RU2694543C1 - Method for producing dermal matrix - Google Patents
Method for producing dermal matrix Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694543C1 RU2694543C1 RU2018139784A RU2018139784A RU2694543C1 RU 2694543 C1 RU2694543 C1 RU 2694543C1 RU 2018139784 A RU2018139784 A RU 2018139784A RU 2018139784 A RU2018139784 A RU 2018139784A RU 2694543 C1 RU2694543 C1 RU 2694543C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- samples
- flaps
- hours
- matrix
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинским биотехнологиям и может быть использовано для получения имплантационного материала на биологической основе, обладающего регенеративным потенциалом для применения в общей и пластической хирургии, комбустиологии, онкологии, урологии, гинекологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, а также в качестве бионосителя при создании ткане-инженерных конструкций и прототипов органов.The invention relates to medicine, namely, to medical biotechnology and can be used to obtain implantation material on a biological basis, with regenerative potential for use in general and plastic surgery, combustiology, oncology, urology, gynecology, dentistry and maxillofacial surgery, and also as a bio-carrier when creating tissue-engineering structures and prototype organs.
Дерма как основная составляющая кожи человека и животных, является уникальным исходным материалом, для получения ацеллюлярных дермальных матриксов. Сам процесс получения сопряжен с необходимостью удаления из кожи всех клеток и их фрагментов, способных индуцировать иммунный ответ в организме донора. Достижение необходимых свойств для материалов на биологической основе возможно не только за счет тщательного соблюдения технологии, но и за счет контроля целевых параметров достигаемых свойств на каждом из ее этапов.The dermis as the main component of human and animal skin is a unique starting material for the preparation of acellular dermal matrices. The process of obtaining itself is associated with the need to remove from the skin of all cells and their fragments capable of inducing an immune response in the body of the donor. Achieving the necessary properties for materials on a biological basis is possible not only through careful adherence to technology, but also by monitoring the target parameters of the properties achieved at each of its stages.
Известен способ получения бесклеточного дермального матрикса из кожи человека [1], заключающийся в обработке дермы 30% раствором карбамида с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,5% в соотношении дерма/карбамид 1:3 в течение 24 часов при +4°С. Далее концентрацию карбамида понижают до 20%, при этом, время экспозиции материала при комнатной температуре и периодическом встряхивании составляет 1 час.A method of obtaining cell-free dermal matrix from human skin [1], which consists in treating the dermis with a 30% solution of urea with the addition of calcium chloride to a concentration of 0.5% in the ratio of derma / urea 1: 3 for 24 hours at + 4 ° C. Next, the concentration of urea is reduced to 20%, while the exposure time of the material at room temperature and periodic shaking is 1 hour.
Известен способ, включающий обработку кожи животного, предварительно очищенной от волосяных луковиц и подкожно-жировой клетчатки, водно-щелочным раствором на основе гидроксида натрия, калия дигидрофосфата и водного или безводного тетраборнокислого натрия, при температуре от 1 до 10°С; водным раствором сульфата натрия и гидроксида натрия; водным раствором борной кислоты. При этом, каждый из этапов отличается по длительности, температурному режиму рабочих растворов, необходимостью периодического взбалтывания или перемешивания. Для оценки конечного результата авторы приводят данные электронно-микроскопического исследования, подтверждающие сохранность пространственной ориентации коллагеновых волокон матрикса [2].The known method includes treating the skin of an animal, pre-cleaned from hair follicles and subcutaneous fat, aqueous-alkaline solution based on sodium hydroxide, potassium dihydrogen phosphate and aqueous or anhydrous tetraborate sodium, at a temperature of from 1 to 10 ° C; an aqueous solution of sodium sulfate and sodium hydroxide; an aqueous solution of boric acid. At the same time, each of the stages differs in duration, temperature regime of working solutions, the need for occasional agitation or mixing. To assess the final result, the authors cite the data of electron microscopic studies confirming the preservation of the spatial orientation of the collagen fibers of the matrix [2].
Недостатками перечисленных способов являются применение агрессивных химических соединений, щелочей и кислот; полное отсутствие или недостаточное воздействие физического фактора в виде интенсивного встряхивания, что способствует механическому удалению фрагментов клеток; не приводятся методы оценки тех или иных свойств матрикса по завершении каждого из этапов децеллюляризации, что также позволяет оценить их достаточность; не предусмотрены способы дополнительной обработки в случае не достижения требуемых свойств.The disadvantages of these methods are the use of aggressive chemical compounds, alkalis and acids; total absence or insufficient effect of the physical factor in the form of intensive shaking, which contributes to the mechanical removal of cell fragments; methods for assessing certain properties of the matrix at the completion of each of the stages of decellularization are not provided, which also allows to evaluate their sufficiency; no additional processing methods are provided in case the required properties are not achieved.
