RU2689791C1

RU2689791C1 - Method for determining viability of human spermatozoa

Info

Publication number: RU2689791C1
Application number: RU2018135349A
Authority: RU
Inventors: Анна Андреевна Доценко; Игорь Владимирович Кудрявцев; Мария Константиновна Серебрякова; Александр Витальевич Полевщиков
Priority date: 2018-10-05
Filing date: 2018-10-05
Publication date: 2019-05-29

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to reproductive medicine, and can be used to determine viability of human spermatozoa using a lectinhistochemistry method. That is ensured by staining the sperm cell suspension with a false narcissus lectin (Narcissus pseudonarcissus L.) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), followed by material analysis by flow cytometry.EFFECT: invention has high reproducibility, which enables to compare viability of spermatozoa before and after cryopreservation or at different stages of treating male infertility; also has moderate time costs when conducting single tests and significant reduction of time spent in conducting mass tests, which enables to improve the choice of treatment of infertility, improve selection of spermatic donors when creating donor banks.1 cl, 5 dwg, 6 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и репродуктивной биологии и может быть использовано для проведения фундаментальных исследований и в клинической практике в рамках вспомогательных репродуктивных технологий для выявления причин мужского бесплодия, определения фертильного статуса, определения криорезистентности сперматозоидов в ходе процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и создания донорских банков спермы.The invention relates to the field of medicine and reproductive biology and can be used to conduct basic research and in clinical practice in the framework of assisted reproductive technologies to identify the causes of male infertility, determine the fertile status, determine the cryoresistance of sperm cells during in-vitro fertilization (IVF) and create donor banks sperm

Жизнеспособность сперматозоидов в женском репродуктивном тракте по разным оценкам может достигать 3-5 дней, однако их оплодотворяющая способность проявляется в гораздо меньший период, составляющий от нескольких часов до 1-2 дней. В случаях, когда процент прогрессивно-подвижных форм составляет менее 40%, определение жизнеспособности сперматозоидов является необходимым для выбора тактики лечения и прогнозирования эффективности процедуры ЭКО. В образцах с низким процентом прогрессивно-подвижных сперматозоидов необходимо оценивать процент живых клеток, поскольку обычно доля живых клеток превышает долю подвижных.The viability of spermatozoa in the female reproductive tract, according to various estimates, can reach 3-5 days, but their fertilizing ability is manifested in a much shorter period, ranging from several hours to 1-2 days. In cases where the percentage of progressively mobile forms is less than 40%, the determination of the viability of spermatozoa is necessary for choosing the tactics of treatment and predicting the effectiveness of the IVF procedure. In samples with a low percentage of progressively motile spermatozoa, it is necessary to estimate the percentage of living cells, since the proportion of living cells usually exceeds the proportion of motile cells.

Данный показатель также важен при проведении ЭКО пациентам с тяжелыми формами мужского фактора бесплодия, что зачастую предусматривает использование оперативных способов получения мужских гамет с последующей криоконсервацией материала. Из-за травматичного характера процедуры и малого количества получаемых клеток, для накопления материала перед ЭКО требуется осуществление криоконсервации материала в жидком азоте, при этом криоконсервация существенным образом сказывается на жизнеспособности гамет и требует использования точных методов оценки этого показателя.This indicator is also important when conducting IVF in patients with severe male infertility factor, which often involves the use of operational methods for producing male gametes with subsequent cryopreservation of the material. Due to the traumatic nature of the procedure and the small number of cells obtained, for the accumulation of material before IVF, the material should be cryopreserved in liquid nitrogen, while cryopreservation significantly affects the viability of the gametes and requires the use of accurate methods for evaluating this indicator.

Для оценки жизнеспособности может применяться ряд известных методов, из которых наиболее распространенными являются тесты, основанные на определении целостности мембран при окрашивании сперматозоидов эозин-нигрозином или с помощью гипоосмотического набухания (HOS - тест).A number of known methods can be used to assess viability, the most common of which are tests based on determining the integrity of membranes when staining spermatozoa with eosin-nigrosin or using hypoosmotic swelling (HOS).

В клинической практике в большинстве случаев принято придерживаться рекомендаций Всемирной Организации Здравоохранения в части определения жизнеспособности сперматозоидов человека, основанных на оценке целостности и проницаемости мембраны сперматозоида.In clinical practice, in most cases, it is customary to adhere to the recommendations of the World Health Organization in terms of determining the viability of human spermatozoa, based on the assessment of the integrity and permeability of the sperm membrane.

Водорастворимые красители плохо проникают через мембраны неповрежденных клеток, слабо связываются внутриклеточными структурами и слабо их прокрашивают. Повышение проницаемости плазматической и внутренних мембран приводит к возрастанию количества красителя, вошедшего в клетку и связавшегося с компонентами цитоплазмы.Water-soluble dyes poorly penetrate the membranes of intact cells, poorly bound by intracellular structures and poorly stain them. An increase in the permeability of the plasma and internal membranes leads to an increase in the amount of dye that enters the cell and binds to the components of the cytoplasm.

Следовательно, окрашивание клетки красителями и ее жизнеспособность находятся в противоположных взаимоотношениях, и окрашивание усиливается при повреждении мембраны. Отсутствие окрашивания свидетельствует о том, что неповрежденные плазматические мембраны не пропускают краску. На этом основаны многие гистохимические методы определения жизнеспособности клеток (с помощью нейтрального синего, эозина и др.).Consequently, cell staining with dyes and its viability are in opposite relationships, and staining is enhanced when the membrane is damaged. The absence of staining indicates that intact plasma membranes do not let the paint through. Many histochemical methods for determining cell viability are based on this (using neutral blue, eosin, etc.).

Известен метод одношагового окрашивания эозин-нигрозином, в котором эозин используют для окрашивания цитоплазмы клеток, а нигрозин для увеличения контрастности между основным фоном и головками сперматозоидов, что помогает выявлять отдельные клетки [

L.,

I., Kvist U. Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique for human sperm vitality assessment // Hum Reprod. - 2003.- Vol. 18, №4. - P. 813-816.]. Этот метод также позволяет хранить предметные стекла для повторной оценки показателя и в целях контроля качества. Для проведения теста две аликвоты эякулята объемом по 50 мкл смешивают с равными объемами раствора эозин-нигрозина и окрашивают в течение 30 сек. Для каждой аликвоты готовят мазок на предметном стекле, который изучают в световом микроскопе под иммерсионным маслом. Подсчитывают число окрашенных и неокрашенных клеток (по 200 сперматозоидов для каждой аликвоты) и вычисляют среднее значение и различие между процентами живых клеток. Если различие между процентами неприемлемо, т.е. не попадает в 95% доверительный интервал, то готовят два новых препарата и повторяют процедуру.A known method of single-step staining with eosin-nigrosin, in which eosin is used to stain the cytoplasm of cells, and nigrosin to increase the contrast between the main background and sperm heads, which helps to identify individual cells [

L.,

I., Kvist U. Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique for human vitality assessment // Hum Reprod. - 2003.- Vol. 18, No. 4. - P. 813-816.]. This method also allows you to store slides for re-evaluation of the indicator and for quality control purposes. For the test, two 50 µl aliquots of ejaculate are mixed with equal volumes of eosin-nigrosin solution and stained for 30 seconds. For each aliquot, a smear is prepared on a slide, which is examined under a light microscope under immersion oil. Count the number of stained and unstained cells (200 spermatozoa for each aliquot) and calculate the average value and the difference between the percentages of living cells. If the difference between percentages is unacceptable, i.e. does not fall into the 95% confidence interval, then prepare two new drugs and repeat the procedure.

Недостатками данного метода являются субъективность оценки препарата и высокая трудоемкость, особенно в случаях низкой концентрации сперматозоидов в нативном образце. При выявлении счетной ошибки необходимо повторять приготовление препарата и его оценку, увеличивая затраты времени на оценку одного нативного образца.The disadvantages of this method are the subjectivity of the evaluation of the drug and the high complexity, especially in cases of low sperm concentration in the native sample. If a counting error is detected, it is necessary to repeat the preparation of the drug and its evaluation, increasing the time spent on evaluating one native sample.

