RU2699792C1 - Method for prediction of survival in patients with clear cell renal cell carcinoma - Google Patents
Method for prediction of survival in patients with clear cell renal cell carcinoma Download PDFInfo
- Publication number
- RU2699792C1 RU2699792C1 RU2018145058A RU2018145058A RU2699792C1 RU 2699792 C1 RU2699792 C1 RU 2699792C1 RU 2018145058 A RU2018145058 A RU 2018145058A RU 2018145058 A RU2018145058 A RU 2018145058A RU 2699792 C1 RU2699792 C1 RU 2699792C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mrna
- genes
- level
- gene
- expression
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Заявляемое изобретение относится к области биомедицины, конкретно к онкологии, способам прогнозирования исхода заболевания у больных раком почки и может быть использовано для определения подходов к лечению, оптимальных сроков динамического наблюдения за больными и объема обследования. The claimed invention relates to the field of biomedicine, specifically to oncology, methods for predicting the outcome of a disease in patients with kidney cancer and can be used to determine treatment approaches, optimal terms for dynamic follow-up of patients and the volume of examination.
Рак почки занимает третье место по частоте среди онкоурологических заболеваний. Наиболее частым типом рака почки (70-80%) является светлоклеточный почечно-клеточный рак. Важную роль в выборе тактики лечения больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) играют факторы прогноза. Однако особенностью протекания этого заболевания является непредсказуемость развития, что затрудняет выбор тактики лечения. Для повышения эффективности лечения необходимы методы, позволяющие прогнозировать развитие заболевания, особенно выживаемость больных. Существующие способы и методы такого прогноза не обладают достаточными характеристиками для надежного прогнозирования. Kidney cancer ranks third in frequency among oncological diseases. The most common type of kidney cancer (70-80%) is clear cell renal cell carcinoma. An important role in the choice of tactics for treating patients with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) is played by prognosis factors. However, a feature of the course of this disease is the unpredictability of development, which complicates the choice of treatment tactics. To increase the effectiveness of treatment, methods are needed to predict the development of the disease, especially the survival of patients. Existing methods and methods of such a forecast do not have sufficient characteristics for reliable forecasting.
Уровень техникиState of the art
Известен способ прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения при раке почки путем исследования пациента, отличающееся тем, что в ткани опухоли определяют тотальную активность протеасом, экспрессию NF-kB р50, HIF-1α содержание сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям:
Y1=-3,2+0,026·Х1+0,03·Х2-0,02·Х3+0,34·Х4+0,3·Х5
Y2=-33,3-0,01·Х1+0,11·Х2-1,2·Х3+1,57·Х4+1,8·Х5,
где X1 - тотальная активность протеасом ·10-3 МЕ/мг белка;
Х2 - содержание VEGF, пг/мг белка;
Х3 - экспрессия HIF-1α, УЕ/мг белка в лунке;
Х4 - экспрессия NF-κВ р50, УЕ/мг белка в лунке;
Х5 - коэффициент NF-κВ р65/50;
и при Y1>Y2 прогнозируют отсутствие, а при Y1<Y2 прогнозируют развитие гематогенных метастазов.There is a method for predicting the development of hematogenous metastases after combined treatment for kidney cancer by examining a patient, characterized in that the total proteasome activity, expression of NF-kB p50, HIF-1α content of vascular endothelial growth factor VEGF are determined in the tumor tissue and discriminant functions Y1, Y2 are calculated according to the equations:
Y1 = -3.2 + 0.026 · X1 + 0.03 · X2-0.02 · X3 + 0.34 · X4 + 0.3 · X5
Y2 = -33.3-0.01 · X1 + 0.11 · X2-1.2 · X3 + 1.57 · X4 + 1.8 · X5,
where X1 - total proteasome activity · 10 -3 IU / mg protein;
X2 — VEGF content, pg / mg protein;
X3 - expression of HIF-1α, PU / mg protein per well;
X4 - expression of NF-κB p50, UE / mg protein per well;
X5 - coefficient NF-κB p65 / 50;
and for Y1> Y2, absence is predicted, and for Y1 <Y2, the development of hematogenous metastases is predicted.
Информативность данных критериев обоснована наличием связи экспрессии NF-кВ p50, HIF-1α и VEGF с возникновением гематогенных метастазов рака почки, полученное при исследовании 65 больных почечноклеточным раком (RU 2528100).The informational content of these criteria is justified by the presence of a relationship between the expression of NF-kV p50, HIF-1α and VEGF with the appearance of hematogenous metastases of kidney cancer, obtained in a study of 65 patients with renal cell carcinoma (RU 2528100).
Известен способ прогнозирования исхода заболевания у больных метастатическим раком почки, при котором проводят морфологическое и иммуногистохимическое исследование операционного материала, отличающийся тем, что определяют уровень экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и при уровне HIF-1α более 6,35 УЕ/мг белка в лунке и VEGF более 32 пг/мг белка прогнозируют благоприятный исход заболевания, а при уровне HIF-1α менее 6,35 УЕ/мг белка в лунке и VEGF менее 32 пг/мг белка прогнозируют неблагоприятный исход заболевания (RU 2589286)There is a method for predicting the outcome of a disease in patients with metastatic kidney cancer, in which a morphological and immunohistochemical study of surgical material is performed, characterized in that the expression level of the transcription factor HIF-1α and vascular endothelial growth factor VEGF is determined and at a level of HIF-1α of more than 6.35 UE / mg protein per well and VEGF more than 32 pg / mg protein predict a favorable outcome, and with a HIF-1α level of less than 6.35 UE / mg protein per well and VEGF less than 32 pg / mg protein, an unfavorable outcome is predicted d disease (RU 2589286)
Известен способ прогнозирование возможного исхода заболевания у больных с метастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки. Для этого проводят морфологическое и иммуногистохимическое исследование операционного материала. Определяют уровень пролиферативной активности опухоли по экспрессии антигена Ki-67 и экспрессию онкогена мутантного типа p53. Гистологическую степень злокачественности опухоли определяют по значению среднего диаметра ядер опухолевых клеток, наличию или отсутствию ядрышек в ядрах опухолевых клеток. Прогноз онкологической выживаемости рассчитывают по формулеA known method for predicting the possible outcome of the disease in patients with metastatic clear cell renal cancer after nephrectomy or kidney resection. For this, a morphological and immunohistochemical study of the surgical material is performed. The tumor proliferative activity level is determined by expression of the Ki-67 antigen and expression of the p53 mutant oncogen. The histological degree of tumor malignancy is determined by the average diameter of the nuclei of the tumor cells, the presence or absence of nucleoli in the nuclei of the tumor cells. The prognosis of cancer survival is calculated by the formula
УМБП=1,83Х1+1,45Х2+1,18Х3,UMBP = 1.83X1 + 1.45X2 + 1.18X3,
где УМБП - морфо-биомолекулярный показатель;where UMPA is a morpho-biomolecular indicator;
X1 - гистологическая степень злокачественности опухоли;X1 - histological degree of tumor malignancy;
Х2 - уровень экспрессии Ki-67;X2 - expression level of Ki-67;
Х3 - уровень экспрессии p53.X3 - expression level of p53.
и при значении умбп≤6,29 прогноз онкологической выживаемости больных скПКР расценивают как благоприятный, при умбп=6,82-8,92 - как относительно благоприятный, при умбп=9,19-11,55 как относительно неблагоприятный, при умбп>11,55 - как неблагоприятный. (RU №2438127, прототип).and with a value of UMB≤6.29, the prognosis of cancer survival of patients with SCCC is regarded as favorable, with UMB = 6.82-8.92 - as relatively favorable, with UMB = 9.19-11.55 as relatively unfavorable, with UMB> 11 , 55 - as unfavorable. (RU No. 2438127, prototype).
Недостатками перечисленных известных способов являются сложность, низкие чувствительность и специфичность, применимость только при метастатическом раке почки, а также длительность исследований и низкая точность прогнозирования выживаемости больных скПКР. The disadvantages of these known methods are complexity, low sensitivity and specificity, applicability only for metastatic kidney cancer, as well as the duration of the studies and the low accuracy of predicting the survival of patients with SCCR.
Техническая проблема, разрешаемая созданием заявляемого изобретения – необходимость разработки более точных маркеров и способов оперативного прогноза. Разрешение этой проблемы позволит прогнозировать выживаемость конкретного больного и, таким образом, персонализировать лечение, расширить арсенал клинически удобных, требующих очень малого количества (менее 1 мкг) мРНК, что дает возможность использовать заявляемый способ для анализа уровня экспрессии мРНК генов в образцах малого размера, для эффективного способа прогнозирования выживаемости больных скПКР на основе найденной группы генов - CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2 – путем выявления уровня экспрессии мРНК нескольких их этих генов или их комбинаций. The technical problem solved by the creation of the claimed invention is the need to develop more accurate markers and methods for operational forecasting. The solution to this problem will allow predicting the survival of a particular patient and, thus, personalizing the treatment, expanding the arsenal of clinically convenient, requiring a very small amount (less than 1 μg) of mRNA, which makes it possible to use the inventive method for analyzing the level of gene mRNA expression in small samples, for an effective method for predicting the survival of patients with SCCR based on the found group of genes - CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 - by detecting the level of mRNA expression of several of these genes or their combinations.
