RU2685947C2 - RECOMBINANT STREPTOCOCCUS PYOGENES (pT7ErmEMM) STRAIN - TUMOR GROWTH INHIBITOR - Google Patents
RECOMBINANT STREPTOCOCCUS PYOGENES (pT7ErmEMM) STRAIN - TUMOR GROWTH INHIBITOR Download PDFInfo
- Publication number
- RU2685947C2 RU2685947C2 RU2016152829A RU2016152829A RU2685947C2 RU 2685947 C2 RU2685947 C2 RU 2685947C2 RU 2016152829 A RU2016152829 A RU 2016152829A RU 2016152829 A RU2016152829 A RU 2016152829A RU 2685947 C2 RU2685947 C2 RU 2685947C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- streptococcus pyogenes
- strain
- pt7ermemm
- gurov
- recombinant strain
- Prior art date
Links
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 title claims abstract description 28
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 title description 6
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 title description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 9
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003095 anti-phagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007078 todd-hewitt medium Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области микробиологии, молекулярной генетики и медицины и может быть использовано в терапии злокачественных новообразований.The invention relates to the field of microbiology, molecular genetics and medicine and can be used in the treatment of malignant tumors.
Традиционные противораковые методы лечения, такие как хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия, эффективны при лечении солидных опухолей, только в некоторой степени. Кроме того, они часто связаны с серьезными побочными эффектами. Альтернативой этим методам лечения является использование некоторых бактерий в качестве иммуномодуляторов и цитолитиков с прямой противоопухолевой активностью.Traditional anti-cancer therapies, such as surgery, radiation therapy and chemotherapy, are effective in treating solid tumors, only to a certain extent. In addition, they are often associated with serious side effects. An alternative to these treatments is the use of some bacteria as immunomodulators and cytolytics with direct antitumor activity.
Терапевтический эффект от использования бактерий в лечении рака был продемонстрирован более 100 лет назад [Nowotny A. Handbook of Endotoxin. Vol. 3. Elsevier Science; Amsterdam: 389-448 (1985)]. А в 1890 нью-йоркский врач Coley обнаружил, что у нескольких пациентов с неоперабельными опухолями наблюдалась регрессия роста опухоли после введения Streptococcus pyogenes (СГА) [Coley W.B. Clin Orthop Relat Res: 3-11 (1991)].The therapeutic effect of the use of bacteria in the treatment of cancer was demonstrated more than 100 years ago. [Nowotny A. Handbook of Endotoxin. Vol. 3. Elsevier Science; Amsterdam: 389-448 (1985)]. And in 1890, the New York physician Coley discovered that several patients with inoperable tumors showed regression of tumor growth after administration of Streptococcus pyogenes (GHA) [Coley W.B. Clin Orthop Relat Res: 3-11 (1991)].
Известен штамм Streptococcus pyogenes, введение которого мышам в ранее привитую опухоль (рак поджелудочной железы) приводило к регрессии последней [Maletzki C, Linnebacher М, Kreikemeyer B, Emmrich J. Gut. 57(4): 483-491 (1998)].A known strain of Streptococcus pyogenes, the introduction of which to mice in a previously vaccinated tumor (pancreatic cancer) led to a regression of the latter [Maletzki C, Linnebacher M, Kreikemeyer B, Emmrich J. Gut. 57 (4): 483-491 (1998)].
Однако бактерии Streptococcus pyogenes являются широко распространенным патогеном для человека и приматов, инфицируя, главным образом, назофарингеальную слизистую и кожу.However, the bacteria Streptococcus pyogenes are a common pathogen for humans and primates, infecting mainly the nasopharyngeal mucosa and skin.