Метод 2. [

L.,

I., Kvist U. Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique for human sperm vitality assessment // Hum Reprod. - 2003. - Vol. 18, №4. - Р. 813-816]. Тест на жизнеспособность с использованием одного раствора эозина является простым и быстрым. Готовят реагенты: 1) NaCl, 0,9% (w/v): растворяют 0,9 г NaCl в 100 мл дистиллированной воды; 2) эозин Y, 0,5% (w/v): растворяют 0,5 г эозина Y (цветовой показатель 45380) в 100 мл 0,9% NaCl. Далее берут две аликвоты эякулята по 5 мкл и соединяют с 5 мкл раствора эозина на предметных стеклах, перемешивают наконечником пипетки, покрывают предметные стекла покровными и оставляют на 30 сек. Оценивают каждое стекло в инвертированном фазово-контрастном микроскопе и подсчитывают число окрашенных и неокрашенных клеток; после чего вычисляют среднее значение и различие между процентами живых клеток. Если различие между процентами неприемлемо и не попадает в 95% доверительный интервал, то готовят два новых препарата и повторяют процедуру.Method 2. [

L.,

I., Kvist U. Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique for human vitality assessment // Hum Reprod. - 2003. - Vol. 18, No. 4. - P. 813-816]. The viability test using a single eosin solution is simple and quick. Prepare reagents: 1) NaCl, 0.9% (w / v): dissolve 0.9 g of NaCl in 100 ml of distilled water; 2) eosin Y, 0.5% (w / v): dissolve 0.5 g of eosin Y (color index 45380) in 100 ml of 0.9% NaCl. Next, take two 5 µl aliquots of the ejaculate and connect with 5 µl of the eosin solution on the slides, mix with a pipette tip, cover the slides with coverslips and leave for 30 sec. Each glass is examined in an inverted phase-contrast microscope and the number of stained and unstained cells is counted; then calculate the average value and the difference between the percentages of living cells. If the difference between the percentages is unacceptable and does not fall within the 95% confidence interval, then prepare two new drugs and repeat the procedure.

Недостатком этого метода, помимо субъективности, является то, что влажные препараты не подлежат хранению для проведения контроля качества, некоторые коммерчески доступные растворы эозина являются гипотоническими водными растворами, которые негативно влияют на сперматозоиды и дают ложно-положительные результаты.The disadvantage of this method, in addition to subjectivity, is that wet preparations cannot be stored for quality control, some commercially available eosin solutions are hypotonic aqueous solutions that negatively affect spermatozoa and give false-positive results.

Метод 3. Как альтернатива методам с окрашиванием может быть использован тест с гипоосмотическим набуханием (HOS-тест) для определения жизнеспособности сперматозоидов [Jeyendran R.S., Van der Ven H.H., Perez-Pelaez M., Crabo B.G., Zaneveld L.J. Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics // J. Reprod. Fertil. - 1984. - Vol. 70, №1. - P. 219-228]. Данный метод полезен, когда необходимо избежать окрашивания сперматозоидов, например, при отборе сперматозоидов для интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (процедура ИКСИ). Сперматозоиды с интактными мембранами набухают в течение 5 мин в гипоосмотическом растворе, а формы жгутиков стабилизируются к 30 мин [Hossain A.M., Rizk В., Barik S., Huff С., Thorneycroft I.H. Time course of hypo-osmotic swellings of human spermatozoa: evidence of ordered transition between swelling subtypes // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13, №6. - Р. 1578-1583].Method 3. As an alternative to staining methods, a test with hyposmotic swelling (HOS test) can be used to determine the viability of spermatozoa [Jeyendran R.S., Van der Ven H.H., Perez-Pelaez M., Crabo B.G., Zaneveld L.J. There are no further problems with semen characteristics. J. Reprod. Fertil. - 1984. - Vol. 70, №1. - P. 219-228]. This method is useful when it is necessary to avoid staining of spermatozoa, for example, when selecting spermatozoa for intracytoplasmic injection of a spermatozoon into an oocyte (ICSI procedure). Spermatozoa with intact membranes swell for 5 minutes in a hypo-osmotic solution, and flagella forms stabilize by 30 minutes [Hossain A.M., Rizk B., Barik S., Huff S., Thorneycroft I.H. Time course of hypo-osmotic swellings of human spermatozoa: evidence of ordered transition between swelling subtypes // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13, №6. - P. 1578-1583].

Недостатки совпадают с недостатками Метода 2.Disadvantages coincide with the disadvantages of Method 2.

Методы проточной цитометрии для определения уровней жизнеспособности и апоптоза, как и гистохимические методы, основаны на изучении структуры и функционального состояния клеточных мембран. При проведении функциональных тестов используют несколько параметров: оценка митохондриального потенциала, жизнеспособность, статус капацитации и акросомальной реакции. Различия между тестами основаны на свойствах используемых красителей.Methods of flow cytometry to determine the levels of viability and apoptosis, as well as histochemical methods, are based on the study of the structure and functional state of cell membranes. When performing functional tests, several parameters are used: assessment of mitochondrial potential, viability, status of accumulation and acrosomal reaction. The differences between the tests are based on the properties of the dyes used.

Жизнеспособность принято оценивать с помощью липофильных красителей, свободно проникающих через билипидный слой внешних и внутренних клеточных мембран. На основании митохондриального потенциала можно делать выводы о жизнеспособности клетки.Viability is usually evaluated using lipophilic dyes, freely penetrating through the bilipid layer of the outer and inner cell membranes. Based on the mitochondrial potential, conclusions can be drawn about cell viability.

Известны несколько способов оценки мембранного статуса при помощи липофильных красителей и метода проточной цитометрии.There are several methods for assessing membrane status using lipophilic dyes and flow cytometry.

Способ 1. Катионные липофильные красители, к группе которых относится DiOC6(3) в литературе получили название «митохондриальных зондов», так как применяются для изучения мембранного потенциала митохондрий [Cottet-Rousselle С., Ronot X., Leverve X., Mayol J.-F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry Part A. - 2011. - Vol. 79А. - Р. 405-425]. Благодаря своим липофильным свойствам DiOC6(3) способен свободно проникать через билипидные мембраны клетки (поверхностную мембрану клетки, а также внешнюю и внутреннюю мембраны митохондрий) и, благодаря уже катионным свойствам, этот краситель накапливается в областях с высокой концентрацией протонов, то есть под внутренней мембраной митохондрий. Этот эффект сопровождается изменением интенсивности флюоресценции проникшего в клетки красителя в зеленой части спектра, что и регистрируют при анализе на проточном цитофлуориметре [Wlodkowic D., Telford W., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death // Methods Cell Biol. - 2011. - Vol. 103, №1. - Р. 55-98]. В том случае, если концентрация протонов снижена, как это имеет место на начальных этапах апоптоза, краситель будет накапливаться в них менее эффективно, и, как следствие, интенсивность его флюоресценции будет снижена. За счет этого можно отличить живые клетки с эффективно функционирующими митохондриями (и, как следствие, высокой интенсивностью флюоресценции), от гибнущих или мертвых клеток, в которых функционирование митохондрий нарушено. В том случае, если деполяризация митохондрий рассматривается как «раннее» событие при запуске апоптоза, то нарушение целостности поверхностной мембраны (то есть ее фрагментация) обычно характерно для клеток, находящихся на терминальных стадиях гибели. Поэтому для выявления разных стадий апоптоза, помимо DiOC6(3), клетки дополнительно окрашиваются йодистым пропидием (PI) - красителем, способным взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами клеток. PI не способен диффундировать через билипидные мембраны и, как следствие, не способен связаться с ДНК клеток. Однако по мере фрагментации цитоплазматической и ядерной мембран краситель проникает в клетку и взаимодействует РНК и ДНК. Следствием подобного взаимодействия является накопления красителя в цитоплазме и ядре, и клетка обретает флуоресценцию в красной части спектра.Method 1. Cationic lipophilic dyes, to the group of which DiOC6 (3) belongs, are called “mitochondrial probes” in the literature, as they are used to study the membrane potential of mitochondria [Cottet-Rousselle S., Ronot X., Leverve X., Mayol J. -F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry Part A. - 2011. - Vol. 79A. - P. 405-425]. Due to its lipophilic properties, DiOC6 (3) is able to penetrate freely through the cell bilipid membranes (cell surface membrane, as well as the outer and inner mitochondrial membranes) and, due to cationic properties, this dye accumulates in areas with a high concentration of protons, that is, under the inner membrane mitochondria. This effect is accompanied by a change in the fluorescence intensity of the dye penetrated into the cells in the green part of the spectrum, which is recorded in the analysis on a flow cytometer [Wlodkowic D., Telford W., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Apoptosis and // Methods Cell Biol. - 2011. - Vol. 103, No. 1. - P. 55-98]. In the event that the proton concentration is reduced, as is the case in the initial stages of apoptosis, the dye will accumulate in them less effectively, and, as a result, the intensity of its fluorescence will be reduced. Due to this, it is possible to distinguish living cells with efficiently functioning mitochondria (and, as a consequence, high fluorescence intensity), from dying or dead cells, in which the functioning of mitochondria is impaired. In the event that mitochondrial depolarization is considered as an “early” event when apoptosis is triggered, violation of the integrity of the surface membrane (that is, its fragmentation) is usually characteristic of cells that are in terminal stages of death. Therefore, in order to detect different stages of apoptosis, in addition to DiOC6 (3), the cells are additionally stained with propidium iodide (PI), a dye capable of interacting with the nucleic acids of the cells. PI is not able to diffuse through bilipid membranes and, as a result, is not able to bind to the DNA of cells. However, as the cytoplasmic and nuclear membranes are fragmented, the dye penetrates the cell and interacts with RNA and DNA. The result of this interaction is the accumulation of dye in the cytoplasm and nucleus, and the cell acquires fluorescence in the red part of the spectrum.