Технический результат при использовании заявляемого способа, обеспечивающий разрешение указанной проблемы заключается в расширении возможностей его применения для прогнозирования выживаемости и обоснованного выбора тактики лечения больных скПКР на разных стадиях развития благодаря повышению чувствительности, специфичности и достоверности результатов прогнозирования, упрощению технологии, сокращению длительности процедур и, тем самым, в увеличению производительности и эффективности исследований. The technical result when using the proposed method, which provides a solution to this problem, consists in expanding the possibilities of its application for predicting survival and making a reasonable choice of treatment tactics for patients with SCCR at different stages of development due to the increased sensitivity, specificity and reliability of the prediction results, simplification of the technology, reduction in the duration of procedures and, therefore, most, in increasing the productivity and effectiveness of research.
Сущность изобретения состоит в том, что способ прогнозирования выживаемости больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) предусматривает получение образцов из опухолевой и нормальной ткани почки, выделение из них мРНК, выполнение обратной транскрипции мРНК и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с продуктами обратной транскрипции с помощью наборов праймеров, специфичных к продуктам обратной транскрипции мРНК генов, для измерения уровня экспрессии мРНК, на основании которого делают прогноз выживаемости больных скПКР путем сравнения уровня экспрессии мРНК генов из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2 в образцах из опухолевой ткани с уровнем экспрессии тех же генов в образцах из нормальной ткани, соотнесенных с уровнями экспрессии мРНК эндогенного контрольного гена, исходя из того, что: The essence of the invention lies in the fact that a method for predicting the survival of patients with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) involves obtaining samples from tumor and normal kidney tissue, isolating mRNA from them, performing mRNA reverse transcription and real-time polymerase chain reaction (PCR-RV) with reverse transcription products using sets of primers specific for the reverse transcription products of mRNA genes to measure the level of mRNA expression, based on which the survival forecast is made the incidence of SCCR patients by comparing the level of mRNA expression of genes from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 group in samples from tumor tissue with the expression level of the same genes in samples from normal tissue correlated with the levels of mRNA expression of the endogenous control gene, based on of the fact that:
- в том случае, если значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани не менее трех генов из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3 и PLIN2 превышают уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а также в том случае, если значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани не менее двух генов из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3 и PLIN2 превышают уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани и, одновременно, значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 ниже уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани, результаты проведенных измерений свидетельствуют в каждом из этих случаев, о благоприятном прогнозе 3,5-летней выживаемости больных с момента постановки диагноза.- if the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of at least three genes from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3 and PLIN2 genes exceed the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples, as well as if the expression level values mRNA of tumor tissue samples of at least two genes from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, and PLIN2 genes exceed the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples and, at the same time, the level of BAP1 gene mRNA expression is lower than the level of mRNA expression of this gene in normal tissue samples , the results of measurements indicate in each of these cases, a favorable prognosis of 3.5-year patient survival from the time of diagnosis.
Предпочтительно, в качестве мРНК эндогенного контрольного гена используют мРНК гена из группы: GAPDH и ACTB, а прогноз признают благоприятным в том случае, если значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов, выбранных для анализа из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3 и PLIN2 превышают, по меньшей мере, в 3,3; 2; 2; 3,5 и 1,5 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а также в том случае, если значение уровня экспрессии мРНК выбранного для анализа гена BAP1 ниже, по меньшей мере, в 2,5 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. Preferably, the mRNA of the gene group: GAPDH and ACTB is used as the mRNA of the endogenous control gene, and the prognosis is considered favorable if the mRNA expression level of the tumor tissue samples of genes selected for analysis from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3 and PLIN2 groups exceed at least 3.3; 2; 2; 3.5 and 1.5 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples, and also if the value of the mRNA expression level of the BAP1 gene selected for analysis is lower than at least 2.5 times expression of mRNA of this gene in normal tissue samples.
Предпочтительно, выделение мРНК образцов из опухолевой и нормальной ткани почки проводят путем лизиса образцов в растворе гуанидинтиоционата, сорбции мРНК на колонках, отмывках мРНК в спиртовых растворах и элюции мРНК.Preferably, mRNA is isolated from tumor and normal kidney tissue by lysis of the samples in a solution of guanidine thiocyanate, sorption of mRNA on columns, washing of mRNA in alcohol solutions and elution of mRNA.
Предпочтительно, наличие и качество выделенной мРНК проверяют с помощью электрофореза в 1,8% агарозном геле при постоянной силе тока 130 мА в течение 30 мин, а оценку полученных электрофорезом фрагментов проводят на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете.Preferably, the presence and quality of the isolated mRNA is checked by electrophoresis in a 1.8% agarose gel at a constant current of 130 mA for 30 minutes, and fragments obtained by electrophoresis are evaluated on a transilluminator in ultraviolet light.
Предпочтительно, https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D1%84%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F_%28%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F%29 - cite_note-1амплификацию при полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) проводят в режиме реального времени в термоциклере в следующих режимах:Preferably, https://en.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D1%84%D0%B8%D0%BA%D0%B0 % D1% 86% D0% B8% D1% 8F_% 28% D0% BC% D0% BE% D0% BB% D0% B5% D0% BA% D1% 83% D0% BB% D1% 8F% D1% 80 % D0% BD% D0% B0% D1% 8F_% D0% B1% D0% B8% D0% BE% D0% BB% D0% BE% D0% B3% D0% B8% D1% 8F% 29 - cite_note-1 amplification when polymerase chain reaction (PCR-RV) is carried out in real time in a thermal cycler in the following modes:
причем в диапазоне температуры 60,0°С – 95,0°С производят снятие кривой плавления путем наблюдения интенсивности флуоресценции продуктов ПЦР (ампликонов) при ступенчатом изменении температуры с шагом в 1°С. moreover, in the temperature range 60.0 ° C - 95.0 ° C, the melting curve is recorded by observing the fluorescence intensity of the PCR products (amplicons) with a stepwise change in temperature in increments of 1 ° C.
Предпочтительно, перед проведением реакции обратной транскрипции выравнивают концентрации мРНК в контрольных и экспериментальных образцах из опухолевой и нормальной ткани почки, смешивают водный раствор мРНК (0,3 – 1,5 мкг) с гексапраймером Random 6 и реакционной смесью, включающей: буфер 5x, MgCl2 – 25mM, dNTP – 10 mM, а обратную транскрипцию вышеупомянутой смеси проводят в термоциклере в следующих режимах: 250С – 10 мин. , 420С – 1час, 700С – 10мин.Preferably, before carrying out the reverse transcription reaction, mRNA concentrations in control and experimental samples from tumor and normal kidney tissue are leveled, an aqueous mRNA solution (0.3-1.5 μg) is mixed with Random 6 hexaprimer and a reaction mixture comprising: 5x buffer, MgCl 2 - 25mM, dNTP - 10 mM, and the reverse transcription of the above mixture is carried out in a thermal cycler in the following modes: 25 0 С - 10 min. , 42 0 С - 1 hour, 70 0 С - 10 min.
В частных случаях реализации способа определяют уровень экспрессии мРНК генов с использованием красителя Eva Green, для чего для каждого исследуемого гена конструируют олигонуклеотидные F - прямой праймер и R - обратный праймер следующей структуры и состава In particular cases of the method implementation, the level of gene mRNA expression is determined using the Eva Green dye, for which oligonucleotide F - direct primer and R - reverse primer of the following structure and composition are designed for each gene studied
В иных частных случаях реализации определяют уровень экспрессии генов с использованием наборов праймеров TaqMan® Gene Expression Assay, в следующих сочетаниях указанных наборов и генов. In other particular cases of implementation, the level of gene expression is determined using TaqMan® Gene Expression Assay primer sets, in the following combinations of these sets and genes.
