention.

Заявляемое изобретение разработано в ООО «ПАРСЕК ЛАБ».The claimed invention was developed in LLC “PARSEK LAB”.

Осуществление изобретения:The implementation of the invention:

Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Исследуемый препарат ДНК не должен содержать посторонних примесей, соотношение А260/A280 должно составлять 1,7-1,9. Для анализа одного образца требуется 300 нг ДНК (30 мкл ДНК с концентрацией 10нг/мкл для анализа 5 локусов), концентрация геномной ДНК должна быть оценена флуоресцентным методом.The research material is human genomic DNA. The studied DNA preparation should not contain impurities, the ratio A 260 / A 280 should be 1.7-1.9. For analysis of one sample, 300 ng of DNA is required (30 μl of DNA with a concentration of 10 ng / μl for analysis of 5 loci), the concentration of genomic DNA should be estimated by fluorescence.

Использование изобретения возможно в двух форматах моноплексный и мультиплексный:The use of the invention is possible in two formats monoplex and multiplex:

1. Формат – моноплексный.1. The format is monoplex.

Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO4, рН=8,9; 180 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ Mg2+, 10% глицерол).To obtain the gene sequences HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 of the main histocompatibility complex, PCR staging of long fragments using a set of specific primers is used. Additionally, the following components are added to the reaction mixture: a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates at a final concentration of 200 μM each, Taq polymerase (AccuPrime or Encyclo), reaction buffer (600 mM Tris-SO 4 , pH = 8.9; 180 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 mM Mg 2+ , 10% glycerol).

В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующим профилям:A DNA sample is added to the prepared reaction mixture and PCR of long fragments is carried out according to the following profiles:

- для локуса HLA-A- for locus HLA-A

ТемператураTemperature ВремяTime Количество цикловThe number of cycles 94оС94 about With 2 мин2 minutes 1one 98оС98 about With 10 сек10 sec 3535 67оС67 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 3 мин3 min 68оС68 about With 10 мин10 min 1one 4оС4 о С не ограниченоnot limited

- для локуса HLA-B- for locus HLA-B

ТемператураTemperature ВремяTime Количество цикловThe number of cycles 94оС94 about With 2 мин2 minutes 1one 98оС98 about With 10 сек10 sec 3535 60оС60 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5 мин5 minutes 68оС68 about With 10 мин10 min 1one 4оС4 о С не ограниченоnot limited

- для локуса HLA-C- for locus HLA-C

ТемператураTemperature ВремяTime Количество цикловThe number of cycles 94оС94 about With 2 мин2 minutes 1one 98оС98 about With 10 сек10 sec 3535 65оС65 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5 мин5 minutes 68оС68 about With 10 мин10 min 1one 4оС4 о С не ограниченоnot limited

- для локуса HLA-DQB1- for locus HLA-DQB1

ТемператураTemperature ВремяTime Количество цикловThe number of cycles 94оС94 about With 2 мин2 minutes 1one 98оС98 about With 10 сек10 sec 3535 60оС60 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 6 мин6 min 68оС68 about With 10 мин10 min 1one 4оС4 о С не ограниченоnot limited

- для локуса HLA-DRB1- for locus HLA-DRB1

ТемператураTemperature ВремяTime Количество цикловThe number of cycles 94оС94 about With 2 мин2 minutes 1one 98оС98 about With 10 сек10 sec 30thirty 62оС62 about With 30 сек30 sec 68оС68 about With 7 мин7 min 68оС68 about With 10 мин10 min 1one 4оС4 о С не ограниченоnot limited

2. Формат – мультиплексный.2. The format is multiplexed.

Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO4, рН=8,9; 180 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ Mg2+, 10% глицерол).To obtain the gene sequences HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 of the main histocompatibility complex, PCR staging of long fragments using a set of specific primers is used. Additionally, the following components are added to the reaction mixture: a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates at a final concentration of 200 μM each, Taq polymerase (AccuPrime or Encyclo), reaction buffer (600 mM Tris-SO 4 , pH = 8.9; 180 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 mM Mg 2+ , 10% glycerol).

В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующему профилю:A DNA sample is added to the prepared reaction mixture and PCR of long fragments is carried out according to the following profile:

ТемператураTemperature ВремяTime Количество цикловThe number of cycles 94оС94 about With 2 мин2 minutes 1one 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 70оС70 o C 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 69оС69 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 68оС68 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 67оС67 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 66оС66 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 65оС65 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 64оС64 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 63оС63 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 62оС62 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 61оС61 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 60оС60 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 33 59оС59 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 58оС58 about With 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 98оС98 about With 10 сек10 sec 22 57оС57 о С 15 сек15 sec 68оС68 about With 5,5 мин5.5 min 68оС68 about With 10 мин10 min 1one 4оС4 о С не ограниченоnot limited