Таким образом, живые жизнеспособные клетки будут обладать яркой флуоресценций по каналу, предназначенному для детекции DiOC6(3), но не будут накапливать йодистый пропидий (фенотип DiOC6(3)^bright PI^-). Клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза (митохондриальный потенциал снижен, но плазматическая мембрана еще сохраняет свою целостность и непроницаемость для йодистого пропидия), будут иметь фенотип DiOC6(3)^dim-to-neg PI^-. Вместе с тем, клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза или уже погибшие (некроз), не будут эффективно накапливать DiOC6(3), но будут окрашиваться PI - фенотип DiOC₆(3)^dim-to-negPI⁺.Thus, living viable cells will have bright fluorescence through the channel intended for the detection of DiOC6 (3), but will not accumulate propidium iodide (the phenotype DiOC6 (3) ^bright PI ^- ). Cells that are in the early stages of apoptosis (mitochondrial potential is reduced, but the plasma membrane still retains its integrity and impermeability for propidium iodide) will have a DiOC6 (3) ^dim-to-neg PI ^- phenotype. At the same time, cells that are in the late stage of apoptosis or already dead (necrosis) will not effectively accumulate DiOC6 (3), but PI will be stained - DiOC ₆ (3) ^dim-to-neg PI ⁺ phenotype.

Для оценки мембранного потенциала митохондрий к 100 мкл клеточной суспензии (2-3×10⁶ клеток/мл) добавляют 20-кратный рабочий раствор DiOC₆(3) («Invitrogen», США), получая конечную концентрацию красителя равную 20 нМ [9]. Рабочий раствор готовят ex tempere, добавляя к 10 мкл стокового раствора (стоковый - 1 мг красителя, растворенный в 1 мл ДМСО, аликвотировали по 10 мкл и хранили при -20°С до использования) 4900 мкл ЗФР. После внесения красителя образцы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 20 мин при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в защищенном от света месте. По завершении инкубации образцы отмывают избытком ЗФР, содержащим 2% FCS (8 минут при 300g). После этого надосадок декантируют, а клеточный осадок переводят в 100 мкл свежего ЗФР. В полученную клеточную суспензию вносят 10 мкл раствора йодистого пропидия («Sigma-Aldrich», США), получая финальную концентрацию PI, равную 1 мкг/мл. Образцы инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. По завершении инкубации в образцы вносят по 200 мкл ЗФР и проводят цитометричекий учет. Для каждого из образцов анализируют не менее 50000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от агрегатов и в последующем дискриминировать агрегаты из анализа, используют следующие сочетания сигналов по прямому (FS, величина, пропорциональная размеру клеток) и боковому (SS, величина, характеризующая структуру клеток) светорассеянию - интенсивность пикового против интенсивности интегрального сигналов по FS или SS, а также время полета против интенсивности интегрального сигналов FS или SS. Анализ полученных результатов проводят при помощи программного обеспечения Kaluza™ («Beckman Coulter», США). Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании DiOC₆(3) и PI приведены на фиг. 1, где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения DiOC₆(3), усл. ед.; а по оси ординат - интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.To assess the mitochondrial membrane potential, a 20-fold working solution of DiOC ₆ (3) (Invitrogen, USA) is added to 100 µl of cell suspension (2-3 × 10 ⁶ cells / ml), obtaining a final dye concentration of 20 nM [9] . The working solution is prepared ex tempere by adding 10 μl of stock solution (stock - 1 mg of dye dissolved in 1 ml of DMSO, 10 μl aliquoted and stored at -20 ° C until use) for 4900 μl of PBS. After making the dye, the samples are thoroughly mixed and incubated for 20 min at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ in a dark place. At the end of the incubation, the samples are washed with an excess of PBS containing 2% FCS (8 minutes at 300g). After that, the supernatant is decanted, and the cell sediment is transferred to 100 μl of fresh PBS. 10 μl of a propidium iodide solution (Sigma-Aldrich, United States) is added to the resulting cell suspension, obtaining a final PI concentration of 1 μg / ml. Samples are incubated for 10 minutes at room temperature, protected from light. At the end of the incubation, 200 μl of PBS are added to the samples and cytometric counts are performed. For each of the samples, at least 50,000 single cells are analyzed. To distinguish single cells from aggregates and subsequently discriminate aggregates from the analysis, the following combinations of signals are used by direct (FS, a value proportional to cell size) and lateral (SS, the value characterizing the cell structure) to light scattering - peak intensity versus FS intensity or SS, as well as flight time versus intensity of the integrated signals FS or SS. The analysis of the obtained results is carried out using Kaluza ™ software (Beckman Coulter, USA). The results of sperm viability assessment by flow cytometry with staining with DiOC ₆ (3) and PI are shown in FIG. 1, where the luminous intensity of DiOC ₆ (3) is shown along the abscissa axis; unit; and on the ordinate - the intensity of the glow of propidium iodide, usl. units

Способ 2. Спектр исследований, равно как и набор модельных объектов, для которых применялись красители группы SYTO, крайне широк. Об универсальности SYTO свидетельствует тот факт, что вещества данного семейства успешно зарекомендовали себя при работе не только с клетками и культурами клеток млекопитающих, но и с бактериями различного происхождения [Guindulain Т., Comas J., Vives-Rego J. Use of nucleic acid dyes SYTO-13, TOTO-1, and YOYO-1 in the study of Escherichia coli and marine prokaryotic populations by flow cytometry // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, №11. - P. 4608-4611], а также клетками и отдельными органеллами растений [Rowan В.А., Oldenburg D.J., Bendich A.J. A high-throughput method for detection of DNA in chloroplasts using flow cytometry // Plant. Methods. - 2007. - Vol. 3:5, http://www.plantmethods.com/content/3/1/5].Method 2. The spectrum of research, as well as the set of model objects for which the dyes of the SYTO group were used, are extremely wide. The universality of SYTO is evidenced by the fact that substances of this family have successfully proven themselves to work not only with mammalian cells and cultures, but also with bacteria of different origin [Guindulain T., Comas J., Vives-Rego J. Use of nucleic acid dyes SYTO-13, TOTO-1, and YOYO-1 in the study of Escherichia coli and marine cytometry // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, No. 11. - P. 4608-4611], as well as plant cells and individual organelles [Rowan, VA, Oldenburg, D.J., Bendich A.J. A high-throughput flow cytometry method // Plant. Methods. - 2007. - Vol. 3: 5, http://www.plantmethods.com/content/3/1/5].