Известен штамм Streptococcus pyogenes М39 «Гуров», обладающий противоопухолевой активностью [Черешнев В.А. Биологические законы и жизнеспособность человека: метод многофункциональной восстановительной биотерапии: научное издание: 2-е изд., перераб. и доп. / В.А. Черешнев, А.А. Морова, И.Н. Рямзина. - Пермь, 2006. - 215 с. Библиогр.: С. 215.], однако и этот штамм также проявляет довольно высокую патогенность.A known strain of Streptococcus pyogenes M39 "Gurov", which has antitumor activity [Chereshnev VA Biological laws and human vitality: the method of multifunctional restorative biotherapy: scientific publication: 2nd ed., Pererab. and add. / V.A. Chereshnev, A.A. Morova, I.N. Ryamzin. - Perm, 2006. - 215 p. Bibliography: S. 215.], however, this strain also exhibits rather high pathogenicity.
Задачей настоящего изобретения явилось создание рекомбинантного штамма Streptococcus pyogenes на основе вышеупомянутого штамма «Гуров», обладающего такой же противоопухолевой активностью, но в то же время низкой патогенностью для человека.The present invention was the creation of a recombinant strain of Streptococcus pyogenes on the basis of the above-mentioned strain "Gurov", with the same antitumor activity, but at the same time low pathogenicity for humans.
В основу решения указанной задачи положена модификация нуклеотидной последовательности гена, кодирующего М белок, путем интеграции в него специально сконструированной плазмиды pT7ErmEMM.The solution to this problem is based on the modification of the nucleotide sequence of the gene encoding the M protein by integrating into it a specially designed plasmid pT7ErmEMM.
М белок является одним из основных факторов вирулентности СГА, способствующий устойчивости СГА к фагоцитозу [Maxted W.R. The British Journal of Experimental Pathology. №37(4): 415-422 (1954).]. Впоследствии было доказано, что антифагоцитарную активность М белка обеспечивает область, расположенная на его N-терминальном конце [Cunningham М.W., Beachey Е.Н. Infection and Immunity. №9 (2): 244-248 (1974); Beachey E.H., Campbell G.L., Ofek I. Infection and Immunity. №9 (5): 891-896 (1947).].M protein is one of the main factors of GHA virulence, contributing to GHA resistance to phagocytosis [Maxted W.R. The British Journal of Experimental Pathology. No. 37 (4): 415-422 (1954).]. Subsequently, it was proved that the antiphagocytic activity of the M protein is provided by the region located at its N-terminal end [Cunningham M.W., Beachey E.N. Infection and Immunity. No. 9 (2): 244-248 (1974); Beachey E.H., Campbell G.L., Ofek I. Infection and Immunity. No. 9 (5): 891-896 (1947).].
Получена интегративная плазмида pT7ErmEMM со вставкой гена, кодирующего участок на N-терминальном конце М белка, которая интегрируется в нуклеотидную последовательность исходного штамма «Гуров».An integrative plasmid pT7ErmEMM was obtained with the insertion of a gene encoding a region at the N-terminal end of the M protein, which is integrated into the nucleotide sequence of the original Gurov strain.
Генетическую модификацию осуществляют следующим образом:Genetic modification is as follows:
Проводят анализ гена emm, кодирующего N-терминальный конец М белка, с целью выбора фрагмента, отвечающего за антифагоцитарные свойства М белка. Конструируют пары праймеров, фланкирующих выбранную область на гене emm, включая сайты рестрикции для эндонуклеаз HindIII и EcoRI с целью последующего клонирования в интегративный вектор. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и специфических праймеров получают необходимый фрагмент ДНК.The emm gene encoding the N-terminal end of the M protein is analyzed to select a fragment responsible for the antiphagocytic properties of the M protein. Design primer pairs flanking the selected region on the emm gene, including restriction sites for the HindIII and EcoRI endonucleases for subsequent cloning into an integrative vector. Using the polymerase chain reaction (PCR) and specific primers get the necessary DNA fragment.
