RU2685957C2 - Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes - Google Patents
Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2685957C2 RU2685957C2 RU2016152455A RU2016152455A RU2685957C2 RU 2685957 C2 RU2685957 C2 RU 2685957C2 RU 2016152455 A RU2016152455 A RU 2016152455A RU 2016152455 A RU2016152455 A RU 2016152455A RU 2685957 C2 RU2685957 C2 RU 2685957C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sga
- chim
- protein
- streptococcus pyogenes
- recombinant protein
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 title claims abstract description 13
- 241001415395 Spea Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims abstract 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 18
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 208000012160 familial progressive hyperpigmentation with or without hypopigmentation Diseases 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 8
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 5
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 108010059574 C5a peptidase Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- -1 MtsA Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010028885 Necrotising fasciitis Diseases 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010039587 Scarlet Fever Diseases 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- 208000017757 Streptococcal toxic-shock syndrome Diseases 0.000 description 2
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010044251 Toxic shock syndrome streptococcal Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 201000007970 necrotizing fasciitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 2
- 108020002447 serine esterase Proteins 0.000 description 2
- 102000005428 serine esterase Human genes 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000003780 Clusterin Human genes 0.000 description 1
- 108090000197 Clusterin Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100020743 Dipeptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010016228 Fasciitis Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010021531 Impetigo Diseases 0.000 description 1
- 102000010631 Kininogens Human genes 0.000 description 1
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100030979 Methylmalonyl-CoA mutase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 108700037929 Streptococcus pyogenes SpeA Proteins 0.000 description 1
- 241000873260 Streptococcus pyogenes serotype M1 Species 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010022946 erythrogenic toxin Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000004124 rheumatic heart disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N sulbactam Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 229960005256 sulbactam Drugs 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве вакцин против Streptococcus pyogenes, стрептококка группы А (СГА).The invention relates to the field of microbiology and molecular genetics and can be used in the medical industry in the production of vaccines against Streptococcus pyogenes, streptococcus group A (MHA).
S. pyogenes (СГА) является основной причиной заболеваемости и смертности от патогенных бактерий во всем мире [Carapetis JR и др. Lancet Infect Dis. 685–694 (2005)]. СГА могут инфицировать как кожу, так и дыхательные пути, и вызывают такие неинвазивные заболевания, как фарингиты, импетиго и скарлатина [Tanz RR, Shulman ST. Pediatr Infect Dis J. 175–176 (2007); Currie BJ. Curr Opin Infect Dis. 132–138 (2006)]. К инвазивным заболеваниям, вызываемым СГА, относятся некротический фасцит, сепсис, токсический шоковый синдром и пневмония. СГА инфекции могут приводить к серьезным осложнениям: острому пострептококковому гломерулонефриту, ревматической лихорадке или ревматическому поражению сердца [Martin JM, Green M. Semin Pediatr Infect Dis. 140–148 (2006)]. Во всем мире ежегодно от заболеваний, вызываемых СГА, умирает около 500000 человек [Carapetis JR и др. Lancet Infect Dis. 685–694 (2005)].S. pyogenes (GHA) is the leading cause of morbidity and mortality from pathogenic bacteria worldwide [Carapetis JR et al. Lancet Infect Dis. 685–694 (2005)]. MUH can infect both the skin and the respiratory tract, and cause such non-invasive diseases as pharyngitis, impetigo and scarlet fever [Tanz RR, Shulman ST. Pediatr Infect Dis J. 175–176 (2007); Currie BJ. Curr Opin Infect Dis. 132–138 (2006)]. Invasive diseases caused by MUH include necrotic fasciitis, sepsis, toxic shock syndrome, and pneumonia. MUH infections can lead to serious complications: acute post-recurrent glomerulonephritis, rheumatic fever, or rheumatic heart disease [Martin JM, Green M. Semin Pediatr Infect Dis. 140–148 (2006)]. Worldwide, about 500,000 people die from MUH annually [Carapetis JR et al. Lancet Infect Dis. 685–694 (2005)].
Заболевания, вызываемые стрептококками групп А, рассматриваются как важная социально-экономическая и медицинская проблема во всех странах мира.Diseases caused by streptococcus groups A are considered as an important socio-economic and medical problem in all countries of the world.
Общепризнанным методом лечения бактериальных инфекций, вызванных СГА, является антибиотикотерапия. При лечении СГА инфекций препаратами выбора являются бета-лактамы: бензилпенициллин, ампициллин [Семина Н.А., Сидоренко С.В. и др., Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 6 (4): 306-359 (2004)], ампициллин + сульбактам [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 332 (2003)]; макролиды: эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин; ванкомицин [Зуева Л.П., Поляк М.С. и др., Микробиологический мониторинг, СПб: Медицинский информационно-аналитический центр, 1- 72 (2004)].The conventional method of treating bacterial infections caused by MUH is antibiotic therapy. In the treatment of MUH infections, the drugs of choice are beta-lactams: benzylpenicillin, ampicillin [Semin N.A., Sidorenko S.V. et al., Wedge. Microbiol. Antimicrobial. Chemotherm. 6 (4): 306-359 (2004)], ampicillin + sulbactam [A. Burbello and others. Let's lie. Lecar Means, St. Petersburg: Neva, 332 (2003)]; macrolides: erythromycin, clarithromycin, roxithromycin, azithromycin; vancomycin [Zueva L.P., Polyak M.S. et al., Microbiological Monitoring, St. Petersburg: Medical Information and Analytical Center, 1- 72 (2004)].
В целях профилактики СГА инфекций используют такие антибиотики, как бензатин бензилпенициллин [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 323-324 (2003)], эритромицин [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 352 (2003)], ампициллин с сульбактамом [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 332 (2003)].In order to prevent MUH infections, antibiotics such as benzathine benzylpenicillin are used [A. Burbello. and others. Let's lie. Lecar Means, St. Petersburg: Neva, 323-324 (2003)], erythromycin [Burbello A.T. and others. Let's lie. Lecar Means, St. Petersburg: Neva, 352 (2003)], ampicillin with sulbactam [A. Burbello. and others. Let's lie. Lecar Means, St. Petersburg: Neva, 332 (2003)].
Широкое использование антибиотиков в терапии выявило целый ряд недостатков. Установлено, что побочные эффекты применения антибиотиков связаны с изменением биохимических характеристик крови человека, развитием аллергических реакций, дисбактериоза, иммуносупрессии, угнетения кроветворения и рядом других нарушений. Существенным недостатком терапии антибиотиками является также неизбежная селекция антибиотикорезистентных вариантов микроорганизмов, связанная с широким представительством разнообразных мобильных генетических элементов в окружающей микробиоте являющейся практически неистощимым источником генов лекарственной устойчивости. Это приводит к снижению эффективности антибактериальной терапии и необходимости постоянного поиска новых вариантов антибиотиков.The widespread use of antibiotics in therapy revealed a number of shortcomings. It has been established that the side effects of the use of antibiotics are associated with changes in the biochemical characteristics of human blood, the development of allergic reactions, dysbacteriosis, immunosuppression, hematopoietic suppression and a number of other disorders. A significant drawback of antibiotic therapy is also the inevitable selection of antibiotic-resistant variants of microorganisms, associated with a wide representation of various mobile genetic elements in the surrounding microbiota, which is a practically inexhaustible source of drug resistance genes. This leads to a decrease in the effectiveness of antibiotic therapy and the need for a constant search for new variants of antibiotics.