Отличительной чертой красителей семейства SYTO является их способность спонтанно проникать через клеточные билипидные мембраны и связываться с нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК) в цитоплазме, ядре и митохондриях клетки. Такого рода взаимодействие сопровождается многократным (по некоторым оценкам, до 40 раз) увеличением флуоресценции, тогда как в растворе - в отсутствие связывания с лигандами - флуоресценция данных красителей крайне низка. Подобно большинству флуоресцентных красителей цианиновой группы, молекулы SYTO несут несколько участков, которые могут связываться с фосфатными группировками в составе нуклеиновых кислот, а также интеркалировать между нуклеотидами и встраиваться между бороздками двуцепочечной ДНК. Существенным преимуществом данных красителей является отсутствие выраженного токсического эффекта, что было доказано в экспериментах по длительной инкубации (до 72 ч) клеток с данными красителями [Wlodkowic D., Skommer J., Pelkonen J. Towards an understanding of apoptosis detection by SYTO dyes // Cytometry A. - 2007. - Vol. 71, №2. - Р. 61-72]. В настоящее время точные механизмы взаимодействия красителей SYTO с нуклеиновыми кислотами детально не изучены [Wlodkowic D., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances // Exp. Oncol. - 2012. - Vol. 34, №3. - Р. 255-262]. Но уже первый опыт применения SYTO в проточной цитометрии показал, что эффективность взаимодействия красителя с клетками, находящихся на разных стадиях апоптоза, заметно снижается при сравнении с окраской нормальных живых клеток. Живые клетки обычно характеризуются ярким свечением по SYTO (SYTO^bright), тогда как гибнущие клетки будут SYTO^dim. Поэтому большая часть гипотез касается именно данного аспекта применения красителей SYTO. Так, считается, что описанный эффект может быть вызван взаимным «гашением» молекул SYTO, связанных с ДНК, в результате их пространственного сближения в ходе конденсации хроматина ядра клетки, что имеет место при апоптозе. Вместе с тем, снижение флуоресценции SYTO в погибающих клетках также может быть вызвано резким уменьшением количества сайтов связывания красителя при конденсации хроматина, равно как и падением концентрации РНК в цитоплазме клетки в результате нарушения процессов транскрипции в ядре. Кроме того, при апоптозе нарушается нормальная работа митохондрий, в которых запускаются процессы деградации митохондриальной ДНК, что также сопровождается снижением числа сайтов связывания красителя и сопровождается общим снижением флуоресценции клетки. Нарушение мембранного потенциала митохондрий также может снижать эффективность накопления красителя клеткой. В последнем случае это объясняется наличием в составе всех представителей данной группы красителей положительно-заряженных группировок, определяющих общий положительный заряд молекул при нейтральных рН. Подобное наблюдение, по мнению Wlodkowic и соавторов [Wlodkowic D., Skommer J., Darzynkiewicz Z. SYTO probes in the cytometry of tumor cell death // Cytometry A. - 2008. - Vol. 73, №6. - P. 496-507], позволяет проводить аналогии между механизмом действия липофильных катионных митохондриальных «зондов» (например, JC-1 и TMRM) и красителей SYTO.A distinctive feature of the dyes of the SYTO family is their ability to spontaneously penetrate cell bilipid membranes and bind to nucleic acids (DNA and RNA) in the cytoplasm, nucleus and mitochondria of the cell. This kind of interaction is accompanied by a multiple (by some estimates, up to 40 times) increase in fluorescence, whereas in solution — in the absence of binding to ligands — the fluorescence of these dyes is extremely low. Like most cyanine fluorescent dyes, SYTO molecules carry several sites that can bind to phosphate groups of nucleic acids, as well as intercalate between nucleotides and integrate between the double-stranded DNA grooves. A significant advantage of these dyes is the absence of a pronounced toxic effect, which was proved in experiments on long-term incubation (up to 72 hours) of cells with these dyes [Wlodkowic D., Skommer J., Pelkonen J. Cytometry A. - 2007. - Vol. 71, No. 2. - P. 61-72]. At present, the exact mechanisms of interaction of SYTO dyes with nucleic acids have not been studied in detail [Wlodkowic D., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances // Exp. Oncol. - 2012. - Vol. 34, No. 3. - P. 255-262]. But already the first experience of using SYTO in flow cytometry showed that the effectiveness of the interaction of the dye with cells at different stages of apoptosis decreases markedly when compared with the staining of normal living cells. Living cells are usually characterized by a bright glow on SYTO (SYTO ^bright ), whereas dying cells will be SYTO ^dim . Therefore, most of the hypotheses concern precisely this aspect of the use of SYTO dyes. So, it is believed that the described effect can be caused by the mutual “quenching” of SYTO molecules associated with DNA as a result of their spatial convergence during the condensation of the chromatin of the cell nucleus, which occurs during apoptosis. At the same time, a decrease in the fluorescence of SYTO in dying cells can also be caused by a sharp decrease in the number of dye binding sites during chromatin condensation, as well as a decrease in the RNA concentration in the cytoplasm of the cell as a result of disruption of transcription processes in the nucleus. In addition, apoptosis disrupts the normal functioning of mitochondria, in which the processes of mitochondrial DNA degradation are triggered, which is also accompanied by a decrease in the number of dye binding sites and is accompanied by a general decrease in cell fluorescence. Violation of the mitochondrial membrane potential can also reduce the efficiency of dye accumulation by the cell. In the latter case, this is explained by the presence of positively charged groups in all members of this group of dyes, which determine the total positive charge of molecules at neutral pH. Such an observation, according to Wlodkowic and co-authors [Wlodkowic D., Skommer J., Darzynkiewicz Z. SYTO probes in cytometry of tumor cell death // Cytometry A. - 2008. - Vol. 73, No. 6. - P. 496-507], allows to draw analogies between the mechanism of action of lipophilic cationic mitochondrial “probes” (for example, JC-1 and TMRM) and SYTO dyes.

Подобные феномены были описаны при комбинированной окраски клеток SYTO16 и TMRM, когда апоптотизирующие клетки слабо окрашивались обоими красителями, а живые клетки обладали выраженной флуоресценцией по каналам, предназначенным для детекции этих красителей.Similar phenomena were described in the combination of staining of SYTO16 and TMRM cells, when apoptotic cells were weakly stained with both dyes, and living cells had pronounced fluorescence through the channels intended for the detection of these dyes.

Окраску клеток проводили в пробирках для проведения цитометрического учета 12×75 мм («Beckman Coulter», США). Для этого к 100 мкл клеточной суспензии (2-3×10⁶ кл/мл) добавляли по 5 мкл 20-кратного рабочего раствора SYTO-16 green («Invitrogen», США), получая конечную концентрацию красителя равную 125 нМ. Рабочий раствор готовили ex tempere, добавляя к 5 мкл стокового раствора 1995 мкл ЗФР (стоковый - 1 мМ ДМСО, аликвотировали по 5 мкл и хранили при -20°С до использования). После чего в образцы вносили по 10 мкл раствора йодистого пропидия («Sigma-Aldrich», США), получая финальную концентрацию PI равную 1 мкг/мл. Окраску проводили при комнатной температуре в течение 15 мин в защищенном от света месте. По завершении инкубации к образцам добавляли по 200 мкл ЗФР и анализировали на проточном цитофлуориметре Navios™ («Beckman Coulter», США). Для каждого из образцов анализировали не менее 50000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от агрегатов и в последующем дискриминировать агрегаты из анализа, использовали следующие сочетания сигналов по FS/SS, а также время полета против интенсивности интегрального сигналов FS или SS. Анализ полученных результатов проводили при помощи программного обеспечения Kaluza™ («Beckman Coulter», США).The cells were stained in test tubes for 12 × 75 mm cytometric counting (Beckman Coulter, United States). To this end, 5 μl of a 20-fold SYTO-16 green working solution (Invitrogen, USA) was added to 100 μl of the cell suspension (2-3 × 10 ⁶ cells / ml) to obtain a final dye concentration of 125 nM. The working solution was prepared ex tempere by adding 1995 μl of PBS to stock 5 μl of stock solution (stock - 1 mM DMSO, 5 μl aliquoted and stored at -20 ° C until use). After that, 10 μl of propidium iodide solution (Sigma-Aldrich, United States) was added to the samples to obtain a final PI concentration of 1 μg / ml. Coloring was carried out at room temperature for 15 minutes in a dark place. At the end of the incubation, 200 μl of PBS were added to the samples and analyzed on a Navios ™ flow cytometer (Beckman Coulter, United States). For each of the samples, at least 50,000 single cells were analyzed. To distinguish single cells from aggregates and subsequently discriminate the aggregates from the analysis, the following combinations of FS / SS signals were used, as well as flight time versus the intensity of the integrated FS or SS signals. The analysis of the obtained results was performed using Kaluza ™ software (Beckman Coulter, USA).

Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании SYTO-16 Green и PI приведены на фиг. 2., где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения SYTO-16 Green, усл. ед.; по оси ординат: интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.The results of sperm cell viability assessment by flow cytometry with SYTO-16 Green and PI staining are shown in FIG. 2., where the intensity of luminescence of SYTO-16 Green is shown on the abscissa axis; unit; ordinate: intensity of luminescence of propidium iodide, cf. units

Способ 3 основан на применении родамина-123 (Rh123), который был самым первым флуоресцентным красителем, примененным для окрашивания митохондрий и оценки жизнеспособности клеток [Johnson L.V., Walsh M.L., Chen, L.B. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123 // PNAS. - 1980. - Vol. 77, №2. - Р. 990-994]. Благодаря своим липофильным свойствам Rh123 спонтанно диффундирует через плазматическую мембрану клетки, а наличие катионных свойств помогает ему преимущественно накапливаться в эффективно функционирующих митохондриях клетки, несущих отрицательный заряд на своей внутренней мембране. Вместе с тем, данный краситель может спонтанно окрашивать компоненты эндоплазматической сети и аппарата Гольджи, однако снизить неспецифическое окрашивание позволяет отмывка избытком физиологического раствора по завершении инкубации красителя с клетками. Это связано с тем, что в клетках с нарушенным мембранным потенциалом митохондрий краситель способен с одинаковой скоростью как проникать через мембрану внутрь, так и выходить наружу. Для эффективного возбуждения Rh123 используют источники света с длиной волны около 500 нм, тогда как максимум испускания данного красителя находится в районе 529 нм [Cottet-Rousselle С., Ronot X., Leverve X., Mayol J.-F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry Part A. - 2011. - Vol. 79A. - Р. 405-425]. Обычно Rh123 применяется в концентрациях не более 0,5 мкМ или 0,1 мкг/мл, так как увеличение концентрации сопровождается усилением неспецифического окрашивания. Для приготовления маточных (стоковых) растворов используют ДМСО, после чего аликвотируют и хранят при -20°С до использования. Рабочие растворы готовят на среде, аналогичной той, которую применяют для культивирования клеток. Для исследования апоптоза применяют комбинированную окраску родамином 123, обладающим выраженной флуоресценцией в зеленой части спектра, и йодистым пропидием, максимум эмиссии которого приходится на красную часть спектра. Подобный подход позволяет выделить живые клетки функционирующими митохондриями по свечению Rh123 и целостной поверхностной мембраной, непроницаемой для PI. Клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза, будут негативны по обоим красителям (мембранный потенциал митохондрий нарушен, но поверхностная мембрана еще сохраняет свою целостность), а при позднем апоптозе и некрозе клетки будут окрашиваться только йодистым пропидием.Method 3 is based on the use of rhodamine-123 (Rh123), which was the very first fluorescent dye used to stain mitochondria and assess cell viability [Johnson L.V., Walsh M.L., Chen, L.B. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123 // PNAS. - 1980. - Vol. 77, No. 2. - P. 990-994]. Due to its lipophilic properties, Rh123 spontaneously diffuses through the plasma membrane of the cell, and the presence of cationic properties helps it to accumulate primarily in effectively functioning cell mitochondria, which carry a negative charge on their inner membrane. At the same time, this dye can spontaneously stain the components of the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus, however, it is possible to reduce non-specific staining by washing with an excess of saline solution after the incubation of the dye with cells. This is due to the fact that in cells with an impaired mitochondrial membrane potential, the dye can both penetrate through the membrane and out. For effective excitation of Rh123, light sources with a wavelength of about 500 nm are used, while the maximum emission of this dye is in the region of 529 nm [Cottet-Rousselle S., Ronot X., Leverve X., Mayol J.-F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry Part A. - 2011. - Vol. 79A. - P. 405-425]. Rh123 is usually used in concentrations of no more than 0.5 μM or 0.1 μg / ml, since an increase in concentration is accompanied by an increase in non-specific staining. For the preparation of stock (stock) solutions, DMSO is used, after which they are aliquoted and stored at -20 ° C until use. Working solutions are prepared in an environment similar to that used for cell culture. For the study of apoptosis, a combined color is used with rhodamine 123, which has a pronounced fluorescence in the green part of the spectrum, and propidium iodide, the maximum emission of which falls on the red part of the spectrum. Such an approach makes it possible to isolate living cells by functioning mitochondria by the luminescence of Rh123 and an integral surface membrane impermeable to PI. Cells that are in the early stages of apoptosis will be negative for both dyes (the mitochondrial membrane potential is broken, but the surface membrane still retains its integrity), and in late apoptosis and necrosis, the cells will be stained only with propidium iodide.

В рамках проведения собственных экспериментов к 100 мкл клеточной суспензии добавляли 20-кратный раствор Rh123, приготовленный ex tempere, получая конечную концентрацию красителя 100 мкг/мл. Образцы инкубировали 20 мин при 37°С в защищенном от света месте, после чего однократно отмывали избытком ЗФР, содержащим 2% FCS (330g в течении 8 мин при 15°С). Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл свежего ЗФР, после чего вносили йодистый пропидий в финальной концентрации 1 мкг/мл. По завершении 5-ти минутной инкубации в каждую пробу добавляли по 250 мкл ЗФР, и образцы анализировали на проточном цитометре Navios™. Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании Rh123и PI приведены на фиг. 3., где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения Rh123, усл. ед.; по оси ординат: интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.As part of our own experiments, a 20-fold ex Rx123 solution prepared ex tempere was added to 100 μl of the cell suspension, obtaining a final dye concentration of 100 μg / ml. Samples were incubated for 20 minutes at 37 ° C in a dark place, then washed once with excess PBS containing 2% FCS (330g for 8 minutes at 15 ° C). The resulting cell pellet was resuspended in 100 μl of fresh SFR, and then propidium iodide was added at a final concentration of 1 μg / ml. After 5 minutes of incubation, 250 μl of PBS was added to each sample, and the samples were analyzed on a Navios ™ flow cytometer. The results of sperm viability assessment by flow cytometry with Rh123 and PI staining are shown in FIG. 3., where the x-axis shows the intensity of the glow of Rh123, sr. unit; ordinate: intensity of luminescence of propidium iodide, cf. units

Однако вышеописанные способы, применяемые в настоящее время, субъективны при оценке препарата и трудоемки в случаях низкой концентрации сперматозоидов в нативном образце или при выявлении счетной ошибки, особенно при проведении массовых тестов. Кроме того при проведении контроля качества, они обладают низкой воспроизводимостью результатов а также приводят к возникновению ложноположительных результатов.However, the above-described methods currently used are subjective in evaluating the drug and are laborious in cases of low sperm concentration in the native sample or in detecting a counting error, especially when conducting mass tests. In addition, when conducting quality control, they have low reproducibility of results and also lead to false positive results.

Задачей, поставленной перед изобретением, является повышение объективности оценки жизнеспособности сперматозоидов, повышение точности интерпретации результатов исследования, а также сокращение времени, затрачиваемого на обработку образцов за счет проведения автоматизированного учета результатов, в том числе при массовых исследованиях.The task of the invention is to increase the objectivity of assessing the viability of sperm, improving the accuracy of interpretation of research results, as well as reducing the time spent on sample processing by conducting an automated record of the results, including in mass studies.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе определения жизнеспособности сперматозоидов используется сочетание методов лектиногистохимии и проточной цитометрии.This goal is achieved by the fact that in the proposed method of determining the viability of sperm is used a combination of methods of lectin histochemistry and flow cytometry.

