RU2691752C1 - Способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур - Google Patents
Способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691752C1 RU2691752C1 RU2017147028A RU2017147028A RU2691752C1 RU 2691752 C1 RU2691752 C1 RU 2691752C1 RU 2017147028 A RU2017147028 A RU 2017147028A RU 2017147028 A RU2017147028 A RU 2017147028A RU 2691752 C1 RU2691752 C1 RU 2691752C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gelatin
- silk fibroin
- solution
- stage
- mixture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 9
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 59
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 59
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 59
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 59
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 10
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 11
- VFHVQBAGLAREND-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl-(2,4,6-trimethylphenyl)methanone Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(=O)P(=O)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VFHVQBAGLAREND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000000016 photochemical curing Methods 0.000 claims description 5
- -1 polypropylene form Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 7
- GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=C(OCCO)C=C1 GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 description 4
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- JUYQFRXNMVWASF-UHFFFAOYSA-M lithium;phenyl-(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate Chemical compound [Li+].CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(=O)P([O-])(=O)C1=CC=CC=C1 JUYQFRXNMVWASF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920000671 polyethylene glycol diacrylate Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001299 polypropylene fumarate Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010017 direct printing Methods 0.000 description 1
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 1
- 210000000871 endothelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000379 polypropylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010064995 silkworm fibroin Proteins 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/63—Arthropods
- A61K35/646—Arachnids, e.g. spiders, scorpions, ticks or mites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Предложен способ получения биорезорбируемых трехмерных пористых структур на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка, включающий следующие стадии: растворение фиброина шелка в водном растворе бромида лития; заморозка водного раствора фиброина шелка и лиофилизация; растворение желатина в калий-фосфатном буфере и добавление к раствору избытка метакрилового ангидрида; проведение реакции метакрилирования желатина; добавление к реакционной смеси калий-фосфатного буфера с последующим ее охлаждением и диализом; заморозка полученного продукта и лиофилизация; получение водного раствора регенерированного фиброина шелка; получение раствора метакрилированного желатина в ДМСО и его охлаждение; добавление к раствору метакрилированного желатина фотоинициатора; внесение раствора регенерированного фиброина шелка в смесь метакрилированного желатина и фотоинициатора с последующим проведением фотополимеризации; обработка 96%-ным этиловым спиртом гидрогелей, полученных после фотополимеризации; удаление остатков растворителей. Изобретение обеспечивает высокую скорость фотополимеризации, а также возможность получения пористых конструкций заданной формы и с контролируемой структурой. 3 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Более подробно изобретение относится к области создания биорезорбируемых, биосовместимых трехмерных структур, полученных фотоотверждением смеси метакрилированного желатина и фиброина шелка Bombyx mori и предназначенных для тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Уровень техники
Актуальность исследований в области тканевой инженерии и регенеративной медицины определяется дефицитом донорских тканей и органов, что является причиной инвалидизации и смертности населения и основным сдерживающим фактором развития трансплантологии. В открытом доступе наиболее полная статистика, касающаяся данной проблемы, представлена для США. По данным организации Donatelife America 118.000 человек в США ожидают пересадку донорских органов, 33 600 человек ее получили, 8000 умерли, не дождавшись (данные на 2016 г). Кроме того, обширные ожоги, хронические раны (трофические язвы), в США 600.000-1.500.000 случаев в год, требуют лечения путем трансплантации кожи. Использование донорского материала ограничивается его нехваткой, этическими сложностями, рисками вирусного инфицирования и иммунологического отторжения. Дефицит донорского материала и ограничения в его использовании стимулировали развитие тканевой инженерии, разрабатывающей биоискусственные заменители тканей и органов. Основа таких заменителей - структуры, имитирующие бесклеточную составляющую соединительной ткани, на поверхности Фиброин - основной компонент шелка тутового шелкопряда Bombyx mori. Он обладает рядом уникальных свойств и активно используется для разработки биомедицинских изделий различной формы и предназначения: губчатых пористых