Альтернативой антибиотикотерапии стали разработки вакцинных препаратов, что продолжает оставаться перспективным направлением на протяжении последних десятилетий. В русле этой тенденции проводятся интенсивные исследования по созданию эффективных вакцин против стрептококка группы А.An alternative to antibiotic therapy has been the development of vaccine preparations, which continues to be a promising direction over the past decades. In line with this trend, intensive studies are being conducted to create effective vaccines against group A streptococcus.
Вакцины, специфичные в отношении стрептококка группы А, разрабатываются на основе:Vaccines specific to group A Streptococcus are developed on the basis of:
– М белка (мультивалентные типоспецифичные вакцины и вакцины на основе консервативного фрагмента М белка);- M protein (multivalent type-specific vaccines and vaccines based on a conservative fragment of M protein);
– группового полисахарида;- group polysaccharide;
– поверхностных бактериальных белков (C5a пептидаза, цистеиновая протеаза (экзотоксин В), фибронектин-связывающий белок (Sfb1), пили (антиген Т), экзотоксин С, сериновая протеаза (SpyCEP), сериновая эстераза (Sse), супероксиддисмутаза, GRAB, MtsA, липопротеины).- surface bacterial proteins (C5a peptidase, cysteine protease (exotoxin B), fibronectin-binding protein (Sfb1), pili (antigen T), exotoxin C, serine protease (SpyCEP), serine esterase (Sse), superoxide dismutase, GRAB, MtsA, lipoproteins).
Типоспецифичные мультивалентные вакцины на основе М белка состоят из коротких пептидов, гомологичных N-терминальному концу М белка разных emm серотипов, собранных вместе в один большой полипептид. Так созданы 6, 26 и 30 валентные вакцины, включающие пептиды из 6, 26 и 30 серотипов СГА (соответственно) [Kotloff KL и др. JAMA; 292(6), 709–715 (2004); McNeil SA и др. Clin Infect Dis. 41(8). 1114–1122 (2005); Dale JB и др. Vaccine. 29(46). 8175–8178 (2011)]. Основным недостатком таких вакцин является их узкая типовая специфичность, поскольку сегодня существует более 220 серотипов СГА [McMillan D. J. и др. Clinical Microbiology and Infection; 19 (5), 222-229 (2013)].The type-specific M-protein multivalent vaccines consist of short peptides homologous to the N-terminal end of the M protein of different emm serotypes, assembled together into one large polypeptide. Thus, 6, 26, and 30 valent vaccines are created, including peptides from 6, 26, and 30 GHA serotypes (respectively) [Kotloff KL et al. JAMA; 292 (6), 709–715 (2004); McNeil SA et al. Clin Infect Dis. 41 (8). 1114-1122 (2005); Dale JB et al. Vaccine. 29 (46). 8175-8178 (2011)]. The main disadvantage of such vaccines is their narrow typical specificity, since today there are more than 220 MUH serotypes [McMillan D. J. et al. Clinical Microbiology and Infection; 19 (5), 222-229 (2013)].
Консервативный участок М белка также рассматривается некоторыми учеными в качестве компонента вакцины. Так исследуются полноразмерный консервативный фрагмент из C-повторов [Bessen D, Fischetti VA. Infect Immun; 56, 2666–2672 (1988); Bronze MS и др. J Immunol; 148, 888-893 (1992)], маленькие пептиды J8, J14 и p145, гомологичные консервативному участку из С-повторов [ Batzloff M и др. Indian J Med Res; 119, 104-107 (2004)], эпитоп StreptInCor vaccine [Guilherme L и др. Methods; 49 (4), 316-321 (2009)], поливалентный вакцинный кандидат SV1[Bauer MJ и др. Vaccine; 30 (12), 2197-2205 (2012)]. Однако спорным остается вопрос: обладают ли антитела к консервативной области М белка опсонизирующими и защитными свойствами против СГА, так как исследуемая консервативная область белка находится в толще клеточной стенки и недоступна антителам.The conserved portion of the M protein is also considered by some scientists as a component of the vaccine. Thus, a full-size conservative fragment of C-repeats is investigated [Bessen D, Fischetti VA. Infect Immun; 56, 2666-2672 (1988); Bronze MS et al. J Immunol; 148, 888-893 (1992)], small peptides J8, J14, and p145 homologous to the conservative C-repeat region [Batzloff M et al. Indian J Med Res; 119, 104-107 (2004)], epitope of StreptInCor vaccine [Guilherme L et al. Methods; 49 (4), 316-321 (2009)], polyvalent vaccine candidate SV1 [Bauer MJ et al. Vaccine; 30 (12), 2197-2205 (2012)]. However, the controversial question remains: whether antibodies to the conserved region of the M protein have opsonizing and protective properties against SGA, since the studied conserved region of the protein is thicker than the cell wall and is not accessible to antibodies.
Групповой полисахарид СГА также рассматривается в качестве вакцинного кандидата против СГА [Sabharwal H и др. J Infect Dis; 193 (1), 129-135 (2006)]. Однако антитела, синтезируемые к групповому полисахариду могут перекрестно взаимодействовать с тканями человеческого организма [Cunningham MW и др. J Immunol; 141, 2760-2766 (1988); Dudding BA, Ayoub EM. J Exp Med 1968;128:1081-1098], что и является основным недостатком в его использовании в качестве компонента вакцины против СГА.MUH group polysaccharide is also considered as a vaccine candidate against MUH [Sabharwal H et al. J Infect Dis; 193 (1), 129-135 (2006)]. However, antibodies synthesized to a group polysaccharide can cross-interact with human tissues [Cunningham MW, et al. J Immunol; 141, 2760-2766 (1988); Dudding BA, Ayoub EM. J Exp Med 1968; 128: 1081-1098], which is the main disadvantage in its use as a component of the MUH vaccine.
