RU2697781C2 - Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека - Google Patents

Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека Download PDF

Info

Publication number
RU2697781C2
RU2697781C2 RU2017146642A RU2017146642A RU2697781C2 RU 2697781 C2 RU2697781 C2 RU 2697781C2 RU 2017146642 A RU2017146642 A RU 2017146642A RU 2017146642 A RU2017146642 A RU 2017146642A RU 2697781 C2 RU2697781 C2 RU 2697781C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
vpx
sequence
lentiviral
dendritic cells
vector
Prior art date
Application number
RU2017146642A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017146642A (ru
RU2017146642A3 (ru
Inventor
Степан Петрович Чумаков
Юлия Евгеньевна Кравченко
Анна Евгеньевна Иванова
Елена Ивановна Фролова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2017146642A priority Critical patent/RU2697781C2/ru
Publication of RU2017146642A publication Critical patent/RU2017146642A/ru
Publication of RU2017146642A3 publication Critical patent/RU2017146642A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2697781C2 publication Critical patent/RU2697781C2/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • C12N15/867Retroviral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в терапии онкологических заболеваний. Описан универсальный вспомогательный плазмидный экспрессионный лентивирусный вектор для получения высоких титров вирусных частиц, содержащих ген Vpx, включающий в качестве базовых элементов, обеспечивающих функционирование вектора, последовательность вирион-ассоциированного белка Vpx, содержащую С-концевой HIV-1 gag/pol мотив и FLAG последовательность и объединенную с последовательностью гена трансактиваторного белка Rev через специфическую последовательность Т2А, обеспечивающую расщепление слитых белков во время процесса трансляции мРНК трансгена; в качестве регуляторных элементов- RSVпромотор/энхансер [rous sarcoma virus) и NES (nuclear export signal)- сигнал экспорта из ядра в цитоплазму. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров Vpx-содержащих вирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в терапии онкологических заболеваний.
Дендритные клетки играют ключевую роль в регуляции приобретенного иммунитета, обеспечивая эффективную защиту организма против множества инфекций и различных патологий. Основная функция дендритных клеток заключается в поглощении чужеродных антигенов, их процессирование и презентация антигенных детерминант эффекторным клеткам иммунной системы. В контексте онкологических заболеваний дендритные клетки являются крайне перспективными терапевтическими агентами, благодаря возможности презентации специфических опухолевых антигенов и активации противоопухолевого ответа в организме пациента.
В виду низкого содержания дендритных клеток в крови человека, стандартная схема приготовления дендритно-клеточных вакцин предполагает дифференцировку моноцитов периферической крови пациента в дендритные клетки под воздействием набора цитокинов. В дальнейшем полученные подобным образом дендритные клетки нагружаются очищенным препаратом специфического опухолевого антигена или тотальным лизатом опухолевых клеток. Наиболее оптимальным способом загрузки опухолевых антигенов является трансдукция дендритных клеток антиген-содержащими вирусными векторами, обеспечивающими высокоэффективную презентацию антигенов молекулами главного комплекса гистосовместимости первого класса (MHCI). Как правило, для трансдукции используют лентивирусные векторы на основе вируса иммунодефицита человека 1 типа HIV1, которые позволяют интегрировать целевую последовательность в геномную ДНК клетки, тем самым обеспечивая постоянный и стабильный уровень экспрессии антигена.
В уровне техники раскрыты различные конструкции лентивирусных векторов.