При этом для каждого исследуемого образца из опухолевой и нормальной ткани почки, составляют смесь общим объемом 20 мкл, содержащую: 1мкл. набора праймеров TaqMan® Gene Expression Assay, 10 мкл. набора TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1,6 мкл. комплементарной ДНК (1 мкл.), 7,4 мкл. деионизированной воды, которую встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 сек., а ПЦР-РВ проводят на приборе Step One Plus в следующих режимах:Moreover, for each test sample from the tumor and normal tissue of the kidneys, a mixture with a total volume of 20 μl, containing: 1 μl. TaqMan® Gene Expression Assay primer kit, 10 μl. TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1.6 μl. complementary DNA (1 μl.), 7.4 μl. deionized water, which is shaken on a vortex and centrifuged for 5 seconds, and PCR-PB is carried out on a Step One Plus device in the following modes:
Настоящее изобретение основано на том, что обнаружено и подтверждено наличие ассоциации уровней экспрессии группы генов с прожитием более и менее 3,5 лет. Анализ уровней экспрессии матричной РНК (мРНК) 200 генов в опухолях скПКР и нормальной ткани того же органа позволил выявить 4 гена, связанных с выживаемостью больных раком почки: CA9, VWF, BHLHE41 и EGLN3. Было выяснено, все эти гены прямо регулируются транскрипционным фактором HIF1α. Дополнительно на связь экспрессии с выживаемостью были проанализированы шесть генов, 4 регулируемых транскрипционным фактором HIF2α: PLIN2, CCND1, MMP1, SK1 и два гена, связанных с выживаемостью больных скПКР по данным литературы: MKI67, BAP1. Надежную ассоциацию с выживаемостью продемонстрировали гены BAP1 и PLIN2. The present invention is based on the fact that the presence of an association of expression levels of a group of genes with a life of more and less than 3.5 years is detected and confirmed. Analysis of the expression levels of messenger RNA (mRNA) of 200 genes in tumors of scKPR and normal tissue of the same organ revealed 4 genes associated with the survival of patients with kidney cancer: CA9, VWF, BHLHE41 and EGLN3. It was found that all these genes are directly regulated by the transcription factor HIF1α. Additionally, six genes, 4 regulated by the transcription factor HIF2α: PLIN2, CCND1, MMP1, SK1 and two genes associated with the survival of patients with SCCR according to the literature: MKI67, BAP1, were analyzed for the relationship of expression with survival. Reliable association with survival has been demonstrated by the BAP1 and PLIN2 genes.
В результате сформирован набор (панель) генов для прогнозирования выживаемости на основе измерения уровня экспрессии мРНК в опухолевых образцах и образцах нормальной ткани одного и того же органа, включающий гены CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2. As a result, a set (panel) of genes was generated for predicting survival based on measuring the level of mRNA expression in tumor samples and normal tissue samples of the same organ, including the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1, and PLIN2 genes.
Реализация изобретенияThe implementation of the invention
Способ прогнозирования выживаемости больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) реализуется следующим образом.A method for predicting the survival of patients with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) is implemented as follows.
Использование настоящего изобретения предусматривает измерение уровня экспрессии мРНК генов в опухоли относительно нормальной (гистологически не измененной) ткани почки. The use of the present invention provides for measuring the level of gene mRNA expression in a tumor relative to normal (histologically unchanged) kidney tissue.
Способ предусматривает следующие основные процедуры: выделение мРНК из операционного материала опухолевой и нормальной ткани почки; обратная транскрипция мРНК; полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) с продуктами обратной транскрипции, оценка качества проведенной ПЦР-РВ, анализ полученных данных, определение качества и измерение концентрации водного раствора суммарной мРНК;The method involves the following basic procedures: isolation of mRNA from the surgical material of tumor and normal kidney tissue; reverse transcription of mRNA; real-time polymerase chain reaction (PCR-RV) with reverse transcription products, quality assessment of PCR-RV, analysis of the obtained data, quality determination and measurement of the concentration of an aqueous solution of total mRNA;
Выделение мРНК.Isolation of mRNA.
Выделение мРНК из материала выполняется с помощью, например, набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США) согласно инструкции к набору. Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата, сорбции мРНК на колонках, отмывках мРНК в спиртовых растворах и элюции РНК. Isolation of mRNA from the material is performed using, for example, the RNeasy Mini Kit (QIAGEN, USA) according to the instructions for the kit. The method is based on lysis of samples in a solution of guanidine thiocyanate, sorption of mRNA on columns, washing of mRNA in alcohol solutions and elution of RNA.
Наличие и качество мРНК проверяется с помощью, например, электрофореза в 1,8% агарозном геле. Электрофорез проводится, например, в горизонтальном аппарате для электрофореза SUB CELL 96 BIO-RAD производства США при постоянной силе тока 130 мА в течение 30 мин. Оценка полученных фрагментов может быть проведена на трансиллюминаторе Whatman-Biometra TL-3 в ультрафиолетовом свете. К качественным относятся образцы с четкими полосами 18S и 28S РНК на картине электрофореза без видимой примеси ДНК.The presence and quality of mRNA is checked using, for example, electrophoresis in a 1.8% agarose gel. Electrophoresis is carried out, for example, in a horizontal apparatus for electrophoresis SUB CELL 96 BIO-RAD manufactured in the USA with a constant current of 130 mA for 30 minutes Evaluation of the obtained fragments can be carried out on a Whatman-Biometra TL-3 transilluminator in ultraviolet light. Qualitative ones include samples with clear bands of 18S and 28S RNA in the electrophoresis picture without visible DNA impurity.
Концентрация водного раствора мРНК определяется, например, на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, США) согласно инструкции к прибору.The concentration of an aqueous mRNA solution is determined, for example, on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) according to the instructions for the device.
В случае определения уровня экспрессии с использованием красителя Eva Green реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора ImProm-II™ Reverse Transcription System (США) в соответствии с инструкцией производителя. Перед проведением реакции обратной транскрипции концентрации мРНК выравнивали в контрольных и экспериментальных образцах. Далее водный раствор РНК (0,3 – 1,5 мкг) смешивали с гексапраймером Random 6 и реакционной смесью (буфер 5x, MgCl2 – 25mM, dNTP – 10 mM, обратная транскриптаза) вышеупомянутого набора и проводили реакцию в термоциклере (ЗАО НПФ ДНК - Технология, Россия). С заданной программой 250С – 10 мин., 420С – 1час, 700С – 10мин. When determining the level of expression using the Eva Green dye, the reverse transcription reaction was performed using the ImProm-II ™ Reverse Transcription System kit (USA) in accordance with the manufacturer's instructions. Before the reverse transcription reaction, mRNA concentrations were aligned in the control and experimental samples. Next, an aqueous RNA solution (0.3 - 1.5 μg) was mixed with Random 6 hexaprimer and the reaction mixture (5x buffer, MgCl 2 - 25 mM, dNTP - 10 mM, reverse transcriptase) of the above kit and the reaction was carried out in a thermal cycler (ZAO NPF DNA - Technology, Russia). With the given program 25 0 С - 10 min., 42 0 С - 1 hour, 70 0 С - 10 min.
Для анализа с помощью красителя Eva Green были сконструированы олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) следующей структуры и состава (таблица 1).For analysis using the Eva Green dye, oligonucleotide primers were designed for real-time polymerase chain reaction (PCR-PB) of the following structure and composition (table 1).
Предпочтительно, для подготовки каждого исследуемого образца, составляется смесь общим объемом 25 мкл, содержащую: по 0,25 мкМ каждого оригинального олигонуклеотида (праймера); по 200 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата; 1,0 единица активности taq – полимеразы (СибЭнзим, Россия); буфер для ПЦР (670 мМ трис pH 8,8, 166 мМ сульфата аммония, 20 мМ MgCl2 и 0,1% Tween 20); интеркалирующий краситель SYBR Green1 0,1 мкл (100x), затем полученную смесь встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 сек., а амплификацию проводят в термоциклере в режиме:Preferably, for the preparation of each test sample, a mixture with a total volume of 25 μl is prepared, containing: 0.25 μM of each original oligonucleotide (primer); 200 μM of each nucleoside triphosphate; 1.0 unit of taq activity - polymerase (SibEnzyme, Russia); PCR buffer (670 mm Tris pH 8.8, 166 mm ammonium sulfate, 20 mm MgCl 2 and 0.1% Tween 20); intercalating dye SYBR Green1 0.1 μl (100x), then the resulting mixture is shaken on a vortex and centrifuged for 5 seconds, and amplification is carried out in a thermal cycler in the following mode:
причем в диапазоне температуры 60,0°С – 95,0°С производят снятие кривой плавления ПЦР продуктов с шагом в 1°С. moreover, in the temperature range 60.0 ° C - 95.0 ° C, the melting curve of the PCR products is removed in increments of 1 ° C.
В случае определения уровня экспрессии с использованием наборов TaqMan все процедуры проводятся в соответствии с инструкцией производителя.In the case of determining the expression level using TaqMan kits, all procedures are carried out in accordance with the manufacturer's instructions.
Определение уровней экспрессии мРНК методом TaqMan проводится с использованием наборов TaqMan® Gene Expression Assay фирмы Applied Biosystems, США. Перечень наборов TaqMan приведен в таблице 2. TaqMan mRNA expression levels were determined using TaqMan® Gene Expression Assay kits from Applied Biosystems, USA. A list of TaqMan kits is shown in Table 2.
