RU2695061C1 - Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures - Google Patents
Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures Download PDFInfo
- Publication number
- RU2695061C1 RU2695061C1 RU2019112633A RU2019112633A RU2695061C1 RU 2695061 C1 RU2695061 C1 RU 2695061C1 RU 2019112633 A RU2019112633 A RU 2019112633A RU 2019112633 A RU2019112633 A RU 2019112633A RU 2695061 C1 RU2695061 C1 RU 2695061C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- image
- images
- scaffolds
- cell
- scaffold
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims abstract description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 21
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical class CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- -1 OCT Compound Chemical class 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920003319 Araldite® Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001812 pycnometry Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000000207 volumetry Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Предполагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине, в частности к способам оценки структурных параметров скаффолдов и клеточно-инженерных конструкций (КИК) – характеристики пористости.The alleged invention relates to medicine, biotechnology, tissue engineering, regenerative medicine, in particular to methods for assessing the structural parameters of scaffolds and cell engineering structures (CIC) - characteristics of porosity.
Одним из основных направлений современной регенеративной медицины и биотехнологий является разработка тканезамещающих материалов для восстановления поврежденных тканей и органов. Развитие скаффолд-технологий связано, прежде всего, с культивированием клеток на трехмерных матрицах естественного или искусственного происхождения с целью пространственного трехмерного формирования ткани будущего трансплантата. Внутренняя архитектоника скаффолда, размеры, количество пор и канальцев, обеспечивающих внутренние коммуникации между порами в клеточно-инженерной конструкции, могут оказывать влияние на клеточную миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток. Наличие пор в структуре скаффолда обеспечивает трехмерный рост клеток с формированием множественных отростков и межклеточных контактов с образованием густой клеточной сети. Развитая система пор позволяет создать условия для поддержания нормального метаболизма, пролиферативной активности и дифференцировки клеток, и, как следствие, может обуславливать возможности васкуляризации и ремоделирования регенерирующей ткани. Данные литературы свидетельствуют о непосредственном влиянии микроструктуры скаффолда/КИК на клеточную адгезию, миграцию и пролиферацию (Шпичка А.И., Королев А.В., Дайвик, А. и др. Оценка васкулогенного потенциала гидрогелей на основе модифицированного фибрина // Цитология. 2016. Т. 58. № 10. С. 785–91; Ahn S., Koh Y.H., Kim G. A three-dimensional hierarchical collagen scaffold fabricated by a combined solid freeform fabrication (SFF) and electrospinning process to enhance mesenchymal stem cell (MSC) proliferation // J. Micromechanics Microengineering. 2010. V. 20. № 6. С. 65015; Ho W., Tawil B., Dunn J.C.Y. et al. The behavior of human mesenchymal stem cells in 3D fibrin clots: dependence on fibrinogen concentration and clot structure. // Tissue Eng. 2006. V. 12. № 6. С. 1587–1595; Sadeghi-Ataabadi M., Mostafavi-pour Z., Vojdani Z. et al. Fabrication and characterization of platelet-rich plasma scaffolds for tissue engineering applications // Mater. Sci. Eng. C. 2017. V. 71. С. 372–380). Одной из актуальных проблем, возникающих при разработке материалов для тканевой инженерии и проведении исследовании в области скаффолд-технологий, является определение микроархитектуры скаффолдов и клеточно-инженерных конструкций, в том числе определение наличия развитой системы пор в трехмерной структуре матриц, распределение пор по толще скаффолда и характеристика пористости. One of the main directions of modern regenerative medicine and biotechnology is the development of tissue substituting materials for the restoration of damaged tissues and organs. The development of scaffold technologies is primarily associated with the cultivation of cells on three-dimensional matrices of natural or artificial origin for the purpose of spatial three-dimensional formation of a future graft tissue. The internal architectonics of scaffold, the size, the number of pores and tubules that provide internal communication between the pores in the cell engineering structure, can influence cell migration, proliferation and differentiation of cells. The presence of pores in the scaffold structure provides three-dimensional cell growth with the formation of multiple processes and intercellular contacts with the formation of a dense cellular network. The developed system of pores allows creating conditions for maintaining normal metabolism, proliferative activity and cell differentiation, and, as a result, can determine the possibilities of vascularization and remodeling of regenerating tissue. Literature data indicate the direct influence of the microstructure of a scaffold / CIC on cell adhesion, migration and proliferation (Shpichka A.I., Korolev A.V., Dyvik, A. et al. Assessment of the vasculogenous potential of hydrogels based on modified fibrin // Cytology. 2016 58. No. 10. pp. 785–91; Ahn S., Koh YH, Kim G. A free-form-structured mesenchymal stem cell ( MSC) proliferation // J. Micromechanics Microengineering. 2010. V. 20. No. 6. S. 65015; Ho W., Tawil B., Dunn JCY et al., Fibrin clots: fibrinogen concentration and clot structure. // Tissue Eng. 2 006. V. 12. No. 6. pp. 1587–1595; Sadeghi-Ataabadi M., Mostafavi-pour Z., Vojdani Z. et al., Fabrication of characterization of platelet-rich plasma scaffolds for tissue engineering applications // Mater. Sci. Eng. C. 2017. V. 71. p. 372–380). One of the current problems arising in the development of materials for tissue engineering and conducting research in the field of scaffold technologies is the definition of microarchitecture of scaffolds and cell engineering designs, including the determination of the presence of a developed system of pores in the three-dimensional structure of matrices, the distribution of pores through the thickness of the scaffold and porosity characteristic.