Аналогами заявляемого изобретения являются вакцинные препараты, полученные на основе рекомбинантных белков. В качестве компонентов вакцины против СГА рассматриваются поверхностные факторы патогенности СГА белковой природы. В качестве вакцинных кандидатов рассмотрены рекомбинантные полипептиды, полученные на основе: C5a пептидаза (ScpA) [Cleary PP и др. J Infect Dis; 188 (6), 809-817 (2003)], цистеиновая протеаза экзотоксин В (Spe B) [Kapur V и др. Microb Pathogen; 16, 443 (1994); Chih-Feng Kuo и др. PLoS One; 10 (1), 1-17 (2015)], фибронектин-связывающий белок (Sfb1) [Kawabata S и др. Infect Immun; 69 (2), 924 -930 (2001)], пили (антиген Т) [Koller T и др. J Med Microbiol; 59, 442-452 (2011)], экзотоксин С (Spe C) [McCormick JK и др. J Immunol; 165 (4), 2306-2312 (2000)], сериновая протеаза (SpyCEP) [Zingaretti C и др. FASEB J; 24 (8), 2839-2848 (2010)], сериновая эстераза (Sse) [Liu M и др. Infect Immun; 75 (7), 3651-3657 (2007)], супероксиддисмутаза [McMillan DJ и др. Indian J Med Res; 119, 121-125 (2004)], GRAB, MtsA [McMillan DJ и др. Vaccine; 22, 2783-2790 (2004)], липопротеины [Lei B и др. J Infect Dis. 189 (1), 79-89 (2004)].Analogs of the claimed invention are vaccine preparations derived from recombinant proteins. As components of the vaccine against SGA, superficial factors of the pathogenicity of SGA of protein nature are considered. Recombinant polypeptides derived from: C5a peptidase (ScpA) [Cleary PP et al. J Infect Dis; 188 (6), 809-817 (2003)], cysteine protease exotoxin B (Spe B) [Kapur V et al. Microb Pathogen; 16, 443 (1994); Chih-Feng Kuo et al. PLoS One; 10 (1), 1-17 (2015)], fibronectin-binding protein (Sfb1) [Kawabata S et al. Infect Immun; 69 (2), 924-930 (2001)], drank (antigen T) [Koller T et al. J Med Microbiol; 59, 442-452 (2011)], exotoxin C (Spe C) [McCormick JK et al. J Immunol; 165 (4), 2306-2312 (2000)], serine protease (SpyCEP) [Zingaretti C et al. FASEB J; 24 (8), 2839-2848 (2010)], serine esterase (Sse) [Liu M et al. Infect Immun; 75 (7), 3651-3657 (2007)], superoxide dismutase [McMillan DJ et al. Indian J Med Res; 119, 121-125 (2004)], GRAB, MtsA [McMillan DJ et al. Vaccine; 22, 2783-2790 (2004)], lipoproteins [Lei B et al. J Infect Dis. 189 (1), 79-89 (2004)].
Недостатком вакцинных препаратов полученных на основе одного из перечисленных выше белков является их различная экспрессия на разных фазах роста микроорганизма, а также вариабельность факторов патогенности среди СГА.The disadvantage of vaccine preparations obtained on the basis of one of the above listed proteins is their different expression at different phases of the growth of the microorganism, as well as the variability of pathogenicity factors among GHA.
В представленном изобретении заявляется химерный белок, состоящий из фрагментов поверхностных белков СГА: Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB и терминальных доменов флагеллина Salmonella typhiurium FliA и FliC, выполняющих функцию внутреннего адьюванта, являющегося рецептором Toll 5.The present invention claims a chimeric protein consisting of fragments of MHA surface proteins: Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB and the terminal domains of Salmonella typhiurium FliA and FliA flagellin, which function as an internal adjuvant, which is a
СГА секретирует ингибитор комплемент-опосредованного лизиса Sic молекулярной массой 30 кДа [Akesson P и др. J Biol Chem. 271: 1081-1088 (1996)]. Ранее было продемонстрировано, что Sic блокирует комплемент-опосредованный гемолиз, ингибирует активность противобактериальных пептидов и связывается с белками человеческой плазмы (кластерином и гистидин богатым гликопротеином) [Binks M. J. и др. J Biol Chem. 280: 20120–20125 (2005); Fernie-King B.A. и др. Infect Immun. 70: 4908–4916 (2002); Frick I. M. и др. J Biol Chem. 278: 16561–16566 (2003)]. Также было доказано, что Sic связывается с высокомолекулярными и низкомолекулярными кининогенами (ВМК и НМК, соответственно), ингибируя, таким образом, связывание ВМК с клетками эндотелия и уменьшая активацию контактной фазы плазменного протеолиза [Akesson P и др. Microbiology. 156: 3660-3668 (2010)].MUH secretes the inhibitor of complement-mediated lysis of Sic with a molecular mass of 30 kDa [Akesson P et al. J Biol Chem. 271: 1081-1088 (1996)]. It has been previously demonstrated that Sic blocks complement-mediated hemolysis, inhibits the activity of antibacterial peptides and binds to human plasma proteins (clusterin and histidine rich in glycoprotein) [Binks M. J. et al. J Biol Chem. 280: 20120–20125 (2005); Fernie-King B.A. and others. Infect Immun. 70: 4908–4916 (2002); Frick I. M. et al. J Biol Chem. 278: 16561–16566 (2003)]. It has also been proven that Sic binds to high-molecular and low-molecular kininogens (VMC and NMC, respectively), thus inhibiting the binding of VMC to endothelium cells and reducing the activation of the contact phase of plasma proteolysis [Akesson P et al. Microbiology. 156: 3660-3668 (2010)].
Хемокиновая протеаза SpySEP является поверхностно-связанной сериновой протеазой субтилизинового семейства молекулярной массой 170 кДа. Она инактивирует IL8, специфически расщепляя его С-конец [Edwards R. J. и др. J. Infect. Dis. 192: 783-790 (2005)]. Это приводит к снижению привлечения нейтрофилов в очаг инфекции и последующего бактериального клиренса [Zinkernagel A.S. и др. Cell Host Microbe 4: 170-178 (2008); Hidalgo-Grass C. И др. Lancet. 363: 696-703 (2004)]. На мышиной модели было показано, что анти-SpySEP антитела обладают протективной защитой, что доказывает целесообразность его использования в качестве компонента вакцины против СГА [Rodriguez-Ortega M. J. и др. Nat. Biotechnol. 24: 191-197 (2006); Turner C.E. и др. Vaccine. 27: 4923-4929 (2009)].SpySEP chemokine protease is a surface-linked serine protease of the subtilisin family with a molecular weight of 170 kDa. It inactivates IL8, specifically cleaving its C-terminus [Edwards R. J. et al. J. Infect. Dis. 192: 783-790 (2005)]. This leads to a decrease in the attraction of neutrophils to the site of infection and subsequent bacterial clearance [Zinkernagel A.S. et al. Cell Host Microbe 4: 170-178 (2008); Hidalgo-Grass C. et al. Lancet. 363: 696-703 (2004)]. In the mouse model, it was shown that anti-SpySEP antibodies have protective protection, which proves the feasibility of its use as a component of the vaccine against SGA [Rodriguez-Ortega M.J. et al. Nat. Biotechnol. 24: 191-197 (2006); Turner C.E. and others. Vaccine. 27: 4923-4929 (2009)].
