RU2697802C1 - Method of producing magnetic liposomes - Google Patents
Method of producing magnetic liposomes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697802C1 RU2697802C1 RU2018130628A RU2018130628A RU2697802C1 RU 2697802 C1 RU2697802 C1 RU 2697802C1 RU 2018130628 A RU2018130628 A RU 2018130628A RU 2018130628 A RU2018130628 A RU 2018130628A RU 2697802 C1 RU2697802 C1 RU 2697802C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liposomes
- magnetic
- suspension
- antitumor agent
- water
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
- A61K33/26—Iron; Compounds thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, в частности - онкологии, и может быть использовано для создания магниточувствительных липосомальных форм для целевой доставки противоопухолевых лекарственных средств.The invention relates to the field of pharmacology and medicine, in particular oncology, and can be used to create magnetosensitive liposome forms for targeted delivery of antitumor drugs.
Большинство известных противоопухолевых химиотерапевтических средств характеризуются серьезными недостатками, к которым, в первую очередь, относятся низкая селективность, быстрое выведение из организма, высокая общая токсичность. Многие средства, обладающие противоопухолевой активностью, плохо растворимы в воде, что затрудняет создание наиболее эффективных инъекционных форм, характеризующихся максимальной биодоступностью. Применение липосомальных форм позволяет уменьшить общую токсичность и повысить селективность противоопухолевых химиотерапевтических средств за счет пассивной избирательности, основанной на известном эффекте повышенной проницаемости и накопления (ППН) [Y. Matsumura, Н. Maeda. "A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy. Mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agents smancs" / Canser Res. 1986, No 46, p.6387-6392]. Для проявления эффекта ППН большое значение имеет размер липосом, определяющий способность избирательного проникновения везикул в сосуды, питающие опухоль, а также степень их захватывания ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) в кровеносном русле. В отличие от капилляров сосудов, питающих здоровые ткани, диаметр пор в которых составляет 60-80 нм, размер дефектов кровеносных сосудов, питающих опухоли, для разных типов новообразований колеблется от нескольких сотен нанометров до нескольких микрон. Поэтому, для предотвращения накопления липосом в здоровых тканях оптимальный размер липосом должен начинаться от 90 нм [Д.Г. Гуревич и др. «Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли», Российский биотерапевтический журнал, 2007, №2, т. 6, с. 45-49]. Однако, когда средний диаметр липосом превышает 300 нм, время циркуляции в крови уменьшается по сравнению с липосомами меньшего диаметра, а сами липосомы накапливаются в селезенке [Litzinger D. С.et al. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes / Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1994, т. 1190, №1, с. 99-107]. С учетом этих ограничений, для целевой доставки противоопухолевых средств предпочтительны липосомы с размером 90 - 300 нм. По данным работы [О.И. Саквина, А.Ю. Барышников «Липосомы в направленной доставке противоопухолевых препаратов» / Российский биотерапевтический журнал. 2008. т. 7, №4, с. 80 - 85] оптимальный средний размер частиц не превышает 200 нм.Most of the known antitumor chemotherapeutic agents are characterized by serious shortcomings, which, first of all, include low selectivity, rapid elimination from the body, and high general toxicity. Many drugs with antitumor activity are poorly soluble in water, which makes it difficult to create the most effective injectable forms, characterized by maximum bioavailability. The use of liposomal forms can reduce general toxicity and increase the selectivity of anticancer chemotherapeutic agents due to passive selectivity based on the known effect of increased permeability and accumulation (PPN) [Y. Matsumura, N. Maeda. "A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy. Mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agents smancs" / Canser Res. 1986, No. 46, p. 6387-6392]. For the manifestation of the PPN effect, the size of liposomes is of great importance, which determines the ability of the vesicles to selectively penetrate into the vessels supplying the tumor, as well as the degree of their capture by the reticulo-endothelial system (RES) in the bloodstream. In contrast to the capillaries of blood vessels that feed healthy tissues, the pore diameter of which is 60-80 nm, the size of defects in blood vessels that supply tumors for different types of neoplasms ranges from several hundred nanometers to several microns. Therefore, to prevent the accumulation of liposomes in healthy tissues, the optimal size of liposomes should start from 90 nm [D.G. Gurevich et al. “Effect of liposome sizes on the level and selectivity of thiosens accumulation in a tumor”, Russian Biotherapeutic Journal, 2007, No. 2, v. 6, p. 45-49]. However, when the average diameter of the liposomes exceeds 300 nm, the circulation time in the blood decreases compared with smaller liposomes, and the liposomes accumulate in the spleen [Litzinger D. C. et al. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly (ethylene glycol) -containing liposomes / Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Biomembranes. 1994, t. 1190, No. 1, p. 99-107]. Given these limitations, liposomes with a size of 90-300 nm are preferred for targeted delivery of antitumor agents. According to the work of [O.I. Sakvin, A.Yu. Baryshnikov “Liposomes in targeted delivery of anticancer drugs” / Russian Biotherapeutic Journal. 2008.V. 7, No. 4, p. 80 - 85] the optimal average particle size does not exceed 200 nm.
Использование лишь пассивной избирательности, как правило, недостаточно для достижения уровня селективности, обеспечивающего необходимое снижение общего токсического эффекта препарата и повышения его противоопухолевой эффективности. Одним из подходов, позволяющих совместить возможности пассивного и активного транспорта химиопрепарата в опухоль, является создание магнитных липосом, в которых вместе с лекарственным средством инкапсулированы частицы, обладающие магнитными свойствами, позволяющие целенаправленно концентрировать лекарственное средство в опухоли под действием внешнего магнитного поля. Требования к размерам липосом для адресной доставки противоопухолевых препаратов, о которых говорилось выше, в полной мере применимы и к липосомам, содержащим носители магнитных свойств.Using only passive selectivity is usually not enough to achieve a selectivity level that provides the necessary reduction in the overall toxic effect of the drug and increase its antitumor effectiveness. One approach to combining the possibilities of passive and active transport of a chemotherapeutic drug into a tumor is the creation of magnetic liposomes, in which particles possessing magnetic properties are encapsulated together with the drug, which make it possible to purposefully concentrate the drug in the tumor under the action of an external magnetic field. The liposome size requirements for targeted delivery of antitumor drugs mentioned above are fully applicable to liposomes containing carriers of magnetic properties.
Анализ источников, касающихся получения и практического использования магнитных липосомальных средств адресной доставки противоопухолевых средств, показывает, что в них недостаточно внимания уделяется требованиям к размерным характеристикам липосом, которым должны удовлетворять предназначенные для этой цели препараты.An analysis of the sources related to the production and practical use of magnetic liposomes for targeted delivery of antitumor drugs shows that they do not pay enough attention to the requirements for the dimensional characteristics of liposomes, which must be met by preparations intended for this purpose.