матриксов, пленок, гидрогелей, микрочастиц, трубок, электроспиннинговых волокон, повязок и пр. [Т.J. Phillips, "Current Approaches to Venous Ulcers and Compression," Dermatologic Surg., vol. 27, no. 7, pp. 611-621, Jul. 2001, M. Braddock, C.J. Campbell, and D. Zuder, "Current therapies for wound healing: electrical stimulation, biological therapeutics, and the potential for gene therapy," Int. J. Dermatol., vol. 38, no. 11, pp. 808-817, Nov. 1999, С. Harvey, "Wound healing.," Orthop. Nurs., vol. 24, no. 2, pp. 143-57-9, 2005, A. Cole-King and K.G. Harding, "Psychological factors and delayed healing in chronic wounds.," Psychosom. Med., vol. 63, no. 2, pp. 216-20, 2001, J. Walburn, K. Vedhara, M. Hankins, L. Rixon, and J. Weinman, "Psychological stress and wound healing in humans: A systematic review and meta-analysis," J. Psychosom. Res., vol. 67, no. 3, pp. 253-271, Sep. 2009.] Преимуществами фиброина являются доступность, возможность получения водных растворов, способность к биологическому разложению с образованием не токсичных продуктов распада, низкая иммуногенность, термостабильность, присутствие легкодоступных химических групп для функциональных модификаций, возможность газовой стерилизации и устойчивость к радиации, возможность создания композиционных материалов на его основе, которых могут размножаться и дифференцироваться тканеспецифичные клетки, в результате чего формируется ткань, близкая по свойствам к утраченной. Для лечения обширных и хронических ран, в частности, ран кожи, используется ауто- или аллотрансплантация кожи. В случае аутотрансплантации используется тонкий слой кожи, который включает в себя полностью эпидермис и часть дермы, который выделяют с внутренней части бедра и ягодиц и помещают на место раны. Результат лечения зависит от толщины подстилающей дермы в трансплантате. Наличие толстого слоя дермы ведет к более быстрому заживлению и лучшему эстетическому виду зажившей раны. Поскольку аутотрансплантат является собственной тканью пациента, то нет риска отторжения, однако кожа может быть взята ограниченное количество раз после заживления, поскольку каждый раз донорские участки истончаются из-за замедления регенерации дермы [М. Akan, S. Yildirim, A. Misirliolu, G. Ulusoy, Т. Akz, and G. Ave, "An Alternative Method to Minimize Pain in the Split-Thickness Skin Graft Donor Site," Plast. Reconstr. Surg., vol. 111, no. 7, pp. 2243-2249, Jun. 2003.]. Аллотрансплантация трупной кожи позволяет частично преодолеть дефицит донорского материала и наиболее широко используются при лечении ожоговых ран. Аллотрансплантаты защищают основную ткань, образуя барьер, обеспечивают образование грануляционной ткани, но служат временно из-за отторжения иммунной системой хозяина и требуют последующей аутотрансплантации. Кроме того, существует риск заражения, например, гепатитом В и С или ВИЧ. Наиболее перспективная альтернатива использованию донорской кожи - использование тканеинженерных заменителей. Тканеинженерные заменители ткани являются новым терапевтическим инструментом с широким спектром применений. Кожные заменители действуют как временное защитное покрытие раны, защищают поврежденную ткань от потери жидкости и загрязнения, ускоряя заживление ран. Тканеинженерные заменители тканей включают в свой состав аналог внеклеточного матрикса и/или клетки (клеточные композиции) [Y.М. Bello, A.F. Falabella, and W.Н. Eaglstein, "Tissue-Engineered Skin," Am. J. Clin. Dermatol., vol. 2, no. 5, pp. 305-313, 2001, S. MacNeil, "Progress and opportunities for tissue-engineered skin," Nature, vol. 445, no. 7130, pp. 874-880, Feb. 2007]. Внесение клеточного компонента в состав тканеинженерных конструкций в значительной степени усиливает их регенеративный потенциал. Важной задачей данного направления регенеративной медицины является создание новых высокотехнологичных материалов и конструкций. С развитием аддитивных технологий появилась потребность в создании новых биорезорбируемых материалов, адаптированных для 3D-печати. Трехмерная биопечать (3D-печать) возникла как гибкий инструмент для использования в различных областях регенеративной медицины. Она является относительно новой областью биотехнологии и биоинженерии и позволяет создавать жизнеспособные тканевые структуры в трехмерном пространстве [R.P. Visconti, V. Kasyanov, С. Gentile, J. Zhang, R.R. Markwald, and V. Mironov, "Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree," Expert Opin. Biol. Ther., vol. 10, no. 3, pp. 409-420, Mar. 2010.]. 3D-печать или стереолитография - последовательное нанесение тонких слоев материала, который можно сделать твердым при помощи ультрафиолетового света. Слои наносятся в определенном порядке с образованием твердой трехмерной структуры. Этот процесс в настоящее время применяется для создания трехмерных каркасов из биологических материалов. Разработка жидких материалов позволяет выполнять прямую печать биологически совместимых каркасов, которые могут быть использованы для трансплантации или культивирования клеток [М. Nakamura, S. Iwanaga, С. Henmi, K. Arai, and Y. Nishiyama, "Biomatrices and biomaterials for future developments of bioprinting and biofabrication," Biofabrication, vol. 2, no. 1, p. 14110, Mar. 2010]. Важным преимуществом природных полимеров для 3D-биопечати является их большая биосовместимость с тканями и лучшая адгезия клеток [L. Bedian, А.М. 