Стрептококковый пирогенный экзотоксин SpeA – суперантиген молекулярной массой 25,7 кДа, участвующий в развитии клиники скарлатины, а также формировании стрептококкового токсического шокового синдрома, некротического фасцита, острой ревматической лихорадки [Bohach G.A. и др. Crit. Rev. Microbiol. 17: 251–272 (1990); Hauser A.R. и др. J. Clin. Microbiol. 29: 1562–1567 (1991)]. Суперантигены – это семейство белков, характеризующиеся способностью вызывать чрезмерную активацию Т лимфоцитов человека и млекопитающих, что приводит к избыточному высвобождению Т-клеточных медиаторов и провоспалительных цитокинов, приводящих к возникновению токсического шокового синдрома [Thomas Proft и John D. Fraser в книге Ferretti JJ и др. Streptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations (2016)]. Вакцинация кроликов SpeA защищала животных от возникновения всех симптомов стрептококкового токсического шокового синдрома, включая некротический фасцит [Schlievert P.M. И др. J. Lab. Clin. Med. 127: 13–22 (1996)]. Мутанты СГА по гену, кодирующему SpeA, стимулировали индукцию протективных антител у кроликов [Roggiani M и др. Infect Immun. 68: 5011-5017 (2000)].StreA pyrogenic exotoxin SpeA - superantigen molecular weight of 25.7 kDa, participating in the development of the clinic of scarlet fever, as well as the formation of streptococcal toxic shock syndrome, necrotizing fasciitis, acute rheumatic fever [Bohach G.A. et al. Crit. Rev. Microbiol. 17: 251–272 (1990); Hauser A.R. et al. J. Clin. Microbiol. 29: 1562–1567 (1991)]. Superantigens are a family of proteins characterized by the ability to cause excessive activation of T lymphocytes of humans and mammals, which leads to excessive release of T-cell mediators and pro-inflammatory cytokines, leading to the emergence of toxic shock syndrome [Thomas Proft and John D. Fraser in the book Ferretti JJ and others Streptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations (2016)]. SpeA vaccination of rabbits protected animals from the onset of all of the symptoms of streptococcal toxic shock syndrome, including necrotizing fasciitis [Schlievert P.M. And others J. Lab. Clin. Med. 127: 13–22 (1996)]. MUT mutants for the gene encoding SpeA stimulated the induction of protective antibodies in rabbits [Roggiani M et al. Infect Immun. 68: 5011-5017 (2000)].
ScpA (С5а пептидаза) – поверхностный белок экспрессируемый всеми серотипами СГА. ScpA – сериновая протеаза молекулярной массой 125 кДа, специфически расщепляющая С5а компонент комплемента человека, обезьяны и коровы, тем самым блокируя сайт связывания С5а с лейкоцитами [Cleary PP и др. Infect Immun. 60: 5219-5223 (1992)]. В результате ScpA ингибирует хемотаксис, задерживая инфильтрацию фагацитов, замедляя клиренс бактерий с подкожных поверхностей и со слизистых оболочек организма хозяина и, таким образом, позволяет СГА создавать очаг инфекции [Ji Y и др. Infect Immun. 64: 503-510 (1996); Ji Y и др. Infect Immun. 66: 5399-5405 (1998)].ScpA (C5a peptidase) is a surface protein expressed by all serotypes of GHA. ScpA is a 125 kDa molecular weight serine protease that specifically cleaves the C5a component of human, monkey and cow complement, thereby blocking the binding site of C5a to leukocytes [Cleary PP et al. Infect Immun. 60: 5219-5223 (1992)]. As a result, ScpA inhibits chemotaxis, delaying the infiltration of phagocytes, slowing down the clearance of bacteria from the subcutaneous surfaces and mucous membranes of the host organism and, thus, allows the MHA to create a source of infection [Ji Y et al. Infect Immun. 64: 503-510 (1996); Ji Y et al. Infect Immun. 66: 5399-5405 (1998)].
Интраназальная иммунизация мышей рекомбинантным ScpA вызывала сильный гуморальный иммунный ответ и приводила к снижению носоглоточной колонизации после заражения различными сиротипами СГА, что свидетельствует о перекрестной защитной реакции [Ji Y и др. Infect Immun. 65: 2080-2087 (1997)]. Также было продемонстрировано, что кроличьи анти-ScpA антитела и человеческая сыворотка против ScpA могут нейтролизовать активность С5а пептидазы как in vitro, так и in vivo у мышей [Wexler DE, Cleary PP. Infect Immun. 50: 757-764 (1985); O’Connor SP, Cleary PP. Infect Dis. 156: 495-504 (1987)].Intranasal immunization of mice with recombinant ScpA elicited a strong humoral immune response and led to a decrease in nasopharyngeal colonization after infection with various SIR types of MUH, which indicates a cross-protection reaction [Ji Y et al. Infect Immun. 65: 2080-2087 (1997)]. It has also been demonstrated that rabbit anti-ScpA antibodies and anti-ScpA human serum can neutrolyze the activity of C5a peptidases both in vitro and in vivo in mice [Wexler DE, Cleary PP. Infect Immun. 50: 757-764 (1985); O’Connor SP, Cleary PP. Infect Dis. 156: 495-504 (1987)].
Белок ScaAB СГА также был выбран в качестве компонента вакцины. ScaAB СГА гомологичен белку ScaAB Streptococcus agalactiae и белку PsaA Streptococcus pnumoniae. Последние являются хорошо изученными белками, с доказанной иммуногенностью и протективностью антител, индуцируемых на их введение [Vorobieva E.I., Meringova L.F. и др. Folia Microbiol.50: 172-176 (2005); Berry AM, Paton JC. Infect Immun. 64: 5255-5262 (1996); Ren B и др. Infect Immun. 71: 75-85 (2003)].Protein ScaAB MUH has also been selected as a component of the vaccine. ScaAB MHA is homologous to ScaAB Streptococcus agalactiae protein and PsaA Streptococcus pnumoniae protein. The latter are well-studied proteins, with proven immunogenicity and protection of antibodies induced by their administration [Vorobieva E.I., Meringova L.F. et al. Folia Microbiol.50: 172-176 (2005); Berry AM, Paton JC. Infect Immun. 64: 5255-5262 (1996); Ren B et al. Infect Immun. 71: 75-85 (2003)].
В качестве внутренного адьюванта в состав химерного белка были включены терминальные домены флагеллина Salmonella typhiurium FliA и FliC из-за их способности взаимодействовать с Toll-подобными рецепторами-5 (TLR-5) [Simon R1, Levine MM. Hum Vaccin Immunother. 8: 494-498 (2012); Ramachandran G. и др. PLoS One. 11. (2016)].As an internal adjuvant, the terminal domains of Salmonella typhiurium FliA and FliC flagellin were included in the chimeric protein because of their ability to interact with Toll-like receptors-5 (TLR-5) [Simon R1, Levine MM. Hum Vaccin Immunother. 8: 494-498 (2012); Ramachandran G. et al. PLoS One. 11. (2016)].