Известен рекомбинантный лентивирусный вектор, содержащий: (а) экспрессионную кассету, содержащую трансген, расположенный под контролем промотора, который обладает активностью в отношении стимуляции выявляемой транскрипции трансгена в человеческих клетках человека; и (b) центральный полипуриновый тракт (сРРТ), расположенный выше экспрессирующей кассеты. Элементом посттранскрипционной регуляции является элемент посттранскрипционной регуляции вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WRPE) или элемент посттранскрипционной регуляции вируса гепатита В (HPRE). Промотор может представлять собой EF1-α. Трансген например представляет собой gp91-phox, gp47-phox, эритропоэтин, интерлейкин, колониестимулирующий фактор, интегрин α11bβ, ген множественной лекарственной резистентности, противовирусный ген, ген, кодирующий фактор свертывания крови VIII, ген, кодирующий фактор свертывания крови IX, Т-клеточный рецептор антигена, В-клеточный рецептор антигена, одноцепочечное антитело (ScFv), TNF, гамма-интерферон, CTLA4, В4, Melana, MAGE, маркерный ген, люциферазу или GFP (патент RU 2305708).
Известен способ индуцирования иммунного ответа против антигена у субъекта путем введения субъекту, терапевтически эффективного количества дендритной клетки или ее предшественника, который трансдуцируется псевдотипированным лентивирусным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который экспрессируется в указанной дендритной клетке и представлен на поверхности дендритной клетки, так что после введения субъекту иммунный ответ индуцируется против антигена у субъекта. Описан вектор, который содержит белок оболочки из вируса, отличный от лентивируса, и геном лентивируса, кодирующий продукты гена env и nef; и, по меньшей мере, три вспомогательных белковых генных продукта, например, нефункциональные vif, vpr и vpu (международная заявка WO 0116342 (А1)).
Однако применение лентивирусных векторов для создания дендритно-клеточных вакцин ограничено низкой эффективностью трансдукции дендритных клеток. Низкая эффективность трансдукции обусловлена экспрессией в дендритных клетках белка SAMHD1, специфической фосфогидролазы, которая расщепляет нуклеотиды (dNTPs) до неорганического фосфата и нуклеозида, снижая тем самым пул dNTPs и препятствуя обратной транскрипции вирусного генома. Кроме того, SAMHD1 обладает нуклеазной активностью и приводит к деградации вирусной РНК, снижая вероятность интеграции целевой последовательности до минимума. Для многократного увеличения уровня трансдукции дендритных клеток может быть использован метод создания лентивирусных вирионов, ассоциированных с белком Vpx. Vpx - вирион - ассоциированный белок - характерен для вируса иммунодефицита человека 2 типа (HIV-2) и большинства вирусов иммунодефицита обезьян (SIV), однако отсутствует в HIV-1. Попадая в клетку, Vpx взаимодействует с SAMHD1 и направляет его на путь протеасомной деградации, тем самым позволяя вирусу реплицироваться и встраиваться в геном клетки-хозяина.
В уровне техники имеется ряд решений, где используется последовательность Vpx.
Известна композиция, содержащая псевдотипированные лентивирусные векторные частицы, содержащие (а) белок Vpx или Vpr-белок, который сохраняет активность, ингибирующую SAMHDI, (b) экзогенный полинуклеотид, кодирующий антиген, и (с) множество гликопротеинов оболочки, которые предпочтительно связывают клетки, экспрессирующие DC-SIGN, где ген лентивирусного вектора получен из ВИЧ-1. Ген лентивирусного вектора имеет инактивированный 3'-длинный концевой повтор (LTR) или самоиннактивирующий 3'-длинный концевой повтор (LTR), элемент U3, в котором отсутствует, по меньшей мере, одна из энхансерной последовательности, блок TATA, сайт Spl, сайт NK-kappa В или полипуриновый тракт (РРТ), нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 21, 22 или 23. Дополнительно может содержаться нуклеотидная последовательность, кодирующая дендритную клетку (заявка ЕА 201491813 (А1)).