Клонирование выбранной последовательности ДНК, проводят в интегративный вектор p7ermB, который был любезно предоставлен Робертом МакЛохланом (США), по сайтам рестрикции эндонуклеаз HindIII и EcoRI с получением интегративной плазмиды pT7ErmEMM. Плазмида содержит: фрагмент, несущий ген устойчивости к эритромицину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага T7, фрагмент гена emm. Полученной плазмидой трансформируют штамм Streptococcus pyogenes М39 «Гуров» с получением рекомбинантного штамма.Cloning of the selected DNA sequence is carried out in the p7ermB integrative vector, which was kindly provided by Robert MacLochlan (USA), at the HindIII and EcoRI endonuclease restriction sites to obtain the pT7ErMEMM integrative plasmid. The plasmid contains: a fragment carrying the erythromycin resistance gene, the promoter and terminator of the RNA polymerase of phage T7, a fragment of the emm gene. The resulting plasmid transform a strain of Streptococcus pyogenes M39 "Gurov" to obtain a recombinant strain.
Заявляемый штамм Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) - ингибитор опухолевого роста депонирован и хранится в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ, регистрационный №174 от 17 ноября 2016 г. и характеризуется следующими признаками:The inventive strain of Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) - tumor growth inhibitor deposited and stored in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM-Obolensk" FBUN SSC MB, registration No. 174 dated November 17, 2016 and is characterized by the following features:
Морфологические признаки. Клетки шаровидной или овоидной формы, растущие чаще в виде цепочек, неспороносные, грамположительные.Morphological signs. Cells of spherical or ovoid shape, growing more often in the form of chains, unrestingly, gram-positive.
Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на питательных средах с добавлением крови или сыворотки крови. При выращивании на 5% кровяном агаре образуют очень мелкие колонии с образованием зоны β-гемолиза. На жидких средах (Todd-Hewitt) рост придонно-пристеночный в виде крошковатого осадка, бульон чаще прозрачен.Cultural features. Bacterial cells grow well on nutrient media supplemented with blood or serum. When grown on 5% blood agar, very small colonies form with the formation of a β-hemolysis zone. On liquid media (Todd-Hewitt) the growth of the bottom-parietal in the form of a crumbly sediment, the broth is often transparent.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при оптимуме температуры +37°C и оптимальных значениях pH от 7.2 до 7.6. Не растут при 10°C и 45°C, в бульоне с 6,5% хлорида натрия, при pH 9,6, в молоке с 0,1% метиленового синего. Ферментируют глюкозу, лактозу, сахарозу, салицин, трегалозу, не ферментируют инулин, сорбит, глицерин, гиппурат натрия. Оптимальная среда для культивирования - среда Todd-Hewitt с 5% CO2.Physical and biological signs. Cells grow at a temperature optimum of + 37 ° C and optimum pH values from 7.2 to 7.6. Do not grow at 10 ° C and 45 ° C, in broth with 6.5% sodium chloride, at pH 9.6, in milk with 0.1% methylene blue. Glucose, lactose, sucrose, salicin, trehalose are fermented, do not ferment inulin, sorbitol, glycerin, hippurum sodium. The optimal culture medium is Todd-Hewitt medium with 5% CO 2 .
На фиг. 1 показана схема получения интегративной плазмиды pT7ErmEMM. Фрагмент ДНК, кодирующий выбранную область М белка, получают с помощью полимеразной цепной реакции и специально сконструированных праймеров. Синтезированный фрагмент ДНК очищают с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (PCR Purification Kit, Qiagen, Германия), расщепляют эндонуклеазами HindIII и EcoRI и лигируют с вектором p7ermB, обработанным такими же ферментами.FIG. 1 shows the scheme for obtaining the integrative plasmid pT7ErmEMM. The DNA fragment encoding the selected region of the M protein is obtained by the polymerase chain reaction and specially designed primers. The synthesized DNA fragment is purified using the PCR Purification Kit (PCR Purification Kit, Qiagen, Germany), digested with the HindIII and EcoRI endonucleases and ligated with the p7ermB vector treated with the same enzymes.