Оценку наличия продукта реакции ПЦР длинных фрагментов осуществляют электрофорезом в агарозном геле. Размер ампликона должен соответствовать указанному в таблице:Evaluation of the presence of the PCR reaction product of long fragments is carried out by agarose gel electrophoresis. The amplicon size should be as indicated in the table:

HLA-локусHLA locus Размер продукта ПЦР, п.нPCR product size, bp HLA-AHla-a 3 2003,200 HLA-BHla-b 4 6094 609 HLA-CHla-c 3 0003,000 HLA-DQB1HLA-DQB1 6 1006 100 HLA-DRB1HLA-DRB1 4 3004,300

Примеры визуализации продуктов реакции ПЦР длинных фрагментов с использованием набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1.Examples of visualization of PCR reaction products of long fragments using a set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of genes of the main histocompatibility complex - HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1.

Моноплексный формат:Monoplex format:

Figure 00000001
Figure 00000001

Figure 00000002
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000003

Мультиплексный формат:Multiplex format:

Figure 00000004
Figure 00000004

Список литературы:Bibliography:

1. Passweg J.R., Baldomero H., Bader P.et al.; European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants. Bone Marrow Transplant. – 2015. – 50 (4). P. 476–82. 1. Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. et al .; European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants. Bone Marrow Transplant. - 2015 .-- 50 (4). P. 476–82.

2. Syed A. Abutalib, Parameswaran Hari. Clinical Manual of Blood and Bone Marrow Transplantation. – Chichester: Wiley-Blackwell, 2017. – 424 с.2. Syed A. Abutalib, Parameswaran Hari. Clinical Manual of Blood and Bone Marrow Transplantation. - Chichester: Wiley-Blackwell, 2017 .-- 424 p.

3. Кокорев О.В., Чердынцева Н.В., Зайцев К.В., Волгушев С.В. Теоретические и практические аспекты трансплантации стволовых клеток в онкологии // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – № 4 (16). – С. 53–61.3. Kokorev OV, Cherdyntseva NV, Zaitsev KV, Volgushev SV Theoretical and practical aspects of stem cell transplantation in oncology // Siberian Oncological Journal. - 2005. - No. 4 (16). - S. 53–61.

4. Афанасьев Б.В., Зубаровская Л.С., Алянский А.Л. и др. Выбор донора при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Российский журнал детской гематологии и онкологии. – 2016. – Т.3. – С. 30-36.4. Afanasyev B.V., Zubarovskaya L.S., Alyansky A.L. et al. Choice of a donor for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation // Russian Journal of Pediatric Hematology and Oncology. - 2016. - T.3. - S. 30-36.

5. Счетчик регистра (2018). Доступен: http://www.rdkm.rusfond.ru/registr_stat/001 (обновление 10.08.2018). 5. Register counter (2018). Available: http://www.rdkm.rusfond.ru/registr_stat/001 (updated 10.08.2018).

6. Макаренко О.А., Алянский А.Л., Иванова Н.Е. и др. Эффективность поиска неродственного донора гемопоэтических стволовых клеток с помощью российской поисковой системы Bone Marrow Donor Search: опыт НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой // Клиническая онкогематология. – 2017. -№ 10. – С. 39-44.6. Makarenko O.A., Alyansky A.L., Ivanova N.E. et al. The effectiveness of the search for an unrelated donor of hematopoietic stem cells using the Russian search engine Bone Marrow Donor Search: the experience of the Scientific Research Institute of Pediatric Oncology, Hematology and Transplantology R.M. Gorbachev // Clinical oncohematology. - 2017.-№ 10. - S. 39-44.

7. Логинова М.А., Парамонов И.В. Новые HLA-аллели в российских популяциях // Трансфузиология. – 2016. - №3. Т.17. – С.13-20.7. Loginova MA, Paramonov I.V. New HLA alleles in Russian populations // Transfusiology. - 2016. - No. 3. T.17. - S.13-20.

8. Патент Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1). RU 2649064.8. Patent A set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of 1 intron adjacent to 2 exons of genes of the HLA system of classes I and II (HLA-A and HLA-DRB1). RU 2649064.