В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан лентивирусный вектор который может быть использован для получения вирионов/вирусов, которые проявляют повышенную инфекционность по отношению к макрофагам, полученным из моноцитов (MDM) и дендритным клеткам (MDDC). Лентивирус сконструирован с р6 химерными пакетами gag-pol Vpx и заражает MDDC. (US 9149519 (В2), опубл. 2015-10-06).
Технической задачей изобретения является создание вспомогательного лентивирусного вектора, позволяющего получать вирусные частицы с высоким содержанием молекул белка Vpx.
Задача решается разработанным универсальным плазмидным экспрессионным лентивирусным вектором, кодирующим последовательность гена Vpx, содержащую С-концевой HIV-1 gag/pol мотив и FLAG последовательность, и объединенную с последовательностью гена трансактиваторного белка Rev через специфическую последовательность Т2А, обеспечивающую расщепление слитых белков во время процесса трансляции мРНК трансгена; также включающим ряд регуляторных элементов: RSV промотор/энхансер (rous sarcoma virus), NES (nuclear export signal)-сигнал экспорта из ядра в цитоплазму, MCS (multiple cloning site).
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:
Фиг. 1. Схема основных элементов коммерческой лентивирусной плазмиды pRSV-Rev.
Фиг. 2. Карта вспомогательного вектора pRSV-Rev-T2A-Vpx, кодирующего белок Vpx.
Фиг. 3. Микрофотография дендритных клеток, зараженных вирусом EF1alpha-tagRFP-NP-puro.
Фиг. 4. Цитометрический анализ количества дендритных клеток, экспрессирующих последовательность гена RFP в составе вируса.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением: многократное повышение эффективности трансдукции стабильной экспрессии последовательности целевого антигена в дендритных клетках человека, способных экспрессировать различные генетические конструкции. Изобретение иллюстрируют следующие примеры:
Пример 1. Получение вспомогательного лентивирусного вектора, кодирующего последовательность гена Vpx.
При создании заявленной конструкции производят модификацию коммерческой лентивирусной упаковочной плазмиды pRSV-Rev (Addgene), исходная структура которой приведена на фиг. 1.
Модификация заключается в переклонировании последовательности трансактиваторного белка Rev таким образом, чтобы С-концевой регион данного белка содержал последовательность "self cleaving" Т2А пептида и дополнительный рестрикционный сайт XbaI. Для этого сначала производят амплификацию последовательности Rev с праймерами Rev (прямой праймер) и Rev-T2A (обратный 1]. В качестве матрицы используют коммерческую плазмиду pRSV-Rev. Затем с амплифицированного фрагмента снова производят амплификацию Rev, но в последовательность праймера ранее закладывают последовательности Т2А и сайтов рестрикции XbaI и BglII. Далее производят рестрикцию коммерческой плазмиды pRSV-Rev и конечного амплифицированного фрагмента по сайтам XhoI и BglII. Рестрицированный вектор и фрагмент лигируют.
Последовательность гена Vpx амплифицируют и клонируют по сайтам BglII и XbaI в модифицированную плазмиду pRSV-Rev. Для увеличения эффективности упаковки белка Vpx в капсид вируса в последовательность прямого праймера вводят последовательность HIV-1 gag/pol упаковочного мотива. Кроме того, для идентификации упаковки белка Vpx в капсид лентивирусных частиц, в С-концевую область амплифицированной последовательности Vpx помещают последовательность FLAG эпитопа.
Figure 00000001
Нуклеотидные последовательности элементов, встроенных в pRSV-Rev:
- Последовательность Т2А пептида 5'-ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG-3' SEQ ID №1
- Последовательность рестрикционного сайта XbaI 5'-TCTAGA-3'
SEQ ID №2
- Последовательность Vpx
Figure 00000002
Figure 00000003
SEQ ID №3
- Последовательность FLAG 5'-GACTACAAAGACGATGACGACAAG-3' SEQ ID №4