Для каждого образца, составляют смесь общим объемом 20 мкл, содержавшую: 1мкл TaqMan® Gene Expression Assay, 10 мкл TaqMan ® Gene Expression Master Mix, 1,6 мкл комплементарной ДНК (1-100 нг), 7,4 мкл деионизированной воды. Полученную смесь встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 сек. ПЦР-РВ проводили на приборе Step One Plus (Applied Biosystems, США) в следующем режиме:For each sample, a mixture was made with a total volume of 20 μl, containing: 1 μl of TaqMan® Gene Expression Assay, 10 μl of TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1.6 μl of complementary DNA (1-100 ng), 7.4 μl of deionized water. The resulting mixture was shaken on a vortex and centrifuged for 5 seconds. PCR-RV was performed on a Step One Plus device (Applied Biosystems, USA) in the following mode:
Выполняется ПЦР-РВ для определения уровня экспрессии мРНК каждого гена, выбранного из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2, как для образцов опухолевой ткани, так и для образцов нормальной ткани. В каждом эксперименте предусмотрен негативный контроль (ПЦР-смесь без матрицы - кДНК).PCR-RV is performed to determine the level of mRNA expression of each gene selected from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 groups, both for tumor tissue samples and normal tissue samples. In each experiment, a negative control is provided (PCR mixture without a matrix - cDNA).
В качестве эндогенных контролей используются гены GAPDH и ACTB.The GAPDH and ACTB genes are used as endogenous controls.
При анализе результатов данные, полученные относительно эндогенного контрольного гена GAPDH или ACTB, являлись сопоставимыми (эквивалентными). Указанные гены используются в качестве контрольных, так как экспрессируются в исследуемых клетках и тканях независимо от статуса заболевания на примерно одинаковом уровне (то есть, количества мРНК этих генов примерно одинаковы) в образцах опухоли и в нормальной ткани. Их применение позволяет нормировать суммарное количество РНК. В результатах (примерах 1-5) представлены данные относительно гена GAPDH или ACTB. Результаты сравнения уровня экспрессии мРНК генов (генов-маркеров) из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2 в образцах из опухолевой ткани с уровнем экспрессии тех же генов в образцах из нормальной ткани, соотнесенных с уровнями экспрессии мРНК эндогенного контрольного гена, выражают как отношение экспрессии мРНК гена-маркера относительно экспрессии мРНК эндогенного контрольного гена в образце опухоли к такому же соотношению в образце нормальной ткани. When analyzing the results, the data obtained relative to the endogenous control gene GAPDH or ACTB were comparable (equivalent). These genes are used as control ones, as they are expressed in the studied cells and tissues regardless of the disease status at approximately the same level (that is, the amounts of mRNA of these genes are approximately the same) in tumor samples and in normal tissue. Their use allows normalizing the total amount of RNA. The results (Examples 1-5) present data on the GAPDH or ACTB gene. The results of comparing the expression level of mRNA genes (marker genes) from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1, and PLIN2 groups in tumor tissue samples with the expression level of the same genes in normal tissue samples correlated with the levels of endogenous control gene mRNA expression, expressed as the ratio of the expression of the mRNA of the marker gene relative to the expression of the mRNA of the endogenous control gene in the tumor sample to the same ratio in the sample of normal tissue.
Относительные количества мРНК в опухолевой и нормальной ткани, соотнесенные с уровнями мРНК эндогенного контрольного гена, вычисляются с помощью программного обеспечения Step One Software. В результате получают значения изменения экспрессии в опухолевой ткани относительно нормальной (RQ). Уровень снижения мРНК равен 1/RQ и показывает, во сколько раз содержание мРНК гена снижено в опухоли по сравнению с нормальными тканями, уровень повышения мРНК равен RQ и показывает, во сколько раз содержание мРНК гена повышено в опухоли по сравнению с нормальными тканями.The relative amounts of mRNA in the tumor and normal tissue, correlated with the mRNA levels of the endogenous control gene, are calculated using Step One Software. As a result, the values of the expression change in the tumor tissue are relatively normal (RQ). The level of mRNA reduction is equal to 1 / RQ and shows how many times the mRNA content of the gene is reduced in the tumor compared to normal tissues, the level of mRNA increase is equal to RQ and shows how many times the content of the mRNA of the gene is increased in the tumor compared to normal tissues.
Больных разделили на две группы: с длительностью жизни больше 3,5 лет (благоприятный прогноз) и менее 3,5 лет (неблагоприятный прогноз) с момента постановки диагноза. Для выявления статистически значимых различий в уровнях экспрессии генов в группах больных с разной продолжительностью жизни применили ROC-анализ. Полученные данные, показывающие связь экспрессии генов с выживаемостью: ROC анализ, представлены в таблице 3.Patients were divided into two groups: with a life expectancy of more than 3.5 years (favorable prognosis) and less than 3.5 years (unfavorable prognosis) from the moment of diagnosis. To identify statistically significant differences in gene expression levels in groups of patients with different life expectancies, ROC analysis was used. The obtained data showing the relationship of gene expression with survival: ROC analysis are presented in table 3.
Основой ROC-анализа является построение ROC-кривой, которая отражает зависимость доли правильно классифицированных положительных результатов от доли ложноположительных результатов. Такие кривые называют Receiver Operating Characteristic curve — «операционные характеристические кривые наблюдателя», или, сокращенно, ROC-curve (ROC-кривые), а действия, выполняемые для их построения и расчетов значимости различий, значений чувствительности и специфичности — ROC-анализом. The basis of the ROC analysis is the construction of the ROC curve, which reflects the dependence of the proportion of correctly classified positive results on the proportion of false positive results. Such curves are called Receiver Operating Characteristic curve - “observer's operational characteristic curves”, or, in short, ROC-curve (ROC-curves), and the actions performed to construct them and calculate the significance of differences, sensitivity and specificity are called ROC analysis.
Как следует из данных в табл. 2, все 6 генов - CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2 - имеют статистически значимые отличия по уровню экспрессии между группами больных скПКР с разной длительностью жизни. Значения уровня экспрессии этих генов, превышающие определенный критерий отсечения (или находящиеся ниже в случае гена BAP1), свидетельствуют о благоприятном прогнозе 3,5-летней выживаемости. Чувствительность определения выживаемости с помощью экспрессии этих генов находится в интервале 71% - 93%, специфичность - в интервале 70% - 90%. То есть, эти показатели достаточно высокие. Полученные значения площади под кривой AUC показывают, гены CA9, VWF, BHLHE41 и EGLN3 являются отличными классификаторами, а гены BAP1 и PLIN2 - хорошие классификаторы больных скПКР по прогнозируемой продолжительности жизни. As follows from the data in table. 2, all 6 genes — CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1, and PLIN2 — show statistically significant differences in the expression level between groups of patients with SCCR with different lifespan. Values of the expression level of these genes that exceed a certain cut-off criterion (or are lower in the case of the BAP1 gene) indicate a favorable prognosis of 3.5-year survival. The sensitivity of determining survival by expression of these genes is in the range of 71% - 93%, specificity is in the range of 70% - 90%. That is, these indicators are quite high. The obtained values of the area under the AUC curve show that the CA9, VWF, BHLHE41, and EGLN3 genes are excellent classifiers, and the BAP1 and PLIN2 genes are good classifiers of patients with SCCR with a predicted life expectancy.
При этом выявление уровня экспрессии генов CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, и PLIN2 выше критерия отсечения в пораженной раком ткани человека, по сравнению со здоровой тканью почки (или ниже в случае гена BAP1) служит прогностическим признаком выживаемости больных скПКР. Заявленный способ прогнозирования выживаемости больных скПКР позволяет на основе уровня экспрессии генов или их комбинаций с высокой специфичностью и чувствительностью прогнозировать выживаемость больных скПКР.Moreover, the detection of the expression level of the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, and PLIN2 genes above the cut-off criterion in human cancerous tissue compared with healthy kidney tissue (or lower in the case of the BAP1 gene) serves as a prognostic sign of survival of patients with SCCR. The claimed method for predicting the survival of patients with SCCC allows the prediction of the survival of patients with SCCR based on the level of gene expression or their combinations with high specificity and sensitivity.
Процедура реализации способа прогнозирования выживаемости больных светлоклеточным почечно-клеточным раком состоит в том, что у обследуемых лиц берут образцы пораженной раком ткани почки и нормальной ткани того же органа, производят выделение и очистку РНК из взятых образцов и производят методом ПЦР в реальном времени анализ уровня экспрессии РНК с применением праймеров, специфичных к продуктам обратной транскрипции РНК генов, прогнозируют выживаемость больных скПКР по уровню экспрессии в раковой опухоли относительно нормальной ткани какого-либо гена из группы генов: CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2 или их комбинаций. The procedure for implementing the method for predicting the survival of patients with clear cell renal cell carcinoma consists in taking samples of cancerous kidney tissue and normal tissue of the same organ from the examined individuals, isolating and purifying RNA from the samples taken, and performing expression analysis using real-time PCR RNA using primers specific for the products of reverse transcription of RNA genes predict the survival of patients with SCCR by the level of expression in a cancer tumor relative to normal tissue and any gene of the group of genes: CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 or combinations thereof.
