RU2697849C1 - Diagnostic technique for porcine circovirus - Google Patents
Diagnostic technique for porcine circovirus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697849C1 RU2697849C1 RU2019112883A RU2019112883A RU2697849C1 RU 2697849 C1 RU2697849 C1 RU 2697849C1 RU 2019112883 A RU2019112883 A RU 2019112883A RU 2019112883 A RU2019112883 A RU 2019112883A RU 2697849 C1 RU2697849 C1 RU 2697849C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- circovirus
- phosphate
- pig
- cell culture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается способа выявления вируса цирковируса свиней, определения биологической активности вируса при производстве инактивированной вакцины и научных исследованиях.The invention relates to the field of biotechnology and veterinary virology and relates to a method for detecting swine circovirus virus, determining the biological activity of the virus in the production of inactivated vaccines and scientific research.
Способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвинными меченными пероксидазой хрена-иммуноглобулинами и выявления антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток (Патент Украины (UA 89399). Иммунопероксидазный тест для вирусологической диагностики цирковирусной инфекции свиней, МПК G01N 33/536, A61K 39/42 опубликовано 25.04.2014, Бюл. №8).A method for the diagnosis of pig circovirus, including sowing PK-15 cell culture, infection with its biological material, fixation of PK-15 cells, incubation sequentially with specific sera and anti-pig horseradish peroxidase-labeled immunoglobulins and detecting pig circovirus antigen by the presence of dark red cell cytoplasm staining ( Patent of Ukraine (UA 89399). Immunoperoxidase test for virological diagnosis of pig circovirus infection, IPC G01N 33/536, A61K 39/42 published on 04.25.2014, Bull. No. 8).
Цирковирусная инфекция свиней - заболевание поросят отъемышей, которое характеризуется истощением, одышкой, пневмонией, увеличением лимфатических узлов, желтухой, бледностью. Это заболевание известно так же как синдром мультисистемного послеотъемного истощения поросят (СПМИ) - наиболее распространенная форма проявления цирковируса свиней 2-го типа. Впервые заболевание наблюдалось в Саскачеване (Канада), затем оно быстро распространилось во все страны с развитым свиноводством, включая Европу, Америку и Азию. В 1998 г. из тканей поросят с СПМИ был изолирован вирус, обозначенный как цирковирус свиней 2-типа (PCV2), а исходному ЦВС - не патогенному контаминанту культуры клеток РК-15 дали обозначение PCV1 (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).Swine circovirus infection - a disease of weaned piglets, which is characterized by exhaustion, shortness of breath, pneumonia, swollen lymph nodes, jaundice, and pallor. This disease is also known as piglet multisystem post-weaning depletion syndrome (PSMI), the most common form of manifestation of pig type 2 circovirus. The disease was first observed in Saskatchewan (Canada), then it quickly spread to all countries with developed pig husbandry, including Europe, America and Asia. In 1998, a virus designated as type 2 pig circovirus (PCV2) was isolated from the tissues of piglets with SPMI, and the PCV1 was designated PCV1 (type RF patent No. 2283862 and type 2 pig circovirus and its source was not a pathogenic contaminant of PK-15 cell culture). application, IPC C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, published September 20, 2006, Bull. No. 26).
Однако известный диагностики цирковируса свиней является недостаточно эффективным при диагностике цирковируса свиней 2 типа.However, the well-known diagnosis of pig circovirus is not effective in the diagnosis of pig type 2 circovirus.
Задачей предполагаемого изобретения является повышение чувствительности способа при диагностике цирковируса свиней 2 типа.The objective of the proposed invention is to increase the sensitivity of the method in the diagnosis of circovirus pigs type 2.
Поставленная задача достигается в способе диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвинными меченными пероксидазой хрена-иммуноглобулинами и выявления антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащем 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела.The task is achieved in a method for the diagnosis of pig circovirus, including seeding of PK-15 cell culture, infection with its biological material, fixation of PK-15 cells, incubation sequentially with specific sera and anti-pig horseradish peroxidase-labeled immunoglobulins and detection of pig circovirus antigen by the presence of dark red staining of the cytoplasm of cells in that the fixation of RK-15 cells is carried out for 30-40 minutes in 0.01-0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2-7.4 containing 1-4% paraformaldehyde and 0, 2-0.4% onylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22-24 ° C, then treated sequentially for 10-15 minutes with 0.01-0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2-7.4, containing 0.3-0.4 M glycine and 1 -2% casein, then 10-15 minutes with 0.3-0.6% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied.
Также поставленная задача предполагаемого изобретения достигается в способе диагностики цирковируса свиней тем, что в качестве биологического материала используют сыворотку крови, или гомогенат лимфоузлов, или гомогенат легких.Also, the object of the alleged invention is achieved in a method for diagnosing pig circovirus by the fact that blood serum, or lymph node homogenate, or lung homogenate are used as biological material.