Claims (17)

Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости - HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 в ходе ПЦР длинных фрагментов (моноплексный и мультиплексный форматы):A set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of genes of the main histocompatibility complex - HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 during PCR of long fragments (monoplex and multiplex formats): HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTCHLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGGHLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACTHLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATGHLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCTHLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGCHLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTAHLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTGHLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTGHLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATAHLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCTHLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCTHLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCTHLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTATHLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTATHLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT с дальнейшей визуализацией продуктов реакции определенного размера методом электрофореза в агарозном геле, отличающийся возможностью определения последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1 в моноплексном и мультиплексном форматах.with further visualization of the reaction products of a certain size by agarose gel electrophoresis, characterized by the ability to determine the sequence of the entire gene of the HLA-A, HLA-B, HLA-C loci (except for the 3'-UTR locus), the gene segment from the first to fifth exon of the HLA locus -DQB1, the gene region from the second to the fourth exon of the HLA-DRB1 locus in monoplex and multiplex formats.
RU2019117208A 2019-06-03 2019-06-03 Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes RU2703545C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019117208A RU2703545C1 (en) 2019-06-03 2019-06-03 Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019117208A RU2703545C1 (en) 2019-06-03 2019-06-03 Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2703545C1 true RU2703545C1 (en) 2019-10-21

Family

ID=68318153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019117208A RU2703545C1 (en) 2019-06-03 2019-06-03 Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2703545C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3006571A1 (en) * 2013-05-09 2016-04-13 Genodive Pharma Inc. Hla gene multiplex dna typing method and kit
EP2735617B1 (en) * 2011-07-21 2018-02-21 Genodive Pharma Inc. Method and kit for dna typing of hla gene
RU2649064C1 (en) * 2016-12-08 2018-04-02 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (ООО "НПФ ДНК-Технология") Set of synthetic oligonucleotides for determination of sequence of 1 intron, adjacent to 2 exon, genes of hla i and ii class system (hla-a and hla-drb1)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2735617B1 (en) * 2011-07-21 2018-02-21 Genodive Pharma Inc. Method and kit for dna typing of hla gene
EP3006571A1 (en) * 2013-05-09 2016-04-13 Genodive Pharma Inc. Hla gene multiplex dna typing method and kit
RU2649064C1 (en) * 2016-12-08 2018-04-02 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (ООО "НПФ ДНК-Технология") Set of synthetic oligonucleotides for determination of sequence of 1 intron, adjacent to 2 exon, genes of hla i and ii class system (hla-a and hla-drb1)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MADELEINE M.M. et al. Comprehensive analysis of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, and HLA-DQB1 loci and squamous cell cervical cancer risk. Cancer Res. 2008 May 1; 68(9): 3532-9. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. Single cell transcriptomic analysis of human mesenchymal stem cells reveals limited heterogeneity
CN103890190B (en) The DNA typing method of HLA gene and kit
CN105339508B (en) Multiple DNA typing method and kit for HLA gene
EP3075863B1 (en) Simple method and kit for dna profiling of hla genes by high-throughput massively parallel sequencer
Danzer et al. Rapid, scalable and highly automated HLA genotyping using next-generation sequencing: a transition from research to diagnostics
US20050250125A1 (en) Method for conducting pharmacogenomics-based studies
Bravo-Egana et al. New challenges, new opportunities: Next generation sequencing and its place in the advancement of HLA typing
Kitcharoen et al. MICA, MICB, and MHC beta block matching in bone marrow transplantation: relevance to transplantation outcome
de Brito Vargas et al. Remarkably low KIR and HLA diversity in Amerindians reveals signatures of strong purifying selection shaping the centromeric KIR region
He et al. Common and well-documented (CWD) alleles of human leukocyte antigen-A,-B,-C,-DRB1, and-DQB1 loci for the Chinese Han population do not quite correlate with the ASHI CWD alleles
CN117925802B (en) Primer composition for HLA-I and HPA multiplex PCR, application and genotyping method
Renaud et al. Gene expression profiling in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
JP7297840B2 (en) Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphism
Assane et al. Human leukocyte antigen–A,–B, and–DRB1 allele and haplotype frequencies in the Mozambican population: A blood donor–based population study
Costantino et al. Human leukocyte antigen allele linkage disequilibrium and haplotype structure in volunteer bone marrow donors of Paraná State
RU2703545C1 (en) Set of synthetic oligonucleotides for determining the sequence of hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 main histocompatibility complex genes
Lahermo et al. MtDNA polymorphism in the Hungarians: comparison to three other Finno‐Ugric‐speaking populations
Bakhit et al. Intrafamilial and interfamilial heterogeneity of PINK1-associated Parkinson's disease in Sudan
CN112609006B (en) Human leukocyte antigen one-step sequencing and typing method and application thereof
Mellet et al. HLA typing: Conventional techniques v. next-generation sequencing
RU2649064C1 (en) Set of synthetic oligonucleotides for determination of sequence of 1 intron, adjacent to 2 exon, genes of hla i and ii class system (hla-a and hla-drb1)
WO2021250530A1 (en) Rapid method for genotyping sting variants in human individuals
CN112746100A (en) Primer, kit and method for KIR genotyping
Sellami et al. Evidence that erythrocyte DARC-positive phenotype can affect the GVHD occurrence after HLA-identical sibling HSCT
RU2800084C2 (en) Method for obtaining molecular X-chromosome STR markers for identifying an unknown individual and determining biological relationship for working with samples of small amounts of DNA and a set of oligonucleotides for its implementation