Современные методы анализа пористости структуры скаффолдов не являются универсальными, часто длительны и трудоемки, требуют больших затрат, использования токсичных материалов (например, ртуть), либо нацелены на исследование образцов только определенной макроструктуры (порошки, слои, объемные тела). Так, например, калориметрические методы определения, методы пикнометрии позволяют проводить оценку только твердых пористых структур. Газовая волюмометрия применяется для измерения плотности сыпучих и пористых сред, а также плохо смачивающихся или недопускающих контакта с жидкостью веществ. Универсальные методы порометрии, пригодные для исследования любых пористых структур, отсутствуют. Отсутствие универсальных методов исследования пористой структуры усложняет выбор нужной методики исследования и приводит к необходимости комплексирования, унифицирования и модификации уже имеющихся методик и разработки новых подходов для характеристики пористых материалов создаваемых для использования в регенеративной медицине.Modern methods for analyzing the porosity of scaffold structures are not universal, often time consuming and laborious, costly, using toxic materials (for example, mercury), or are aimed at studying samples of only a certain macrostructure (powders, layers, bulk bodies). For example, calorimetric determination methods, pycnometry methods allow the evaluation of only solid porous structures. Gas volumetry is used to measure the density of bulk and porous media, as well as poorly wetted or non-admissible substances. Universal porometry methods suitable for the study of any porous structures are absent. The lack of universal methods for studying the porous structure complicates the selection of the required research methodology and leads to the need to integrate, unify and modify existing methods and develop new approaches to characterize porous materials created for use in regenerative medicine.
В качестве прототипа выбран способ количественного анализа внутренней пористой структуры (см. Lin S.C., Wang Y., Wertheim D.F., Coombes A.G.A. Production and in vitro evaluation of macroporous, cell-encapsulating alginate fibres for nerve repair // Materials Science & Engineering: C. Mater Biol Appl. 2017 Volume 73. P. 653-664), применяемый для характеристики пористости гидрогелиевого скаффолда представленного в виде альгинатных волокон, включающий: замораживание скаффолда в криомолдах с помощью крио-среды (Tissue Tek® O.C.T. Compound) при -80°С в течении 24 часов, перемещение замороженных блоков в криостат (Leica microsystems CM1850) при -20°С для уравновешивания температуры блока и криостата, получение срезов образцов толщиной 8 мкм, перемещение образцов в 2-луночные лабораторные слайды Lab-Tek (Permanentox®) для визуализации внутренней структуры скаффолдов и записи изображений на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе FluoView FV1000 (Olympus Corporation, Япония), получение 2D-изображений, формируемых путем сшивки 26 снимков, снятых со срезов образцов по оси z (104 мкм) с интервалом 4 мкм, предварительная обработка конфокальных изображений с помощью специального программного комплекса анализа и обработки изображений (MATLAB The MathWorks Inc., Natick, MA, USA) с использованием преобразования изображения в оттенки серого, и обработка с использованием порогового значения для обнаружения границы пор и формирования двоичного изображения (threshold), подбора пороговых уровней вручную для каждого изображения, с дальнейшим построением 3D-изображения структуры из последовательных 2D-изображений (до 110 изображений) с использованием программного обеспечения Amira v 5.3 (Visage Imaging GmbH, Берлин, Германия). Полученные 3D-изображения анализируются с помощью вычислительных алгоритмов, разработанных авторами способа. Результатом является характеристика пористости гидрогелиевого скаффолда, выражаемая в процентном соотношении объема пористой фазы с общим объемом скаффолда.As a prototype, a method of quantitative analysis of the internal porous structure was selected (see Lin SC, Wang Y., Wertheim DF, Coombes AGA Production and in vitro evaluation for macroporous, cell-encapsulating tissue for nerve repair). Materials Science & Engineering: C. Mater Biol Appl. 2017 Volume 73. P. 653-664) used to characterize the porosity of a hydrogel scaffold presented in the form of alginate fibers, including: freezing the scaffold in cryoMolds using a cryo-environment (Tissue Tek® OCT Compound) at -80 ° C within 24 hours, moving the frozen blocks in a cryostat (Leica