В работе [A,A. Kuznetsov, V.I. Filippov, et al. "Application of magnetic liposomes for magnetically guided transport of muscle relaxants and anti-cancer photodynamic drugs" / J. of Magnetism and Magnetic Materials. 2001, v. 225. p. 95-100] описан способ инкапсулирования миорелаксантов и противоопухолевых лекарственных средств - фотосенсибилизатора Фотосенс и каталитической системы Терафтал - в магнитолипосомы на основе ферромагнитных частиц субмикронного размера (10-50 нм), в качестве которых используют коллоидное железо, полученное плазмохимическим способом, или коллоидные частицы магнетита в воде, стабилизированные желатином. Этанольный раствор лецитина и холестерина упаривают на роторном испарителе и к полученной пленке прибавляют смесь лекарственного средства с магнитными частицами. После обработки на ультразвуковой бане и отделения не прореагировавших компонентов получают нагруженные лекарственным средством магнитные липосомы, содержащие магнитные частицы в водной фазе внутри липосом. Для включения магнитных частиц в липидный бислой их вводят в этанольный раствор липидных компонентов, который упаривают на роторном испарителе, после чего к полученной пленке прибавляют водный раствор лекарственного средства, не содержащий магнитных частиц. В работе в эксперименте на животных показана возможность использования полученных магнитолипосом для адресной доставки лекарственных средств в пораженный орган. Однако, следует отметить, что в работе не уделено какого-либо внимания размеру получаемых магнитных липосом, что, как отмечалось выше, имеет особенно важное значение с точки зрения повышения селективности и снижения общей токсичности препаратов, используемых в химиотерапии опухолей.In [A, A. Kuznetsov, V.I. Filippov, et al. "Application of magnetic liposomes for magnetically guided transport of muscle relaxants and anti-cancer photodynamic drugs" / J. of Magnetism and Magnetic Materials. 2001, v. 225. p. 95-100] describes a method of encapsulating muscle relaxants and antitumor drugs - the photosensitizer Photosens and the Teraftal catalytic system - into magnetoliposomes based on submicron-sized ferromagnetic particles (10-50 nm), which use colloidal iron obtained by a plasma-chemical method, or colloidal magnet in water, stabilized with gelatin. The ethanol solution of lecithin and cholesterol is evaporated on a rotary evaporator and a mixture of the drug with magnetic particles is added to the resulting film. After processing in an ultrasonic bath and separating unreacted components, drug-loaded magnetic liposomes containing magnetic particles in the aqueous phase inside the liposomes are obtained. To incorporate magnetic particles into the lipid bilayer, they are introduced into an ethanol solution of lipid components, which is evaporated on a rotary evaporator, after which an aqueous drug solution containing no magnetic particles is added to the resulting film. The work in an animal experiment shows the possibility of using the obtained magnetoliposomes for targeted delivery of drugs to the affected organ. However, it should be noted that the work did not pay any attention to the size of the obtained magnetic liposomes, which, as noted above, is especially important from the point of view of increasing the selectivity and reducing the overall toxicity of drugs used in tumor chemotherapy.
В заявке [CN 101590017 А, опубл. 02.12.2009,] описано получение магнитолипосом противоопухолевого средства Таксол (Паклитаксел), практически нерастворимого в воде и проявляющего высокую токсичность в отношении органов пищеварения, кроветворения, иммунной системы. Для получения препарата при температуре 72±3°С получают эмульсию, включающую стеариновую кислоту, поверхностно-активное вещество Твин 80 и этанол, при интенсивном перемешивании прибавляют по каплям дистиллированную воду и магнитную жидкость. Суспензию впрыскивают в воду при охлаждении на ледяной бане, подвергают диализу и лиофильной сушке. Получают твердый магнитолипосомальный препарат с размером частиц 170 - 190 нм, однако из описания не ясно, на какой стадии в систему вводят противоопухолевое средство, а также конкретные условия проведения операций, обеспечивающие получение магнитных липосом указанного размера.In the application [CN 101590017 A, publ. 12/02/2009,] production of magnetoliposomes of the antitumor agent Taxol (Paclitaxel) is described, which is practically insoluble in water and exhibits high toxicity to the digestive, hematopoietic, and immune systems. To obtain the drug at a temperature of 72 ± 3 ° C, an emulsion is prepared comprising stearic acid, the surface-active substance Tween 80 and ethanol, with vigorous stirring, distilled water and magnetic fluid are added dropwise. The suspension is injected into water while cooling in an ice bath, subjected to dialysis and freeze drying. A solid magnetoliposomal preparation with a particle size of 170-190 nm is obtained, however, it is not clear from the description at what stage the antitumor agent is injected into the system, as well as the specific conditions of the operations providing magnetic liposomes of the indicated size.
В патенте Китая [CN 103040756 В, опубл. 14.10.2015] описан способ получения пэгилированных магнитных липосом эпирубицина гидрохлорида. Наночастицы магнетита размером 10 - 30 нм получают соосаждением хлоридов двух- и трехвалентного железа, растворенных в деоксигенированной дистиллированной воде, при нагревании до 80°С в атмосфере азота в присутствии водного раствора аммиака. Смесь взятых в нужном количестве фосфатидилхолина, холестерина, монометилового эфира полиэтиленглиголя (mPEG) и наночастиц магнетита в абсолютном этаноле медленно вводят в раствор сульфата аммония (0,1 мол/л), обрабатывают в ультразвуковой ванне (30 мин, 60°С), упаривают на роторном испарителе в вакууме до исчезновения запаха этанола и подвергают в течение суток диализу против фосфатно-солевого буфера. Полученные «пустые» магнитные липосомы смешивают на водяной бане при 55°С с нужным количеством эпирубицина гидрохлорида. Существенным недостатком изобретения является то, что способ позволяет получать магнитолипосомы, размер которых, по данным авторов, составляет около 50 нм, что позволяет им беспрепятственно проникать в здоровые ткани, увеличивая общую токсичность препарата. Также следует отметить, что использование диализа для очистки усложняет процесс и значительно увеличивает время приготовления.In the patent of China [CN 103040756 B, publ. 10/14/2015] a method for producing pegylated magnetic liposomes of epirubicin hydrochloride is described. Magnetite nanoparticles with a size of 10-30 nm are obtained by coprecipitation of ferrous and ferric chlorides dissolved in deoxygenated distilled water, when heated to 80 ° C in a nitrogen atmosphere in the presence of aqueous ammonia. A mixture of phosphatidylcholine, cholesterol, polyethylene glycol monomethyl ether (mPEG) and magnetite nanoparticles in absolute ethanol taken in the right amount is slowly introduced into a solution of ammonium sulfate (0.1 mol / l), treated in an ultrasonic bath (30 min, 60 ° C), evaporated on a rotary evaporator in vacuo until the odor of ethanol disappears and dialyzed against phosphate-buffered saline for 24 hours. The resulting "empty" magnetic liposomes are mixed in a water bath at 55 ° C with the desired amount of epirubicin hydrochloride. A significant disadvantage of the invention is that the method allows to obtain magnetoliposomes, the size of which, according to the authors, is about 50 nm, which allows them to freely penetrate into healthy tissues, increasing the overall toxicity of the drug. It should also be noted that the use of dialysis for cleaning complicates the process and significantly increases the cooking time.
Описан способ получения магниточувствительных липосом - систем доставки лекарственных веществ с контролируемым высвобождением. [RU 2357724 С1, опубл. 10.06.2009]. Способ включает растворение фосфолипидов в хлороформе, добавление носителя магнитных свойств и воздействие ультразвуком, при этом в качестве источника фосфолипидов используют барсучий жир, в качестве носителя магнитных свойств используют полученный газофазным способом ферромагнитный нанопорошок железа, никеля или кобальта с размером частиц 2-5 нм, заключенный в углеродную оболочку. Полученную липосомальную систему стерилизуют в камере бетатрона. В результате получают крупные магнитолипосомы, размером от 1 до 7 мкм, что значительно превышает оптимальные размеры, позволяющие обеспечить эффективную избирательную доставку лекарственного средства в опухоль. Следует отметить, что использование в качестве источника фосфолипидов барсучего жира может приводить к аутоимунным реакциям.A method for producing magnetosensitive liposomes - controlled-release drug delivery systems is described. [RU 2357724 C1, publ. 06/10/2009]. The method includes dissolving phospholipids in chloroform, adding a carrier of magnetic properties and exposure to ultrasound, using badger fat as a source of phospholipids, using a ferromagnetic nanopowder of iron, nickel or cobalt obtained by a gas-phase method with a particle size of 2-5 nm, concluded into the carbon shell. The resulting liposome system is sterilized in a betatron chamber. As a result, large magnetoliposomes are obtained, ranging in size from 1 to 7 microns, which significantly exceeds the optimal sizes that allow for efficient selective delivery of the drug to the tumor. It should be noted that the use of badger fat as a source of phospholipids can lead to autoimmune reactions.