Известен способ получения дермального матрикса из кожи человека и животных толщиной до 0,38 мм. На первом этапе проводят децеллюляризацию кожного лоскута путем замораживания-оттаивания. Затем кожу погружают в гипертонический раствор натрия хлорида (1М) и перемешивают. Этим достигается деэпителизация кожного лоскута. Второй этап представляет собой децеллюляризацию собственно дермы при помощи детергентов, которыми могут быть растворы додецилсульфата натрия (0,5%), диспаза, Triton Х-100. Стерилизацию осуществляют 0,1-10% раствором азида натрия. Готовый ацеллюлярный матрикс при помощи сканирующего микроскопа изучают с целью оценки структурной организации коллагеновых фибрилл, а также проводят биохимический тест на деградацию коллагеназой [3].A method of obtaining a dermal matrix of human skin and animals with a thickness of up to 0.38 mm. At the first stage, decellularization of the skin graft is carried out by freezing-thawing. Then the skin is immersed in a hypertonic solution of sodium chloride (1M) and mixed. This is achieved deepithelization skin flap. The second stage is the decellularization of the dermis itself using detergents, which can be solutions of sodium dodecyl sulfate (0.5%), dispase, Triton X-100. Sterilization is carried out with 0.1-10% sodium azide solution. The finished acellular matrix using a scanning microscope is studied in order to assess the structural organization of collagen fibrils, as well as conduct a biochemical test for degradation of collagenase [3].
Недостатками способа являются: использование в качестве детергентов додецилсульфата натрия или Triton Х-100, обладающих специфической избирательной токсичностью, которая заключается в возможности поражения отдельных органов мишеней при однократном воздействии, акватоксичности по данным тестирования на острую и хроническую токсичность и стойкой способности к биоаккумуляции. Также, материалы, полученные, в частности, с использованием натрия додецилсульфата в тестах in vitro, продемонстрировали свои цитотоксичные свойства. Имеются данные о выраженной пенообразующей способности Triton Х-100, что требует тщательной, многократной и длительной по времени отмывки. Способ предполагает оценку готового материала только на предмет целостности коллагеновых волокон. В способе не оцениваются показатели, значимо влияющих на его биосовместимость, такие как остаточное содержание липидов, ДНК и клеточных белков.The disadvantages of the method are: use of sodium dodecyl sulfate or Triton X-100 as detergents with specific selective toxicity, which consists in the possibility of damage to individual target organs after a single exposure, aquatic toxicity according to testing for acute and chronic toxicity and persistent ability to bioaccumulate. Also, the materials obtained, in particular, using sodium dodecyl sulfate in in vitro tests, have demonstrated their cytotoxic properties. There is evidence of a pronounced foaming ability of Triton X-100, which requires a thorough, repeated and time-consuming washing time. The method involves the assessment of the finished material only for the integrity of the collagen fibers. The method does not evaluate indicators that significantly affect its biocompatibility, such as residual lipids, DNA and cellular proteins.
Известен способ изготовления дермального матрикса из донорской кожи человека, состоящий из этапа разделения эпидермиса и дермы путем помещения предварительно троекратно замороженного и оттаившего лоскута в 1,8М раствор натрия хлорида. После чего его встряхивают на орбитальном перемешивателе на скорости 250 об./мин до полного отделения эпителия. На втором этапе децеллюляризацию продолжают с использованием 0,2% раствора додецилсульфата натрия также на орбитальном перемешивателе и с той же скоростью в течение 1 часа. Завершают децеллюляризацию матрикса многократными промывками физиологическим раствором. Контроль качества проводят только на заключительном этапе по техническим, бактериологическим и морфологическим параметрам. Готовый матрикс упаковывают и криоконсервируют [4].A known method of manufacturing a dermal matrix of human donor skin, consisting of the stage of separation of the epidermis and dermis by placing the previously frozen and thawed flap three times in 1.8 M sodium chloride solution. After that, it is shaken on an orbital stirrer at a speed of 250 rpm until complete separation of the epithelium. In the second stage, decellularization is continued using a 0.2% solution of sodium dodecyl sulfate, also on an orbital stirrer and at the same rate for 1 hour. Complete decellularization of the matrix with multiple washes with saline. Quality control is carried out only at the final stage of technical, bacteriological and morphological parameters. The finished matrix is packaged and cryopreserved [4].