microsystems CM1850) at -20 ° C to equilibrate temp block and cryostat tours, sampling 8 μm thick samples, moving samples into Lab-Tek 2-well laboratory slides (Permanentox®) to visualize the internal structure of scaffolds and recording images on a FluoView FV1000 confocal laser scanning microscope (Japan Olympus), obtaining 2D images formed by stitching 26 images taken from sample slices along the z axis (104 μm) at 4 μm intervals, pre-processing of confocal images using a special software for image analysis and processing (MATLAB The Ma thWorks Inc., Natick, MA, USA) using image conversion to grayscale, and processing using a threshold value to detect the pore boundary and form a binary image (threshold), manually adjust threshold levels for each image, and then build a 3D image structures from consecutive 2D images (up to 110 images) using Amira v 5.3 software (Visage Imaging GmbH, Berlin, Germany). The resulting 3D images are analyzed using computational algorithms developed by the authors of the method. The result is a characteristic of the porosity of the hydrogel scaffold, expressed as a percentage of the volume of the porous phase with the total volume of the scaffold.
Способ, представленный в прототипе, требует дорогостоящего криооборудования, специализированных криосред (Leica microsystems CM1850, Tissue Tek® O.C.T. Compound), а также сложного дополнительного программного обеспечения, в частности MATLAB The MathWorks Inc., Natick, MA, USA), Amira v 5.3 (Visage Imaging GmbH, Берлин, Германия). Для реализации представленного в прототипе способа необходимо жесткое соблюдение температурных режимов, что значительно усложняет работу с анализируемыми образцами и проведение анализа. Существенным недостатком прототипа является ручная настройка пороговых уровней для каждого изображения, что приводит к субъективизму в подсчете и учете пор, находящихся на границе пороговых уровней изображения. Еще одним недостатком является длительность и трудоемкость способа, так замораживание скаффолда в криосреде происходит при -800С в течение 24 часов, перед разрезанием блока на образцы необходимо «нагревание» замороженного при -800 блока до температуры криостата -200С, что требует несколько часов непрерывной работы. Кроме того, используемые для реализации способа прототипа криосрезы имеют микронный размер, в связи с этим, для получения изображений, необходимо проводить съемку с использованием функции z-стек. Таким образом, для получения одного, включаемого в анализ 2D-изображения, требуется сделать 26 снимков по оси z (104 мкм) с интервалом 4 мкм. В представленном прототипе в анализ включаются не 2D-изображения, а формируемые на их основе 3D-изображения. При этом для построения одного 3D-изображения необходимо до 110 последовательных 2D-изображений, что существенно усложняет процедуру и повышает временные затраты. The method presented in the prototype requires expensive cryo-equipment, specialized cryoshemes (Leica microsystems CM1850, Tissue Tek® OCT Compound), as well as sophisticated additional software, in particular MATLAB The MathWorks Inc., Natick, MA, USA), Amira v 5.3 ( Visage Imaging GmbH, Berlin, Germany). To implement the method presented in the prototype, strict adherence to temperature regimes is necessary, which greatly complicates the work with the analyzed samples and analysis. A significant disadvantage of the prototype is the manual adjustment of the threshold levels for each image, which leads to subjectivism in the counting and counting of pores located on the border of the threshold levels of the image. Another disadvantage is the length and complexity of the method, so freezing a scaffold in a cryogenic environment occurs at -80 0 C for 24 hours, before cutting the block into samples, it is necessary to "heat" the block frozen at -80 0 to a cryostat temperature of -20 0 C, which requires several hours of continuous work. In addition, the cryosections used for the implementation of the prototype method are micron in size, therefore, to obtain images, it is necessary to carry out shooting using the z-stack function. Thus, to obtain one 2D image to be included in the analysis, it is required to take 26 images along the z axis (104 μm) with an interval of 4 μm. In the presented prototype, it is not 2D images that are included in the analysis, but 3D images generated from them. At the same time, to build a single 3D image, you need up to 110 consecutive 2D images, which significantly complicates the procedure and increases time costs.