Известны публикации, касающиеся влияния последовательно повторяющихся процедур замораживания - оттаивания фосфолипидной эмульсии на степень включения в липосому лекарственного средства и размер получаемых липосом. В работе [«Изготовление липосомальных наноконтейнеров как транспортеров лекарственных средств» http://pandia.ru/text/77/414/79986.php] отмечается, что в результате многократно повторяющихся циклов замораживания фосфолипидных дисперсий с последующим оттаиванием образуются липосомы с высоким процентным включением иммобилизируемых веществ. По данным работы [Pick, V. "Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing" / Arch, Biochem. and Biophys. 1981, Vol. 212, p. 186-194] при повторении процедуры замораживание - оттаивание происходит слияние липосом и увеличение их размеров. В работе [Castile J. D., Taylor К. M. G. "Factors affecting the size distribution of liposomes produced by freeze-thaw extrusion" / International Journal of Pharmaceutics, v. 188, Issue 1, 15 October 1999, p 87-95] показано, что добавление к яичному лецитину холестерина приводит к укрупнению получаемых мультиламелярных везикул в процессе нескольких циклов замораживания (жидкий азот, 3 мин.) - оттаивания (50°С, 3 мин.). Максимальный размер липосом получен после пяти циклов в присутствии хлористого натрия. Добавление полимерных ПАВ Полаксомеров Р338 and Р407 способствует уменьшению среднего диаметра липосом. Следует отметить, что упомянутые исследования проведены на липосомах, не содержащих носителей магнитных свойств.There are publications on the effect of successively repeated freezing procedures - thawing of a phospholipid emulsion on the degree of incorporation of a drug into the liposome and the size of the resulting liposomes. In the work [“Production of liposomal nanocontainers as transporters of drugs” http://pandia.ru/text/77/414/79986.php] it is noted that as a result of repeated cycles of freezing phospholipid dispersions with subsequent thawing, liposomes with a high percentage inclusion are formed immobilized substances. According to [Pick, V. "Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing" / Arch, Biochem. and Biophys. 1981, Vol. 212, p. 186-194] when repeating the freezing - thawing procedure, liposomes merge and increase in size. In [Castile J. D., Taylor K. M. G. "Factors affecting the size distribution of liposomes produced by freeze-thaw extrusion" / International Journal of Pharmaceutics, v. 188,
В качестве прототипа настоящего изобретения взят описанный в работе [Javier Alonso et al,"Superparamagnetic Nanoparticles Encapsulated in Lipid Vesicles for Advanced Magnetic Hyperthermia and Biodetection" / Journal of Applied Physics 2016, 119: 083904] способ получения суперпарамагнитных наночастиц, инкапсулированных в фосфолипидные везикулы, предназначенные для гипертермии опухолей. Для получения магнитных липосом в качестве липидного компонента взят синтетический 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphotidylcholine (РОРС). В качестве носителя суперпарамагнитных свойств взяты наночастицы маггемита γ-Fe2O3 (размер 12,8±1,7 нм, величина намагниченности насыщения более 30 emu/g), полученные термодеструкцией ацетилацетоната железа(III) в присутствии олеиновой кислоты и олеиламина. Раствор 10 мг РОРС в хлороформе смешивают с 0,4 мг γ-Fe2O3 в гексане. После упаривания растворителя в аргоне на роторном испарителе остаток вакуумируют, полученную пленку гидратируют ультрачистой водой при перемешивании с последующим мягким озвучиванием. Затем образец подвергают 5-кратной процедуре замораживания - оттаивания в интервале температур от минус 80 до плюс 50°С, после чего полученную дисперсию многократно (31 раз) экструдируют через поликарбонатную мембрану с диаметром пор 100 нм. Полученный образец представляет собой содержащие магнитные наночастицы униламелярные везикулы, размер которых определяется размерами пор мембраны. Наночастицы, не вошедшие в состав липосом, отделяют гель-фильтрацией. Таким образом, для получения магнитных липосом нужного размера требуется многократно повторенная процедура экструзии образца через пористую мембрану, что связано с дополнительными затратами времени и необходимостью использования специального оборудования. Поскольку способ по прототипу предназначен для получения «пустых», не содержащих лекарственного средства липосом, неочевидно, что он позволяет получать нагруженные противоопухолевым средством магнитолипосомы оптимального для противоопухолевой терапии размерного диапазона.As a prototype of the present invention, the method described in [Javier Alonso et al, "Superparamagnetic Nanoparticles Encapsulated in Lipid Vesicles for Advanced Magnetic Hyperthermia and Biodetection" / Journal of Applied Physics 2016, 119: 083904] for producing superparamagnetic nanoparticles encapsulated in phospholipid vesicles intended for hyperthermia of tumors. To obtain magnetic liposomes, the synthetic 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphotidylcholine (POPC) was taken as a carrier of superparamagnetic properties γ-Fe 2 O 3 maghemite nanoparticles were taken (size 12.8 ± 1.7 nm, saturation magnetization more than 30 emu / g) obtained by thermal decomposition of iron (III) acetylacetonate in the presence of oleic acid and oleylamine. 10 mg POPC solution in chloroform mixed with 0.4 mg of γ-Fe 2 O 3 in hexane. After evaporation of the solvent in argon on a rotary evaporator After the residue is evacuated, the resulting film is hydrated with ultrapure water with stirring, followed by soft sounding, then the sample is subjected to a 5-fold freeze-thaw procedure in the temperature range from
Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в разработке простого, не требующего больших затрат времени способа, позволяющего без дополнительной сепарации по размерам получать как пустые, так и нагруженные противоопухолевым средством магнитные липосомы, размерные характеристики которых соответствуют оптимальному для противоопухолевой терапии диапазону, а именно: размер частиц не выходит за пределы диапазона 90 - 300 нм, а средний размер не превышает 200 нм.The problem solved by the present invention is to develop a simple, time-saving method that allows, without additional size separation, to obtain both empty and loaded with antitumor agent magnetic liposomes, the dimensional characteristics of which correspond to the optimal range for antitumor therapy, namely: size particles does not go beyond the range of 90 - 300 nm, and the average size does not exceed 200 nm.
Проблема решена предлагаемым способом получения магнитных липосом, включающим получение суспензии, включающей фосфатидилхолин и магнитные наночастицы, ее обработку ультразвуком и последующую повторяющуюся процедуру ее замораживания - оттаивания, отличающимся тем, что указанная суспензия при необходимости включает дополнительно противоопухолевое средство, в качестве магнитных наночастиц используют наночастицы магнетита в форме водного золя, а указанная повторяющаяся процедура замораживания - оттаивания включает замораживание указанной суспензии при температуре жидкого азота, последующее ее плавное оттаивание при комнатной температуре и дополнительно включает ее последующую обработку ультразвуком, при этом указанную процедуру повторяют не менее трех раз.The problem is solved by the proposed method for producing magnetic liposomes, including obtaining a suspension including phosphatidylcholine and magnetic nanoparticles, its sonication and the subsequent repeated procedure of freezing and thawing, characterized in that said suspension optionally includes an additional antitumor agent, using magnetite nanoparticles as magnetic nanoparticles in the form of a water sol, and the specified repeated procedure of freezing - thawing includes freezing This suspension at a temperature of liquid nitrogen, its subsequent smooth thawing at room temperature and additionally includes its subsequent treatment with ultrasound, and this procedure is repeated at least three times.
Таким образом, каждая, повторяемая, как минимум, трижды, процедура замораживания - оттаивания, включает не только замораживание и оттаивание, как таковые, но и дополнительно включает последующее озвучивание образца в условиях, обычно применяемых при работе с липосомальными формами. Использование только сочетания замораживание - оттаивание или только ультразвуковой обработки по отдельности не позволяет получить требуемый результат так же быстро и просто, как это возможно предлагаемым способом.Thus, each freezing-thawing procedure repeated at least three times includes not only freezing and thawing, as such, but also additionally includes subsequent sounding of the sample under conditions usually used when working with liposome forms. Using only a combination of freezing - thawing or only ultrasonic processing separately does not allow to obtain the desired result as quickly and simply as possible by the proposed method.
В случае получения «пустых», не содержащих противоопухолевое средство магнитных липосом, указанная суспензия представляет собой водную суспензию, содержащую фосфолипид и наночастицы магнетита. Суспензию получают гидратацией пленки фосфолипида, полученной упариванием раствора фосфолипида в органическом растворителе, путем добавления к ней водного золя наночастиц магнетита. Один из возможных вариантов осуществления способа для получения «пустых» липосом описан в Примере 1.In the case of obtaining “empty” magnetic liposomes not containing an antitumor agent, said suspension is an aqueous suspension containing a phospholipid and magnetite nanoparticles. A suspension is obtained by hydration of a phospholipid film obtained by evaporation of a solution of phospholipid in an organic solvent by adding an aqueous sol of magnetite nanoparticles to it. One possible implementation of the method for producing "empty" liposomes is described in Example 1.