Анализ связи уровня экспрессии мРНК набора указанных 6 генов с выживаемостью больных скПКР может быть осуществлен рядом методов. В частности была проведена оценка значимости различий кривых выживаемости, построенных по Каплан-Мейеру. Программное обеспечение позволяет построить кривые выживаемости больных, характеризующиеся разным уровнем экспрессии генов – выше или ниже критерия отсечения, определенного при ROC – анализе. Статистическую значимость различий кривых выживаемости при разном уровне экспрессии генов оценивали с помощью лог-ранк теста. An analysis of the relationship between the level of mRNA expression of a set of these 6 genes and the survival of patients with SCCR can be carried out by a number of methods. In particular, the significance of differences in survival curves constructed by Kaplan-Meyer was evaluated. The software allows constructing survival curves of patients characterized by different levels of gene expression - above or below the cut-off criterion determined by ROC analysis. The statistical significance of differences in survival curves at different levels of gene expression was evaluated using the log rank test.
Результаты сравнения кривых выживаемости с помощью лог-ранк теста представлены в таблице 4. The results of comparing survival curves using the log-rank test are presented in table 4.
Для увеличения надежности результатов было использовано несколько статистических критериев. Результаты, полученные с помощью точного критерия Фишера, представлены в таблице 5. Пороговые значения уровней экспрессии, использованные при этой статистической обработке, были определены при ROC-анализе. To increase the reliability of the results, several statistical criteria were used. The results obtained using the exact Fisher test are presented in table 5. The threshold values of expression levels used in this statistical processing were determined by ROC analysis.
Как видно из данных в табл. 5, значимо связанной с выживаемостью оказалась экспрессия тех же генов, которые были выявлены при ROC-анализе и тесте лог-ранк (таблицы 3 и 4).As can be seen from the data in table. 5, the expression of the same genes that were identified during the ROC analysis and the log-rank test turned out to be significantly related to survival (tables 3 and 4).
Показатели общей выживаемости оказались существенно выше у больных с повышенной экспрессией генов CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, PLIN2 и с пониженной экспрессией гена BAP1 в опухоли, по сравнению с пациентами, у которых экспрессия этих генов снижена или повышена в случае гена BAP1 (в среднем доля проживших более 3,5 лет различается почти в 5 раз в связи с уровнем экспрессии). The overall survival rates were significantly higher in patients with increased expression of the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, PLIN2 genes and with reduced BAP1 gene expression in the tumor, compared with patients in whom the expression of these genes was reduced or increased in the case of the BAP1 gene (average the proportion of those living more than 3.5 years varies by almost 5 times due to the level of expression).
Повышение экспрессии генов CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, PLIN2 и понижение экспрессии гена BAP1 является благоприятным прогностическим фактором для срока жизни больных, а снижение экспрессии этих генов или повышение в случае гена BAP1 – неблагоприятным. An increase in the expression of the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, PLIN2 genes and a decrease in the expression of the BAP1 gene is a favorable prognostic factor for the patients' lifespan, while a decrease in the expression of these genes or an increase in the case of the BAP1 gene is unfavorable.
Указанные гены с высокими значениями чувствительности и специфичности могут выступать в качестве маркеров 3,5-летней выживаемости. Для улучшения показателей чувствительности и специфичности выявленных маркеров, а также увеличения надежности показателей, применили анализ с использованием одновременно нескольких генов. При этом получили несколько панелей маркеров 3,5-летней выживаемости. В зависимости от задачи анализа можно использовать различные панели. These genes with high values of sensitivity and specificity can act as markers of 3.5-year survival. To improve the sensitivity and specificity of the identified markers, as well as to increase the reliability of the indicators, an analysis was applied using several genes simultaneously. At the same time, several marker panels of 3.5-year survival were obtained. Depending on the analysis task, various panels can be used.
Для подтверждения справедливости изложенного выше способа проведены исследования, конкретные результаты которых приведены в частных примерах 1-5, следующим образом.To confirm the validity of the above method, studies were carried out, the specific results of which are given in particular examples 1-5, as follows.
Получали образцы опухолевой и нормальной ткани почки больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР), в которых исследована экспрессия мРНК генов из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2, соотнесенная с уровнями экспрессии мРНК эндогенного контрольного гена (GAPDH или ACTB). Использование указанных эндогенных контрольных генов обеспечивает точность и высокое разрешение при количественном определении данных экспрессии мРНК генов из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2.Samples of tumor and normal kidney tissue of patients with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) were obtained, in which the expression of mRNA genes from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 genes was studied, correlated with the levels of mRNA expression of the endogenous control gene (GAPDH or ACTB) . The use of these endogenous control genes provides accuracy and high resolution for the quantitative determination of mRNA expression data of genes from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 groups.
ПЦР-РВ для определения уровня экспрессии мРНК каждого гена, выбранного из группы CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 и PLIN2, как для образцов опухолевой ткани, так и для образцов нормальной ткани осуществляли в трех повторностях (троекратно). PCR-PB to determine the level of mRNA expression of each gene selected from the CA9, VWF, BHLHE41, EGLN3, BAP1 and PLIN2 groups, both for tumor tissue samples and for normal tissue samples was performed in triplicate (three times).
Из указанных образцов выделена мРНК путем лизиса образцов в растворе гуанидинтиоционата, сорбции мРНК на колонках, отмывках мРНК в спиртовых растворах и элюции мРНК. Наличие и качество выделенной мРНК проверены с помощью электрофореза в 1,8% агарозном геле при постоянной силе тока 130 мА в течение 30 мин, а оценка полученных электрофорезом фрагментов проведена на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете. Перед проведением реакции обратной транскрипции выравнивали концентрации мРНК в контрольных и экспериментальных образцах из опухолевой и нормальной ткани почки, смешивали водный раствор мРНК (0,3 – 1,5 мкг) с гексапраймером Random 6 и реакционной смесью, включающей: буфер 5x, MgCl2 – 25mM, dNTP – 10 mM. Обратную транскрипцию вышеупомянутой смеси проводили в термоциклере в следующих режимах: 250С – 10 мин., 420С – 1час, 700С – 10мин. From these samples, mRNA was isolated by lysis of samples in a solution of guanidine thiocyanate, sorption of mRNA on columns, washing of mRNA in alcohol solutions and elution of mRNA. The presence and quality of the isolated mRNA was verified by 1.8% agarose gel electrophoresis at a constant current of 130 mA for 30 minutes, and fragments obtained by electrophoresis were evaluated on a transilluminator in ultraviolet light. Before the reverse transcription reaction, the mRNA concentrations in the control and experimental samples from tumor and normal kidney tissue were leveled, an aqueous mRNA solution (0.3 - 1.5 μg) was mixed with Random 6 hexaprimer and a reaction mixture including: buffer 5x, MgCl 2 - 25mM, dNTP - 10 mM. Reverse transcription of the above mixture was carried out in a thermal cycler in the following modes: 25 0 С - 10 min., 42 0 С - 1 hour, 70 0 С - 10 min.
В случаях (примеры 1,2) определения уровеня экспрессии мРНК генов с использованием красителя Eva Green, для каждого исследуемого гена были сконструированы и использованы олигонуклеотидные F – прямой праймер и R – обратный праймер приведенные выше в таблице 1. In cases (examples 1,2) of determining the level of gene mRNA expression using the Eva Green dye, oligonucleotide F - direct primer and R - reverse primer are shown and are shown in Table 1 above for each studied gene.
Амплификацию при полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) проводили в режиме реального времени в термоциклере в следующих режимах:Amplification during polymerase chain reaction (PCR-RV) was carried out in real time in a thermal cycler in the following modes:
причем в диапазоне температуры 60,0°С – 95,0°С производили снятие кривой плавления путем наблюдения интенсивности флуоресценции продуктов ПЦР (ампликонов) при ступенчатом изменении температуры с шагом в 1°С. moreover, in the temperature range 60.0 ° C - 95.0 ° C, the melting curve was recorded by observing the fluorescence intensity of the PCR products (amplicons) with a stepwise change in temperature in increments of 1 ° C.
В других случаях (примеры 3,4,5) реализацию способа для определения уровня экспрессии мРНК генов производили с использованием набора праймеров TaqMan® указанных выше в таблице 2. In other cases (examples 3,4,5), the implementation of the method for determining the level of gene mRNA expression was performed using the TaqMan® primer set indicated in Table 2 above.