Недостатками данного способа является источник исходного сырья -кожа человека, что требует проведения тщательных исследований с целью исключения потенциальных инфекций у доноров. Такой источник сырья ограничивает возможность получения больших по площади лоскутов. Известна специфическая избирательная токсичность додецилсульфата натрия с возможностью поражения отдельных органов мишеней при однократном воздействии и его акватоксичность в исследованиях острой и хронической токсичности, а также цитотоксичность материалов, полученных с его применением в тестах in vitro [5]. Готовый матрикс подвергают анализу только на технические, морфологические и бактериологические показатели. Данный способ взят нами за прототип.The disadvantages of this method is the source of the source of raw materials - human skin, which requires careful research to eliminate potential infections from donors. Such a source of raw materials limits the possibility of obtaining large area patches. Known specific selective toxicity of sodium dodecyl sulfate with the possibility of damage to individual organs of targets during a single exposure and its aquatic toxicity in studies of acute and chronic toxicity, as well as cytotoxicity of materials obtained with its use in in vitro tests [5]. The finished matrix is analyzed only for technical, morphological and bacteriological indicators. This method is taken as a prototype.
Целью изобретения является получение безопасного ацеллюлярного дермального матрикса с заданными параметрами, контролируемыми на этапах его получения.The aim of the invention is to obtain a safe acellular dermal matrix with specified parameters, controlled at the stages of its receipt.
Эта цель достигается тем, что исходным сырьем является кожа свиней, из которой выкраивают необходимые по размеру лоскуты, отмывают их, подвергают трехкратному циклу замораживания и оттаивания, после чего на первом этапе с целью деэпителизации лоскуты погружают в емкость с гипертоническим раствором, содержащим 605 мг основания Трис, 4,0 г натрия хлорида и 202,5 мг ЭДТА на каждые 100 мл фосфатно-солевого раствора; устанавливают емкость на платформу шейкера в режиме 250 уд./мин.; через 4 часа матрикс из гипертонического раствора переносят в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена, индуцируя осмотический шок; повторяют первый этап еще раз; эффективность деэпителизации оценивают визуально по отсутствию эпителиальных фрагментов на поверхности дермы; на втором этапе для децеллюляризации применяют раздельную трехкомпонентную децеллюляризующую систему: сначала лоскуты погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия, приготовленным на деионизированной воде, емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин; длительность обработки дезоксихолатом натрия составляет 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов; промывание лоскутов осуществляют деионизированной водой; затем их погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия и добавляют 0,07 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М трис-HCl буфера с рН 7,6-7,8; емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд/мин на 9 часов; смену децеллюляризующего раствора проводят трижды через каждые 3 часа; после этого лоскуты 4-5 раз ополаскивают в деионизированной воде и фосфатно-солевом растворе (рН 7,4); в контрольных образцах лоскутов определяют содержание липидов, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения результатов исследования; если в контрольных образцах выявляют любое отличное от нуля содержание липидов, то при комнатной температуре основные образцы размораживают и домывают, используя 1% раствор дезоксихолата натрия и 0,03 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М Трис-HCl буфера рН 7,6-7,8; целевым показателем содержания липидов считают их полное отсутствие; после этого лоскуты погружают в раствор ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленный с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция (II) хлорида и инкубируют их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора; лоскуты ополаскивают путем погружения в емкость с трис-HCl буфером рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция хлорида; заменяют промывочный раствор на деионизированную воду и устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин. при комнатной температуре на 12 часов; в контрольных образцах лоскутов определяют содержание ДНК флуоресцентным методом, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения этих результатов исследования; если в контрольных образцах количество ДНК превышает 200 нг/мг, то основные образцы при комнатной температуре размораживают и повторно инкубируют в идентичном растворе ДНК-азы до достижения содержания ДНК в образцах не превышающего 200 нг/мг; далее их дважды в течение 12 часов промывают деионизированной водой и трехкратно в течение 12 часов фосфатно-солевым раствором рН 7,2-7,4 на шейкере в режиме 250 уд./мин при комнатной температуре; контрольные образцы подвергают морфологическому исследованию путем изготовления гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным; препараты исследуют, применяя поляризационную микроскопию, и оценивают матрикс на предмет целостности коллагеновых волокон и сохранения их пространственной ориентации; качественный состав дермального матрикса исследуют с применением времяпролетной масспектрометрии с ионизацией электроспреем; достигаемым целевым параметром является удаление основного пула клеточных белков (тубулин, аннексии, виментин, кавеолин и т.