Как показали наши исследования, для проведения иммунопероксидазной реакции возможно использование только забуференного параформальдегида, при этом необходимо строго придерживаться определенного времени фиксации. Так, меньшая продолжительность фиксации приводит к диффузии, вымыванию антигена, а длительная - обуславливает маскировку антигена, образование большого числа альдегидных связей, препятствующих реакции антиген-антител, что приводит к снижению возможности выявления цирковируса свиней 2 типа. Нами впервые предложено проводить пермеабилизацию антигена с помощью использования нонилфенилполиэтиленгликоля (нонидент, NP-40), что позволило проводить идентификацию цирковируса свиней более стабильно. Пермеабилизация нужна, когда антитело должно достигать внутриклеточной части клеток, так как эпитопы находятся в цитоплазматической области. Кроме этого, впервые предложено обрабатывать клетки РК-15 глицином при определенных режимах воздействия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран, устранению «сшивок» между белками, образуемых в результате фиксации. Предполагаем, что глицин связывает свободные альдегидные группы, которые в противном случае связывали бы первичные и вторичные антитела, что неизбежно привело бы к высокому фоновому окрашиванию. После воздействия антиген становиться более доступным для антител. В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа диагностики цирковируса свиней аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».As our studies have shown, for carrying out the immunoperoxidase reaction, it is possible to use only buffered paraformaldehyde, and it is necessary to strictly adhere to a certain fixation time. So, a shorter fixation time leads to diffusion, leaching of the antigen, and a long fixation causes masking of the antigen, the formation of a large number of aldehyde bonds that impede the reaction of antigen antibodies, which leads to a decrease in the possibility of detecting type 2 pig circovirus. We were the first to propose antigen permeabilization using nonylphenylpolyethylene glycol (nonident, NP-40), which allowed identification of pig circovirus more stably. Permeabilization is needed when the antibody must reach the intracellular part of the cells, since the epitopes are in the cytoplasmic region. In addition, it was proposed for the first time to treat PK-15 cells with glycine under certain exposure conditions, which helps to increase the permeability of cell membranes, eliminates “cross-linking” between the proteins formed as a result of fixation. We suggest that glycine binds free aldehyde groups, which would otherwise bind primary and secondary antibodies, which would inevitably lead to high background staining. After exposure, the antigen becomes more accessible to antibodies. In the patent and scientific and technical literature, technical solutions are not known containing modes of the diagnostic method for pig circovirus similar to the claimed one, i.e. the proposal meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».All modes of the method are feasible in an industrial environment, aimed at solving a real technical problem, i.e. the proposal is “industrially applicable”.
Изобретение иллюстрируется на следующих примерах:The invention is illustrated by the following examples:
Пример 1.Example 1
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - blood serum of pigs (serum samples were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with pig type 2 circovirus - PCV2 / SHBC strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегид и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels as in the known method. After 30 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the PCV2 / SHBC strain virus is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 2. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).Example 2. Prepare lung homogenates from samples of lung material in a known manner (RF Patent No. 2283862 Type 2 pig circovirus and its use, IPC C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12 , C12Q 1/68, G01N 33/569, published September 20, 2006, Bull. No. 26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out by a biological object - homogenate of lungs of pigs (samples of lung material were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with pig type 2 circovirus - strain “PCV2 / SHBC”).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels as in the known method. After 30 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the PCV2 / SHBC strain virus is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same samples were processed by the prototype method. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 3. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).Example 3. Homogenates of lymph nodes are prepared from samples of the material of the lymph nodes in a known manner (Methodological features of isolating the virus from pig's lymphoid organs and infection of the PK-15 culture are described in the article by I. Morozov (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - a homogenate of their lymph nodes (samples of lymph node material were in an experiment of 20 from 3-4-week-old piglets infected with pig type 2 circovirus - PCV2 / SHBC strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 30 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the PCV2 / SHBC strain virus is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same samples were processed by the prototype method. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 4.Example 4
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - blood serum of pigs (serum samples were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with pig type 2 circovirus - PCV2 / SHBC strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels as in the known method. After 40 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the PCV2 / SHBC strain is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 5. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).Example 5. Prepare lung homogenates from samples of lung material in a known manner (RF Patent No. 2283862 Type 2 pig circovirus and its use, IPC C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12 , C12Q 1/68, G01N 33/569, published September 20, 2006, Bull. No. 26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out by a biological object - homogenate of lungs of pigs (samples of lung material were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with pig type 2 circovirus - strain “PCV2 / SHBC”).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 40 minutes in 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4 containing 4% paraformaldehyde and 0.4% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 24 ° C, then treated sequentially for 15 minutes 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4, containing 0.4 M glycine and 2% casein, then 15 minutes with 0.6% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 40 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the PCV2 / SHBC strain is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 6. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК -15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).Example 6. Prepare homogenates of the lymph nodes from samples of the material of the lymph nodes in a known manner (Methodological features of isolation of the virus from the pig's lymphoid organs and infection of the PK-15 culture are described in the article by I. Morozov (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - a homogenate of their lymph nodes (samples of lymph node material were in an experiment of 20 from 3-4-week-old piglets infected with pig type 2 circovirus - PCV2 / SHBC strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 40 minutes in 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4 containing 4% paraformaldehyde and 0.4% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 24 ° C, then treated sequentially for 15 minutes 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4, containing 0.4 M glycine and 2% casein, then 15 minutes with 0.6% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 40 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the PCV2 / SHBC strain is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 7.Example 7
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - blood serum of pigs (serum samples were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with type 2 pig circovirus - Stoon 1010 strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегид и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 30 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the Stoon 1010 strain is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive real-time PCR result.