Прототипом заявляемого изобретения является 6, 26 и 30 валентные вакцины, состоящие из коротких остатков, гомологичных N-терминальному концу М белка 6, 26 и 30 серотипов СГА, соответственно [Kotloff KL и др. JAMA; 292(6), 709–715 (2004); McNeil SA и др. Clin Infect Dis. 41(8). 1114–1122 (2005); Dale JB и др. Vaccine. 29(46). 8175–8178 (2011)]. Однако такие вакцины обладают протективными свойствами в отношении только тех серотипов СГА, на основе которых они были созданы.The prototype of the claimed invention is 6, 26 and 30 valent vaccines consisting of short residues homologous to the N-terminal end of
Прототипом заявленного изобретения является рекомбинантный слитый белок SpeAB, состоящий из комбинации инактивированных измененных форм стрептококкового пирогенного экзотоксина А и экзотоксина В СГА [Ulrich RG. J Immune Based Ther Vaccines. (2008); Morefield G. и др. Vaccine. 32: 3810-3815 (2014)]. Авторами на мышиной модели были продемонстрированы протективные свойства анти-SpeAB антител. Однако остается открытым вопрос о стабильности данного слитого белка.The prototype of the claimed invention is a recombinant protein SpeAB, consisting of a combination of inactivated modified forms of streptococcal pyrogenic exotoxin A and exotoxin B SGA [Ulrich RG. J Immune Based Thermo Vaccines. (2008); Morefield G. et al. Vaccine. 32: 3810-3815 (2014)]. The authors in the mouse model demonstrated the protective properties of anti-SpeAB antibodies. However, the question remains about the stability of this fusion protein.
Прототипом заявляемого изобретения является синтетический липопептид, состоящий из В-клеточного эпитопа М белка J14, фибриллобразующего пептида Q11 и липоаминокислотного фрагмента С16 [Azmi F и др. Bioorg Med Chem. 15: 6401-64028 (2014)]. Авторами была доказана иммуногенность липопептида и его стабильность.The prototype of the claimed invention is a synthetic lipopeptide consisting of the B cell epitope M protein J14, the fibril-forming peptide Q11 and the lipoamino acid fragment C16 [Azmi F et al. Bioorg Med Chem. 15: 6401-64028 (2014)]. The authors proved the immunogenicity of the lipopeptide and its stability.
Задачей данного изобретения стало получение химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM (FliA-FliC-Sic-SpySEP-SpeA-ScpA-ScaAB), состоящего из консервативных и иммуногенных фрагментов аминокислотных последовательностей поверхностных белков: Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB и терминальных доменов флагеллина Salmonella typhiurium FliA и FliC, выполняющих функцию внутреннего адьюванта; обладающего иммуногенными свойствами за счет синтеза специфических антител, и выраженными протективными свойствами анти-SGA-CHIM антител. Химерный рекомбинантный белок SGA-CHIM используют в качестве вакцинного препарата против Streptococcus pyogenes.The objective of this invention was to obtain a chimeric recombinant protein SGA-CHIM (FliA-FliC-Sic-SpySEP-SpeA-ScpA-ScaAB), consisting of conservative and immunogenic fragments of the amino acid sequences of the surface proteins: Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB and terminal domains Flamellin Salmonella typhiurium FliA and FliC, which function as an internal adjuvant; possessing immunogenic properties due to the synthesis of specific antibodies, and pronounced protective properties of anti-SGA-CHIM antibodies. The chimeric recombinant protein SGA-CHIM is used as a vaccine preparation against Streptococcus pyogenes.
Поставленная задача решалась:The task was solved:
а) получением штамма-продуцента SGA-CHIM;a) obtaining a producer strain SGA-CHIM;
б) получением химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM.b) obtaining chimeric recombinant protein SGA-CHIM.
Сущностью предлагаемого изобретения является создание уникального химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM, обладающего выраженным иммуногенными и протективным эффектами.The essence of the invention is the creation of a unique chimeric recombinant protein SGA-CHIM, with pronounced immunogenic and protective effects.
Авторами заявляемого изобретения получены анти-SGA-CHIM антитела при интраназальном и подкожном введении SGA-CHIM мышам.The authors of the claimed invention obtained anti-SGA-CHIM antibodies with intranasal and subcutaneous administration of SGA-CHIM mice.
Авторами заявляемого изобретения изучены:The authors of the claimed invention studied:
1) иммуногенность химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM;1) the immunogenicity of the chimeric recombinant protein SGA-CHIM;
2) протективные свойства анти-SGA-CHIM антител мыши в отношении СГА in vivo.2) the protective properties of mouse anti-SGA-CHIM antibodies against GHA in vivo.
Уникальный химерный рекомбинантный белок SGA-CHIM имеет высокую физиологическую стабильность, вызывает синтез анти-SGA-CHIM антител, причем синтезируемые специфические антитела обладают протективными свойствами против Streptococcus pyogenes.The unique chimeric recombinant protein SGA-CHIM has a high physiological stability, induces the synthesis of anti-SGA-CHIM antibodies, and the specific antibodies synthesized have protective properties against Streptococcus pyogenes.
Уникальный химерный рекомбинантный белок SGA-CHIM полезен в качестве вакцинного препарата для профилактики и лечения бактериальных инфекций, вызванных Streptococcus pyogenes.The unique chimeric recombinant protein SGA-CHIM is useful as a vaccine preparation for the prevention and treatment of bacterial infections caused by Streptococcus pyogenes.
Результатом заявленного изобретения является создание химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM.The result of the claimed invention is the creation of a chimeric recombinant protein SGA-CHIM.
Химерный рекомбинантный белок SGA-CHIM получали с использованием генно-инженерных методов. Аминокислотная последовательность химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM была сконструирована и транслирована в нуклеотидную последовательность, оптимизированную для экспрессии в E. coli. Синтез нуклеотидной последовательности гена, кодирующей белок SGA-CHIM, осуществляли путем удлинения перекрывающихся олигонуклеотидов, как описано у Majumder K. Gene. 110: 89-94 (1992). Для клонирования на концах гена были добавлены сайты рестрикции для эндонуклеаз EcoRI и XhoI.Chimeric recombinant protein SGA-CHIM was obtained using genetic engineering methods. The amino acid sequence of the chimeric recombinant protein SGA-CHIM was designed and translated into a nucleotide sequence optimized for expression in E. coli. The nucleotide sequence of the gene encoding the SGA-CHIM protein was synthesized by lengthening overlapping oligonucleotides, as described in Majumder K. Gene. 110: 89-94 (1992). Restriction sites for EcoRI and XhoI endonucleases were added for cloning at the ends of the gene.