Задача предполагаемого изобретения – усовершенствование способа.The objective of the proposed invention is the improvement of the method.
Технический результат – получение характеристик пористости скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций (КИК) менее трудоемким, более быстрым и дешевым способом.The technical result is to obtain the characteristics of the porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures (CIC) in a less laborious, faster and cheaper way.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем получение 2D изображений срезов скаффолдов, загрузку 2D-изображений в программный комплекс анализа и обработки изображений, обработку полученных изображений с формированием двоичного изображения, до получения срезов образцы скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций последовательно фиксируют в 2,5% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере и в 1% растворе OsO4, затем подвергают пробоподготовке препаратов для электронной микроскопии, получают ультратонкие срезы, с полученных срезов на трансмиссионном электронном микроскопе при увеличении 4400× получают 2D-изображения с пяти и более EM-полей зрения, которые обрабатывают с применением процедуры формирования двоичного изображения с использованием автоматической настройки верхнего и нижнего значений пороговых уровней, полученное двоичное изображение анализируют по принципу сканирования всего изображения, при котором в качестве области интереса принимают структурообразующую часть скаффолда, а за фон изображения - просвет пор, измеряют выделенные с помощью порогового значения объекты, делают расчет процентного отношения структурообразующей части скаффолда (С) от общей площади анализируемого изображения, включая просвет пор, процент просвета пор рассчитывается по формуле: П (%)= 100% - С(%).The technical result is achieved due to the fact that in the method including obtaining 2D images of scaffold slices, loading 2D images into an image analysis and processing software package, processing the obtained images with the formation of a binary image, to obtain cuts, samples of scaffolds and / or cell engineering designs consistently fixed in a 2.5% solution of glutaraldehyde in phosphate buffer and in 1% OsO4 solution, then subjected to sample preparation of preparations for electron microscopy, ultrathin cuts, from the obtained slices on a transmission electron microscope at a magnification of 4400 ×, receive 2D images from five or more EM fields of view, which are processed using the procedure of forming a binary image using automatic adjustment of the upper and lower threshold values, the resulting binary image is analyzed by the principle of scanning the entire image, in which the structure-forming part of the scaffold is taken as the region of interest, and the lumen of the pore is measured as the image background, nye via threshold objects do calculation percentage of structure-forming parts of the scaffold (P) of the total area of the analyzed image, including pores lumen, the lumen of the pore percentage calculated by the formula: P (%) = 100% - C (%).
Способ оценки пористости скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций осуществляют следующим образом:The method of assessing the porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures is as follows:
1. Образцы скаффолов и/или клеточно-инженерных конструкций фиксируют в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) с последующей фиксацией в 1%-ном растворе OsO4.1. Samples of scaffolding and / or cell engineering structures are fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution on phosphate buffer (pH = 7.4), followed by fixation in a 1% solution of OsO4.
2. Фиксированные образцы подвергают пробоподготовке для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), которая общепринята как стандартная подготовка образцов для ТЭМ (Бисерова Н.М. Методы визуализации биологических ультраструктур. Подготовка биологических объектов для изучения с помощью электронных и флуоресцентных конфокальных лазерных микроскопов. Практическое руководство для биологов. Москва: Товарищество научных изданий КМК. 2013. 104 с., 24 вкл.): образцы дегидратируют в спиртах восходящей концентрации (от 50 до 100%) и ацетоне (100%), далее выдерживают в смеси 50% заливочной среды и 50% ацетона с последующим заключением в смесь Эпон-Аралдит. Помещенные в смесь образцы выдерживают сутки при 37°С, затем полимеризуют при 60°С. 2. Fixed samples are subjected to sample preparation for transmission electron microscopy (TEM), which is generally accepted as the standard preparation of samples for TEM (Biserova NM. Methods of visualization of biological ultrastructures. Preparation of biological objects for study using electronic and fluorescent confocal laser microscopes. A practical guide for biologists. Moscow: Fellowship of scientific publications of KMK. 2013. 104 p., 24 incl.: samples are dehydrated in alcohols of increasing concentration (from 50 to 100%) and acetone (100%), more kept in a mixture of 50% of the priming medium and 50% of acetone, followed by the conclusion of the mixture of Epon-Araldite. Placed in the mixture, the samples are kept for a day at 37 ° C, then polymerized at 60 ° C.