Пример 8. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).Example 8. Prepare lung homogenates from samples of lung material in a known manner (RF Patent No. 2283862 Type 2 pig circovirus and its use, IPC C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12 , C12Q 1/68, G01N 33/569, published September 20, 2006, Bull. No. 26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out by a biological object - homogenate of lungs of pigs (samples of lung material were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with pig circovirus of type 2 strain "Stoon 1010").
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 30 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the Stoon 1010 strain is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same samples were processed by the prototype method. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 9. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).Example 9. Prepare homogenates of the lymph nodes from samples of the material of the lymph nodes in a known manner (Methodological features of isolation of the virus from the pig's lymphoid organs and infection of the PK-15 culture are described in the article by I. Morozov (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out by a biological object - a homogenate of their lymph nodes (samples of lymph node material were in an experiment of 20 from 3-4 weeks old piglets infected with type 2 pig circovirus - Stoon 1010 strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 30 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the Stoon 1010 strain is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same samples were processed by the prototype method. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Пример 10.Example 10
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - blood serum of pigs (serum samples were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with type 2 pig circovirus - Stoon 1010 strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 30 minutes in 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 1% paraformaldehyde and 0.2% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 22 ° C, then treated sequentially for 10 minutes 0.01 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.2, containing 0.3 M glycine and 1% casein, then 10 minutes with 0.3% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 40 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the strain “Stoon 1010” is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive real-time PCR result.
Пример 11. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).Example 11. Prepare lung homogenates from samples of lung material in a known manner (RF Patent No. 2283862 Type 2 pig circovirus and its use, IPC C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12 , C12Q 1/68, G01N 33/569, published September 20, 2006, Bull. No. 26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа -штаммом «Stoon 1010»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out with a biological object - homogenate of lungs of pigs (samples of lung material were in experiment 20 from 3-4 weeks old piglets infected with pig circovirus of type 2 strain “Stoon 1010”).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 40 minutes in 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4 containing 4% paraformaldehyde and 0.4% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 24 ° C, then treated sequentially for 15 minutes 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4, containing 0.4 M glycine and 2% casein, then 15 minutes with 0.6% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 40 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the strain “Stoon 1010” is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive real-time PCR result.
Пример 12. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).Example 12. Prepare homogenates of the lymph nodes from samples of the material of the lymph nodes in a known manner (Methodological features of isolating the virus from the pig's lymphoid organs and infection of the PK-15 culture are described in the article by I. Morozov (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).Infection of the PK-15 cell culture is carried out by a biological object - a homogenate of their lymph nodes (samples of lymph node material were in an experiment of 20 from 3-4 weeks old piglets infected with type 2 pig circovirus - Stoon 1010 strain).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.The PK-15 cell culture was fixed for 40 minutes in 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4 containing 4% paraformaldehyde and 0.4% nonylphenylpolyethylene glycol at a temperature of 24 ° C, then treated sequentially for 15 minutes 0.02 M phosphate-buffered saline with a pH of 7.4, containing 0.4 M glycine and 2% casein, then 15 minutes with 0.6% hydrogen peroxide, after which specific polyclonal antibodies are applied. Next, in the wells of polystyrene panels, the antigen-antibody complex is stained by adding a chromogen-substrate solution of 50 μl to each well of polystyrene panels, as in the known method. After 40 minutes of staining with a chromogen-substrate solution, the wells are washed with distilled water and the virus of the strain “Stoon 1010” is detected by dark red staining of the cytoplasm of infected cells with a light, unpainted nucleus. Uninfected cells lack cytoplasm staining.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.The same test preparations were processed in a known manner by the prototype. All test preparations processed by the prototype method gave a negative result. All test preparations processed by the present method gave a positive result, which is confirmed by a positive result of real-time PCR.