, G. 
, R. Parra-saldivar, and H.M.N. Iqbal, "International Journal of Biological Macromolecules Bio-based materials with novel characteristics for tissue engineering applications - A review," vol. 98, pp. 837-846, 2017]. Недостатками синтетических полимеров являются плохая биосовместимость, наличие токсичных продуктов деградации и утрата механических свойств в процессе деградации. Существующие технологии позволяют осуществлять 3D-печать из синтетических материалов, таких как полимолочная кислота и ее производные, но общеизвестен факт, что биодеградация полилактатов сопровождается локальным закислением, что является причиной локального воспаления [Manavitehrani, A. Fathi, Y. Wang, Р. K. Maitz, and F. Dehghani, "Reinforced Poly(Propylene Carbonate) Composite with Enhanced and Tunable Characteristics, an Alternative for Poly(lactic Acid)," ACS Appl. Mater. Interfaces, vol. 7, no. 40, pp. 22421-22430, Oct. 2015]. Полипропиленфумарат (ППФ) является одним из наиболее широко изученных биодеградируемых полимеров, используемых в стереолитографии, считается биологически совместимым материалом для тканевой инженерии: он деградирует в пропиленгликоль и остатки фумаровой кислоты. Оба продукта разложения являются нетоксичными; фумаровая кислота является природным промежуточным продуктом в метаболизме глюкозы. Однако существуют ограничения связанные с глубиной поглощения смеси, которые могут быть ограничивающим фактором для изготовления 3D тканевой инженерии каркасов
В литературе описано множество технологических приемов для получения полимерных изделий сложной формы на основе растворов фиброина шелка. Основная масса этих методов основана на получении «физически сшитого» полимера. Ключевой этап получения этого полимера - индуцирование сворачивания повторов - GAGAGS-первичной последовательности фиброина в антипараллельные бета-листы с образованием прочных кристаллических доменов. Нерастворимый в воде полимерный материал, полученный подобным образом, является «физически сшитым». Это означает, что между белковыми цепями отсутствуют ковалентные связи, а роль узлов сшивки выполняют кристаллические домены. Материал такого строения обладает превосходными механическими свойствами, формируется из водных растворов и обладает относительно невысокой скоростью деградации. Подобные методы («замораживание-оттаивание», обработка спиртами или ультразвуком) хорошо зарекомендовали для получения макроскопических изделий, таких как двумерные пленки и трехмерные пористые скаффолды, однако они не успели продемонстрировать значительных успехов в изготовлении изделий более сложной геометрии, порядок структуры которых сопоставим с размерами живых клеток (например, «микропаттернированные» поверхности).
Существует множество способов синтеза GMA, но они все представляют из себя вариации первого предложенного Van Den Bulcke et al. метода [A.I. Van Den Bulcke, B. Bogdanov, N. De Rooze, E.H. Schacht, M. Cornelissen, H. Berghmans, Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels, Biomacromolecules 1 (2000) 31-38]. Фотосшивание синтезированного GelMA может проводиться с использованием водорастворимого инициатора под ультрафиолетовым светом. Обычно используют 2-гидрокси-1-[4-(2-гидроксиэтокси)фенил]-2-метил-1-пропанон (Irgacure 2959) [.W. Nichol, S.T. Koshy, H. Bae, C.M. Hwang, S. Yamanlar, A. Khademhosseini, Cell-laden microengineered gelatin methacrylate hydrogels, Biomaterials 31 (2010) 5536-5544, J.A. Benton, C.A. DeForest, V. Vivekanandan, K.S. Anseth, Photocrosslinking of gelatin macromers to synthesize porous hydrogels that promote valvular interstitial cell function, Tissue Eng. Part A 15 (2009) 3221-3230] и литий-ацилфосфинатную соль (LAP) [B.D. Fairbanks, M.P. Schwartz, C.N. Bowman, K.S. Anseth, Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility, Biomaterials 30 (2009) 6702-6707]. Irgacure 2959, коммерчески доступный фотоинициатор, обладает растворимостью в воде не менее 5 мг/мл [J.A. Benton, B.D. Fairbanks, K.S. Anseth, Characterization of valvular interstitial cell function in three dimensional matrix metalloproteinase degradable PEG hydrogels, Biomaterials 30 (2009) 6593-6603], что является достаточно высоким значением для большинства реакций фотополимеризации, проводимых в водных средах. LAP, недавно разработанный альтернативный водорастворимый фотоинициатор, обладает более высокой растворимостью в воде (до 8,5 мас. %) и более высоким молярным коэффициентом экстинкции при 365 нм, чем Irgacure 2959 [B.D. Fairbanks, M.P. Schwartz, C.N. Bowman, K.S. Anseth, Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility, Biomaterials 30 (2009) 6702-6707].