Лектиногистохимия основана на использовании лектинов - в основном растительных углевод-связывающих белков с заданной лигандной специфичностью. Если метод иммуногистохимии основан на использовании антител, специфичных в основном к различным белковым детерминантам, то лектиногистохимия позволяет выявлять локализацию, изменения состава и плотности различных олиго- и полисахаридных структур. Важно, что процесс апоптоза сопровождается изменениями в составе полисахаридных структур гликокаликса животных клеток за счет утраты верхних слоев гликокаликса и демаскирования структур его нижних слоев, содержащих α-D-маннозу, что совпадает с изменениями проницаемости плазматической мембраны и может рассматриваться как один из ранних признаков апоптоза [Bilyy R.О., Antonyuk V.О., Stoika R.S. Cytochemical study of role of α-D-mannose-and β-B-galactose-containing glycoproteins in apoptosis // J. Mol. Hist. - 2004. - Vol. 35. №.8-9. - P. 829-838]. В качестве красителя используется лектин нарцисса ложного (Narcissus pseudonarcissus L., NPA), специфичный к α-D-маннозе, меченный FITC.Lectinohistochemistry is based on the use of lectins - mainly vegetable carbohydrate-binding proteins with a given ligand specificity. If the method of immunohistochemistry is based on the use of antibodies specific mainly to different protein determinants, then lectinhistochemistry allows identification of localization, changes in the composition and density of various oligo-and polysaccharide structures. It is important that the process of apoptosis is accompanied by changes in the composition of the polysaccharide glycocalyx structures of animal cells due to the loss of the upper layers of the glycocalyx and unmasking of the structures of its lower layers containing α-D-mannose, which coincides with changes in the plasma membrane permeability and can be considered as one of the early signs of apoptosis [Bilyy R.O., Antonyuk V.O., Stoika RS Cytochemical study of the α-D-mannose-and β-B-galactose-containing glycoproteins in apoptosis // J. Mol. Hist. - 2004. - Vol. 35. №.8-9. - P. 829-838]. The dye used is a false narcissus lectin (Narcissus pseudonarcissus L., NPA), specific to α-D-mannose, labeled with FITC.

Гликолипиды, входящие в состав клеточной мембраны условно принято называть стабилизирующими. Они оказывают двоякое действие на лабильность клеточных мембран. Дестабилизирующее воздействие оказывается за счет более длинных остатков норвоновой и цереброновой кислот. Одновременно с этим наличие холестерина между липидами снижает активность перемещения липидов, чем обуславливается его стабилизирующее воздействие на клеточные мембраны. Мембрана сперматозоидов, подобно внутриклеточным мембранам, содержит небольшое количество гликолипидов. Большая доля фосфолипидов и сфинголипидов обеспечивает большую текучесть мембраны и увеличивает склонность таких мембран к разрыву, что является, с одной стороны, необходимым компонентом успешного проникновения сперматозоида в яйцеклетку, а с другой - потенциальной точкой повреждения при криоконсервации.Glycolipids that make up the cell membrane are conventionally called stabilizing. They have a dual effect on the lability of cell membranes. The destabilizing effect is due to the longer residues of norvic and cerebronic acids. At the same time, the presence of cholesterol between lipids reduces the activity of lipid movement, which causes its stabilizing effect on cell membranes. The sperm membrane, like the intracellular membranes, contains a small amount of glycolipids. A large proportion of phospholipids and sphingolipids provides greater membrane fluidity and increases the tendency of such membranes to rupture, which is, on the one hand, a necessary component of successful penetration of the sperm cell into the egg cell, and on the other hand, a potential point of damage during cryopreservation.

На высокой лабильности и, как следствие, высокой проницаемости/способности к диффузии мембраны сперматозоидов основаны методы окрашивания сперматозоидов при помощи липофильных красителей, в том числе для анализа при помощи проточной цитометрии. Однако сперматозоид не относится к клеткам с высоким метаболизмом, и выявление клеток с запущенным процессом апоптоза до разрушения мембраны сперматозоида представляется затруднительным.High lability and, as a consequence, high permeability / diffusivity of the sperm membrane are based on methods for staining sperm using lipophilic dyes, including analysis using flow cytometry. However, the sperm cell does not belong to cells with a high metabolism, and the identification of cells with advanced apoptosis process before the destruction of the sperm cell membrane is difficult.

Одним из первых событий запуска апоптоза и снижения жизнеспособности является потеря гликопротеинами и гликолипидами сиаловых кислот, которые в норме экранируют остатки α-D-маннозы, локализованные в перимембранной зоне. Десиализация гликолипидов и гликопротеинов открывает возможность взаимодействия с NK-клетками. Данное свойство клеточных мембран позволяет предположить, что красители, связывающиеся с углеводными остатками, позволяют выявлять клетки на более ранних этапах апоптоза по сравнению с липофильными красителями и обеспечивать наиболее достоверные результаты.One of the first events of the start of apoptosis and decrease in viability is the loss of glycoproteins and glycolipids of sialic acids, which normally shield α-D-mannose residues localized in the perimembrane zone. Desialization of glycolipids and glycoproteins opens up the possibility of interaction with NK cells. This property of cell membranes suggests that dyes that bind to carbohydrate residues allow cells to be detected at earlier stages of apoptosis compared to lipophilic dyes and provide the most reliable results.

Лектины - это белки, обладающие свойством связывать углеводы, при этом такое связывание является высокоспецифичным. Это свойство обусловливает их активное использование в области лектиногистохимии для определения углеводных детерминант на поверхности клеточных мембран. Кроме того, лектины, конъюгированные с биотином и различными флуорохромами, находят свое применение и в проточной цитометрии. В частности, некоторые лектины применяли для определения экспрессии различных углеводных детерминант на плазматической мембране на разных стадиях апоптоза [Batisse Ch., Marquet J., Greffard A., Fleury-Feith J., Jaurand M.-C., Pilatte Y. Lectin-Based Three-Color Flow Cytometric Approach for Studying Cell Surface Glycosylation Changes That Occur During Apoptosis // Cytometry Part A. - 2004. - Vol. 62A. - Р. 81-88]. Изменение гликозилирования плазматической мембраны сопровождает различные процессы, протекающие в клетке, такие как дифференцировка, активация и запуск апоптоза. Подобные изменения могут быть выявлены при помощи лектинов разной углеводной специфичности. В литературе имеются данные об изменении связывания различных лектинов с тимоцитами разной степени зрелости, а также клетками, находящимися на разных стадиях апоптоза [London J., Berrih S., Bach J.F. Peanut agglutinin I. A new tool for studying T lymphocyte subpopulations // J. Immun. - 1978. - Vol. 121, №. 2. - P. 438-443,; Raedler A., Raedler E., Becker W. M., Arndt R., Thiele H.G. Subcapsular thymic lymphoblasts expose receptors for soy bean lectin // Immunology. - 1982. - Vol. 46, №.2. - P. 321-328].Lectins are proteins that have the ability to bind carbohydrates, while this binding is highly specific. This property determines their active use in the field of lectinohistochemistry for the determination of carbohydrate determinants on the surface of cell membranes. In addition, lectins conjugated with biotin and various fluorochromes are also used in flow cytometry. In particular, some lectins were used to determine the expression of various carbohydrate determinants on the plasma membrane at different stages of apoptosis [Batisse Ch., Marquet J., Greffard A., Fleury-Feith J., Jaurand M.-C., Pilatte Y. Lectin- Cyclometry Part A. - 2004. - Vol. 62A. - P. 81-88]. The change in plasma membrane glycosylation accompanies various processes that take place in the cell, such as differentiation, activation, and activation of apoptosis. Such changes can be detected using lectins of different carbohydrate specificity. In the literature, there is evidence of changes in the binding of various lectins to thymocytes of different degrees of maturity, as well as cells in different stages of apoptosis [London J., Berrih S., Bach J.F. Peanut agglutinin I. A new tool for studying T lymphocyte subpopulations // J. Immun. - 1978. - Vol. 121, no. 2. - P. 438-443; Raedler A., Raedler E., Becker W.M., Arndt R., Thiele H.G. Subcapsular thymic lymphoblasts expose receptors for soybeans lectin // Immunology. - 1982. - Vol. 46, №.2. - P. 321-328].