Нуклеотидную последовательность созданной генетической конструкции верифицируют методом секвенирования по Сэнгеру. Итогом работы стала генетическая конструкция pRSV-Rev-T2A-Vpx, структура которой представлена на фиг. 2.
Пример 2. Структура вспомогательного лентивирусного вектора, кодирующего последовательность гена Vpx.
В состав заявленного вектора входит ряд базовых и регуляторных элементов, обеспечивающих полноценное функционирование вектора:
- RSV промотор/энхансер (rous sarcoma virus) - последовательность, обеспечивающая стабильную экспрессию во многих эукариотических клетках.
- NES (nuclear export signal) - короткая последовательность, способствующая экспорту белка из клеточного ядра в цитоплазму через ядерный поровый комплекс.
- Rev - регуляторная последовательность, обеспечивающая транспортировку молекулы вирусной мРНК из ядра в цитоплазму, где происходит ее экспрессия.
- Т2А - последовательность, обеспечивающая расщепление слитых белков во время процесса трансляции мРНК трансгена. В заявленной генетической конструкции обеспечивает расщепление белков Rev и Vpx.
- HIV-1 gag/pol - последовательность, способствующая интеграции белка в состав вирусной частицы. В описываемой конструкции обеспечивает интеграцию белка Vpx.
- FLAG - последовательность, позволяющая идентифицировать белок, с которым она конъюгирована. В заявленном векторе FLAG слит с Vpx.
- Vpx - вирион - ассоциированный белок, характерный для вируса иммунодефицита человека 2 типа (HIV-2) и большинства вирусов иммунодефицита обезьян (SIV). Направляет белок SAMHD1 на путь протеасомной деградации, повышая таким образом эффективность репликации вирусов в дендритных клетках.
Пример 3. Анализ эффективности наработки вирусных частиц в дендритных клетках человека, трансфицированных лентивирусом, содержащим белок Vpx.
Для анализа эффективности трансдукции дендритных клеток Vpx-содержащим вирусом клеточная линия НЕК293Т котрансфецируют лентивирусным вектором pLenti-EF1alpha-tagRFP-NP-puro и упаковочными вспомогательными плазмидами pVSV-G, pMDLg/pRRE, pRSV-Rev-T2A-Vpx. В результате получают лентивирусный препарат, содержащий белок Vpx, инфекционный титр которого оценивался путем подсчета количества инфицированных (трансдуцированных) вирусным вектором клеток в популяции при использовании фиксированного объема вирусного препарата. Для сравнительной оценки получают вирусные частицы, в составе которых Vpx отсутствует. Содержание белка Vpx в составе вирионов верифицируют методом вестерн-блота окраской на FLAG пептид, который слит с С-концевым доменом Vpx.
Дендритные клетки, полученные в результате дифференцировки моноцитов, разделяют на 2 группы и инфицируют Vpx+ (содержащими Vpx) или Vpx- (не содержащими Vpx) вирусными частицами. Анализ экспрессии флуоресцентного белка RFP (red fluorescent protein) в составе вирусной кассеты проводят через 48 часов после инфекции методом проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии (фиг. 3, 4). В результате инфекции, 42,5% популяции дендритных клеток, зараженных Vpx+ лентивирусными частицами, экспрессировали флуоресцентный белок RFP (фиг. 4), в то время как для Vpx- дендритных клеток процент трансдукции составил всего 0.6. БОльшая эффективность трансдукции целевой клеточной культуры, выражающаяся в большем проценте трансдуцированных клеток, указывает на повышенный инфекционный титр лентивирусного препарата (при прочих равных условиях).
Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности трансдукции дендритных клеток вирусными частицами, содержащими в своем составе Vpx белок, интегрированный в генетический материал вируса при помощи разработанного вспомогательного лентивирусного вектора pRSV-Rev-T2A-Vpx. Данный вектор может использоваться для получения дендритных клеток, способных экспрессировать различные генетические конструкции, что является важным условием для усиления иммунотерапевтического потенциала дендритно-клеточных вакцин.