3. С помощью ультрамикротома получают ультратонкие срезы толщиной 75-80 нм.3. Using ultramicrotome, ultrathin sections of 75-80 nm thick are obtained.
4. Полученные срезы визуализируют с использованием трансмиссионного электронного микроскопа с целью получения 2D-изображений внутренне структуры скаффолдов и/или КИК. EM-изображения получают при увеличении 4400× по одному изображению с пяти и более электронно-микроскопических полей (EM-полей) зрения.4. The obtained sections are visualized using a transmission electron microscope in order to obtain 2D images of the internal structure of scaffolds and / or CIC. EM images are obtained at a magnification of 4400 × in one image from five or more electron microscopic fields (EM fields) of view.
5. EM-изображения загружают в программный комплекс анализа и обработки изображений (например, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD)), где проводится процедура формирования двоичного изображения (threshold) с использованием автоматической настройки верхнего и нижнего значения порога с целью сегментирования области интереса и заднего фона изображения. При этом в качестве области интереса выступает структурообразующая часть скаффолда, а за фон изображения принимается просвет пор. Процедура формирования двоичного изображения (threshold) позволяет преобразовать изображения в оттенки серого, и сформировать двоичные изображения, где все пиксели, значения яркости которых попадают в пороговый интервал отображаются как черные, а все остальные – белые. Полученное двоичное изображение анализируют по принципу сканирования всего изображения и выделения объектов по заданному ранее пороговому значению (например, с использованием команды Analyze Particles). После этого выделенные с помощью порогового значения объекты измеряются. Делается расчет процентного отношения площади области интереса к площади всего изображения, что в случае анализа EM-изображений срезов скаффолдов и/или КИК соответствует проценту, приходящемуся на долю структурообразующей части скаффолда (С) от общей площади анализируемого изображения (принимаемого за 100%) включая просвет пор. Процент просвета пор (П) рассчитывается по формуле: П (%)= 100% - С (%).5. EM images are loaded into an image analysis and processing software package (for example, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD)), where the procedure of forming a binary image (threshold) is performed using automatic adjustment of the upper and lower threshold values for the purpose of segmentation areas of interest and background image. In this case, the structure-forming part of the scaffold acts as an area of interest, and the lumen of the pores is taken as the background of the image. The procedure of forming a binary image (threshold) allows you to convert images to shades of gray, and form binary images, where all the pixels whose brightness values fall within the threshold interval are displayed as black, and all the others are white. The resulting binary image is analyzed according to the principle of scanning the entire image and selecting objects according to a predetermined threshold value (for example, using the Analyze Particles command). After that, the objects selected by the threshold value are measured. Calculation is made of the percentage of the area of interest to the area of the entire image, which in the case of analyzing EM images of scaffold slices and / or CIC corresponds to the percentage attributable to the structure-forming part of the scaffold (C) of the total area of the analyzed image (taken as 100%) including clearance since then The percentage of the lumen of the pores (P) is calculated by the formula: P (%) = 100% - C (%).
Полученные данные дают возможность охарактеризовать пористость исследуемого образца по процентному соотношению структурообразующей части скаффолда и просвета пор, а так же получить соотношение в целых числах: для получения соотношения в целых числах С (%) принимают равной 1, П в целых числах рассчитывают по формуле П = П (%) / С (%).The data obtained make it possible to characterize the porosity of the sample under investigation according to the percentage ratio of the structure-forming part of the scaffold and the pore lumen, as well as to obtain the ratio in integers: to obtain the ratio in integers C (%) is equal to 1, P in integers calculated by the formula P = P (%) / C (%).
Пример 1.Example 1
Для исследования пористости взяты два фрагмента фибрин-коллагенового скаффолда, отличающиеся вводимым в их состав при изготовлении коллагеном. Образец №1 – в составе коллаген I типа бычий, образец №2 – в составе коллаген I типа рыбный, выделенный из шкур трески. Образцы скаффолдов №1 и №2 фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и в 1%-ном растворе OsO4. Затем, согласно представленному способу (п.2-4), была сделана пробоподготовка образцов для электронной трансмиссионной микроскопии с получением ультратонких срезов толщиной 75-80нм на ультратоме UC7 (Leica), и проведено исследование на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI). В результате было получено по 7 EM-изображений каждого образца с 7 случайных различных полей зрения при увеличении 4400×. На рисунке 1 приведены примеры ЕМ-изображений исследуемых образцов скаффолдов, где А – образец №1, B - образец №2. Полученные EM-изображения загружены в программный комплекс анализа и обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) с последующим проведением всех процедур описанных в п.5 представленного способа.To study the porosity, two fragments of a fibrin-collagen scaffold, differing in their composition when collagen was made, were taken. Sample No. 1 - composed of collagen type I bull, sample No. 2 - composed of collagen type I fish, isolated from cod skins. Samples of No. 1 and No. 2 scaffolds were fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution in phosphate buffer (pH = 7.4) and in a 1% OsO4 solution. Then, according to the presented method (p.2-4), sample preparation was made for electronic transmission microscopy to obtain ultrathin sections of 75-80 nm thick using an UC7 ultratome (Leica), and a study was conducted on a transmission electron microscope Morgagni 268D (FEI). As a result, 7 EM images of each sample were obtained with 7 random different fields of view at 4400 × magnification. Figure 1 shows examples of EM images of the scaffold samples studied, where A is sample No. 1, B is sample No. 2. The resulting EM images are loaded into the ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) image analysis and processing software package, followed by all the procedures described in paragraph 5 of the presented method.