Известны функциональные тесты с применением лектинов для определения акросомального и, как следствие, фертильного статуса сперматозоида, например, с применением высокоспецифичного лектина арахиса (peanut agglutinin, PNA). Метод основан на особенностях строения мембраны сперматозоида в акросомальной области. При капацитации происходят изменения гликоконъюгантов клеточной мембраны сперматозоида. Это выражается в изменении соотношения холестерина и фосфолипидов мембраны. Молекулы сывороточного альбумина в женском репродуктивном тракте способны отнимать холестерин у сперматозоида, что дестабилизирует мембрану на участке акросомного пузырька, что является необходимым условием слияния мембран при акросомальной реакции. На поверхности сперматозоида, не прошедшего капацитацию, находятся углеводы, которые препятствуют его прикреплению к яйцеклетке. Эти углеводы представляют собой полимер из повторяющихся остатков галактозы и N-ацетилглюкозамина, которые блокируют рецепторы сперматозоида, узнающие прозрачную оболочку (zona pellucida) ооцита. Рецепторами сперматозоида являются молекулы фермента N-ацетилглюкозамингалактозилтрансферазы (гликозилтрансферазы).Functional tests are known using lectins to determine the acrosomal and, as a result, the fertile status of the spermatozoon, for example, using the highly specific peanut lectin (peanut agglutinin, PNA). The method is based on the structural features of the sperm cell membrane in the acrosomal region. During the captation, changes in the sperm cell membrane glycoconjugants occur. This is reflected in a change in the ratio of cholesterol and phospholipid membrane. Molecules of serum albumin in the female reproductive tract are capable of taking cholesterol from the spermatozoon, which destabilizes the membrane at the site of the acrosomal vesicle, which is a necessary condition for the fusion of membranes during an acrosomal reaction. On the surface of the spermatozoid, which has not been condensed, there are carbohydrates that prevent its attachment to the egg cell. These carbohydrates are a polymer of repetitive galactose and N-acetylglucosamine residues that block sperm receptors that recognize the transparent membrane (zona pellucida) of the oocyte. Sperm receptors are molecules of the enzyme N-acetylglucosaming lactosyltransferase (glycosyltransferase).

Молекулы гликозилтрансферазы встроены в плазматическую мембраны сперматозоида непосредственно над акросомой, причем их активные центры обращены наружу. Гликозилтрансфераза «узнает» N-ацетилглюкозаминовые остатки гликопротеинов прозрачной оболочки (гликопротеин ZP3). При капацитации блокировавшие ее углеводы убираются.Glycosyltransferase molecules are embedded in the plasma membrane of the sperm just above the acrosome, with their active centers facing outwards. Glycosyltransferase “recognizes” the N-acetylglucosamine residues of the transparent membrane glycoproteins (glycoprotein ZP3). In the event of a condensation, the carbohydrates that blocked it are removed.

При использовании в качестве красителя лектина PNA специфичное связывание с углеводными остатками акросомальной области мембраны не позволяет определить общий фертильный статус сперматозоида и его жизнеспособность, а также сделать выводы о криорезистентности.When using PNA lectin as a dye, specific binding to the carbohydrate residues of the acrosomal membrane region does not allow one to determine the general fertile status of the sperm cell and its viability, as well as to draw conclusions about cryoresistance.

Для преодоления этого недостатка в заявленном способе в качестве красителя мы применили лектин нарцисса ложного (Narcissus pseudonarcissus L., NPA), меченный флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) специфично связывающийся с остатками α-D-маннозы.To overcome this drawback in the claimed method, as a dye, we used the lectifin of a false narcissus (Narcissus pseudonarcissus L., NPA) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) specifically binding to α-D-mannose residues.

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

Для оценки уровня апоптоза 100 мкл суспензии клеток, полученной описанным выше способом, переносят в пробирки для цитофлуориметрического учета. Далее в образцы добавляют по 10 мкл раствора NPA, специфически распознающего терминальные остатки α-D-маннозы, конъюгированного с FITC, в финальной концентрации 5 мкг/мл. После внесения реагентов клетки инкубируют 20 мин при 37°С в защищенном от света месте. По завершении инкубации для удаления из суспензии избытка красителя и подавления неспецифического связывания клетки отмывают избытком забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР, рН 7,2-7,4) с добавлением 2% FCS путем центрифугирования при 330g в течение 8 мин при охлаждении до 15°С. Полученный осадок ресуспендируют в 100 мкл ЗФР и к суспензии добавляют 10 мкл раствора йодистого пропидия (PI, финальная концентрация 1 мкг/мл) для выявления клеток, утративших целостность поверхностной мембраны. Пробы инкубируют в течение 5 мин в защищенном от света месте при комнатной температуре, после чего в каждую пробу добавляют по 250 мкл ЗФР, и образцы анализируют на проточном цитометре Navios™ способом, аналогичным для липофильных красителей.To assess the level of apoptosis, 100 μl of the cell suspension obtained by the method described above is transferred to test tubes for cytofluorimetric registration. Next, 10 μl NPA solution, specifically recognizing the terminal residues of α-D-mannose conjugated with FITC, at a final concentration of 5 μg / ml is added to the samples. After making the reagents, the cells are incubated for 20 minutes at 37 ° C in a dark place. At the end of the incubation to remove excess dye from the suspension and suppress non-specific binding, the cells are washed with an excess of phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2-7.4) with 2% FCS added by centrifuging at 330g for 8 minutes while cooling to 15 ° WITH. The resulting pellet is resuspended in 100 μl of PBS and 10 μl of propidium iodide solution (PI, final concentration 1 μg / ml) is added to the suspension to identify cells that have lost the integrity of the surface membrane. Samples are incubated for 5 min in the dark place at room temperature, after which 250 μl of PBS are added to each sample, and the samples are analyzed on a Navios ™ flow cytometer in the same way as for lipophilic dyes.

Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании NPA-FITC и PI приведены на фиг. 4, где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения NPA-FITC, усл. ед.; по оси ординат: интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.The results of assessing the viability of spermatozoa by flow cytometry with NPA-FITC and PI staining are shown in FIG. 4, where the NPA-FITC luminescence intensity is shown on the abscissa axis, arb. unit; ordinate: intensity of luminescence of propidium iodide, cf. units

Сопоставление результатов применения четырех описанных выше способов было проведено на материале 54 пациентов, сперматозоиды которых были подвергнуты криоконсервации с использованием четырех сред для консервации клеток ("MediCult", "Sage", "Irvine", "Vitrolife", все США).Comparison of the results of applying the four methods described above was carried out on the material of 54 patients whose spermatozoa were cryoconserved using four cell preservation media (MediCult, Sage, Irvine, Vitrolife, all of the USA).

На фиг. 5. представлены результаты оценки жизнеспособности нативного и криоконсервированного материала с использованием проточной цитометрии и различных красителей, где по оси абсцисс: красители, использованные для оценки уровня жизнеспособности сперматозоидов (DIOC - красители DiOC6(3), SYTO - краситель SYTO-16 Green, RHO - краситель Родамин 123, NPA - лектин нарцисса, меченный FITC). Во всех случаях также использовали йодистый пропидий. По оси ординат: процент живых клеток.FIG. 5. presents the results of assessing the viability of native and cryopreserved material using flow cytometry and various dyes, where on the abscissa axis: dyes used to assess the level of viability of sperm (DIOC - dyes DiOC6 (3), SYTO - dye SYTO-16 Green, RHO - Rhodamine 123 dye, NPA - narcissus lectin labeled with FITC). In all cases, propidium iodide was also used. Y-axis: percentage of living cells.

В поле фиг. 5 для каждого вида красителей показана группа столбиков, соответствующих разным консервирующим средам (("MediCult", "Sage", "Irvine", "Vitrolife"), в сравнении с нативным образцом.In the field of FIG. 5 for each type of dyes is shown a group of columns corresponding to different preservative media (("MediCult", "Sage", "Irvine", "Vitrolife") in comparison with the native sample.

Для доказательства более высокой эффективности применения лектина NPA, меченного FITC, было проведено сравнительное исследование с использованием способов 1, 2, 3 и заявленного метода. Указанный способ применяли у 54 супружеских пар, обратившихся по поводу бесплодия.To prove the higher efficiency of the application of NPA lectin labeled with FITC, a comparative study was conducted using methods 1, 2, 3 and the claimed method. This method was used in 54 married couples who applied for infertility.