Claims (1)

  1. Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор, предназначенный для эффективного заражения моноцитов и дендритных клеток человека, кодирующий последовательность гена Vpx, включающий в качестве базовых элементов, обеспечивающих функционирование вектора, последовательность вирион-ассоциированного белка Vpx, содержащую С-концевой HIV-1 gag/pol мотив и FLAG последовательность и объединенный с последовательностью гена трансактиваторного белка Rev через специфическую последовательность Т2А, обеспечивающую расщепление слитых белков во время процесса трансляции мРНК трансгена; в качестве регуляторных элементов - RSV промотор/энхансер (rous sarcoma virus) и NES (nuclear export signal) - сигнал экспорта из ядра в цитоплазму.
RU2017146642A 2017-12-28 2017-12-28 Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека RU2697781C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017146642A RU2697781C2 (ru) 2017-12-28 2017-12-28 Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017146642A RU2697781C2 (ru) 2017-12-28 2017-12-28 Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017146642A RU2017146642A (ru) 2019-06-28
RU2017146642A3 RU2017146642A3 (ru) 2019-07-17
RU2697781C2 true RU2697781C2 (ru) 2019-08-19

Family

ID=67209747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017146642A RU2697781C2 (ru) 2017-12-28 2017-12-28 Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2697781C2 (ru)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Thomas D. Norton and Elizabeth A. Miller, Recent Advances in Lentiviral vaccines for Hiv-1 infection.Frontiers in Immunology, Volume 7, Article 243, 21 June 2016.doi: 10.3389/fimmu.2016.00243. Сорокин А.В. и др. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков. Успехи биологической химии, т.47, 2007, с.89-128. *
Thomas D. Norton and Elizabeth A. Miller, Recent Advances in Lentiviral vaccines for Hiv-1 infection.Frontiers in Immunology, Volume 7, Article 243, 21 June 2016.doi: 10.3389/fimmu.2016.00243. Сорокин А.В. и др. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков. Успехи биологической химии, т.47, 2007, с.89-128. Trichas G. et al. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice.BMC Biology, 15 September 2008.doi:10.1186/1741-7007-6-40. Иванов А.С. и др. Технологии белковой интерактомики.; НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 2011 г. (поступила в редакцию 08.06.2010 г.). *
Trichas G. et al. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice.BMC Biology, 15 September 2008.doi:10.1186/1741-7007-6-40. Иванов А.С. и др. Технологии белковой интерактомики.; НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 2011 г. (поступила в редакцию 08.06.2010 г.). *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017146642A (ru) 2019-06-28
RU2017146642A3 (ru) 2019-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sakuma et al. Lentiviral vectors: basic to translational
Mangeot et al. Development of minimal lentivirus vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) and their use for gene transfer into human dendritic cells
Merten et al. Large-scale manufacture and characterization of a lentiviral vector produced for clinical ex vivo gene therapy application
Pluta et al. Use of HIV as a gene transfer vector
EP2405945A2 (en) Non-integrating retroviral vector vaccines
US20170362607A1 (en) Use of non-subtype b gag proteins for lentiviral packaging
Ku et al. Use of lentiviral vectors in vaccination
Heinkelein et al. Efficient intracellular retrotransposition of an exogenous primate retrovirus genome
Titti et al. Live attenuated simian immunodeficiency virus prevents super-infection by cloned SIVmac251 in cynomolgus monkeys.
Suzuki et al. Gene regulatable lentiviral vector system
AU2021232603A1 (en) On demand expression of exogenous factors in lymphocytes to treat HIV
Sakkhachornphop et al. Zinc finger protein designed to target 2-long terminal repeat junctions interferes with human immunodeficiency virus integration
Johnson et al. HIV-based lentiviral vectors: Origin and sequence differences
Jung et al. Preclinical assessment of mutant human TRIM5α as an anti-HIV-1 transgene
Mühlebach et al. Stable transduction of primary human monocytes by simian lentiviral vector PBj
US20150182617A1 (en) Glycoproteins for pseudotyping lentivectors
Tareen et al. A rev-independent gag/pol eliminates detectable psi-gag recombination in lentiviral vectors
Buffa et al. A single administration of lentiviral vectors expressing either full-length human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) HXB2 Rev/Env or codon-optimized HIV-1JR-FL gp120 generates durable immune responses in mice
Schüle et al. Restriction of HIV-1 replication in monocytes is abolished by Vpx of SIVsmmPBj
RU2697781C2 (ru) Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека
Barker et al. Vectors derived from the human immunodeficiency virus, HIV-1
Garg et al. Conditional cytotoxic anti-HIV gene therapy for selectable cell modification
Poluri et al. Genetic therapy for HIV/AIDS
Kloke et al. Functional HIV‐2‐and SIVsmmPBj‐derived lentiviral vectors generated by a novel polymerase chain reaction‐based approach
Corre et al. “RCL-pooling assay”: a simplified method for the detection of replication-competent lentiviruses in vector batches using sequential pooling

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210628

Effective date: 20210628