При необходимости получения магнитных липосом, нагруженных противоопухолевым средством, указанная суспензия представляет собой водную суспензию, содержащую фосфолипид, наночастицы магнетита и противоопухолевое средство. При этом, если противоопухолевое средство растворимо в воде, суспензию получают гидратацией пленки фосфолипида, полученной упариванием раствора фосфолипида в органическом растворителе, путем добавления к ней водного золя наночастиц магнетита, содержащего дополнительно водорастворимое противоопухолевое средство. Возможность получения заявляемым способом магнитных липосом, содержащих водорастворимое противоопухолевое средство, продемонстрирована в Примере 2, в котором в качестве водорастворимого противоопухолевого средства взят рубомицина гидрохлорид.If it is necessary to obtain magnetic liposomes loaded with an antitumor agent, the suspension is an aqueous suspension containing a phospholipid, magnetite nanoparticles and an antitumor agent. In this case, if the antitumor agent is soluble in water, the suspension is obtained by hydration of a phospholipid film obtained by evaporation of a solution of phospholipid in an organic solvent by adding an aqueous sol of magnetite nanoparticles containing an additional water-soluble antitumor agent to it. The possibility of obtaining by the claimed method of magnetic liposomes containing a water-soluble antitumor agent is demonstrated in Example 2, in which rubomycin hydrochloride is taken as a water-soluble antitumor agent.
Если противоопухолевое средство не растворимо в воде, суспензию получают гидратацией пленки фосфолипида, полученной упариванием раствора фосфолипида в органическом растворителе, содержащего дополнительно не растворимое в воде противоопухолевое средство, путем добавления к ней водного золя наночастиц магнетита. Возможность получения заявляемым способом магнитных липосом, содержащих не растворимое в воде противоопухолевое средство, продемонстрирована в Примере 3, в котором в качестве не растворимого в воде противоопухолевого средства взят феофорбид А.If the antitumor agent is not soluble in water, the suspension is prepared by hydration of a phospholipid film obtained by evaporation of a solution of phospholipid in an organic solvent containing an additionally insoluble antitumor agent by adding an aqueous sol of magnetite nanoparticles to it. The possibility of obtaining by the claimed method of magnetic liposomes containing a water-insoluble antitumor agent is demonstrated in Example 3, in which theophorbide A was taken as a water-insoluble antitumor agent.
Перечень иллюстраций, поясняющих сущность изобретения, приведен ниже.The list of illustrations illustrating the invention is given below.
Фиг. 1. Электронная микрофотография наночастиц магнетита, использованных для получения магнитных липосом заявляемым способом (LEO-912 АВ, Zeiss, Германия).FIG. 1. Electron micrograph of magnetite nanoparticles used to obtain magnetic liposomes of the claimed method (LEO-912 AB, Zeiss, Germany).
Фиг. 2 (А - Д). Распределение по размерам магнитолипосом, содержащих рубомицина гидрохлорид, по данным динамического светорассеяния (ДСР) (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Великобритания).FIG. 2 (A - D). Size distribution of magnetoliposomes containing rubomycin hydrochloride according to dynamic light scattering (DLS) data (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., United Kingdom).
2A. После однократной ультразвуковой обработки (70W, 40KHz, комнатная температура, 5 мин) суспензии, содержащей фосфатилхолин, наночастицы магнетита, рубомицина гидрохлорид без проведения процедуры замораживание - оттаивание с последующим озвучиванием.2A. After a single ultrasonic treatment (70W, 40KHz, room temperature, 5 min), a suspension containing phosphatylcholine, magnetite nanoparticles, rubomycin hydrochloride without the freezing - thawing procedure followed by sounding.
2Б. Образец обработан аналогично 2А и дополнительно подвергнут однократной процедуре замораживания - оттаивания с последующим озвучиванием в тех же условиях в течение 15 минут.2B. The sample was processed similarly to 2A and was additionally subjected to a single freeze-thaw procedure, followed by sounding under the same conditions for 15 minutes.
2В. Образец обработан аналогично 2А и дополнительно подвергнут двукратной процедуре замораживания - оттаивания с последующим озвучиванием в тех же условиях в течение 15 минут.2B. The sample was processed similarly to 2A and was additionally subjected to a double freeze-thaw procedure, followed by sounding under the same conditions for 15 minutes.
2Г. Образец обработан аналогично 2А и дополнительно подвергнут трехкратной процедуре замораживания - оттаивания с последующим озвучиванием в тех же условиях в течение 15 минут.2G. The sample was processed similarly to 2A and was additionally subjected to a three-fold freeze-thaw procedure, followed by sounding under the same conditions for 15 minutes.
2Д. Образец обработан аналогично 2А и дополнительно подвергнут четырехкратной процедуре замораживания - оттаивания с последующим озвучиванием в тех же условиях в течение 15 минут.2d. The sample was processed similarly to 2A and was additionally subjected to a four-fold freeze-thaw procedure, followed by sounding under the same conditions for 15 minutes.
В основе изобретения лежат результаты проведенных авторами исследований влияния условий проведения процедуры замораживания - оттаивания с последующим дополнительным озвучиванием на размер получаемых магнитолипосомальных глобул.The invention is based on the results of studies by the authors of the influence of the conditions of the freezing - thawing procedure, followed by additional scoring on the size of the resulting magnetoliposomal globules.
В качестве фосфолипида использован фосфатидилхолин из соевого лецитина, однако, очевидно, что аналогично может быть использован фосфатидилхолин другого происхождения, включая синтетический.Phosphatidylcholine from soya lecithin was used as the phospholipid, however, it is obvious that phosphatidylcholine of other origin, including synthetic, can be used in a similar way.
В качестве магнитных наночастиц могут быть использованы наноразмерные носители магнитных свойств, образующие водные золи. Для иллюстрации возможности осуществления изобретения нами использованы суперпарамагнитные наночастицы магнетита Fe3O4, полученные способом термического разложения, как описано в работе [Л.Х. Комиссарова и др. «Разработка технологии получения монодисперсных наночастиц магнетита малого размерного диапазона и оценка их токсичности на мышах» / Технологии живых систем, 2017., т. 14, №4, с. 51-57].As magnetic nanoparticles, nanosized carriers of magnetic properties that form aqueous sols can be used. To illustrate the possibility of carrying out the invention, we used superparamagnetic magnetite nanoparticles of Fe 3 O 4 obtained by thermal decomposition, as described in [L.Kh. Komissarova et al. “Development of a technology for producing monodisperse magnetite nanoparticles of small size range and assessment of their toxicity in mice” / Technologies of living systems, 2017., t. 14, No. 4, p. 51-57].
Получение наночастиц магнетитаObtaining magnetite nanoparticles
Раствор ацетилацетоната железа(III) в триэтиленгликоле (66,6 мг/мл) нагревают при постоянном перемешивании в атмосфере аргона до температуры 110 - 120°С и выдерживают в течение 30 мин., после чего температуру быстро поднимают до 250°С и продолжают нагревание в течение 600 минут. После охлаждения к полученной суспензии добавляют 40 мл этилацетата и наночастицы осаждают постоянным Sm-Co магнитом (150 мТл). Осадок последовательно пятикратно промывают ацетоном, этанолом и водой и ресуспендируют в дистиллированной воде с получением водного золя с концентрацией наночастиц магнетита 30 мг/мл. Для хранения образца используют инертную атмосферу и температуру 2 - 4°С.A solution of iron (III) acetylacetonate in triethylene glycol (66.6 mg / ml) is heated with constant stirring in an argon atmosphere to a temperature of 110 - 120 ° C and maintained for 30 minutes, after which the temperature is quickly raised to 250 ° C and continued heating for 600 minutes. After cooling, 40 ml of ethyl acetate was added to the resulting suspension, and the nanoparticles were precipitated with a permanent Sm-Co magnet (150 mT). The precipitate is washed five times successively with acetone, ethanol and water and resuspended in distilled water to obtain an aqueous sol with a magnetite nanoparticle concentration of 30 mg / ml. An inert atmosphere and a temperature of 2-4 ° C are used to store the sample.