Из уровня техники известны возможные варианты получения структур на оснвое желатина и его производных.
Из публикаций WO 2012164032 A1 «Crosslinked gelatin hydrogels», ЕР 2574349 A1 «Therapeutic use of gelatin hydrogels with a gel-sol transition at body temperature», WO 2013040559 A1 «Fabrication of gelatin hydrogel sheet for the transplantation of corneal endothelium» известны способы получения пленок на оснвое метакрилированного желатина. Несмотря на низкую стоимость реактивов, легкость получения пленок из метакрилированного желатина, такие изделия представляют собой желатиновый гидрогель и, соответственно, обладают недостаточными механическими свойствами, плохо сохраняют фиксированную форму в физиологических условиях, обладают высокой скоростью биодеградации, изменение которой возможно лишь путем химических модификаций, снижающих биосовместимость материала.
Фиброин шелка является самособирающимся структурным белком, который обладает многими важными свойствами материала для тканевой инженерии и регенеративной медицины, такие как хорошая механическая прочность, биосовместимость, высокая проницаемость растворенного кислорода и водяного пара, и сопротивление ферментативной деградации.
По сравнению с другими полимерами, важным преимуществом фиброина шелка для систем типа гидрогель является его способность физически сшиваться без каких-либо химических модификаций. Гелеобразование фиброина шелка является процессом агрегации белков, и связано с изменением конформации молекул фиброина от случайной укладки до β-листа. Механические свойства и склонность к деградации гидрогеля в значительной степени зависят от степени кристалличности и степени физической сшивки.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является необходимость разработки способа формирования биорезорбируемых, биосовместимых трехмерных структур на основе метакрилированного производного желатина и структурного белка шелка - фиброина, которые могут быть использованы в тканевой инженерии и регенеративной медицине.
Гидрогели синтезированы по типу взаимопроникающих полимерных сеток (ВПС). ВПС гидрогели являются сшитыми полимерными сетками, которые способны поглощать большое количество воды и набухать до равновесного состояния. Благодаря этой способности ВПС гидрогели очень схожи с натуральными тканями и часто показывают хорошую биосовместимость.
В заявляемом изобретении фотосшиваемые ВПС гидрогели на основе метакрилированного желатина (GelMA) и фиброина шелка (FB), образованные путем последовательной полимеризации, которые обладают настраиваемыми структурными и биологическими свойствами.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является обеспечение возможности получения биорезорбируемых трехмерных структур с применением технологии фотополимеризации, используемой в фотополимерных 3D-принтерах. При этом обеспечивается высокая скорость фотополимеризации.
Изобретение позволит получать пористые конструкции заданной формы и с контролируемой структурой, в том числе на основе компьютерных моделей.
Заявляемый способ характеризуется простотой и технологичностью, возможностью использования недорогого и доступного сырья, что в сочетании с уникальными свойствами получаемых описанных способом структур, а именно обладающих достаточными механическими свойствами для поддержания целостности структуры в физиологических условиях, пористой структурой, обеспечивающей миграцию клеток, в том числе прогениторных и свободное проникновение растворенных питательных веществ и факторов, обеспечивает возможность получения доступного конкурентоспособного продукта.
Поставленная задача решается тем, что способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур, согласно техническому решению, включает следующие стадии:
а) подготовку водного раствора фиброина шелка путем растворения фиброина из расчета 150-300 мг/мл в 9.3М водном растворе бромида лития в течение 5-7 часов при нагревании до 85°C±5°C и последующего диализа против воды;
б) заморозку полученного на стадии а) водного раствора фиброина в течение 12-24 часов при температуре (-18-25°C) и последующую лиофилизацию до постоянной массы;
в) получение однородного раствора желатина путем его растворения из расчета 50 мг на 1 мл в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,2 на водяной бане при 50°C и постоянном перемешивании;
г) добавление к полученному на стадии в) раствору избытка метакрилового ангидрида: не менее 50 мкл на 1 мл;
д) проведение реакции метакрилирования путем инкубации смеси, полученной на стадии г) в течение 3 часов, при постоянном перемешивании и температуре 50°C;
е) добавление к реакционной смеси, полученной после завершения этапа, описанного в пункте д), 0,1М калий-фосфатного буфера раствор рН 7,2 из расчета 1 мл на 50 мг желатина;
ж) охлаждение реакционной смеси до комнатной температуры и диализ в целлюлозных мембранах против двадцатикратного объема dH2O при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со сменой каждый час в течение трех - пяти дней до исчезновения запаха метакрилового ангидрида;
з) заморозку полученного на стадии ж) продукта при (-18°C) и последующую лиофилизацию до достижения постоянной массы;
и) подготовку водного раствора регенерированного фиброина, полученного на стадии б), путем растворения 90-180 мг регенерированного фиброина в 1 мл дистиллированной воды при 50-60°C в течение 30-180 минут
к) подготовку раствора метакрилированного желатина, полученного на стадии з), путем растворения 180 мг метакилированного желатина в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО) при 50-60°C в течение 30-180 минут;
л) охлаждение раствора метакрилированного желатина, полученного на стадии к) до температуры 30-35°C;
м) получение раствора, содержащего метакрилированный желатин и фотоинициатор путем добавления к раствору, полученному на стадии л), ТРО (дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфин оксид (97%)) из расчета 3 масс. %. по меткрилированному желатину;
н) получение смеси фиброина и желатина для фотоотверждения путем внесения раствора регенерированного фиброина, полученного на стадии и) в смесь метакрилированного желатина и фотоинициатора, полученную на стадии м) при постоянном перемешивании;
о) фотополимеризацию смеси, полученной на стадии н), путем облучения смеси в полипропиленовой форме светом ультрафиолетовой лампы (мощностью 36 Вт) в течение 5-15 минут.