д.) и идентификация в составе матрикса преимущественно матрисомных белков (декорин, дерматопонтин); при достижении целевых параметров дермальный матрикс подлежит химической стерилизации, упаковке и криоконсервации.This goal is achieved by the fact that the raw material is the skin of pigs, from which the necessary flaps are cut, washed, subjected to a threefold cycle of freezing and thawing, after which, in the first stage, in order to de-epithelize, the flaps are immersed in a container with hypertonic solution containing 605 mg of base Tris, 4.0 g of sodium chloride and 202.5 mg of EDTA for every 100 ml of phosphate-saline solution; set the capacity on the shaker platform in the mode of 250 bpm; after 4 hours, the matrix from the hypertonic solution is transferred to a diluted 1: 9 phosphate buffer of Sørensen, inducing osmotic shock; repeat the first stage again; deepithelization efficiency is assessed visually by the absence of epithelial fragments on the surface of the dermis; at the second stage, a separate three-component decellularizing system is used for decellularization: first, the flaps are immersed in a container with a 2% sodium deoxycholate solution prepared in deionized water, the capacity is set on a shaker at 250 bpm; the processing time of sodium deoxycholate is 48 hours with a change of solution every 12 hours; washing the flaps carried out with deionized water; then they are immersed in a container with 2% sodium deoxycholate solution and 0.07 g of pancreatic lipase is added for every 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer with pH 7.6-7.8; the capacity is set on a shaker in the mode of 250 beats / min for 9 hours; change decellularizing solution spend three times every 3 hours; after that, the flaps 4-5 times rinsed in deionized water and phosphate-saline solution (pH 7.4); in the control samples of flaps, the lipid content is determined, and the main samples are immersed in a diluted 1: 9 Serensen phosphate buffer and stored at -18 ° C until the results of the study are obtained; if any non-zero lipid content is detected in the control samples, then at room temperature, the main samples are thawed and frozen using a 1% solution of sodium deoxycholate and 0.03 g of pancreatic lipase for every 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer pH 7.6 -7.8; the target indicator of lipid content is their complete absence; after that, the flaps are immersed in a 0.1 mg / ml DNase solution prepared using Tris-HCl buffer pH 6.8 with the addition of 10 mM magnesium (II) sulfate and 1.9 mM calcium (II) chloride and incubated in containers without stirring at 37 ° C for 9 hours with a three-time change of solution; the rags are rinsed by immersion in a container with Tris-HCl buffer pH 6.8 with the addition of 10 mM magnesium (II) sulfate and 1.9 mM calcium chloride; replace the wash solution with deionized water and set it on a shaker in the mode of 250 bpm. at room temperature for 12 hours; in the control flap samples, the DNA content is determined by the fluorescent method, and the main samples are immersed in a diluted 1: 9 Sorensen phosphate buffer and stored at -18 ° C until these study results are obtained; if in the control samples the amount of DNA exceeds 200 ng / mg, then the main samples are thawed at room temperature and re-incubated in an identical solution of DNA-ase until the DNA content in the samples not exceeding 200 ng / mg is reached; then they are twice washed for 12 hours with deionized water and three times for 12 hours with a phosphate-saline solution of pH 7.2-7.4 on a shaker at 250 bpm / min at room temperature; control samples are subjected to morphological research by making histological specimens stained with picrosirius red; the preparations are examined using polarizing microscopy and the matrix is evaluated for the integrity of the collagen fibers and the preservation of their spatial orientation; the qualitative composition of the dermal matrix is investigated using time-of-flight mass spectrometry with ionization by electrospray; Achieved target parameter is the removal of the main pool of cellular proteins (tubulin, annexation, vimentin, caveolin, etc.) and the identification in the composition of the matrix of mainly matriotic proteins (decorin, dermatotopontin); upon reaching the target parameters, the dermal matrix is subject to chemical sterilization, packaging, and cryopreservation.
Техническим результатом предлагаемого способа является возможность использования в качестве исходного сырья шкуры животных, что снимает ограничения на площадь иссекаемых лоскутов; отсутствие потенциальных рисков трансмиссии опасных инфекций, которыми являются ВИЧ, гепатит, сифилис, а также губчатой энцефалопатии, в случае использования в качестве исходного сырья шкур крупного рогатого скота.The technical result of the proposed method is the ability to use as a raw material animal skins, which removes the restrictions on the area of excised flaps; lack of potential risks of transmission of dangerous infections, such as HIV, hepatitis, syphilis, and also spongy encephalopathy, in case of using cattle hides as a raw material.
Способ обладает повторяемостью и приводит к ожидаемым результатам при производстве полупродукта или готового продукта требуемого качества, то есть является валидированным. Предполагает использование реагентов исключительно биологического происхождения, основные действующие вещества которых естественным образом образуются в организме в процессе пищеварения - липаза, ДНК-аза, дезоксихолат натрия (компонент желчи). Четкая идентификация качественного состава готового продукта с абсолютной точностью подтверждает отсутствие основного пула клеточных белков - инициаторов иммунных реакций и идентифицировать в составе матрикса преимущественно матрисомные белки, что характеризует его биосовместимость и регенеративный потенциал.The method has repeatability and leads to the expected results in the production of intermediate or finished product of the required quality, that is, it is validated. It involves the use of reagents exclusively of biological origin, the main active substances of which are naturally formed in the body during digestion - lipase, DNA-ase, sodium deoxycholate (a component of bile). A clear identification of the qualitative composition of the finished product with absolute accuracy confirms the absence of the main pool of cellular proteins - the initiators of immune reactions and identify mainly matrix proteins in the matrix that characterizes its biocompatibility and regenerative potential.