Согласно полученным результатам образец скаффолда №1, имеет более плотную структуру, чем образец №2. Так процент структурообразующей части образца №1 статистически значимо в 1,5 раза превышал таковой в образце №2 (Табл.1). При анализе процентного соотношения структурообразующей части скаффолда и просвета пор было установлено, что в образце №1 это соотношение составляло 24,86:75,14 а в образце №2 – 16,29:83,71 соответственно. Соотношение структурообразующей части скаффолда и просвета пор в целых числах в образце №1 составляло 1:3, а в образце №2 – 1:5, соответственно.According to the results obtained, the sample of scaffold No. 1 has a more dense structure than sample No. 2. So, the percentage of the structure-forming part of sample No. 1 is statistically significantly 1.5 times higher than that in sample No. 2 (Table 1). When analyzing the percentage of the structure-forming part of the scaffold and the lumen of the pores, it was found that in sample No. 1 this ratio was 24.86: 75.14 and in sample No. 2 - 16.29: 83.71, respectively. The ratio of the structure-forming part of the scaffold and the pore gap in integers in sample No. 1 was 1: 3, and in sample No. 2 - 1: 5, respectively.
Табл.1Table 1
изображенияNo. EM-
Images
(просвет пор, %)P
(lumen,%)
(просвет пор, %)P
(lumen,%)
Примечание: где в строке «Соотношение в целых числах» С (%) принято равным 1, а П в целых числах рассчитано по формуле П = П (%) / С (%).Note: where in the line "Ratio in integers" C (%) is assumed to be 1, and P in integers is calculated by the formula P = P (%) / C (%).
Пример №2. Example number 2.
Для исследования была сформирована клеточно-инженерная конструкция (КИК) на основе естественных биополимеров (фибрина и коллагена) с мезенхимальными стволовыми клетками человека (МСК). Клеточно-инженерная конструкция культивировалась в стандартных условиях (в культуральной среде αMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в клеточном инкубаторе с содержанием CO2 5% и температурой 370С) в течение девяти суток. Известно, что в оптимальных условиях, которые должна обеспечивать бесклеточная часть КИК, МСК должны преобразовывать структуру клеточно-инженерной конструкции, созданную на основе естественных биополимеров. Одним из критериев оценки изменения структуры в процессе культивирования КИК является изменение характеристик пористости. Для характеристики пористости исследуемой клеточно-инженерной конструкции в процессе ее культивирования на 2 и 9 сутки после ее формирования были взяты два фрагмента. Фрагмент КИК №1 (2 сутки культивирования) и фрагмент №2 (9 сутки культивирования) фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и в 1%-ном растворе OsO4. Затем, согласно представленному способу (п.2-4), была сделана пробоподготовка образцов для электронной трансмиссионной микроскопии с получением ультратонких срезов толщиной 75-80нм на ультратоме UC7 (Leica), и проведено исследование на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI). В результате было получено по 7 EM-изображений каждого образца с 7 случайных различных полей зрения при увеличении 4400× (Рис.1). Полученные EM-изображения загружены в программный комплекс анализа и обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) с последующим проведением всех процедур описанных в п.5 представленного способа.For the study, a cell-engineering construct (CIC) was formed based on natural biopolymers (fibrin and collagen) with human mesenchymal stem cells (MSCs). The cell engineering design was cultured under standard conditions (in an αMEM culture medium containing 10% fetal calf serum in a cell incubator with a CO 2 content of 5% and a temperature of 37 ° C) for nine days. It is known that in the optimal conditions that the cell-free part of the CIC should provide, MSCs should transform the structure of the cell-engineering structure created on the basis of natural biopolymers. One of the criteria for assessing the change in structure in the process of CIC cultivation is a change in the characteristics of porosity. To characterize the porosity of the studied cell-engineering structure in the process of its cultivation, on 2 and 9 days after its formation, two fragments were taken. A CIC No. 1 fragment (2 days of cultivation) and No. 2 fragment (9 days of cultivation) were fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution in phosphate buffer (pH = 7.4) and in a 1% OsO4 solution. Then, according to the presented method (p.2-4), sample preparation was made for electronic transmission microscopy to obtain ultrathin sections of 75-80 nm thick using an UC7 ultratome (Leica), and a study was conducted on a transmission electron microscope Morgagni 268D (FEI). As a result, 7 EM images of each sample were obtained with 7 random different fields of view at 4400 × magnification (Fig. 1). The resulting EM images are loaded into the ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) image analysis and processing software package, followed by all the procedures described in paragraph 5 of the presented method.