Синтетический химерный ген sga-chim был проклонирован в плазмиду pET24b+ (Invitrogen, США). Полученную плазмиду, названную pColdIIsga-chim (6012 п.н.), трансформировали в штамм E. coli BL21 Star F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) (Invitrogen, США) с помощью «кальциевого метода». Отбор клонов-трансформантов проводили через 18 часов роста клеток при 37°С на плотной среде с 1% L-агаром (Difco, США), содержащей ампициллин (100мкг/мл). Штамм-продуцент химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM назвали E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim.The synthetic chimeric sga-chim gene was cloned into the plasmid pET24b + (Invitrogen, USA). The resulting plasmid, named pColdIIsga-chim (6012 bp), was transformed into E. coli BL21 Star F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) strain (Invitrogen, USA) using the “calcium method” . The selection of transformant clones was carried out after 18 hours of cell growth at 37 ° C on a dense medium with 1% L-agar (Difco, USA) containing ampicillin (100 µg / ml). The strain-producer of the chimeric recombinant protein SGA-CHIM was named E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim.
Для получения чистого препарата химерного рекомбинантного белка клетки штамма-продуцентав E. сoli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim культивировали на L-бульоне (Difco, США) с добавлением ампициллина (100мкг/мл) до поздней логарифмической фазы роста (ОD600=0,7 ÷ 0,9). Затем продукцию химерного рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG), и клетки культивировали еще 4,5 часа. После этого клетки осаждали центрифугированием, суспендировали в лизирующем (связывающем) буфере А (20 мМ Na2HPO4, 20 мM NaH2PO4, 500 мM NaCl, 20 мM имидазола, лизоцим (10-3 мг/мл) и PMSF (0,03М), рН=7.4). Суспензию клеток вскрывали ультразвуком (3 раза по 20 секунд с перерывом 40 секунд). Разрушенные клетки подвергали центрифугированию (20000 g в течение 20 минут при температуре 40С). Полученный осадок отделяли от супернатанта и растворяли в связывающем буфере, содержащем мочевину (8 М раствор), материал центрифугировали для отделения лизата от не растворившихся фрагментов. Полученную надосадочную жидкость наносили на Ni-сефарозу.To obtain a pure preparation of a chimeric recombinant protein, the cells of the producing strain E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim were cultivated on L-broth (Difco, USA) with ampicillin added (100 µg / ml) until the late logarithmic growth phase (OD 600 = 0, 7 ÷ 0.9). Then, production of the chimeric recombinant protein was induced by the addition of isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the cells were cultured for another 4.5 hours. After that, the cells were precipitated by centrifugation, suspended in lysis (binding) buffer A (20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, lysozyme (10 -3 mg / ml) and PMSF (0 , 03M), pH = 7.4). The cell suspension was sonicated (3 times for 20 seconds with a break of 40 seconds). The destroyed cells were centrifuged (20,000 g for 20 minutes at 40 ° C). The resulting precipitate was separated from the supernatant and dissolved in a binding buffer containing urea (8 M solution), the material was centrifuged to separate the lysate from the undissolved fragments. The resulting supernatant was applied to Ni-Sepharose.
Очистку рекомбинантного белка проводили с использованием Ni-сефарозы (Amersham, США). Полученный после аффинной хроматографии рекомбинантный белок диализовали против дистиллированной воды рН=8,0. Чистоту и молекулярную массу химерного рекомбинантного полипептида определяли с помощью 14% SDS-PAGE в вертикальном пластинчатом аппарате Mini-PROTEAN II (BioRad, США), сравнивая пробег белка с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (№161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса SGA-CHIM = (70±0,5) кДа.Purification of the recombinant protein was performed using Ni-Sepharose (Amersham, USA). The recombinant protein obtained after affinity chromatography was dialyzed against distilled water pH = 8.0. The purity and molecular weight of the chimeric recombinant polypeptide was determined using 14% SDS-PAGE in a vertical Mini-PROTEAN II plate apparatus (BioRad, USA), comparing the mileage of the protein with the mileage of proteins of known molecular weight (Precision Plus Protein standards (# 161-0373), Bio-Rad, USA). Molecular weight SGA-CHIM = (70 ± 0.5) kDa.
Результатом изобретения является химерный рекомбинантный белок SGA-CHIM, состоящий из консервативных и иммуногенных фрагментов аминокислотных последовательностей поверхностных белков: Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB и терминальных доменов флагеллина Salmonella typhiurium FliA и FliC.The result of the invention is a chimeric recombinant protein SGA-CHIM, consisting of conservative and immunogenic fragments of the amino acid sequences of surface proteins: Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB and terminal domains of flagellin Salmonella typhiurium FliA and FliC.
Белок SGA-CHIM обладает следующими свойствами:Protein SGA-CHIM has the following properties:
а) при интраназальном введении в организм млекопитающим (мышам) вызывает синтез анти-SGA-CHIM антител;a) when intranasally administered to mammals (mice), causes the synthesis of anti-SGA-CHIM antibodies;
б) синтезируемые специфические антитела по п. (а) обладают протективными свойствами в отношении Streptococcus pyogenes;b) the synthesized specific antibodies according to (a) have protective properties against Streptococcus pyogenes;
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие некоторые варианты изобретения, но не ограничивающие его.The following are specific examples illustrating some variants of the invention, but not limiting it.
Пример 1. Выделение и очистка химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM.Example 1. Isolation and purification of chimeric recombinant protein SGA-CHIM.
Клонирование синтетического гена sga-chim осуществляли с использованием экспрессионной плазмиды pET24b+ (Invitrogen, США). При подготовке к клонированию была проведена двойная рестрикция sga-chim (1674 п.н.) и плазмиды pET24b+ (4368 п.н.) ферментами EcoRI и XhoI с образованием липких концов. В ходе клонирования была получена рекомбинантная плазмидная ДНК (обозначенная как pColdIIsga-chim (6042 п.н.). Рекомбинантную плазмидную ДНК pColdIIsga-chim трансформировали в гетерологичную систему E. coli BL21 Star F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3). Генетическим маркером плазмидной ДНК pET24b+ является ген amp, кодирующий бета-лактамазу, что обеспечивает устойчивость к ампициллину клеток, несущих данную плазмиду. Трансформацию клеток E. coli проводили по Darget (1979). Отбор клонов-трансформантов проводили через 18 часов роста клеток при 37°С на плотной среде с 1% L-агаром (Difco, США), содержащей ампициллин (100мкг/мл). В результате проведенного клонирования были получены рекомбинантные клоны, несущие плазмиду pColdIIsga-chim с синтетическим геном sga-chim. Один из рекомбинантных клонов получил название E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim и был использован для дальнейшей работы.Cloning of the synthetic sga-chim gene was performed using the expression plasmid pET24b + (Invitrogen, United States). In preparation for cloning, double restriction of sga-chim (1674 bp) and plasmid pET24b + (4368 bp) with EcoRI and XhoI enzymes was carried out with the formation of sticky ends. During cloning, recombinant plasmid DNA was obtained (designated as pColdIIsga-chim (6042 bp). The recombinant plasmid DNA pColdIIsga-chim was transformed into a heterologous E. coli BL21 Star F-ompT hsdSB (rB-mB-) system (DE3). The genetic marker for the pET24b + plasmid DNA is the amp gene encoding beta-lactamase, which provides resistance to the ampicillin of cells carrying this plasmid. Transformation of E. coli cells was performed according to Darget (1979). The selection of transformant clones was performed after 18 hours of growth cells at 37 ° C on a dense medium with 1% L-agar (Difco, USA), soda ampicillin (100 µg / ml). As a result of the cloning, recombinant clones were obtained that carry the plasmid pColdIIsga-chim with the synthetic sga-chim gene. One of the recombinant clones was called E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim and was used for further work.