п) индукцию перехода молекул фиброина из α-спиралей и статистического клубка в β-слои путем обработки 96%-ным этиловым спиртом гидрогелей, полученных на стадии о) при комнатной температуре в течение 1-6 часов;
р) удаление остатков растворителей путем промывки избытком дистилированной воды в течение 2-6 часов при постоянном перемешивании и смене раствора каждые 30-45 минут.
В заявляемом изобретении может быть использован фиброин шелка каркасной нити пауков, фиброин шелка тутового шелкопряда и других видов шелкопрядов, фиброин рекомбинантного шелка, а также искусственные аналоги шелка.
В качестве фотоинициатора был выбран дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфин оксид (97%), являющийся высокореактивным, нерастворимым в воде соединением, применяемым для быстрого фотоотверждения, например, для лазерной стереолитографии. В ранее описанной системе с метакрилированным желатином и фиброином был использован 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (Irgacure 2959). Это изменение позволило сократить время требуемого УФ-облучения в 5-10 раз и осуществлять фотополимеризацию в слоях раствора толщиной до 5 мм.
Трехмерные структуры, полученные в соответствии с заявляемым изобретением могут применяться для регенерации тканей и органов, в том числе для восстановления покровных тканей организма.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлены: А - внешний вид трехмерной биорезорбируемой структуры на основе фиброина и метакрилированного желатина, Б - пористая структура конструкций. Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии.
Осуществление изобретения
Получение водного раствора фиброина шелка осуществляли с использованием Нитей хирургических нестерильных 100% натуральный шелк, произведенных по ГОСТ 396-84 (Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 396-84, наличие сертификата соответствия №0302120, гарантии производителя, срок годности, условия хранения по ГОСТ 396-84, сертификат соответствия), растворяя навеску в водном 9.3М растворе лития бромистого (х.ч., о.с.ч., ТУ 2154-006-00750907-2016; Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 3885-73, наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид) с последующим замораживанием в чашках Петри диаметром десять см и лиофилизацией на приборе Alpha 1-2 LDplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия) до постоянной массы. Необходимую для получения раствора с нужной концентрацией массу белка растворяли в дистиллированной воде.
Синтез метакрилированного желатина осуществляли с использованием желатина кристаллического (особо чистый, Carl Roth, Германия). Навеску кристаллического желатина (1 г) помещали в кругло донную колбу, оснащенную магнитной мешалкой, и добавляли 20 мл 0,1 М калий-фосфатного буферного раствора с рН 7,2. Растворение желатина производили на водяной бане (50°C) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Итоговая концентрация раствора составляла 6 мас. %. В полученный раствор вносили избыток метакрилового ангидрида. Реакцию проводили в течение трех часов при постоянном перемешивании и нагревании (50°C). Далее к реакционной смеси добавляли 0,1 М калий-фосфатный буферный раствор с рН 7,2 (20 мл), после чего охлаждали смесь до комнатной температуры и очищали диализом в целлюлозных мембранах против двадцатикратного объема дистиллированной воды при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со сменой каждый час в течение трех сут до исчезновения запаха метакрилового ангидрида. Продукт реакции переносили в чашку Петри, замораживали при (-18°C) и лиофилизировали на приборе Alpha 1-2 LDplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия) до достижения постоянной массы.
Смесь мономеров для фототверждения получали на основе водного раствора фиброина и метакрилированного желатина, который растворяли в диметилсульфоксиде в термошкафу при температуре 50-60°C до его полного растворения и добавляли фотоинициатор дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфин оксид (97%) (3 мас. % по метакрилированному желатину). Далее по каплям при перемешивании вносили водный раствор фиброина в смесь метакрилированного желатина и фотоинициатора. Концентрация метакрилированного желатина в итоговом растворе составляла не менее 3 мас. %, а соотношение мономеров (метакрилированный желатин: фиброин) - 2:1 и 1:1.