Для каждого исследуемого образца из опухолевой и нормальной ткани почки, составляют смесь общим объемом 20 мкл, содержащую: 1мкл. набора праймеров TaqMan® Gene Expression Assay, 10 мкл. набора TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1,6 мкл. комплементарной ДНК (1 мкл), 7,4 мкл. деионизированной воды, которую встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 сек., а ПЦР-РВ проводят на приборе Step One Plus в следующих режимах:For each test sample from the tumor and normal tissue of the kidneys, make up a mixture with a total volume of 20 μl, containing: 1 μl. TaqMan® Gene Expression Assay primer kit, 10 μl. TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1.6 μl. complementary DNA (1 μl), 7.4 μl. deionized water, which is shaken on a vortex and centrifuged for 5 seconds, and PCR-PB is carried out on a Step One Plus device in the following modes:
Измененные значения экспрессии мРНК генов выражаются в относительных единицах - экспрессия в опухоли относительно нормальной ткани. Меняться может от долей единицы до сотен значений; но больше 200 - 300, как правило, не бывает.Altered values of gene mRNA expression are expressed in relative units — tumor expression relative to normal tissue. It can vary from fractions of a unit to hundreds of values; but more than 200 - 300, as a rule, does not happen.
В любом случае с использованием красителя Eva Green или набора праймеров TaqMan®, для определения связи экспрессии генов с выживаемостью использовали панель из пяти генов VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и BAP1. Прогноз 3,5-летней выживаемости считали в целом благоприятным, если значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани не менее трех генов из группы VWF, BHLHE41, EGLN3 и PLIN2 превышают уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани не менее, чем в 1,5 раза, а также в том случае, если значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани не менее двух генов из группы VWF, BHLHE41, EGLN3 и PLIN2 превышают уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани и, одновременно, значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше не менее, чем в 2,0 раза, уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани, в каждом из этих случаев. При этом в качестве мРНК эндогенного контрольного гена использовали мРНК гена из группы: GAPDH и ACTB, а прогноз признавали наиболее благоприятным в том случае, если значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов из группы VWF, BHLHE41, EGLN3 и PLIN2 превышают в 2; 2; 3,5 и 1,5 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше в 2,5 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. In any case, using the Eva Green stain or TaqMan® primer set, a panel of five genes VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 and BAP1 was used to determine the relationship between gene expression and survival. The forecast of 3.5-year survival was generally considered favorable if the mRNA expression level of tumor tissue samples of at least three genes from the VWF, BHLHE41, EGLN3, and PLIN2 genes exceeds the mRNA expression level of the same genes in normal tissue samples by at least 1 , 5 times, and also if the mRNA expression level of tumor tissue samples of at least two genes from the VWF group, BHLHE41, EGLN3 and PLIN2 exceeds the mRNA expression level of the same genes in normal tissue samples and, at the same time, the mRNA expression level BAP1 gene less e is not less than 2.0 times, the mRNA expression level of the gene in normal tissue samples, in each of these cases. In this case, the mRNA of the gene from the group: GAPDH and ACTB was used as the mRNA of the endogenous control gene, and the prognosis was recognized as the most favorable if the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of genes from the VWF, BHLHE41, EGLN3 and PLIN2 groups exceed 2; 2; 3.5 and 1.5 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples, and the value of the BAP1 mRNA expression level is less than 2.5 times the level of mRNA expression of this gene in normal tissue samples.
Был применен следующий принцип (схема, или формула): если положительный результат демонстрирует 0 или 1 ген – плохой прогноз; 2 гена – серая зона (дать ответ не представляется возможным); 3 – 5 генов – хорошая выживаемость. The following principle was applied (scheme, or formula): if a positive result shows 0 or 1 gene - a poor prognosis; 2 genes - gray zone (it is not possible to give an answer); 3 to 5 genes - good survival.
Изложенный подход обеспечивает оптимальное сочетание надежности результата, чувствительности и специфичности метода. Если положительный сигнал дают хотя бы три гена, вероятность ошибочного суждения о результате мала и может быть оценена, на основании показателей чувствительности и специфичности для отдельных генов панели, как не превышающая 0,008. The stated approach provides the optimal combination of reliability of the result, sensitivity and specificity of the method. If at least three genes give a positive signal, the probability of an erroneous judgment about the result is small and can be estimated, based on the sensitivity and specificity indicators for individual panel genes, as not exceeding 0.008.
Применение описанного способа прогнозирования к 149 больным скПКР (примеры 1-5) позволило правильно определить прогноз выживаемости среди 132 больных. Application of the described forecasting method to 149 patients with SCCR (examples 1-5) made it possible to correctly determine the prognosis of survival among 132 patients.
Пример 1.Example 1
Описанным образом получены образцы опухолевой и нормальной ткани почки 34 больных (включая 12 женщин и 22 мужчин в возрасте от 17 до 68 лет) больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) на разных стадиях развития (от ранней до стадии метастазирования), в которых исследована экспрессия мРНК трех из указанной выше группы генов. In the described manner, samples of tumor and normal kidney tissue of 34 patients (including 12 women and 22 men aged 17 to 68 years) of patients with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) at different stages of development (from early to metastasis stage) were studied, in which mRNA expression of three of the above gene group.
А именно, для определения прогноза выживаемости указанных больных использовали панель из трех генов VWF, EGLN3, и BAP1. Namely, to determine the prognosis of survival of these patients, a panel of three genes VWF, EGLN3, and BAP1 was used.
У 22 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов VWF, EGLN3 и превышают не менее чем в 2; 3,5 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше не менее чем в 2,5 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани хотя бы у двух генов из указанных трех. У 21 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз не менее 3,5 года выживаемости с даты постановки диагнозаIn 22 patients, the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of the VWF, EGLN3 genes exceed at least 2; 3.5 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is less than 2.5 times the level of mRNA expression of this gene in samples of normal tissue in at least two of these genes three. In 21 patients from this group, observations confirmed a prognosis of at least 3.5 years of survival from the date of diagnosis
У 8 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов VWF, EGLN3 превышают в 1,1-1,4; 1,6-1,8 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше в 2,0 – 2,1 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. У 6 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагнозаIn 8 patients, the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of the VWF, EGLN3 genes exceed 1.1-1.4; 1.6-1.8 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is 2.0-2.1 times lower than the level of mRNA expression of this gene in samples of normal tissue. In 6 patients from this group, the observations confirmed the prognosis of less than 3.5 years of survival since diagnosis
У 4 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов VWF, EGLN3 превышают в 2,0 -2,1; 1,6-1,8 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше в 2,5 – 2,6 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. У 2 больных из данной группы наблюдениями установлено менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза, у 2 больных – более 3,5 года выживаемости с даты постановки диагноза.In 4 patients, the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of the VWF, EGLN3 genes exceeded 2.0 -2.1; 1.6-1.8 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is 2.5 to 2.6 times lower than the level of mRNA expression of this gene in samples of normal tissue. In 2 patients from this group, the observations showed less than 3.5 years of survival from the time of diagnosis, in 2 patients - more than 3.5 years of survival from the date of diagnosis.
Пример 2.Example 2
Описанным образом получены образцы опухолевой и нормальной ткани почки 28 больных (включая 11 женщин и 17 мужчин в возрасте от 19 до 66 лет) больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) на разных стадиях развития (от ранней до стадии метастазирования), в которых исследована экспрессия мРНК четырех из указанной выше группы генов. In the described manner, samples of tumor and normal kidney tissue were obtained in 28 patients (including 11 women and 17 men aged 19 to 66 years) with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) at different stages of development (from early to metastasis), in which mRNA expression of four of the above gene group.
А именно, для определения прогноза выживаемости указанных больных использовали панель из четырех генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и BAP1Namely, to determine the prognosis of survival of these patients, a panel of four genes EGLN3, BHLHE41, PLIN2 and BAP1 was used
У 19 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и превышают не менее чем в 3,6; 2,1; 2,2 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше не менее чем в 2,6 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани хотя бы у двух генов из указанных четырех. У 18 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз не менее 3,5 года выживаемости с даты постановки диагнозаIn 19 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the genes EGLN3, BHLHE41, PLIN2 and exceed not less than 3.6; 2.1; 2.2 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples, and the value of the BAP1 gene mRNA expression level is not less than 2.6 times the level of mRNA expression of this gene in normal tissue samples in at least two of the genes four. In 18 patients from this group, observations confirmed a prognosis of at least 3.5 years of survival from the date of diagnosis
У 7 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2 превышают в 1,2-1,5; 1,3-1,8; 1,9-3,0 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше в 1,9 – 2,1 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. У 6 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагнозаIn 7 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2 genes exceed 1.2-1.5; 1.3-1.8; 1.9-3.0 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is 1.9 to 2.1 times lower than the level of mRNA expression of this gene in samples of normal tissue. In 6 patients from this group, the observations confirmed the prognosis of less than 3.5 years of survival since diagnosis
У 2 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2 превышают в 2,0 -2,1; 1,6-1,8; 3,1-3,2 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше в 2,6 – 2,7 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. У 1 больного из данной группы наблюдениями установлено менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза, у 1 больного – более 3,5 года выживаемости с даты постановки диагноза.In 2 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2 genes exceed 2.0–2.1; 1.6-1.8; 3.1-3.2 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is 2.6 to 2.7 times lower than the level of mRNA expression of this gene in samples of normal tissue. In 1 patient from this group, the observations showed less than 3.5 years of survival from the time of diagnosis, in 1 patient - more than 3.5 years of survival from the date of diagnosis.