Электронная микрофотография полученных наночастиц магнетита (просвечивающий электронный микроскоп LEO-912 АВ, Zeiss, Германия, ускоряющее напряжение 120 кВ) показана на Фиг. 1. Средний диаметр наночастиц составляет 6,12±1,07 нм. Величина намагниченности насыщения, составляющая 62,3 emu/g, позволяет легко управлять их перемещением даже с помощью бытового магнита.An electron micrograph of the obtained magnetite nanoparticles (transmission electron microscope LEO-912 AB, Zeiss, Germany, accelerating voltage of 120 kV) is shown in FIG. 1. The average diameter of the nanoparticles is 6.12 ± 1.07 nm. The saturation magnetization of 62.3 emu / g makes it easy to control their movement even with a household magnet.
Варьируя условия реакции, можно получать частицы различного размера. Так, если нагревание проводят при температуре 285°С в течение 1 часа, получают наночастицы магнетита размером 8,23±1,32 нм, для которых величина намагниченности насыщения составляет 68,7 emu/g.By varying the reaction conditions, particles of various sizes can be obtained. So, if heating is carried out at a temperature of 285 ° C for 1 hour, magnetite nanoparticles of 8.23 ± 1.32 nm in size are obtained, for which the saturation magnetization is 68.7 emu / g.
Полученные магнитные наночастицы характеризуются низкими показателями острой токсичности: значение LD50 составляет 155,6 мг/кг, с 95%-ным доверительным интервалом от 137,7 до 175,8 мг/кг., что более, чем на порядок превышает дозы магнитоуправляемых носителей, используемые для доставки противоопухолевых препаратов в органы-мишени [Christoph A., Wolfgang A., Hulin P., et al. "Magnetic mitoxantrone nanoparticles detection by histology, X-ray and MRI after magnetic tumor targeting" / J. of Magn. and Magn. Materials. 2001, v. 225. p. 187-193].The obtained magnetic nanoparticles are characterized by low rates of acute toxicity: the LD50 value is 155.6 mg / kg, with a 95% confidence interval from 137.7 to 175.8 mg / kg, which is more than an order of magnitude higher than the doses of magnetically controlled carriers, used to deliver anticancer drugs to target organs [Christoph A., Wolfgang A., Hulin P., et al. "Magnetic mitoxantrone nanoparticles detection by histology, X-ray and MRI after magnetic tumor targeting" / J. of Magn. and Magn. Materials. 2001, v. 225. p. 187-193].
В основе изобретения лежат результаты проведенных авторами исследований влияния состава и условий получения магнитных липосом на размеры получаемых липосомальных глобул. В экспериментах с «пустыми» магнитными липосомами, а также с магнитолипосомами, нагруженными химиотерапевтическими средствами - феофорбидом А и рубомицина гидрохлоридом, было обнаружено, что, если обработанную ультразвуком липосомальную суспензию, включающую фосфатидилхолин и наночастицы магнетита в форме водного золя, или фосфатидилхолин, наночастицы магнетита и дополнительно - противоопухолевый препарат, подвергать последовательно повторяющейся процедуре, включающей глубокое быстрое замораживание при температуре жидкого азота, затем плавное оттаивание при температуре, близкой к комнатной, и последующую УЗ обработку в мягких условиях, то, по мере увеличения количества повторов (циклов), размерный состав липосом становится все более однородным: количество фракций на диаграмме ДСР уменьшается, средний размер липосом также последовательно уменьшается, а их распределение по размерам становится все более узким. При этом, как показали эксперименты, после трех циклов средний размер магнитных липосом не превышает 200 нм, минимальный размер не выходит за пределы 90 нм, а максимальный не превышает 300 нм. Дальнейшее увеличение количества повторов практически не дает заметного эффекта.The invention is based on the results of studies conducted by the authors of the influence of the composition and conditions for the production of magnetic liposomes on the size of the resulting liposome globules. In experiments with empty magnetic liposomes, as well as with magnetoliposomes loaded with chemotherapeutic agents - pheophorbide A and rubomycin hydrochloride, it was found that if an ultrasonically treated liposomal suspension, including phosphatidylcholine and magnetite nanoparticles in the form of nanoparticulate sol, or and additionally, an antitumor drug, subjected to a sequentially repeated procedure, including deep, quick freezing at a temperature of liquid nitrogen, then smooth thawing at a temperature close to room temperature and subsequent ultrasonic treatment under mild conditions, then, as the number of repetitions (cycles) increases, the size composition of liposomes becomes more and more uniform: the number of fractions in the DSB diagram decreases, the average size of liposomes also decreases sequentially , and their size distribution is becoming narrower. Moreover, as shown by experiments, after three cycles, the average size of magnetic liposomes does not exceed 200 nm, the minimum size does not go beyond 90 nm, and the maximum does not exceed 300 nm. A further increase in the number of repetitions has practically no noticeable effect.
Оттаивание образца удобно проводить на водяной бане при температуре, близкой к комнатной, предпочтительно, в пределах 20 - 30°С. Тот же температурный диапазон предпочтителен и для проведения последующего озвучивания. Время озвучивания подбирают экспериментально с учетом характеристик используемого УЗ-оборудования. Как правило, при использовании обычных лабораторных УЗ-ванн оно не превышает 15 минут. Увеличение времени озвучивания не целессобразно, т.к. необходимый диапазон размеров получаемых липосом достигается при времени озвучивания 5-15 минут. Отклонения времени и температуры от указанных величин в разумных пределах не влияют существенно на достижение результата.It is convenient to thaw the sample in a water bath at a temperature close to room temperature, preferably in the range of 20-30 ° C. The same temperature range is preferred for subsequent scoring. The scoring time is selected experimentally, taking into account the characteristics of the ultrasound equipment used. As a rule, when using conventional laboratory ultrasonic baths, it does not exceed 15 minutes. An increase in dubbing time is not practical, because the necessary size range of the obtained liposomes is achieved with a dubbing time of 5-15 minutes. Deviations of time and temperature from the indicated values within reasonable limits do not significantly affect the achievement of the result.
Результаты проведенных исследований показаны в Табл. 1, где приведены данные по изменению размерных характеристик магнитных липосом разного состава в зависимости от количества повторов процедуры замораживание - оттаивание - озвучивание.The results of the studies are shown in Table. 1, which presents data on the change in the dimensional characteristics of magnetic liposomes of different compositions depending on the number of repetitions of the freezing - thawing - voicing procedure.
Получение магнитных липосом, содержащих и не содержащих противоопухолевое средство, описано в Примерах 1-3.The preparation of magnetic liposomes containing and not containing an antitumor agent is described in Examples 1-3.
В случае получения «пустых» магнитолипосом (Пример 1) после проведения однократной процедуры замораживание - оттаивание - озвучивание исходной суспензии магнитных липосом на диаграмме ДСР присутствует три пика, соответствующих липосомам со средним размером от приблизительно 170 до приблизительно 1420 нм. Более 90% приходится на глобулы со средним размером около 630 нм. По мере повторения циклов однородность образца повышается: после второго цикла на диаграмме остается 2 пика, а после третьего средний размер частиц, представленных единственным пиком, составляет около 185 нм, при этом все частицы попадают в диапазон 90 - 300 нм Дальнейшее повторение процедуры приводит к получению частиц, попадающих в тот же размерный диапазон.In the case of obtaining “empty” magnetoliposomes (Example 1) after a single freeze-thaw-thaw-voicing initial suspension of magnetic liposomes, there are three peaks on the DSL diagram corresponding to liposomes with an average size of from about 170 to about 1420 nm. More than 90% are globules with an average size of about 630 nm. As the cycles repeat, the homogeneity of the sample increases: after the second cycle, 2 peaks remain in the diagram, and after the third cycle, the average particle size represented by a single peak is about 185 nm, while all particles fall into the range of 90 - 300 nm. Further repetition of the procedure leads to particles falling into the same size range.