Для получения трехмерных биорезорбируемых конструкций на основе фиброина растворы мономеров (300 мкл) вносили в полипропиленовую форму диаметром 13 мм так, чтобы образовался ровный слой. После этого фотополимеризовали в свете ультрафиолетовой лампы (мощностью 36 Вт) в течение 10 мин. Далее в формы добавляли 96%-ный этиловый спирт и выдерживали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем отмывали растворители избытком дистилированной воды в течение двух-трех часов при постоянном перемешивании и смене раствора.
Все перечисленные выше процедуры осуществлялись с использованием следующего оборудования: Система очистки воды Elix 70, «Millipore» (Франция, система включает: картридж предварительной очистки Progard TL, картридж обратного осмоса, модуль Elix; производительность 70 л/час при температуре 7-30о С, рабочее давление 0,7-1,0 МПа, 220 В, 50 Гц, габариты (ШГВ): 662×441×733 мм, 56 кг); Резервуар для сбора очищенной воды SDS 200, «Millipore» (Франция, объем 200 л), Весы электронные RV 1502, «OHAUS» (США, (1500,00±0,01) г, 220 В, 50 Гц); Шкаф вытяжной 1200 ШВМкв (Россия, ООО «ЛаМО» макс, мощность подключаемых приборов 3,5 кВт, 220 В, габариты (ШГВ): 1280×750×2400 мм); Холодильник бытовой Атлант МХМ 1707-02 (Минск, Белоруссия, емкость камеры холодильника 175 л, температура от 0°C до 10°C, емкость мороз, камеры 115 л, температура минус 18 до минус 24°C, 220 В, 50 Гц); Баня водяная BWT-U/20, Biosan (Латвия, ванна из н/ж стали объем 20 л. Диапазон регулирования температуры от 30°C до 100°C, точность поддержания температуры ±0,1°C, внутренняя циркуляция, внутр. размеры ванны: 300×320×140 мм, габариты: 345×550×290 мм, 11 кг, 220 В, 50 Гц, 1 кВт), Термостат ТС-1/80, СКТБ (80 л, температура до +60°C, принудительная вентиляция, камера - нержавеющая сталь), Центрифуга для микропробирок Eppendorf 5418R 18×1,5/2 мл, 14000 об/мин, 16873g, с охлаждением, ротор FA-45-18-11, 18×1,5/2 мл, UV лампа BURANO® (36 W).
Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Специалисту в данной области техники понятно, что данные примеры не являются ограничивающими изобретение, а лишь показывают возможность его реализации.
Пример 1.
Навеску хирургических шелковых нитей растворяли в 9,3 М растворе бромида лития в течение 6 часов при 80°C, затем диализовали против дистиллированной воды в течение суток с десятью сменами воды. Раствор фиброина замораживали в чашках Петри диаметром десять см и лиофилизировали на приборе Alpha 1-2 LDplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия). Необходимую для получения раствора с концентрацией 3 мас % массу белка растворяли в дистиллированной воде.
Навеску кристаллического желатина (1 г) помещали в кругл о донную колбу, оснащенную магнитной мешалкой, и добавляли 20 мл 0,1 М калий-фосфатного буферного раствора с рН 7,2. Растворение желатина производили на водяной бане (50°C) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Итоговая концентрация раствора составляла 5 мас. %. В полученный раствор вносили избыток метакрилового ангидрида. Реакцию проводили в течение трех ч при постоянном перемешивании и нагревании (50°C). Далее к реакционной смеси добавляли 0,1 М калий-фосфатный буферный раствор с рН 7,2 (20 мл), после чего охлаждали смесь до комнатной температуры и очищали диализом в целлюлозных мембранах против двадцатикратного объема дистиллированной воды при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со сменой каждый час в течение трех сут. до исчезновения запаха метакрилового ангидрида. Продукт реакции переносили в чашку Петри, замораживали при (-18°C) и лиофилизировали на приборе Alpha 1-2 LDplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия) до постоянной массы.
Навеску метакрилированного желатина растворяли в диметилсульфоксиде в термошкафу при температуре 50-60°C до его полного растворения и добавляли фотоинициатор дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфин оксид (97%) (3 мас. % по метакрилированному желатину). Далее аккуратно при перемешивании приливали водный раствор фиброина. Концентрация метакрилированного желатина в итоговом растворе составляла не менее 3 мас. %, а соотношение мономеров (метакрилированный желатин: фиброин) - 1:1.