Пример 3.Example 3
Описанным образом получены образцы опухолевой и нормальной ткани почки 29 больных (включая 10 женщин и 19 мужчин в возрасте от 20 до 66 лет) больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) на разных стадиях развития (от ранней до стадии метастазирования), в которых исследована экспрессия мРНК четырех из указанной выше группы генов. In the described manner, samples of tumor and normal tissue of the kidney were obtained in 29 patients (including 10 women and 19 men aged 20 to 66 years) with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) at different stages of development (from early to metastasis), in which mRNA expression of four of the above gene group.
А именно, для определения прогноза выживаемости указанных больных использовали панель из четырех генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и VWF,Namely, to determine the prognosis of survival of these patients, a panel of four genes EGLN3, BHLHE41, PLIN2 and VWF was used.
У 20 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2, VWF и превышают не менее чем в 3,5; 2,1; 1,6; 2,1 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани хотя бы у двух генов из указанных четырех. У 19 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз не менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагнозаIn 20 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2, VWF genes and exceed not less than 3.5; 2.1; 1.6; 2.1 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue in at least two of the four genes. In 19 patients from this group, observations confirmed a prognosis of at least 3.5 years of survival from the time of diagnosis
У 7 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2, VWF превышают в 1,4-1,6; 1,3-1,8; 1,6-2,0; 2,1-2,3 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани. У 6 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз менее 3,5 года выживаемости с даты постановки диагнозаIn 7 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2, VWF genes exceed 1.4-1.6; 1.3-1.8; 1.6-2.0; 2.1-2.3 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples. In 6 patients from this group, observations confirmed a prognosis of less than 3.5 years of survival from the date of diagnosis
У 2 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2, VWF превышают в 2,0 -2,1; 1,6-1,8; 1,6-2,2; 2,1-2,5 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани. У 1 больного из данной группы наблюдениями установлено менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза, у 1 больного – более 3,5 года выживаемости с даты постановки диагноза.In 2 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2, VWF genes exceed 2.0–2.1; 1.6-1.8; 1.6-2.2; 2.1-2.5 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples. In 1 patient from this group, the observations showed less than 3.5 years of survival from the time of diagnosis, in 1 patient - more than 3.5 years of survival from the date of diagnosis.
Пример 4.Example 4
Описанным образом получены образцы опухолевой и нормальной ткани почки 27 больных (включая 10 женщин и 17 мужчин в возрасте от 22 до 70 лет) больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) на разных стадиях развития (от ранней до стадии метастазирования), в которых исследована экспрессия мРНК четырех из указанной выше группы генов. In the described manner, samples of tumor and normal kidney tissue were obtained in 27 patients (including 10 women and 17 men aged 22 to 70 years) with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) at different stages of development (from early to metastasis), in which mRNA expression of four of the above gene group.
А именно, для определения прогноза выживаемости указанных больных использовали панель из четырех генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и CA9.Namely, a panel of four genes EGLN3, BHLHE41, PLIN2 and CA9 was used to determine the prognosis of survival of these patients.
У 18 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2, CA9 и превышают не менее чем в 3,5; 2,1; 1,6; 3,3 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани хотя бы у двух генов из указанных четырех. У 17 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз не менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагнозаIn 18 patients, the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2, CA9 genes and exceed not less than 3.5; 2.1; 1.6; 3.3 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue in at least two of the four genes. In 17 patients from this group, observations confirmed a prognosis of at least 3.5 years of survival from the time of diagnosis
У 7 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2, CA9 превышают в 1,5-1,8; 1,4-1,7; 1,2-1,4; 2,9-3,3 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани. У 6 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз менее 3,5 года выживаемости с даты постановки диагнозаIn 7 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2, CA9 genes exceed 1.5-1.8; 1.4-1.7; 1.2-1.4; 2.9-3.3 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples. In 6 patients from this group, observations confirmed a prognosis of less than 3.5 years of survival from the date of diagnosis
У 2 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов EGLN3, BHLHE41, PLIN2, CA9 превышают в 2,0 -2,1; 1,6-1,8; 1,3-1,6; 2,1-2,5 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани. У 1 больного из данной группы наблюдениями установлено менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза, у 1 больного – более 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза.In 2 patients, the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of the EGLN3, BHLHE41, PLIN2, CA9 genes exceed 2.0 -2.1; 1.6-1.8; 1.3-1.6; 2.1-2.5 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples. In 1 patient from this group, the observations showed less than 3.5 years of survival from the time of diagnosis, in 1 patient - more than 3.5 years of survival from the time of diagnosis.
Пример 5.Example 5
Описанным образом получены образцы опухолевой и нормальной ткани почки 31 больного (включая 12 женщин и 19 мужчин в возрасте от 22 до 71 года) больных светлоклеточным почечно-клеточным раком (скПКР) на разных стадиях развития (от ранней до стадии метастазирования), в которых исследована экспрессия мРНК четырех из указанной выше группы генов. In the described manner, samples of tumor and normal kidney tissue of 31 patients (including 12 women and 19 men aged 22 to 71 years) of patients with clear cell renal cell carcinoma (SCCR) at different stages of development (from early to metastasis stage) were studied, in which mRNA expression of four of the above gene group.
А именно, для определения прогноза выживаемости указанных больных использовали панель из шести генов СА9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и BAP1.Namely, to determine the prognosis of survival of these patients, a panel of six genes CA9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 and BAP1 was used.
У 20 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов СА9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 и превышают не менее чем в 3,3; 2,1; 3,5; 2,1; 1,6 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше не менее чем в 2,5 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани хотя бы у трех генов из указанных шести. У 18 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз не менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагнозаIn 20 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the CA9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 genes and exceed not less than 3.3; 2.1; 3.5; 2.1; 1.6 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in normal tissue samples, and the value of the BAP1 mRNA expression level is less than 2.5 times the level of mRNA expression of this gene in normal tissue samples in at least three of the genes indicated six. In 18 patients from this group, observations confirmed a prognosis of at least 3.5 years of survival from the time of diagnosis
У 9 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов СА9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 превышают в 2,5-2,8; 1,5-1,7; 2,3-3,4; 0,9-1,3 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше не более чем в 1,5-1,8 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани хотя бы у трех генов из указанных шести. У 7 больных из данной группы наблюдениями подтвержден прогноз менее 3,5 года выживаемости с даты постановки диагнозаIn 9 patients, the values of the mRNA expression level of samples of tumor tissue of the CA9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 genes exceed 2.5–2.8; 1.5-1.7; 2.3-3.4; 0.9-1.3 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is less than 1.5-1.8 times less than the level of mRNA expression of this gene in normal samples tissue of at least three of the six genes. In 7 patients from this group, observations confirmed a prognosis of less than 3.5 years of survival from the date of diagnosis
У 2 больных значения уровня экспрессии мРНК образцов опухолевой ткани генов СА9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 превышают в 2,3 -2,5; 1,5-1,8; 3,3-3,6; 1,1-1,5 раза, соответственно, уровень экспрессии мРНК тех же генов в образцах нормальной ткани, а значение уровня экспрессии мРНК гена BAP1 меньше не более чем в 1,7-1,9 раза уровня экспрессии мРНК этого гена в образцах нормальной ткани. У 1 больного из данной группы наблюдениями установлено менее 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза, у 1 больного – более 3,5 года выживаемости со времени постановки диагноза.In 2 patients, the values of the mRNA expression level of tumor tissue samples of CA9, VWF, EGLN3, BHLHE41, PLIN2 genes exceed 2.3–2.5; 1.5-1.8; 3.3-3.6; 1.1-1.5 times, respectively, the level of mRNA expression of the same genes in samples of normal tissue, and the value of the level of mRNA expression of the BAP1 gene is less than 1.7-1.9 times the level of mRNA expression of this gene in normal samples tissue. In 1 patient from this group, the observations showed less than 3.5 years of survival from the time of diagnosis, in 1 patient - more than 3.5 years of survival from the time of diagnosis.
Приведенными примерами подтверждено, что примененный подход обеспечивает наиболее эффективное сочетание надежности результата, чувствительности и специфичности метода. Только единичные ответы были ложноположительными, или ложноотрицательными и три были определены, как относящиеся к серой зоне и нуждающиеся в дальнейших исследованиях. The above examples confirm that the applied approach provides the most effective combination of the reliability of the result, the sensitivity and specificity of the method. Only single responses were false positive or false negative and three were identified as being in the gray zone and needing further research.