Клон E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim проверяли на способность продуцировать белок SGA-CHIM. Для получения чистого препарата SGA-CHIM клетки E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim культивировали на L-бульоне (Difco, США) с добавлением ампициллина (100мкг/мл). Продукцию и очистку (с использованием Ni-сефарозы, Amersham, США) SGA-CHIM проводили как описано выше.The clone E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim was tested for its ability to produce SGA-CHIM protein. To obtain pure SGA-CHIM, E. coli BL21 (DE3) pColdIIsga-chim cells were cultured in L-broth (Difco, USA) with ampicillin added (100 µg / ml). Production and purification (using Ni-sepharose, Amersham, USA) SGA-CHIM was performed as described above.
Молекулярную массу SGA-CHIM определяли с помощью 14% SDS-PAGE, сравнивая пробег белка SGA-CHIM с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (№161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM оказалась равной (70,0±0,5) кДа.The molecular weight of SGA-CHIM was determined using 14% SDS-PAGE, comparing the mileage of SGA-CHIM with the mileage of proteins of known molecular weight (Precision Plus Protein standards (No. 161-0373), Bio-Rad, USA). The molecular mass of the chimeric recombinant protein SGA-CHIM was equal to (70.0 ± 0.5) kDa.
Аминокислотная последовательность химерного рекомбинантного белка SGA-CHIM представлена в перечне последовательностей под № 1 и состоит из 548 аминокислотных остатков.The amino acid sequence of the chimeric recombinant protein SGA-CHIM is listed in
Химерный рекомбинантный белок SGA-CHIM содержит аминокислотные последовательности поверхностных белков Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB и терминальных доменов флагеллина Salmonella typhiurium FliA и FliC, ковалентно связанных с аминокислотными остатками, кодируемыми pET24b+ (Invitrogen, США).The chimeric recombinant protein SGA-CHIM contains the amino acid sequences of the Sic, SpySEP, SpeA, ScpA, ScaAB surface proteins and the terminal domains of Salmonella typhiurium FliA and FliA flagellin terminal proteins covalently linked to amino acid residues encoded by pET24b + (Invitrogen, USA).
Пример 2. Изучение динамики изменения титра анти-SGA-CHIM антител в ходе интраназальной иммунизации мышей белком SGA-CHIM.Example 2. The study of the dynamics of changes in the titer of anti-SGA-CHIM antibodies during intranasal immunization of mice with SGA-CHIM protein.
Иммунный ответ приобретенного иммунитета к химерному рекомбинантному белку SGA-CHIM изучали на беспородных белых мышах (самки, возраст – 10 недель, вес 22÷25 г), полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово». Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 21 день и интраназально под легким эфирным наркозом. Группе мышей из 50 особей вводили 0,05 мл препарата, содержащего 20 мкг SGA-CHIM. Специфические антитела к SGA-CHIM определяли с 1 по 47 день от начала иммунизации. Специфические антитела определяли с помощью двухслойного метода иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки полистеролового планшета с высокой сорбционной емкостью (Costar, США) вносили по 100 мкл SGA-CHIM в концентрации 2 мкг/мл. Сорбцию проводили в 100 мМ бикарбонатном буфере (рН=9,45) в течение 16 ÷ 20 часов при 4°С. После этого содержимое из планшета удаляли и добавляли в лунки по 150 мкл 0,15 М NaCl, рН=7,4 (PBS), содержащего 0,05% Твин–20 (PBST). Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 мин. Содержимое планшета удаляли и трижды промывали PBST. Затем в лунки планшета вносили иммунную или нормальную (в качестве отрицательного контроля) сыворотку (с начальным разведением 1:100) с последующим шагом разведения равным двум. Все разведения осуществляли в PBST, и каждую пробу дублировали. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°С. Далее содержимое планшета удаляли и дважды промывали планшет PBST. После этого в лунки добавляли по 100 мкл А-ПХ конъюгата (белок А стафилококка, ковалентно связанный с пероксидазой хрена (Sigma, США) в концентрации 10-7 моль/л. После часовой инкубации при 37°С содержимое планшета удаляли и трижды отмывали планшет PBST и один раз PBS, чтобы избежать ингибирующего действия Твин-20 на ферментативную активность пероксидазы. Далее для визуализации реакции в лунки планшета вносили по 100 мкл субстратной смеси (0,5 мкг/мл тетраметилбензидина (Sigma, США) в 100 мМ фосфатно–цитратном буфере (рН=5,0), 10 мкл 30% перекиси водорода), которую готовили непосредственно перед применением. Планшет инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре, и реакцию останавливали внесением в лунки по 30 мкл 50% концентрированной серной кислоты. Реакцию регистрировали при длине волны 450 нм с помощью прибора iMark Microplate Reader, Bio-Rad (США).The immune response of acquired immunity to chimeric recombinant protein SGA-CHIM was studied in outbred white mice (females, 10 weeks old, weight 22 ÷ 25 g) obtained from the Rappolovo laboratory animal nursery. Immunization was performed twice with an interval of 21 days and intranasally under light ether anesthesia. A group of mice from 50 animals were injected with 0.05 ml of a preparation containing 20 μg of SGA-CHIM. Specific antibodies to SGA-CHIM were determined from
Через три недели от начала иммунизации в крови мышей регистрировали появление специфических антител к SGA-CHIM. На фиг. 2. представлена динамика изменения титра анти-SGA-CHIM антител в ходе интраназальной иммунизации мышей SGA-CHIM. Three weeks after the start of immunization, the appearance of specific antibodies to SGA-CHIM was recorded in the blood of mice. FIG. 2. presents the dynamics of changes in the titer of anti-SGA-CHIM antibodies during intranasal immunization of SGA-CHIM mice.
Максимум иммунного ответа наблюдали на 35 день от начала иммунизации с титром антител равным 222х103. Также отмечали наличие специфических антител через 47 дней с титром 21х103. Результаты, представленные на фиг. 1 демонстрируют, что интраназальное введение SGA-CHIM приводило к выраженной индукции анти-SGA-CHIM в организме мышей.The maximum of the immune response was observed on
Пример 3. Изучение протективных свойств анти-SGA-CHIM антител при интраназальном заражении мышей СГА 9189 (серотип М1).Example 3. The study of the protective properties of anti-SGA-CHIM antibodies by intranasal infection of MHA 9189 mice (serotype M1).