Для получения образцов трехмерных биорезорбируемх конструкций по 300 мкл растворов мономеров вносили в полипропиленовую форму диаметром 13 мм так, чтобы образовался ровный слой. После этого фотополимеризовали в свете ультрафиолетовой лампы (мощностью 36 Вт) в течение десяти мин. Далее в формы добавляли 96%-ный этиловый спирт и выдерживали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем отмывали растворители избытком дистилированной воды в течение двух-трех часов при постоянном перемешивании и смене раствора. При необходимости дальнейшего хранения переносили гидрогелевые образцы в 70%-ный раствор этилового спирта. Полученные биорезорбируемые трехмерные структуры представлены на фиг. 1А.
Пример 2.
Исследование структуры полученных образцов.
Образцы обезвоживали в возрастающих концентрациях этилового спирта и ацетоне, затем высушивали на приборе Critical point dryer НСР-2 (Hitachi Ltd., Япония) и напыляли слоем платины толщиной 20 нм с использованием прибора IB-3 Ion Coater (Eiko Engineering Co, Япония). Полученные образцы изучали на микроскопе CamScan S2 (Cambridge Instruments, Великобритания).
Внутреннее пространство трехмерных конструкций характеризовалось пористой структурой (фиг. 1Б).
Таким образом, были получены фотоотверждаемые трехмерные структуры на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка, которые могут быть использованы при формировании скаффолдов для тканевой инженерии, раневых покрытий, в том числе микроструктурированных.
Claims (20)
1. Способ получения биорезорбируемых трехмерных пористых структур на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка, включающий следующие стадии:
а) подготовка водного раствора фиброина шелка путем растворения фиброина шелка из расчета 150-300 мг/мл в 9,3М водном растворе бромида лития в течение 5-7 часов при нагревании до 85±5°С и последующего диализа против воды;
б) заморозка водного раствора фиброина шелка, полученного на стадии а), в течение 12-24 часов при температуре от -18 до -25°С с последующей лиофилизацией до постоянной массы;
в) растворение желатина из расчета 50 мг на 1 мл в 0,1М калий-фосфатном буфере с рН 7,2 на водяной бане при 50°С и постоянном перемешивании до получения однородного раствора;
г) добавление к полученному на стадии в) раствору избытка метакрилового ангидрида в количестве не менее 50 мкл на 1 мл;
д) проведение реакции метакрилирования желатина путем инкубации смеси, полученной на стадии г), в течение 3 часов при постоянном перемешивании и температуре 50°С;
е) добавление к реакционной смеси, полученной после завершения стадии д), 0,1М калий-фосфатного буфера с рН 7,2 из расчета 1 мл на 50 мг желатина;
ж) охлаждение реакционной смеси до комнатной температуры и диализ в целлюлозных мембранах против двадцатикратного объема dH2O при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со сменой каждый час в течение 3-5 дней до исчезновения запаха метакрилового ангидрида;
з) заморозка полученного на стадии ж) продукта при -18°C с последующей лиофилизацией до постоянной массы;
и) подготовка водного раствора регенерированного фиброина шелка, полученного на стадии б), путем растворения 90-180 мг регенерированного фиброина шелка в 1 мл дистиллированной воды при 50-60°С в течение 30-180 минут;
к) подготовка раствора метакрилированного желатина, полученного на стадии з), путем растворения 180 мг метакрилированного желатина в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО) при 50-60°С в течение 30-180 минут;
л) охлаждение раствора метакрилированного желатина, полученного на стадии к), до температуры 30-35°С;
м) получение раствора, содержащего метакрилированный желатин и фотоинициатор, путем добавления к раствору, полученному на стадии л), фотоинициатора, представляющего собой дифенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфин оксид (ТРО), из расчета 3% мас. по метакрилированному желатину;
н) получение смеси фиброина шелка и метакрилированного желатина для фотоотверждения путем внесения раствора регенерированного фиброина шелка, полученного на стадии и), в смесь метакрилированного желатина и фотоинициатора, полученную на стадии м) при постоянном перемешивании;
о) фотополимеризация смеси, полученной на стадии н), путем облучения указанной смеси в полипропиленовой форме светом ультрафиолетовой лампы мощностью 36 Вт в течение 5-15 минут;
п) индукция перехода молекул фиброина шелка из α-спиралей и статистического клубка в β-слои путем обработки 96%-ным этиловым спиртом гидрогелей, полученных на стадии о), при комнатной температуре в течение 1-6 часов;
р) удаление остатков растворителей путем промывки избытком дистиллированной воды в течение 2-6 часов при постоянном перемешивании и смене раствора каждые 30-45 минут.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в смеси для фотополимеризации на стадии о) массовое соотношение метакрилированного желатина к фиброину шелка составляет 1:1.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в смеси для фотополимеризации на стадии о) массовое соотношение метакрилированного желатина к фиброину шелка составляет 2:1.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что фотополимеризация смеси на стадии о) проводится в течение 10 минут.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017147028A RU2691752C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017147028A RU2691752C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2691752C1 true RU2691752C1 (ru) | 2019-06-18 |