Как показали исследования, если положительный сигнал дают хотя бы три гена, вероятность ошибочного суждения о результате мала и может быть оценена, на основании показателей чувствительности и специфичности для отдельных генов панели, как не превышающая 0,008. Чувствительность и специфичность способа составили 83,3%. Без учета серой зоны чувствительность и специфичность составляют 92,5%.Studies have shown that if at least three genes give a positive signal, the probability of an erroneous judgment on the result is small and can be estimated, based on the sensitivity and specificity indicators for individual panel genes, as not exceeding 0.008. The sensitivity and specificity of the method amounted to 83.3%. Without taking into account the gray zone, the sensitivity and specificity are 92.5%.
Использование предлагаемого способа на разных стадиях развития скПКР позволяет оперативно и с минимальной трудоемкостью сделать достоверный прогноз выживаемости для большинства больных скПКР. В результате обеспечено увеличение производительности и эффективности исследований для прогнозирования выживаемости и обоснованного выбора тактики лечения больных светлоклеточным почечно-клеточным раком. Using the proposed method at different stages of development of SCCR allows quickly and with minimal labor to make a reliable prognosis of survival for most patients with SCCR. As a result, an increase in the productivity and effectiveness of studies to predict survival and a reasonable choice of treatment tactics for patients with clear cell renal cell carcinoma was ensured.
Claims (14)
R –tgt-agt-cag-aga-ccc-ctc-ataF - agt-tgc-tgt-ctc-gct-tgg-aa
R –tgt-agt-cag-aga-ccc-ctc-ata
R – cgt-gtg-ggt-tcc-tac-gat-ctF - gga-aat-gga-aca-ggt-tat-gt
R - cgt-gtg-ggt-tcc-tac-gat-ct
R – agc-tgc-ctt-cca-aca-tga-ctt-tF - ttg-act-gga-gga-cac-ctg-att
R - agc-tgc-ctt-cca-aca-tga-ctt-t
R – ggg-aga-ggt-att-gca-aga-cttF - tct-gga-gaa-agc-tgt-agt-ctt
R - ggg-aga-ggt-att-gca-aga-ctt
R – ctt-ggc-ccc-agt-cac-agt-agF - ggc-aga-gaa-cgg-tgt-gaa-ga
R - ctt-ggc-ccc-agt-cac-agt-ag
R – tgt-tct-gca-cgt-cat-cct-ccF - ctg-ccg-gcc-ttt-cta-gac-aa
R - tgt-tct-gca-cgt-cat-cct-cc
R – tga-gtc-ctt-cca-cga-tac-caaF - gaa-cca-tga-gaa-gta-tga-caa
R - tga-gtc-ctt-cca-cga-tac-caa
набора праймеров (Assay ID) An identification number
set of primers (Assay ID)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018145058A RU2699792C1 (en) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | Method for prediction of survival in patients with clear cell renal cell carcinoma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018145058A RU2699792C1 (en) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | Method for prediction of survival in patients with clear cell renal cell carcinoma |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2699792C1 true RU2699792C1 (en) | 2019-09-11 |
Family
ID=67989471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018145058A RU2699792C1 (en) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | Method for prediction of survival in patients with clear cell renal cell carcinoma |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2699792C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2731390C1 (en) * | 2020-04-12 | 2020-09-02 | Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех» | Test system and method for detecting rna of coronavirus sars-cov-2, virus-agent of coronavirus disease 2019 covid-19, by polymerase chain reaction in real time (embodiments) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2438127C1 (en) * | 2010-06-29 | 2011-12-27 | Комитет по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга Санкт-Петербургское государственное учреждение здравоохранения "Городское патологоанатомическое бюро" | Method for prediction of oncological survival rate in patients with nonmetastatic renal cell carcinoma after malignant nephrectomy or partial nephrectomy |
| US20130005597A1 (en) * | 2009-12-18 | 2013-01-03 | Rathmell W Kimryn | Methods and compositions for analysis of clear cell renal cell carcinoma (ccrcc) |
-
2018
- 2018-12-19 RU RU2018145058A patent/RU2699792C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130005597A1 (en) * | 2009-12-18 | 2013-01-03 | Rathmell W Kimryn | Methods and compositions for analysis of clear cell renal cell carcinoma (ccrcc) |
| RU2438127C1 (en) * | 2010-06-29 | 2011-12-27 | Комитет по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга Санкт-Петербургское государственное учреждение здравоохранения "Городское патологоанатомическое бюро" | Method for prediction of oncological survival rate in patients with nonmetastatic renal cell carcinoma after malignant nephrectomy or partial nephrectomy |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GIRIQIS A. H. et al. Multilevel whole-genome analysis reveals candidate biomarkers in clear cell renal cell carcinoma //Cancer research, 2012, Т. 72, N. 20, с. 5273-5284. * |
| КОГАН М. И. и др. Молекулярно-биологические факторы прогнозирования течения почечно-клеточного рака (обзор литературы) //Онкоурология, 2016, N. 3. * |
| КОГАН М. И. и др. Молекулярно-биологические факторы прогнозирования течения почечно-клеточного рака (обзор литературы) //Онкоурология, 2016, N. 3. GIRIQIS A. H. et al. Multilevel whole-genome analysis reveals candidate biomarkers in clear cell renal cell carcinoma //Cancer research, 2012, Т. 72, N. 20, с. 5273-5284. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2731390C1 (en) * | 2020-04-12 | 2020-09-02 | Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех» | Test system and method for detecting rna of coronavirus sars-cov-2, virus-agent of coronavirus disease 2019 covid-19, by polymerase chain reaction in real time (embodiments) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | The level of circulating miRNA-10b and miRNA-373 in detecting lymph node metastasis of breast cancer: potential biomarkers | |
| Stasik et al. | Increased MYC gene copy number correlates with increased mRNA levels in diffuse large B-cell lymphoma | |
| US9182383B2 (en) | Biomarkers for the diagnosis and treatment of pancreatic cancer | |
| Ismail et al. | Diagnostic significance of miR-639 and miR-10b in βreast cancer patients | |
| Zhou et al. | Combination of serum miRNAs with Cyfra21-1 for the diagnosis of non-small cell lung cancer | |
| US20140155280A1 (en) | Method of diagnosing neoplasms | |
| WO2020157070A1 (en) | Novel biomarkers and diagnostic profiles for prostate cancer | |
| RU2699792C1 (en) | Method for prediction of survival in patients with clear cell renal cell carcinoma | |
| KR102592433B1 (en) | Marker for prognosing extranodal nk/t-cell lymphoma, extranodal nk/t-cell lymphoma prognostic kit comprising the same and method for prognosing extranodal nk/t-cell lymphoma | |
| Zhen et al. | LyGDI is a promising biomarker for ovarian cancer | |
| CN110577999A (en) | Application of CXCR4 as gastric cancer prognosis evaluation biomarker and diagnosis kit | |
| JP2012523828A (en) | Methods and tools for predicting the efficacy of anthracyclines in cancer | |
| Quintanilla et al. | Differentially deregulated microRNAs as novel biomarkers for neoplastic progression in ulcerative colitis | |
| KR20210137828A (en) | Method of ovarian cancer diagnosis using machine learning model and system applying thereof | |
| CA3067527A1 (en) | Mmp1 gene transcript for use as marker for diagnosis of ovarian cancer prognosis, and test method | |
| KR102065594B1 (en) | Biomarker for predicting resistance to anticancer agent | |
| KR102258097B1 (en) | Method for diagnosing liver cancer by measuring expression level of serum exosomal long non-coding RNA | |
| US20240093307A1 (en) | Serum exosomal sf3b4 marker composition for diagnosing early stage hepatocellular carcinoma for noninvasive in vitro diagnosis | |
| KR102280516B1 (en) | Biomarker composition for predicting prognosis of combined chemo radio therapy in a patient with cervical cancer | |
| EP3321683A1 (en) | Method for evaluating lymph node metastatic potential of endometrial cancer | |
| US20210388448A1 (en) | Method of determining prognosis in patients with follicular lymphoma | |
| RU2817940C1 (en) | Method for prediction of risk of lethal outcome in the first 4 years from beginning of anticancer treatment in patients with squamous cell lung cancer | |
| CN115125304B (en) | CERNA regulation network for early diagnosis or detection of non-small cell lung cancer and application thereof | |
| WO2023004460A1 (en) | Methods of detecting and/or diagnosing pancreatic cancer | |
| Riva et al. | BIOM-10. PREVALENCE OF NF1 MISSENSE MUTATIONS AND CANDIDATE MODIFIER GENES IN SPINAL NEUROFIBROMATOSIS PATIENTS |