Аналогичные закономерности получены и для магнитных липосом, нагруженных противоопухолевыми средствами. Для наглядности динамика изменения размерного распределения магнитных липосом, содержащих рубомицин, в зависимости от количества последовательных циклов замораживание - оттаивание - озвучивание, показана на диаграммах, представленных на Фиг. 2А-2Д. На Фиг. 2А показано распределение по размерам магнитолипосом, полученных после первоначальной 5-минутной УЗ-обработки суспензии, включающей фосфатидилхолин, химиопрепарат и наночастицы магнетита, без использования цикла замораживание - оттаивание - озвучивание. Образец крайне неоднороден и включает липосомы с размером в диапазоне от 300 до 700 нм, а так же глобулы, превышающие по размеру 1 мкм. Увеличение времени УЗ обработки до 35 минут (на диаграмме не показано) хотя и увеличивает долю частиц меньшего размера, однако, не позволяет достичь требуемого результата. После первого цикла замораживание - оттаивание - озвучивание картина меняется (см. Фиг. 2Б): средний размер частиц существенно снижается, происходит четкое разделение на две фракции, к первой, содержащей около 6% частиц, относятся липосомы со средним диаметром около 130 нм, основную фракцию (более 80%) составляют частицы, средний диаметр которых превышает 575 нм. Повторение цикла приводит к дальнейшей реструктуризации размерного состава магнитных липосом (см. Фиг. 2В), при этом средний размер более, чем 80% частиц, составляет 212 нм, однако образец еще содержит более 17% частиц, средний размер которых составляет около 450 нм. После третьего цикла (Фиг. 2Г) распределение представляет собой один пик, соответствующий среднему размеру липосом около 180 нм и не содержащему частиц с размером, выходящим за пределы диапазона 90-300 нм. Проведение дополнительного четвертого цикла замораживание - оттаивание - озвучивание (см. Фиг. 2Д) практически не меняет картину и с точки зрения решения поставленной задачи -получения магнитных липосом размером 90 - 300 нм и средним размером, не превышающем 200 нм, является излишним.Similar patterns were also obtained for magnetic liposomes loaded with antitumor agents. For clarity, the dynamics of changes in the size distribution of magnetic liposomes containing rubomycin, depending on the number of consecutive cycles of freezing, thawing, and voicing, is shown in the diagrams presented in FIG. 2A-2D. In FIG. Figure 2A shows the size distribution of magnetoliposomes obtained after the initial 5-minute ultrasound treatment of the suspension, including phosphatidylcholine, a chemotherapeutic drug, and magnetite nanoparticles, without using a freeze-thaw-sound cycle. The sample is extremely heterogeneous and includes liposomes with sizes ranging from 300 to 700 nm, as well as globules larger than 1 μm in size. An increase in the time of ultrasonic treatment to 35 minutes (not shown in the diagram), although it increases the fraction of particles of a smaller size, however, does not allow achieving the desired result. After the first cycle, freezing - thawing - scoring, the picture changes (see Fig. 2B): the average particle size is significantly reduced, there is a clear separation into two fractions, the first containing about 6% of the particles includes liposomes with an average diameter of about 130 nm, the main fraction (more than 80%) are particles whose average diameter exceeds 575 nm. The repetition of the cycle leads to further restructuring of the size composition of magnetic liposomes (see Fig. 2B), while the average size of more than 80% of the particles is 212 nm, but the sample still contains more than 17% of the particles, the average size of which is about 450 nm. After the third cycle (Fig. 2G), the distribution is one peak corresponding to an average liposome size of about 180 nm and not containing particles with a size outside the range of 90-300 nm. Carrying out an additional fourth cycle of freezing - thawing - dubbing (see Fig. 2D) practically does not change the picture and from the point of view of solving the formulated problem of producing magnetic liposomes with a size of 90 - 300 nm and an average size not exceeding 200 nm, is unnecessary.
Как видно из Таблицы 1, аналогичные закономерности изменения размерного состава магнитолипосом в зависимости от количества повторов цикла замораживание - оттаивание - озвучивание, характерны и для магнитолипосом, нагруженных феофорбидом А.As can be seen from Table 1, similar patterns of change in the size composition of magnetolipos, depending on the number of repetitions of the cycle, freezing - thawing - voicing, are also characteristic of magnetolipos loaded with pheophorbide A.
Из данных, приведенных в Табл. 1 также видно, что в процессе последовательного повторения циклов замораживание - оттаивание - озвучивание в указанных условиях происходит не только уменьшение среднего размера магнитных липосомальных частиц, но и сужение размерного диапазона, свидетельствующее о получении образцов магнитных липосом все более однородных по размерному составу.From the data given in Table. Figure 1 also shows that during the successive repetition of the freezing, thawing, and voicing cycles, under the indicated conditions, not only a decrease in the average size of magnetic liposomal particles occurs, but also a narrowing of the size range, which indicates that magnetic liposome samples are becoming more and more uniform in size.
Таким образом, как для препаратов магнитных липосом, не содержащих лекарственное средство, так и для магнитных липосом, нагруженных феофорбидом А или рубомицина гидрохлоридом, зависимости изменения размеров частиц от количества циклов замораживание - оттаивание - озвучивание носят близкий характер. Это говорит о том, что выявленные закономерности, имеют общий характер и могут быть использованы для получения различных по химическому составу магнитных липосом оптимального, с точки зрения возможности их применения в онкологии, размера.Thus, for both drug-free magnetic liposomes and magnetic liposomes loaded with pheophorbide A or rubomycin hydrochloride, the dependences of particle size changes on the number of freeze-thaw-sound cycles are similar. This suggests that the revealed patterns are of a general nature and can be used to obtain magnetic liposomes of various chemical composition that are optimal in terms of the possibility of their use in oncology.
Приведенные ниже примеры демонстрируют возможность реализации изобретения, при этом не охватывают всех возможных вариантов, описываемых формулой изобретения.The following examples demonstrate the feasibility of the invention, while not covering all the possible options described by the claims.
Пример 1. Получение «пустых» магнитных липосом, не содержащих противоопухолевое средство.Example 1. Obtaining "empty" magnetic liposomes that do not contain an antitumor agent.
80 мг фосфатидилхолина растворяют в 2,5 мл хлороформа, раствор упаривают досуха на роторно-вакуумном испарителе при температуре, не превышающей 40°С. К образовавшейся на стенках тонкой фосфолипидной пленке прибавляют 3 мл водного золя наночастиц магнетита (средний диаметр 6,12±1,07 нм, концентрация 10 мг/мл), и озвучивают в УЗ-ванне при комнатной температуре в течение 5 мин, мощность 70W, частота 40KHz. Затем проводят 3-кратную процедуру, включающую быстрое замораживание при температуре жидкого азота, плавное оттаивание на водяной бане при температуре 20 - 30°С и последующее озвучивание полученной суспензии в тех же условиях в течение 15 мин. Следует отметить, что приведенные в этом и последующих примерах конкретные условия озвучивания (время, температура), зависящие от свойств образцов и характеристик УЗ-оборудования, подбираются экспериментально. Отклонение от приведенных в примерах значений в разумных пределах не влияет на результат.80 mg of phosphatidylcholine is dissolved in 2.5 ml of chloroform, the solution is evaporated to dryness on a rotary vacuum evaporator at a temperature not exceeding 40 ° C. To a thin phospholipid film formed on the walls, 3 ml of an aqueous sol of magnetite nanoparticles is added (average diameter 6.12 ± 1.07 nm,
По результатам измерения с помощью метода динамического светорассеяния (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Великобритания) средний размер полученных магнитных липосом составляет 185,5±72,1 нм (см. Табл. 1). Величина намагниченности насыщения для полученного образца магнитных липосом составляет 15,2 emu/g, что позволяет осуществлять контролируемую доставку магнитолипосомального препарата к области опухоли с помощью воздействия внешнего магнитного поля [Gang J. et al. "Magnetic poly ε-caprolactone nanoparticles containing Fe3O4 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cancer xenograft mouse model / Journal of drug targeting. 2007. v. 15. №.6. p. 445-453.].According to the results of measurements using the dynamic light scattering method (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK), the average size of the obtained magnetic liposomes is 185.5 ± 72.1 nm (see Table 1). The saturation magnetization value for the obtained sample of magnetic liposomes is 15.2 emu / g, which allows for the controlled delivery of the magnetoliposome preparation to the tumor region using an external magnetic field [Gang J. et al. "Magnetic poly ε-caprolactone nanoparticles containing Fe 3 O 4 and gemcitabine enhance anti-tumor effect in pancreatic cancer xenograft mouse model / Journal of drug targeting. 2007. v. 15. No. 6. p. 445-453.].