Исследование полученного ацеллюлярного дермального матрикса проведено в соответствие с ГОСТ Р ИСО 10993.5-2011 методом прямого контакта, т.е образцы были помещены непосредственно на монослой фибробластов - цА17 6 пассажа по достижении ими конфлуентности (на 6 сутки). Посевная доза клеток составила 1×104 кл/см2. Процент жизнеспособных клеток после снятия их с поверхности культурального пластика составил 98%. Результаты исследования показали, что на протяжении всего эксперимента клетки в основном сохраняли присущие дермальным фибробластам человека форму, размеры, характер роста, расположение и размеры ядер, структуру цитоплазмы. Показатели пролиферативной активности клеток в присутствии образцов ацеллюлярного дермального матрикса и в контрольных культурах представлены в таблице 1 Приложения 1 Результаты исследования показали, что полученный матрикс не обладает цитотоксичными свойствами.The study of the obtained acellular dermal matrix was carried out in accordance with GOST R ISO 10993.5-2011 by direct contact, that is, the samples were placed directly on a monolayer fibroblast - cA17 6 passage upon reaching confluence (on day 6). Sowing dose of cells was 1 × 10 4 cells / cm 2 . The percentage of viable cells after removing them from the surface of the culture plastic was 98%. The results of the study showed that throughout the experiment, the cells basically retained the shape, size, growth pattern, location and size of the nuclei, and the structure of the cytoplasm inherent in human dermal fibroblasts. Indicators of cell proliferative activity in the presence of samples of the acellular dermal matrix and in control cultures are presented in Table 1 of Appendix 1. The results of the study showed that the obtained matrix does not possess cytotoxic properties.
Способ получения дермального матрикса реализуется следующим образом. Исходным сырьем является кожа свиней, из которой выкраивают необходимые по размеру лоскуты, отмывают их, подвергают трехкратному циклу замораживания и оттаивания. После чего на первом этапе с целью деэпителизации лоскуты погружают в емкость с гипертоническим раствором, содержащим 605 мг основания Трис, 4,0 г натрия хлорида и 202,5 мг ЭДТА на каждые 100 мл фосфатно-солевого раствора; устанавливают емкость на платформу шейкера в режиме 250 уд. /мин.; через 4 часа матрикс из гипертонического раствора переносят в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена, индуцируя осмотический шок; повторяют первый этап еще раз. Эффективность деэпителизации оценивают визуально по отсутствию эпителиальных фрагментов на поверхности дермы.The method of obtaining the dermal matrix is as follows. The raw material is the skin of pigs, from which they cut out the flaps of the necessary size, wash them, subject them to a threefold cycle of freezing and thawing. Then, in the first stage, with the purpose of de-epithelization, the flaps are immersed in a container with hypertonic solution containing 605 mg of Tris base, 4.0 g of sodium chloride and 202.5 mg of EDTA for every 100 ml of phosphate-saline solution; set the capacity on the shaker platform in the mode of 250 beats. / min; after 4 hours, the matrix from the hypertonic solution is transferred to a diluted 1: 9 phosphate buffer of Sørensen, inducing osmotic shock; repeat the first stage again. The effectiveness of decapitalization is assessed visually by the absence of epithelial fragments on the surface of the dermis.
На втором этапе для децеллюляризации применяют раздельную трехкомпонентную децеллюляризующую систему: сначала лоскуты погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия, приготовленным на деионизированной воде, емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин; длительность обработки дезоксихолатом натрия составляет 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов; промывание лоскутов осуществляют деионизированной водой; затем их погружают в емкость с раствором, содержащим 2% раствор дезоксихолата натрия и 0,07 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М трис-HCl буфера с рН 7,6-7,8; емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд/мин на 9 часов; смену децеллюляризующего раствора проводят трижды через каждые 3 часа; после этого лоскуты 4-5 раз ополаскивают в деионизированной воде и фосфатно-солевом растворе (рН 7,4). В контрольных образцах лоскутов определяют содержание липидов, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения результатов исследования. Если в контрольных образцах выявляют любое отличное от нуля содержание липидов, то при комнатной температуре основные образцы размораживают и домывают, используя раствор, содержащий 1% раствор дезоксихолата натрия и 0,03 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М Трис-HCl буфера рН 7,6-7,8. Целевым показателем содержания липидов считают их отсутствие.At the second stage, a separate three-component decellularizing system is used for decellularization: first, the flaps are immersed in a container with a 2% sodium deoxycholate solution prepared in deionized water, the capacity is set on a shaker at 250 bpm; the processing time of sodium deoxycholate is 48 hours with a change of solution every 12 hours; washing the flaps carried out with deionized water; then they are immersed in a container with a solution containing 2% sodium deoxycholate solution and 0.07 g of pancreatic lipase for every 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer with pH 7.6-7.8; the capacity is set on a shaker in the mode of 250 beats / min for 9 hours; change decellularizing solution spend three times every 3 hours; after that, the flaps 4-5 times rinsed in deionized water and phosphate-saline solution (pH 7.4). The control samples of flaps determine the content of lipids, and the main samples are immersed in a diluted 1: 9 phosphate buffer of Sørensen and stored at -18 ° C until the results of the study are obtained. If any non-zero lipid content is detected in the control samples, then at room temperature the main samples are thawed and frozen using a solution containing 1% sodium deoxycholate solution and 0.03 g pancreatic lipase for every 100 ml of 0.1 M Tris-HCl pH buffer 7.6-7.8. The target indicator of lipid content is their absence.