Показано, что характеристики пористости клеточно-инженерной конструкции на 2 сутки ее культивирования значительно отличалась от таковых на 9 сутки (Табл.2).It was shown that the characteristics of the porosity of the cell-engineering structure on the 2nd day of its cultivation differed significantly from those on the 9th day (Table 2).
Табл.2Table 2
изображенияNo. EM-
Images
Примечание: где в строке «Соотношение в целых числах» С (%) принято равным 1, а П в целых числах рассчитано по формуле П = П (%) / С (%).Note: where in the line "Ratio in integers" C (%) is assumed to be 1, and P in integers is calculated by the formula P = P (%) / C (%).
Так, процент структурообразующей части КИК фрагмента №2 в 1,6 раза превышал этот же показатель фрагмента №1. При анализе процентного соотношения структурообразующей части КИК и просвета пор было установлено, что во фрагменте №1, взятом на 2 сутки культивирования, это соотношение составляло 29,20:70,80 (соотношение в целых числах 1:2), а во фрагменте №2, взятом на 9 сутки – 47,21:52,79 (соотношение в целых числах 1:1) соответственно. Использование способа позволило охарактеризовать структуру КИК и выявить изменения в характеристиках структуры КИК при ее культивировании.Thus, the percentage of the structure-forming part of the CIC of fragment No. 2 was 1.6 times higher than the same indicator of fragment No. 1. When analyzing the percentage of the structure-forming part of the CIC and the pore lumen, it was found that in fragment No. 1, taken on the 2nd day of cultivation, this ratio was 29.20: 70.80 (ratio in whole numbers 1: 2), and in fragment No. 2 , taken on the 9th day - 47,21: 52,79 (ratio in integers 1: 1), respectively. The use of the method allowed us to characterize the structure of the CIC and to identify changes in the characteristics of the structure of the CIC during its cultivation.
Таким образом, предложенный способ позволяет получить объективные характеристики пористости скаффолдов и клеточно-инженерных конструкций с применением общепринятых методов, используемых в электронной микроскопии, без применения сложного и дорогостоящего криооборудования. Способ не требует дополнительного специализированного программного обеспечения, а может быть реализован с использованием программного комплекса анализа и обработки изображений с открытым исходным кодом, распространяемого без лицензионных ограничений, например, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), что значительно удешевляет реализацию и повышает доступность представленного способа. Использование стандартных автоматизированных настроек при обработке изображений, в частности при применении процедуры формирования двоичного изображения (threshold), позволяет стандартизовать обработку изображений и, таким образом, снизить субъективизм при оценке результатов, имеющийся в прототипе. Использование для характеристики пористости ультратонких срезов скаффолдов / КИК позволяет упростить процедуру визуализации внутренней структуры образцов и сократить временные и трудозатраты (при получении изображений для анализа и непосредственно при проведении процедуры анализа изображений) по сравнению с прототипом, где используются срезы микронного размера.Thus, the proposed method allows to obtain objective characteristics of the porosity of scaffolds and cell-engineering structures using conventional methods used in electron microscopy, without the use of complex and expensive cryo-equipment. The method does not require additional specialized software, but can be implemented using an open source image analysis and processing software package that is distributed without licensing restrictions, for example, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), which significantly reduces the cost of implementation and increases availability of the presented method. The use of standard automated settings for image processing, in particular when applying the procedure of formation of a binary image (threshold), allows you to standardize image processing and, thus, reduce the subjectivity in the evaluation of the results that is available in the prototype. The use of ultra-thin scaffold / CIC sections to characterize the porosity allows us to simplify the procedure for visualizing the internal structure of samples and reduce time and labor costs (when obtaining images for analysis and directly during the image analysis procedure) compared to the prototype using micron-sized sections.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019112633A RU2695061C1 (en) | 2019-04-25 | 2019-04-25 | Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019112633A RU2695061C1 (en) | 2019-04-25 | 2019-04-25 | Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2695061C1 true RU2695061C1 (en) | 2019-07-19 |
Family