Образец хранят в герметичной, продутой азотом емкости при температуре 2 - 4°С в течение 15 дней. После разбавления стерильной или бактериостатической водой для инъекций до нужной концентрации образец может быть использован для гипертермии опухолей.The sample is stored in a sealed, nitrogen-purged container at a temperature of 2 - 4 ° C for 15 days. After dilution with sterile or bacteriostatic water for injection to the desired concentration, the sample can be used for hyperthermia of tumors.
Для предотвращения окисления фосфолипида и увеличения срока хранения в образец могут быть добавлены разрешенные для внутривенного введения антиоксиданты и/или консерванты в эффективном количестве. Если предполагается дальнейшее хранение суспензии магнитных липосом в замороженном состоянии, в образец добавляют криопротектор из класса моно- или дисахаридов, например, сахарозу.To prevent the oxidation of phospholipid and increase the shelf life, antioxidants and / or preservatives approved for intravenous administration in an effective amount may be added to the sample. If further storage of the suspension of magnetic liposomes is supposed to be frozen, a cryoprotectant from the class of mono- or disaccharides, for example, sucrose, is added to the sample.
Пример 2. Получение магнитных липосом, нагруженных рубомициномExample 2. Obtaining magnetic liposomes loaded with rubomycin
Рубомицина гидрохлорид. 
Навеску рубомицина гидрохлорида массой 6 мг растворяют в 1,25 мл дистиллированной воды. К полученному раствору добавляют 0,25 мл водного золя наночастиц магнетита (средний диаметр наночастиц 8,23±1,32 нм) с концентрацией наночастиц 30 мг/мл. Смесь, содержащую рубомицин в концентрации 4 мг/мл и наночастицы магнетита в концентрации 5 мг/мл, озвучивают при комнатной температуре в течение 15 мин (мощность 70 W, частота 40KHz). Навеску фосфатидилхолина массой 40 мг растворяют в 1,5 мл хлороформа, раствор упаривают досуха на роторно-вакуумном испарителе при температуре, не превышающей 40°С. К образовавшейся на стенках колбы тонкой липидной пленке прибавляют 1,5 мл приготовленного, как описано выше, раствора рубомицина гидрохлорида, содержащего наночастицы магнетита. Полученную суспензию озвучивают в условиях, как в Примере 1, а затем проводят 3-кратную процедуру, включающую быстрое замораживание при температуре жидкого азота, плавное оттаивание при комнатной температуре не выше 30°С и последующее озвучивание полученной суспензии в УЗ-ванне в условиях, аналогичных Примеру 1. Средний размер полученных магнитных липосом, нагруженных рубомицином по данным ДСР составляет 179,5±75,3 нм (см. Табл. 1).A portion of rubomycin hydrochloride weighing 6 mg is dissolved in 1.25 ml of distilled water. 0.25 ml of an aqueous sol of magnetite nanoparticles (average nanoparticle diameter of 8.23 ± 1.32 nm) with a nanoparticle concentration of 30 mg / ml was added to the resulting solution. A mixture containing rubomycin at a concentration of 4 mg / ml and magnetite nanoparticles at a concentration of 5 mg / ml are voiced at room temperature for 15 minutes (power 70 W,
Величина намагниченности насыщения для полученного образца магнитных липосом составляет 9,6 emu/g, что позволяет осуществлять адресную доставку препарата под действием магнитного поля. Коэрцитивная сила образца менее 4 кА/м, остаточная намагниченность менее 0,5 emu/g. Таким образом, образец практически не обладает остаточной намагниченностью, что исключает возможность неконтролируемой агрегации наночастиц после воздействия агнитного поля.The saturation magnetization value for the obtained sample of magnetic liposomes is 9.6 emu / g, which allows targeted delivery of the drug under the influence of a magnetic field. The coercive force of the sample is less than 4 kA / m, the residual magnetization is less than 0.5 emu / g. Thus, the sample has practically no residual magnetization, which excludes the possibility of uncontrolled aggregation of nanoparticles after exposure to an agnitic field.
Образец хранят в герметичной, продутой азотом емкости при температуре 2-4°С. Визуальный контроль и контроль методом ДСР показывают, что в этих условиях образец сохраняет стабильность не менее двух недель.The sample is stored in a sealed, nitrogen-purged container at a temperature of 2-4 ° C. Visual inspection and control by DSR show that under these conditions the sample remains stable for at least two weeks.
Для обеспечения криостабильности образцов магнитных липосом, нагруженных рубомицином, в водный раствор, содержащий лекарственное средство и наночастицы магнетита, добавляют сахарозу до концентрации 40 мг/мл. Заявляемым способом получают стабильную суспензию, содержащую магнитные липосомы со средним диаметром 173,0±74,9 нм. После трехкратного замораживания образца при температуре минус 20°С с последующим оттаиванием при 6°С размер магнитных липосом практически не изменяется и составляет 173,5±92,3 нм. В замороженном состоянии при температуре минус 20°С образец может храниться не менее двух месяцев и сразу после размораживания готов к применению.To ensure cryostability of samples of magnetic liposomes loaded with rubomycin, sucrose is added to an aqueous solution containing the drug and magnetite nanoparticles to a concentration of 40 mg / ml. The inventive method receive a stable suspension containing magnetic liposomes with an average diameter of 173.0 ± 74.9 nm. After freezing the sample three times at a temperature of minus 20 ° С followed by thawing at 6 ° С, the size of magnetic liposomes practically does not change and amounts to 173.5 ± 92.3 nm. In a frozen state at a temperature of minus 20 ° С the sample can be stored for at least two months and immediately after defrosting it is ready for use.
Пример 3. Получение магнитолипосом, нагруженных феофорбидом АExample 3. Obtaining magnetolipos loaded with pheophorbide A
Феофорбид А - практически нерастворимый в воде противоопухолевый препарат, представляющий собой продукт распада хлорофилла, и применяемый в качестве фотосенсибилизатора в фотодинамической терапии опухолей.Pheoforbid A is a practically insoluble antitumor drug, which is a decay product of chlorophyll, and is used as a photosensitizer in the photodynamic therapy of tumors.
В 1,5 мл хлороформа растворяют 40 мг фосфатидилхолина и 1 мг феофорбида А. Полученный раствор упаривают досуха на роторно-вакуумном испарителе при температуре, не превышающей 40°С. К образовавшейся на стенках тонкой липидной пленке прибавляют 1,5 мл водного золя наночастиц магнетита с концентрацией 5 мг/мл. Средний диаметр наночастиц 8,23±1,32 нм. Полученную суспензию озвучивают как в Примере 1, а затем проводят 3-кратную процедуру, включающую быстрое замораживание при температуре жидкого азота, оттаивание на водяной бане при температуре 25°С с последующим озвучиванием полученной суспензии в УЗ-ванне, как в Примере 1. Средний размер полученных липосом по данным ДСР составляет 186,6±81,3 нм. Образец хранят в герметичной, продутой азотом емкости при температуре 2 - 4°С. Визуальный контроль и контроль методом фотонной корелляционной спектроскопии показывают, что в этих условиях образец сохраняет стабильность не менее двух недель.40 mg of phosphatidylcholine and 1 mg of pheophorbide A are dissolved in 1.5 ml of chloroform. The resulting solution is evaporated to dryness on a rotary vacuum evaporator at a temperature not exceeding 40 ° C. 1.5 ml of an aqueous sol of magnetite nanoparticles with a concentration of 5 mg / ml are added to the thin lipid film formed on the walls. The average nanoparticle diameter is 8.23 ± 1.32 nm. The resulting suspension is voiced as in Example 1, and then a 3-fold procedure is carried out, including rapid freezing at a temperature of liquid nitrogen, thawing in a water bath at a temperature of 25 ° C, followed by voicing of the resulting suspension in an ultrasonic bath, as in Example 1. Average size obtained liposomes according to DSR is 186.6 ± 81.3 nm. The sample is stored in a sealed, nitrogen-purged container at a temperature of 2 - 4 ° C. Visual inspection and control by photon correlation spectroscopy show that under these conditions the sample remains stable for at least two weeks.
Магнитные свойства магнитолипосом, нагруженных феофорбидом А, аналогичны тем, которые получены для магнитолипосом, нагруженных рубомицином.The magnetic properties of magnetolipos loaded with pheophorbide A are similar to those obtained for magnetolipos loaded with rubomycin.