Интегративная плазмида pT7ErmEMM содержит: фрагмент, несущий ген устойчивости к эритромицину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, фрагмент гена emm.The integrative plasmid pT7ErmEMM contains: a fragment carrying the erythromycin resistance gene, a promoter and terminator of the R7 polymerase of phage T7, a fragment of the emm gene.
Полученной плазмидой трансформируют клетки Streptococcus pyogenes М39 «Гуров» по протоколу, описанному Суворовым А.Н. (Suvorov A.N., Kok J. and Venema G. FEMS Microbiol. Lett. - №56. - C. 95-100 (1988)). Для электропорации используют прибор GenePulser (BioRad, США) при разности потенциалов 2500 вольт и продолжительности импульса - 4.2 миллисекунды и расстоянием между электродами - 1 мм, при 2 мкг внесенной в кювету для электропорации ДНК pT7ErmEMM. Трансформанты высевают на агаризованную среду (1% ТНВ агара) с добавлением эритромицина и выращивают в течение 48-72 часов при 37°C. Выросшие колонии анализируют при помощи ПЦР на наличие фрагмента ДНК, кодирующего М белок. В результате ПЦР было установлено, что в область гена М белка произошло встраивание интегративной плазмиды, что прерывало открытую рамку считывания данного гена. Таким образом, получают рекомбинантный штамм Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) нуклеотидная последовательность которого полностью определена путем геномного секвенирования, а область интеграции приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, где встроенная плазмида представлена в позициях с 498 по 3463.The obtained plasmid transform cells of Streptococcus pyogenes M39 "Gurov" according to the protocol described by Suvorov A.N. (Suvorov A.N., Kok J. and Venema G. FEMS Microbiol. Lett. - No. 56. - C. 95-100 (1988)). For electroporation, a GenePulser device (BioRad, USA) is used with a potential difference of 2500 volts and a pulse duration of 4.2 milliseconds and a distance between electrodes of 1 mm, and 2 μg of pT7ErMEMM introduced into a cuvette for electroporation of DNA. Transformants are sown on agar medium (1% TNV agar) with the addition of erythromycin and grown for 48-72 hours at 37 ° C. Grown colonies are analyzed by PCR for the presence of a DNA fragment coding for M protein. As a result of PCR, it was found that an integrative plasmid was inserted into the region of the M protein gene, which interrupted the open reading frame of this gene. Thus, a recombinant strain of Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) is obtained, the nucleotide sequence of which is fully determined by genomic sequencing, and the integration region is given in the sequence listing under the number SEQ ID NO: 1, where the inserted plasmid is represented at positions 498 to 3463.
Полученный рекомбинантный штамм сохраняет групповую принадлежность, характерную морфологию, адгезивную способность к клеткам эпителия и другие свойства S. pyogenes и при этом обладает противоопухолевой активностью.The obtained recombinant strain retains the group affiliation, characteristic morphology, adhesive ability to epithelial cells and other properties of S. pyogenes and at the same time it has antitumor activity.
Исследование противоопухолевой активности полученного штамма проводили in vivo на лабораторных животных (мыши-самцы линии С3НА и беспородные мыши весом 16-18 г, полученные из питомника «Рапполово»). Для получения солидных опухолей мышам линии С3НА подкожно вводят в область спины 2×105 клеток сингенной гепатомы 22а в объеме 0,2 мл физиологического раствора, а беспородным мышам - аналогичное количество клеток саркомы S37. Контрольные животные получают инъекцию физиологического раствора. Оценку выживаемости проводят в группах по 10 животных, опыты повторяют три раза.The study of the antitumor activity of the obtained strain was carried out in vivo in laboratory animals (male mice of the C3HA line and outbred mice weighing 16-18 g, obtained from the kennel "Rappolovo"). To obtain solid tumors, C3HA mice are subcutaneously injected into the back area with 2 × 10 5 cells of syngeneic hepatoma 22a in a volume of 0.2 ml of saline, and outbred mice with a similar number of S37 sarcoma cells. Control animals receive saline injection. Evaluation of survival is carried out in groups of 10 animals, the experiments are repeated three times.