После этого лоскуты погружают в раствор ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленный с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и кальция (II) хлорида 1,9 мМ и инкубируют их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора; лоскуты ополаскивают путем погружения в емкость с трис-HCl буфером рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция хлорида; заменяют промывочный раствор на деионизированную воду и устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин. при комнатной температуре на 12 часов. В контрольных образцах лоскутов определяют содержание ДНК флуоресцентным методом, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения этих результатов исследования. Если в контрольных образцах количество ДНК превышает 200 нг/мг, то основные образцы при комнатной температуре размораживают и повторно инкубируют в идентичном растворе ДНК-азы до достижения содержания ДНК в образцах не превышающего 200 нг/мг.After that, the flaps are immersed in a 0.1 mg / ml DNase solution prepared using Tris-HCl buffer pH 6.8 with the addition of 10 mM magnesium (II) sulfate and calcium (II) chloride 1.9 mm and incubated in containers without stirring at 37 ° C for 9 hours with a three-time change of solution; the rags are rinsed by immersion in a container with Tris-HCl buffer pH 6.8 with the addition of 10 mM magnesium (II) sulfate and 1.9 mM calcium chloride; replace the wash solution with deionized water and set it on a shaker in the mode of 250 bpm. at room temperature for 12 hours. In the control flap samples, the DNA content was determined by the fluorescence method, and the main samples were immersed in a diluted 1: 9 Sorensen phosphate buffer and stored at -18 ° C until these study results were obtained. If in the control samples the amount of DNA exceeds 200 ng / mg, then the main samples are thawed at room temperature and re-incubated in an identical solution of DNA-ase until the DNA content in the samples not exceeding 200 ng / mg is reached.
Далее образцы промывают дважды деионизированной водой и трижды фосфатно-солевым раствором рН 7,2-7,4 на шейкере в режиме 250 уд./мин. при комнатной температуре, при этом смену промывочных растворов осуществляют каждые 12 часов. Контрольные образцы подвергают морфологическому исследованию путем изготовления гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным. Препараты исследуют, применяя поляризационную микроскопию и оценивая матрикс на предмет целостности коллагеновых волокон и сохранения их пространственной ориентации. Качественный состав дермального матрикса исследуют с применением времяпролетной масспектрометрии с ионизацией электроспреем. Достигаемым целевым параметром является удаление основного пула клеточных белков (тубулин, аннексии, виментин, кавеолин и т.д.) и идентификация в составе матрикса преимущественно матрисомных белков (декорин, дерматопонтин). При достижении целевых параметров дермальный матрикс подлежит химической стерилизации, упаковке и криоконсервации.Next, the samples are washed twice with deionized water and three times with phosphate-saline solution pH 7.2-7.4 on a shaker in the mode of 250 beats / min. at room temperature, while changing the wash solutions carried out every 12 hours. Control samples are subjected to morphological examination by making histological specimens stained with picrosirius red. The preparations are examined using polarizing microscopy and evaluating the matrix for the integrity of the collagen fibers and maintaining their spatial orientation. The qualitative composition of the dermal matrix is investigated using time-of-flight mass spectrometry with ionization by electrospray. The achieved target parameter is the removal of the main pool of cellular proteins (tubulin, annexation, vimentin, caveolin, etc.) and the identification of predominantly matrix proteins in the matrix (decorin, dermatopontin). Upon reaching the target parameters, the dermal matrix is subject to chemical sterilization, packaging, and cryopreservation.