Таким образом, только использование предлагаемого технического решения при диагностике цирковируса свиней 2 типа позволило диагностировать это заболевание животных.Thus, only the use of the proposed technical solution in the diagnosis of circovirus pigs type 2 allowed to diagnose this disease of animals.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019112883A RU2697849C1 (en) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | Diagnostic technique for porcine circovirus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019112883A RU2697849C1 (en) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | Diagnostic technique for porcine circovirus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2697849C1 true RU2697849C1 (en) | 2019-08-21 |
Family
ID=67733684
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019112883A RU2697849C1 (en) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | Diagnostic technique for porcine circovirus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2697849C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2283862C2 (en) * | 1997-10-03 | 2006-09-20 | Мериаль | Ii type porcine circovirus and uses thereof |
| EA028376B1 (en) * | 2010-12-22 | 2017-11-30 | Сбк Вирбак Лимитед | Porcine circovirus type 2 (pcv2), immunogenic composition containing the same, test kit, and application thereof |
-
2019
- 2019-04-26 RU RU2019112883A patent/RU2697849C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2283862C2 (en) * | 1997-10-03 | 2006-09-20 | Мериаль | Ii type porcine circovirus and uses thereof |
| EA028376B1 (en) * | 2010-12-22 | 2017-11-30 | Сбк Вирбак Лимитед | Porcine circovirus type 2 (pcv2), immunogenic composition containing the same, test kit, and application thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПЕТРОВА О.Г. и др. Диагностика цикровирусной инфекции свиней// Аграрный Вестник Урала, 2014, N3 (121), с.27-30. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nawagitgul et al. | Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV | |
| Dulac et al. | Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs. | |
| US7358075B2 (en) | Assay for porcine circovirus production | |
| Chiang et al. | Use of monoclonal antibodies against Hendra and Nipah viruses in an antigen capture ELISA | |
| CN103308688A (en) | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) detection kit for porcine circovirus type 2 IgM antibody and preparation method of ELISA detection kit | |
| Monaghan et al. | Expression of immunogenic structural proteins of cyprinid herpesvirus 3 in vitro assessed using immunofluorescence | |
| Yoon et al. | Comparison of a commercial H1N1 enzyme-linked immunosorbent assay and hemagglutination inhibition test in detecting serum antibody against swine influenza viruses | |
| CN110967480A (en) | Preparation and application of pig epidemic diarrhea virus IgA antibody ELISA kit | |
| CN112760294A (en) | Canine type I adenovirus monoclonal antibody/polyclonal antibody, double-antibody sandwich ELISA kit and application | |
| RU2697849C1 (en) | Diagnostic technique for porcine circovirus | |
| Wang et al. | Development and evaluation of a competitive ELISA using a monoclonal antibody for antibody detection after goose parvovirus virus-like particles (VLPs) and vaccine immunization in goose sera | |
| Collins et al. | A competition ELISA for the detection of antibodies to rabbit haemorrhagic disease virus | |
| CN109799351A (en) | Porcine circovirus 2 type double-antibody sandwich elisa kit and its application | |
| RU2425377C1 (en) | Method to diagnose leukosis in cattle | |
| Aiki-Raji et al. | A slaughterhouse survey for porcine circovirus type 2 in commercial pigs in Ibadan, Southwest Nigeria | |
| Qing et al. | The recombinant nonstructural polyprotein NS1 of porcine parvovirus (PPV) as diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated pigs | |
| Han et al. | Establishment and application of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay differentiating PCV2 antibodies from mixture of PCV1/PCV2 antibodies in pig sera | |
| Seo et al. | Evaluation of commercial polyclonal-and monoclonal-antibody-based immunohistochemical tests for 2 genotypes of Porcine circovirus type 2 and comparison with in-situ hybridization assays | |
| Zhang et al. | Development of a potential diagnostic monoclonal antibody against capsid spike protein VP27 of the novel goose astrovirus | |
| Endalew et al. | Virological and serological responses of sheep and cattle to experimental Schmallenberg virus infection | |
| Dekker et al. | Validation of a screening liquid phase blocking ELISA for swine vesicular disease | |
| Gottschalk et al. | An Antigen Capture Test for the Detection of Cattle Viremic with Bovine Viral Diarrhoea Virus‐A Comparison with BVD Virus Isolation from Buffy Coat Cells in Bovine Kidney Cells | |
| KR101099076B1 (en) | Indirect ELISA kit using heparin-treated PRRSV and manufacturing method thereof | |
| Gu et al. | Infectious bovine rhinotracheitis | |
| Luzzago et al. | Indirect immunohistochemistry on skin biopsy for the detection of persistently infected cattle with bovine viral diarrhoea virus in Italian dairy herds |