Family
ID=66947700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017147028A RU2691752C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2691752C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115054729A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-16 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 一种双网络水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN115154672A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-10-11 | 成都斐洛智凝生物科技有限公司 | 用于治疗牙周组织炎症破坏的多功能水凝胶的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2483756C1 (ru) * | 2012-01-24 | 2013-06-10 | Игорь Иванович Агапов | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ |
| WO2014123761A1 (en) * | 2013-02-06 | 2014-08-14 | Virginia Commonwealth University | Photoactive silk protein and fabrication of silk protein structures using photolithography |
-
2017
- 2017-12-29 RU RU2017147028A patent/RU2691752C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2483756C1 (ru) * | 2012-01-24 | 2013-06-10 | Игорь Иванович Агапов | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ |
| WO2014123761A1 (en) * | 2013-02-06 | 2014-08-14 | Virginia Commonwealth University | Photoactive silk protein and fabrication of silk protein structures using photolithography |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Kan Yue et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels / Biomaterials, 2015, Vol.73, pp.254-271. * |
| Wenqian Xiao et al. Synthesis and characterization of photocrosslinkable gelatin and silk fibroin interpenetrating polymer network hydrogels / Acta Biomater, 2011, Vol.7, N.6, pp.2384-2393. * |
| Мойсенович М.М. и др. Композитные матриксы на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита для регенеративной медицины и культивирования клеток в трехмерной культуре / Acta naturae, 2014, Т.6, N.1 (20), с.103-109. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115054729A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-16 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 一种双网络水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN115154672A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-10-11 | 成都斐洛智凝生物科技有限公司 | 用于治疗牙周组织炎症破坏的多功能水凝胶的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | Highly elastic biodegradable single-network hydrogel for cell printing | |
| Delgado et al. | Collagen cross-linking: biophysical, biochemical, and biological response analysis | |
| de Oliveira Barud et al. | A multipurpose natural and renewable polymer in medical applications: Bacterial cellulose | |
| Jeong et al. | Polymer-based hydrogel scaffolds for skin tissue engineering applications: a mini-review | |
| Kundu et al. | Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations | |
| Mohamed et al. | Nanomaterials and nanotechnology for skin tissue engineering | |
| Kim et al. | Synthesis and evaluation of novel biodegradable hydrogels based on poly (ethylene glycol) and sebacic acid as tissue engineering scaffolds | |
| Gibas et al. | Synthetic polymer hydrogels for biomedical applications | |
| Ramadass et al. | Sol–gel assisted fabrication of collagen hydrolysate composite scaffold: A novel therapeutic alternative to the traditional collagen scaffold | |
| Schneider-Barthold et al. | Hydrogels based on collagen and fibrin–frontiers and applications | |
| Jiang et al. | Feasibility study of tissue transglutaminase for self-catalytic cross-linking of self-assembled collagen fibril hydrogel and its promising application in wound healing promotion | |
| FR2616318A1 (fr) | Peau artificielle et son procede de preparation | |
| CN106310380B (zh) | 一种纳米纤维化丝素蛋白凝胶及其制备方法 | |
| JP2010504122A (ja) | 生体高分子繊維を含んでなる合成多層構造 | |
| Zhang et al. | Photopolymerizable chitosan hydrogels with improved strength and 3D printability | |
| Zhang et al. | A highly transparent, elastic, injectable sericin hydrogel induced by ultrasound | |
| Bidault et al. | Self-supported fibrin-polyvinyl alcohol interpenetrating polymer networks: an easily handled and rehydratable biomaterial | |
| CN109125808A (zh) | 一种可生物降解的胶原基角膜替代物及其制备方法 | |
| CN108409938A (zh) | 一种新型可降解聚氨酯生物材料及其制备方法和应用 | |
| Bouhlouli et al. | Applications of bacterial cellulose as a natural polymer in tissue engineering | |
| Wang et al. | Ductility and porosity of silk fibroin films by blending with glycerol/polyethylene glycol and adjusting the drying temperature | |
| RU2691752C1 (ru) | Способ формирования биорезорбируемых трехмерных структур | |
| Huang et al. | Bioprinted gelatin-recombinant type III collagen hydrogel promotes wound healing | |
| Valente et al. | Enhancing resistance of silk fibroin material to enzymatic degradation by cross-linking both crystalline and amorphous domains | |
| Ghosh et al. | 3D printed hierarchical porous poly (ε-caprolactone) scaffolds from pickering high internal phase emulsion templating |