Исследование биосовместимости ацеллюлярного дермального матрикса проведено в соответствие с ГОСТ ISO 10993-1-2011 на половозрелых крысах стока Wistar обоего пола. Ацеллюлярный дермальный матрикс имплантировали в карман, сформированный ниже поверхностной фасции шеи. Срок имплантации составил от 28 до 90 суток. Данные макроскопической оценки ацеллюлярного дермального матрикса и зоны имплантации показали отсутствие признаков отека, гематом, рубцов и фиброзных структур в виде капсулы. Матрикс на всех сроках сохранял свою изначальную локализацию. Признаки резорбции были отмечены только по краям материала, но без его фрагментации.The biocompatibility study of the acellular dermal matrix was carried out in accordance with GOST ISO 10993-1-2011 on adult Wistar runoff rats of both sexes. The acellular dermal matrix was implanted in a pocket formed below the superficial fascia of the neck. The term of implantation ranged from 28 to 90 days. The data of macroscopic evaluation of the acellular dermal matrix and the implantation zone showed no signs of edema, hematomas, scars, and fibrous structures in the form of a capsule. Matrix on all terms retained its original localization. Signs of resorption were noted only along the edges of the material, but without its fragmentation.
По данным гистологического исследования матрикс не индуцировал воспалительную реакцию, содержал на периферии значительное число тучных клеток (к 28 суткам); на периферии и в центре - фибробласты (28-45 суток), а также единичные скопления лимфоцитов и макрофагов (28 суток). К 90 суткам часть коллагеновых фибрилл матрикса была фрагментирована, а межфибриллярное пространство заполнено оформленной соединительной тканью реципиента.According to histological studies, the matrix did not induce an inflammatory response, contained a significant number of mast cells at the periphery (by day 28); on the periphery and in the center - fibroblasts (28-45 days), as well as isolated accumulations of lymphocytes and macrophages (28 days). By 90 days, part of the collagen matrix fibrils was fragmented, and the interfibrillary space was filled with the recipient's formed connective tissue.
Полученные результаты свидетельствуют о биосовместимости полученного материала в условиях длительного контакта с окружающими тканями и позволяют рекомендовать его в качестве имплантационного материала для решения конкретных клинических задач.The results obtained indicate the biocompatibility of the material obtained under conditions of prolonged contact with surrounding tissues and allow us to recommend it as an implant material for solving specific clinical problems.
Способ может применяться в условиях биотехнологических производств для получения имплантационного материала на биологической основе, как альтернатива искусственным материалам.The method can be applied in the conditions of biotechnological production to obtain an implantation material on a biological basis, as an alternative to artificial materials.
Источники информацииInformation sources
1. Патент РФ на изобретение №2240809 от 27.11.2004 «Способ получения бесклеточного дермального матрикса».1. RF patent for the invention No. 2240809 of 11/27/2004 "Method for producing a cell-free dermal matrix".
2. Патент РФ на изобретение №2353397 от 13.04.2007 «Биорассасывающаяся коллагеновая матрица, способ ее получения и применение».2. RF patent for invention No. 233,397 of April 13, 2007, “Bioabsorbable collagen matrix, method for its preparation and use.”
3. «Method of Preparing Isolated Cell-FreeSkin, Cell-Free Dermal Matrix, Method of Producing the Sameand Composite Cultured Skin with The Use of the Cell-Free Dermal Matrix». Патент US 2007/0269791 A1.3. "Method of Preparing Cell-Free Cell-Free, Cell-Free Dermal Matrix, Cell-Free Dermal Matrix." Patent US 2007/0269791 A1.
4. Патент РФ на изобретение №2524619 С2 от 02.04.2013 г. «Способ изготовления дермального матрикса».4. RF patent for invention No. 2524619 C2 of April 2, 2013, “A method of manufacturing a dermal matrix”.