ID=67309530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019112633A RU2695061C1 (en) | 2019-04-25 | 2019-04-25 | Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2695061C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170136154A1 (en) * | 2010-07-09 | 2017-05-18 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Biodegradable scaffolds |
| CN108114324A (en) * | 2018-01-30 | 2018-06-05 | 扬州大学 | A kind of vitro cytotoxicity test method for the method and the stent that skin tissue engineering scaffold is prepared based on 3D biometric print technologies |
-
2019
- 2019-04-25 RU RU2019112633A patent/RU2695061C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170136154A1 (en) * | 2010-07-09 | 2017-05-18 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Biodegradable scaffolds |
| CN108114324A (en) * | 2018-01-30 | 2018-06-05 | 扬州大学 | A kind of vitro cytotoxicity test method for the method and the stent that skin tissue engineering scaffold is prepared based on 3D biometric print technologies |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| doi:10.1016/j.msec.2016.12.016. * |
| LIN S. C.-Y. et al. Production and in vitro evaluation of macroporous, cell-encapsulating alginate fibres for nerve repair, 2017, Materials Science and Engineering: C (73), P. 653-664. * |
| ЛАРИОНОВ П.М. и др. Оценка тканеинженерных конструкций (скаффолдов) с использованием методов конфокальной микроскопии, Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2017, N 11-1, С. 81-85. * |
| ЛАРИОНОВ П.М. и др. Оценка тканеинженерных конструкций (скаффолдов) с использованием методов конфокальной микроскопии, Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2017, N 11-1, С. 81-85. Найдено из Интернета [он-лайн] на сайте: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11936. LIN S. C.-Y. et al. Production and in vitro evaluation of macroporous, cell-encapsulating alginate fibres for nerve repair, 2017, Materials Science and Engineering: C (73), P. 653-664. doi:10.1016/j.msec.2016.12.016. * |
| Найдено из Интернета [он-лайн] на сайте: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11936. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wilke et al. | Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse | |
| Aguilera et al. | New dimensions in microstructure of food products | |
| Schneider et al. | Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network | |
| Burel et al. | A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography | |
| Braet et al. | Contribution of high‐resolution correlative imaging techniques in the study of the liver sieve in three‐dimensions | |
| Ciani et al. | An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy | |
| US11221280B2 (en) | Method of preparing biological tissue sample and method of observing biological tissue section sample | |
| Dallas et al. | Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network | |
| Kamioka et al. | A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-μm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography | |
| Kochan et al. | Label-free spectroscopic characterization of live liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) isolated from the murine liver | |
| Jadin et al. | Three-dimensional (3-D) imaging of chondrocytes in articular cartilage: growth-associated changes in cell organization | |
| RU2695061C1 (en) | Method for porosity of scaffolds and / or cell-engineering structures | |
| McDonald et al. | Correlation of scanning electron microscope and light microscope images of individual cells in human blood and blood clots | |
| Mori et al. | Laser scanning–based tissue autofluorescence/fluorescence imaging (LS-TAFI), a new technique for analysis of microanatomy in whole-mount tissues | |
| Weninger et al. | Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques | |
| Nierenberger et al. | Evolution of the three-dimensional collagen structure in vascular walls during deformation: an in situ mechanical testing under multiphoton microscopy observation | |
| Mikhutkin et al. | Towards tissue engineering: 3D study of polyamide-6 scaffolds | |
| Booth et al. | Studying kinetochore-fiber ultrastructure using correlative light-electron microscopy | |
| RU2675376C1 (en) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold | |
| Yang et al. | New bone formation and microstructure assessed by combination of confocal laser scanning microscopy and differential interference contrast microscopy | |
| Debeir et al. | Models of cancer cell migration and cellular imaging and analysis | |
| Cain et al. | Quantification of transendothelial migration using three-dimensional confocal microscopy | |
| JP2019004794A (en) | Proliferation prediction method, proliferation prediction apparatus and program | |
| Poobalasingam et al. | Imaging the lung: the old ways and the new | |
| Almarshad et al. | Focused ion beam-based milling, imaging and analysis of 3D tumor spheroids |