Клинический пример 1. Супружеская пара Т. Обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 69%. Процент оплодотворения составил 83%, через 10 дней получен положительный результат ХГЧ (наличие хорионического гонадотропина человека, появление которого рассматривается как ранний признак наступления беременности), на 21 день на контрольном УЗИ визуализировано 1 плодное яйцо.Clinical example 1. A married couple T. Turned on an outpatient basis for infertility. The treatment method of in vitro fertilization. At the time of fertilization, the percentage of viable forms of spermatozoa using the claimed method was 69%. The percentage of fertilization was 83%, after 10 days, a positive result of hCG (the presence of human chorionic gonadotropin, the appearance of which is considered as an early sign of pregnancy) was obtained. On day 21, 1 fertilized egg was visualized on the control ultrasound.

Клинический пример 2. Супружеская пара Ч. обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 16%. Процент оплодотворения составил 50%, через 10 дней получен отрицательный результат ХГЧ.Clinical example 2. The married couple C. turned in an outpatient procedure for infertility. The treatment method of in vitro fertilization. At the time of fertilization, the percentage of viable forms of spermatozoa using the claimed method was 16%. The percentage of fertilization was 50%, after 10 days a negative result of hCG was obtained.

Клинический пример 3. Супружеская пара Л. Обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 50%. Процент оплодотворения составил 67%, через 10 дней получен положительный результат ХГЧ, на 21 день на контрольном УЗИ визуализировано 1 плодное яйцо.Clinical example 3. Married couple L. Appealed on an outpatient basis for infertility. The treatment method of in vitro fertilization. At the time of fertilization, the percentage of viable forms of spermatozoa using the claimed method was 50%. The percentage of fertilization was 67%, after 10 days a positive result of hCG was obtained; on day 21, 1 fertilized egg was visualized on the control ultrasound.

Клинический пример 4. Супружеская пара П. обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 16%. Процент оплодотворения составил 88%, через 10 дней получен отрицательный результат ХГЧ.Clinical example 4. A married couple P. turned on an outpatient basis for infertility. The treatment method of in vitro fertilization. At the time of fertilization, the percentage of viable forms of spermatozoa using the claimed method was 16%. The percentage of fertilization was 88%, after 10 days a negative result of hCG was obtained.

Клинический пример 5. Супружеская пара Г. обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 74%. Процент оплодотворения составил 100%, через 10 дней получен положительный результат ХГЧ, на 21 день на контрольном УЗИ визуализировано 1 плодное яйцо.Clinical example 5. The married couple G. turned on an outpatient basis for infertility. The treatment method of in vitro fertilization. At the time of fertilization, the percentage of viable forms of spermatozoa using the claimed method was 74%. The percentage of fertilization was 100%, after 10 days a positive result of hCG was obtained; on day 21, 1 fertilized egg was visualized on the control ultrasound.

Клинический пример 6. Супружеская пара С. Обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 39%. Процент оплодотворения составил 50%, через 10 дней получен отрицательный результат ХГЧ.Clinical example 6. Married couple C. Appealed on an outpatient basis for infertility. The treatment method of in vitro fertilization. At the time of fertilization, the percentage of viable forms of spermatozoa using the claimed method was 39%. The percentage of fertilization was 50%, after 10 days a negative result of hCG was obtained.

Материалы исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа в соответствии с результатами проверки сравниваемых совокупностей на нормальность распределения [Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ., М: Практика 1999; 459 с.; Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Прикладная медицинская статистика. М.: Фолиант, 2006. - 432 с.; Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине: М.: ГэотарМед, 2003. - 139 с.; Плавинский С.Л. Биостатистика: планирование, обработка и представление результатов биомедицинских исследований при помощи системы SAS: Санкт-Петербург: Издат. дом СПбМАПО, 2005. - 559 с.]. Накопление, корректировку, систематизацию исходной информации и визуализацию полученных результатов осуществляли в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2010. Статистический анализ проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 20 [Наследов А.Д., SPSS Компьютерный анализ данных в психологии и социальных науках. СПб.: Питер, 2011. - 445 с.].The research materials were subjected to statistical processing using the methods of parametric and non-parametric analysis in accordance with the results of testing the compared sets for normal distribution [Glantz S. Biomedical statistics. Per. from English., M: Practice 1999; 459 s .; Zaitsev V.M., Liflyandsky V.G., Marinkin V.I. Applied medical statistics. M .: Foliant, 2006. - 432 p .; Petri A., Sabin K. Visual statistics in medicine: M .: GeotarMed, 2003. - 139 pp .; Plavinsky S.L. Biostatistics: planning, processing and presenting the results of biomedical research using the SAS system: St. Petersburg: Publ. House SPbMAPO, 2005. - 559 p.]. The accumulation, correction, systematization of the initial information and the visualization of the obtained results were carried out in Microsoft Office Excel 2010 spreadsheets. Statistical analysis was performed using IBM SPSS Statistics 20 software [Inherited AD, SPSS Computer analysis of data in the psychology and social sciences. SPb .: Peter, 2011. - 445 p.].

Были сопоставлены результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов при помощи проточной цитометрии в зависимости от различных методик окрашивания. Получены средние значения доли жизнеспособных сперматозоидов при использовании различных красителей. Сопоставление результатов оценки содержания жизнеспособных сперматозоидов в нативном эякуляте при помощи коэффициента конкордации W Кендалла позволило установить наличие статистически значимой взаимосвязи между показателями, полученными с использованием различных красителей (р<0,05 во всех случаях). При этом корреляционные связи отличались слабой теснотой, максимальные значения W Кендалла отмечались для нативного материала, составляя 0,234.The results of sperm cell viability assessment were compared using flow cytometry depending on different staining techniques. Received average values of the proportion of viable sperm using different dyes. Comparison of the results of the assessment of the content of viable spermatozoa in the native ejaculate using the Kendall coefficient W makes it possible to establish the presence of a statistically significant relationship between the indicators obtained using different dyes (p <0.05 in all cases). At the same time, the correlations were characterized by weak closeness, the maximum values of W Kendall were noted for the native material, amounting to 0.234.

При сопоставлении содержания жизнеспособных сперматозоидов в зависимости от используемой среды для криоконсервации были получены значения коэффициента конкордации W Кендалла, свидетельствующие о наличии статистически значимых корреляционных связей высокой тесноты (р<0,001 для всех красителей). Наибольшим значением W Кендалла характеризовалась корреляция показателей при использовании красителя NPA-FITC, составляющая 0,790.When comparing the content of viable spermatozoa depending on the medium used for cryopreservation, the values of the Kendall coefficient W obtained, indicating the presence of statistically significant correlation links of high cramping (p <0.001 for all dyes). The highest value of Kendall's W was characterized by the correlation of indicators when using the NPA-FITC dye, which is 0.790.

Нами были оценены различия определения процентного содержания жизнеспособных сперматозоидов в эякуляте при подтвержденной и неподтвержденной беременности при использовании четырех вышеупомянутых красителей. Было установлено, что указанные различия были статистически значимыми в случае окраски красителем NPA-FITC (р=0,049).We evaluated the differences in the determination of the percentage of viable spermatozoa in the ejaculate in a confirmed and unconfirmed pregnancy using the four dyes mentioned above. It was found that these differences were statistically significant in the case of staining with NPA-FITC (p = 0.049).

Заявленный способ отличается от известных и применяемых в настоящее время снижением субъективности оценки препарата и трудоемкости в случаях низкой концентрации сперматозоидов в нативном образце или при выявлении счетной ошибки, хорошей воспроизводимостью результатов для проведения контроля качества, отсутствием ложноположительных результатов и высокой достоверностью, а также умеренными временными затратами при проведении одиночных тестов и существенным снижением затрат времени при проведении массовых тестов, что позволяет усовершенствовать выбор тактики лечения бесплодия, улучшить отбор доноров спермы при создании донорских банков.The claimed method differs from the known and used at present by reducing the subjectivity of drug evaluation and labor intensity in cases of low sperm concentration in a native sample or when detecting a countable error, good reproducibility of results for quality control, the absence of false positive results and high confidence, as well as moderate time costs when conducting single tests and significantly reducing the time spent during mass tests, which allows the whiskers to improve the choice of tactics for the treatment of infertility, to improve the selection of sperm donors during the creation of donor banks.

Claims

A method for determining the viability of human spermatozoa, including the use of the lectohistochemistry method, characterized in that a suspension of spermatozoa is stained with a false narcissus lectin (Narcissus pseudonarcissus L.) labeled with fluorescein isothiocyanate, followed by analysis of the material by flow cytometry.