5. Rieder Е., Kasimir М.Т., Silberhumer G. et al. // Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004. V. 127 (2). P. 399-405.5. Rieder E., Kasimir M.T., Silberhumer G. et al. // decellularization protocols J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004. V. 127 (2). P. 399-405.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1ANNEX 1
Способ получения дермального матриксаThe method of obtaining the dermal matrix
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018139784A RU2694543C1 (en) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | Method for producing dermal matrix |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018139784A RU2694543C1 (en) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | Method for producing dermal matrix |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694543C1 true RU2694543C1 (en) | 2019-07-16 |
Family
ID=67309133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018139784A RU2694543C1 (en) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | Method for producing dermal matrix |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694543C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717088C1 (en) * | 2019-10-18 | 2020-03-18 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница N 1 имени профессора С.В. Очаповского" Министерства здравоохранения Краснодарского края (ГБУЗ "НИИ-ККБ N 1 им. проф. С.В. Очаповского" Минздрава Краснодарского края) | Method of producing acellular dermal matrix |
| RU2769248C1 (en) * | 2021-04-22 | 2022-03-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова" МЧС России (ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС Росии) | Method for obtaining acellular dermal matrix |
| RU2791987C1 (en) * | 2022-04-08 | 2023-03-15 | Карина Игоревна Мелконян | Method of decellularization of pig dermis for reconstructive plastic surgery |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2014359C1 (en) * | 1992-02-12 | 1994-06-15 | Радюхин Виктор Алексеевич | Three-dimensional bioactive carrier for mammalian cells and tissues cultivation |
| RU2524619C2 (en) * | 2013-04-02 | 2014-07-27 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Method for making dermal matrix |
| US20170119826A1 (en) * | 2013-07-30 | 2017-05-04 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same |
| RU2662554C2 (en) * | 2016-12-16 | 2018-07-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) | Material preparation method for establishing the bio-engineering structure of the esophagus |
-
2018
- 2018-11-09 RU RU2018139784A patent/RU2694543C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2014359C1 (en) * | 1992-02-12 | 1994-06-15 | Радюхин Виктор Алексеевич | Three-dimensional bioactive carrier for mammalian cells and tissues cultivation |
| RU2524619C2 (en) * | 2013-04-02 | 2014-07-27 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Method for making dermal matrix |
| US20170119826A1 (en) * | 2013-07-30 | 2017-05-04 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same |
| RU2662554C2 (en) * | 2016-12-16 | 2018-07-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России) | Material preparation method for establishing the bio-engineering structure of the esophagus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| N.N. SARBAEVA, M.N. MILYAKOVA, V.V. ROSSINSKAYA ET AL. Characterization of an Acellular Dermal Matrix Obtained by Different Detergent-Enzymatic Methods, Biomedical Engineering, vol.51, N3, September 217, pp.166-169. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717088C1 (en) * | 2019-10-18 | 2020-03-18 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница N 1 имени профессора С.В. Очаповского" Министерства здравоохранения Краснодарского края (ГБУЗ "НИИ-ККБ N 1 им. проф. С.В. Очаповского" Минздрава Краснодарского края) | Method of producing acellular dermal matrix |
| RU2769248C1 (en) * | 2021-04-22 | 2022-03-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова" МЧС России (ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС Росии) | Method for obtaining acellular dermal matrix |
| RU2791987C1 (en) * | 2022-04-08 | 2023-03-15 | Карина Игоревна Мелконян | Method of decellularization of pig dermis for reconstructive plastic surgery |
| RU2792542C1 (en) * | 2022-07-23 | 2023-03-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for obtaining a bioengineered graft for plasty of an anterior abdominal wall defect |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Johnson et al. | Human versus porcine tissue sourcing for an injectable myocardial matrix hydrogel | |
| Fu et al. | Decellularization of porcine skeletal muscle extracellular matrix for the formulation of a matrix hydrogel: a preliminary study | |
| AU2007297611B2 (en) | Collagen preparation and method of isolation | |
| Bjork et al. | Ruthenium-catalyzed photo cross-linking of fibrin-based engineered tissue | |
| Milan et al. | Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery | |
| US20220160937A1 (en) | Rapid allograft treatment systems and methods | |
| US9642937B2 (en) | Preparation method for implantable medical biological materials of animal origin | |
| CN110975010B (en) | Placenta tissue matrix material and preparation method thereof | |
| CN107213523A (en) | A kind of preparation method of the co-crosslinking double-network hydrogel support of promotion osteogenic growth | |
| RU2524619C2 (en) | Method for making dermal matrix | |
| Rashtbar et al. | Characterization of decellularized ovine small intestine submucosal layer as extracellular matrix‐based scaffold for tissue engineering | |
| RU2694543C1 (en) | Method for producing dermal matrix | |
| RU2504334C1 (en) | Method of decellularisation of small-calibre blood vessels | |
| EP4272773A1 (en) | Preparation method for decellularized matrix biomaterial | |
| CN106492281B (en) | Biocompatible bone graft and preparation method thereof | |
| Song et al. | Development of novel apoptosis-assisted lung tissue decellularization methods | |
| Assmann et al. | Improvement of the in vivo cellular repopulation of decellularized cardiovascular tissues by a detergent‐free, non‐proteolytic, actin‐disassembling regimen | |
| WO2010123928A1 (en) | Collagen-based matrices for vessel density and size regulation | |
| WO2006137546A1 (en) | Treatment method for preventing transplantation tissue with biological origin from calcification and tissue treated thereby | |
| Deus et al. | Designing highly customizable human based platforms for cell culture using proteins from the amniotic membrane | |
| JP5638950B2 (en) | Collagen-containing cell carrier | |
| KR20210072266A (en) | Adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold and method of making the same | |
| Kumaresan et al. | Development of Human Umbilical cord based scaffold for tissue engineering application | |
| RU2809459C1 (en) | Deamidated collagen biomatrix and method of its preparation | |
| Hrebikova et al. | Decellularized Skeletal Muscle: A Promising Biologic Scaffold for Tissue Engineering |