Протективные свойства анти-SGA-CHIM антител изучали на мышах в экспериментах in vivo на модели генерализованной инфекции. Беспородных белых мышей (самок, 22÷25 г) из питомника «Рапполово» в количестве 20 особей сначала иммунизировали по схеме, приведенной в примере 2. Контрольной группе вводили PBS. Затем обеим группам мышей интраназально под легким эфирным наркозом вводили суспензию СГА М1 серотипа(коллекционный номер 9189) в объеме 25 мкл в дозе 10×108 КОЕ на сроке с максимальной выработкой антител к SGA-CHIM (35-й день от начала иммунизации). Streptococcus pyogenes серотипа M1 (9189) был получен из коллекции отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «ИЭМ». Бактерии культивировали в среде THB в течение 24 часов при 37°C в аэробных условиях, отмывали PBS трехкратным центрифугированием при 3500 об/мин в течение 20 минут и концентрировали при необходимости. Полученную суспензию использовали для заражения.The protective properties of anti-SGA-CHIM antibodies were studied in mice in in vivo experiments on a model of generalized infection. Outbred white mice (females, 22 ÷ 25 g) from the nursery "Rappolovo" in the amount of 20 individuals were first immunized according to the scheme given in example 2. The control group was injected with PBS. Then both groups of mice intranasally under light ether anesthesia were injected with SGA M1 serotype suspension (collection number 9189) in a volume of 25 μl at a dose of 10 × 10 8 CFU with a maximum production of antibodies to SGA-CHIM (35th day from the start of immunization). Streptococcus pyogenes serotype M1 (9189) was obtained from the collection of the Department of Molecular Microbiology at the IEM. Bacteria were cultured in THB medium for 24 hours at 37 ° C under aerobic conditions, washed with PBS three times by centrifugation at 3500 rpm for 20 minutes, and concentrated if necessary. The resulting suspension was used for infection.
Контроль развития инфекции осуществляли с помощью высева стрептококков из гомогенатов легких мышей на колумбийский агар (Difco, США) с добавлением 5% бараньих эритроцитов через 2 часа после заражения СГА. Ткань легкого измельчали на механическом дезинтеграторе Retsch MM400 в течение 3 минут при интенсивности 29 колебаний в секунду. Infection control was carried out by seeding streptococci from mouse lung homogenates on Colombian agar (Difco, USA) with the addition of 5
Как показано на фиг. 2, через 2 часа после интраназального заражения мышей СГА № 9189 серотипа М1 в легких контрольной группы мышей происходило интенсивное накопление СГА, достигая значения 1,2х106 КОЕ. В противоположность этому через 5 часов после введения бактерий наблюдалась элиминация стрептококков из легких мышей, иммунизированных SGA-CHIM. As shown in FIG. 2, 2 hours after intranasal infection of MUH mice No. 9189 of serotype M1 in the lungs of the control group of mice, there was an intense accumulation of MUH, reaching a value of 1.2x10 6 cfu. In contrast, 5 hours after the introduction of bacteria, the elimination of streptococci from the lungs of mice immunized with SGA-CHIM was observed.
Полученные данные убедительно показывают протективность специфических антител, индуцированных введением SGA-CHIM.The data obtained convincingly show the protectiveness of specific antibodies induced by the introduction of SGA-CHIM.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152455A RU2685957C2 (en) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152455A RU2685957C2 (en) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016152455A3 RU2016152455A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152455A RU2016152455A (en) | 2018-07-02 |
| RU2685957C2 true RU2685957C2 (en) | 2019-04-23 |
Family
ID=62813994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016152455A RU2685957C2 (en) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2685957C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2010107878A (en) * | 2007-08-06 | 2011-09-20 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх (De) | IMMUNOGENIC PROTEINS STREPTOCOCCUS |
-
2016
- 2016-12-28 RU RU2016152455A patent/RU2685957C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2010107878A (en) * | 2007-08-06 | 2011-09-20 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх (De) | IMMUNOGENIC PROTEINS STREPTOCOCCUS |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GOOD M.F. et al., Strategic development of the conserved region of the M protein and other candidates as vaccines to prevent infection with group A streptococci, Expert review of vaccines, 2015, Vol.14, No.11, pp.1459-1470. * |
| SONG Y. et al., Progress in development of group A streptococcus vaccines, Current pharmaceutical biotechnology, 2013, Vol.14, No.11, pp.947-950. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016152455A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152455A (en) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2672989A1 (en) | Immunogenic composition comprising alpha-hemolysin oligopeptides | |
| WO2010039563A2 (en) | Protective vaccine against staphylococcus aureus biofilms comprising cell wall-associated immunogens | |
| JP2017210479A (en) | New target of Acinetobacter baumannii | |
| US8741302B2 (en) | Polypeptide derived from Enterococcus and its use for vaccination | |
| US20130243779A1 (en) | Peptides protective against e. faecalis, methods and uses relating thereto | |
| RU2685957C2 (en) | Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes | |
| US8709437B2 (en) | Clostridium chauvoei polypeptide, DNA encoding the polypeptide and a vaccine comprising the polypeptide | |
| Francis et al. | Immunogenicity and protective efficacy of recombinant alkaline shock protein 23 from Staphylococcus aureus in a murine model | |
| JP7303791B2 (en) | Immunogenic compositions containing fusion peptides derived from superantigen toxoids | |
| JP4960219B2 (en) | Therapeutic peptide | |
| RU2378374C2 (en) | Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae | |
| RU2387715C2 (en) | RECOMBINANT DNA PROVIDING PRODUCTION OF POLYPEPTIDES P6, P7, P8 EXHIBITING PROTECTIVE PROPERTIES AGAINST STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AND SELECTIVELY CONNECTING IgA | |
| AU758555B2 (en) | Peptides | |
| US20180141981A1 (en) | Immunogenic composition comprising engineered alpha-hemolysin oligopeptides | |
| US20100173842A1 (en) | Vaccine for staphylococcal infections | |
| RU2587627C2 (en) | Complex of recombinant polypeptides with protective properties in relation to streptococcus agalactiae and streptococcus pyogenes | |
| EP3415160B1 (en) | Polypeptides derived from enterococcus and their use for vaccination and the generation of therapeutic antibodies | |
| US20090220538A1 (en) | vaccine for staphylococcal infections | |
| Pereira et al. | Antibodies anti-rFilF protein has anti-biofilm activity against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii | |
| Takahashi | Exploring the Immunostimulatory Properties of GAS Pili | |
| Henningham | Characterisation of anchorless cell-surface proteins: novel candidates for a safe and universal group a streptococcal vaccine | |
| Huang | Analysis of the Streptococcal Hemoprotein Receptor: A Role in Virulence and Host Defense | |
| Reglinski | Highly selective identification of novel vaccine candidate antigens by immunoprecipitation: The group A streptococcal case | |
| ROGGIANI et al. | STREPTOCOCCAL PYOGENIC EXOTOXINS AND RELATED TOXINS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20190314 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191229 |