Для обеспечения криостабильности магнитных липосом, нагруженных феофорбидом А, в водный золь, содержащий наночастицы магнетита, добавляют сахарозу до концентрации 40 мг/мл. Все остальные процедуры выполняют, как описано выше. Получают стабильную суспензию, содержащую магнитные липосомы со средним диаметром 184,5±83,3 нм. После трехкратного замораживания при температуре минус 20°С с последующим оттаиванием при 6°С размер магнитных липосом практически не изменяется и составляет 185,9±81,8 нм. В замороженном состоянии при температуре минус 20°С образец может храниться не менее двух месяцев, и сразу после размораживания готов к применению.To ensure cryostability of magnetic liposomes loaded with pheophorbide A, sucrose is added to an aqueous sol containing magnetite nanoparticles to a concentration of 40 mg / ml. All other procedures are performed as described above. A stable suspension is obtained containing magnetic liposomes with an average diameter of 184.5 ± 83.3 nm. After three freezing at a temperature of minus 20 ° С followed by thawing at 6 ° С, the size of magnetic liposomes practically does not change and amounts to 185.9 ± 81.8 nm. In the frozen state at a temperature of minus 20 ° С the sample can be stored for at least two months, and immediately after thawing it is ready for use.
Таким образом, предложенный способ получения магнитных липосом легко осуществим, не требует использования специального оборудования и позволяет быстро получать магнитные липосомы, размерные характеристики которых отвечают требованиям, предъявляемым к липосомальным препаратам, применяемым для терапии опухолей. Применение дополнительных сепарирующих процедур для получения частиц нужного размера, не требуется. Способ позволяет получать как «пустые», не содержащие химиопрепарата магнитолипосомы, которые могут быть использованы для гипертермии опухолей, так и нагруженные противоопухолевым средством магнитные липосомы для химиотералевтического лечения.Thus, the proposed method for producing magnetic liposomes is easily feasible, does not require the use of special equipment, and allows one to quickly obtain magnetic liposomes whose dimensional characteristics meet the requirements for liposome preparations used for the treatment of tumors. The use of additional separation procedures to obtain particles of the desired size is not required. The method allows to obtain both "empty", chemotherapy-free magnetoliposomes, which can be used for hyperthermia of tumors, and magnetic liposomes loaded with an antitumor agent for chemotherapy.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018130628A RU2697802C1 (en) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | Method of producing magnetic liposomes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018130628A RU2697802C1 (en) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | Method of producing magnetic liposomes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2697802C1 true RU2697802C1 (en) | 2019-08-20 |
Family
ID=67640556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018130628A RU2697802C1 (en) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | Method of producing magnetic liposomes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2697802C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990004943A1 (en) * | 1988-11-09 | 1990-05-17 | Unger Evan C | Liposomal radiologic contrast agents |
| RU2216315C2 (en) * | 1998-06-18 | 2003-11-20 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс | Method for preparing liposomes |
| RU2357724C1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-06-10 | Институт химии нефти Сибирского отделения Российской академии наук | Method of obtaining magnetosensitive liposomes |
| CN101590017A (en) * | 2008-05-29 | 2009-12-02 | 广州军区广州总医院 | A kind of preparation method of taxol magnetic nano liposome |
| CN103040756B (en) * | 2013-01-07 | 2015-10-14 | 江苏吉贝尔药业股份有限公司 | A kind of preparation method of mPEG epirubicin hydrochloride magnetic liposome |
-
2018
- 2018-08-23 RU RU2018130628A patent/RU2697802C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990004943A1 (en) * | 1988-11-09 | 1990-05-17 | Unger Evan C | Liposomal radiologic contrast agents |
| RU2216315C2 (en) * | 1998-06-18 | 2003-11-20 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс | Method for preparing liposomes |
| RU2357724C1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-06-10 | Институт химии нефти Сибирского отделения Российской академии наук | Method of obtaining magnetosensitive liposomes |
| CN101590017A (en) * | 2008-05-29 | 2009-12-02 | 广州军区广州总医院 | A kind of preparation method of taxol magnetic nano liposome |
| CN103040756B (en) * | 2013-01-07 | 2015-10-14 | 江苏吉贝尔药业股份有限公司 | A kind of preparation method of mPEG epirubicin hydrochloride magnetic liposome |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| II. MATERIALS AND METHODS. * |
| Javier Alonso et al., Superparamagnetic nanoparticles encapsulated in lipid vesicles for advanced magnetic hyperthermia and biodetection // * |
| Javier Alonso et al., Superparamagnetic nanoparticles encapsulated in lipid vesicles for advanced magnetic hyperthermia and biodetection // JOURNAL OF APPLIED PHYSICS 119, 083904, 2016, II. MATERIALS AND METHODS. * |
| KUZNETSOV A.A. et al., Application of magnetic liposomes for magnetically guided transport of muscle relaxants and anti-cancer photodynamic drugs // Journal of Magnetism and Magnetic Materials 225, 2001, р.р. 95-100. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gul et al. | A comprehensive review of magnetic nanomaterials modern day theranostics | |
| Fang et al. | Extremely low frequency alternating magnetic field–triggered and MRI–traced drug delivery by optimized magnetic zeolitic imidazolate framework-90 nanoparticles | |
| Li et al. | Pulmonary delivery of theranostic nanoclusters for lung cancer ferroptosis with enhanced chemodynamic/radiation synergistic therapy | |
| Hwang et al. | Effective delivery of immunosuppressive drug molecules by silica coated iron oxide nanoparticles | |
| Malekigorji et al. | The use of iron oxide nanoparticles for pancreatic cancer therapy | |
| Martina et al. | The effect of magnetic targeting on the uptake of magnetic-fluid-loaded liposomes by human prostatic adenocarcinoma cells | |
| Nappini et al. | Magnetic field responsive drug release from magnetoliposomes in biological fluids | |
| Li et al. | Magnetic iron oxide nanoparticles/10-hydroxy camptothecin co-loaded nanogel for enhanced photothermal-chemo therapy | |
| Lin et al. | Facile phase transfer of hydrophobic Fe 3 O 4@ Cu 2− x S nanoparticles by red blood cell membrane for MRI and phototherapy in the second near-infrared window | |
| Philosof-Mazor et al. | Bolaamphiphilic vesicles encapsulating iron oxide nanoparticles: New vehicles for magnetically targeted drug delivery | |
| Svenskaya et al. | Biodegradable polyelectrolyte/magnetite capsules for MR imaging and magnetic targeting of tumors | |
| Mykhaylyk et al. | Doxorubicin magnetic conjugate targeting upon intravenous injection into mice: High gradient magnetic field inhibits the clearance of nanoparticles from the blood | |
| Behnam et al. | Microniosomes for concurrent doxorubicin and iron oxide nanoparticles loading; preparation, characterization and cytotoxicity studies | |
| US20180280546A1 (en) | Stimuli-responsive magneto-plasmonic nanocarrier | |
| Zhang et al. | Synergistic combination of PEGylated selenium nanoparticles and X-ray-induced radiotherapy for enhanced anticancer effect in human lung carcinoma | |
| Khalkhali et al. | Simultaneous diagnosis and drug delivery by silymarin-loaded magnetic nanoparticles | |
| Liu et al. | Improved delivery system for celastrol-loaded magnetic Fe3O4/α-Fe2O3 heterogeneous nanorods: HIF-1α-related apoptotic effects on SMMC-7721 cell | |
| Wu et al. | Therapeutic strategies of iron-based nanomaterials for cancer therapy | |
| Van de Walle et al. | Emergence of magnetic nanoparticles in photothermal and ferroptotic therapies | |
| Wang et al. | cRGD-conjugated magnetic-fluorescent liposomes for targeted dual-modality imaging of bone metastasis from prostate cancer | |
| Song et al. | Self-assembling ferrimagnetic fluorescent micelles for bioimaging guided efficient magnetic hyperthermia therapy | |
| RU2697802C1 (en) | Method of producing magnetic liposomes | |
| Scialla et al. | Insights into the Effect of Magnetic Confinement on the Performance of Magnetic Nanocomposites in Magnetic Hyperthermia and Magnetic Resonance Imaging | |
| Banerjee et al. | Magneto-and opto-stimuli responsive nanofibers as a controlled drug delivery system | |
| RU2357724C1 (en) | Method of obtaining magnetosensitive liposomes |