Суспензию живых S. pyogenes, приготовленную в физиологическом растворе pH-7,4 в концентрации 106 бактерий/мл в объеме 50 мкл двукратно вводят внутрь опухолей. Первую инъекцию осуществляют через 9 суток от начала инокуляции опухолевых клеток, при достижении опухолевым узлом размера 2-3 мм. Повторную инъекцию проводят с интервалом 5 суток. Контрольным животным вводят подкожно 50 мкл физиологического раствора. Спустя 5 суток после второй инъекции (19 суток после инокуляции опухоли) опухоли измеряют в двух взаимно перпендикулярных направлениях и вычисляют средний диаметр опухоли по формуле: 
Введение штамма Streptococcus pyogenes М39 «Гуров» животным с гепатомой 22а или саркомой S37 не давало положительного эффекта и не вызывало замедления роста опухоли по сравнению с контрольной группой (фиг. 2). При этом выживаемость мышей с саркомой S37 не улучшалась, а у животных с гепатомой 22а наблюдали даже ухудшение выживаемости по отношению к группе контроля (фиг. 3).Introduction of the Streptococcus pyogenes M39 “Gurov” strain to animals with hepatoma 22a or S37 sarcoma did not give a positive effect and did not cause a slowdown in tumor growth compared with the control group (Fig. 2). At the same time, the survival of mice with S37 Sarcoma was not improved, and in animals with hepatoma 22a, even deterioration in survival was observed with respect to the control group (Fig. 3).
При введении животным рекомбинантного штамма Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) отмечали выраженный терапевтический эффект, который заключался в достоверной задержке опухолевого роста, как по отношению к контрольной группе, так и в отношении группы животных, которым вводили исходный штамм Streptococcus pyogenes М39 «Гуров». Сдерживание опухолевого роста регистрировали на 10 сутки после начала лечения на обеих используемых экспериментальных моделях (фиг. 2). При этом выживаемость мышей при введении штамма Streptococcus pyogenes М39 «Гуров» оказалась выше по сравнению с контрольной группой и с группой животных, которым вводили исходный штамм,When a recombinant strain of Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) was administered to animals, a pronounced therapeutic effect was noted, which consisted in a significant delay of tumor growth, both in relation to the control group and in relation to the group of animals that were injected with the original strain M39 "Gurov" Streptococcus pyogenes. Tumor growth inhibition was recorded on
Этот эффект наблюдался только при росте гепатомы 22а (фиг. 3, фрагмент А) и не проявлялся при росте саркомы S37 (фиг. 3, фрагмент Б).This effect was observed only with the growth of hepatoma 22a (Fig. 3, fragment A) and did not appear with the growth of S37 sarcoma (Fig. 3, fragment B).
Фиг. 2 демонстрирует влияние внутриопухолевого введения S.pyogenes на размер опухолей мышей с гепатомой 22а (фрагмент А) и саркомой S37 (фрагмент Б).FIG. 2 shows the effect of intratumoral administration of S. pyogenes on the size of tumors of mice with hepatoma 22a (fragment A) and S37 sarcoma (fragment B).
По оси ординат: средний диаметр опухоли, мм. I - размер опухоли до начала введения бактерий; II - размер опухоли через 10 дней после начала лечения. 1 - группа контрольных мышей, 2 - животные, получающие внутриопухолевое введение Streptococcus pyogenes М39 «Гуров», 3 - Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM). В каждой группе по 30 мышей. Достоверность различий между группами *<0,05; **<0,01; ***<0,001On the ordinate axis: the average diameter of the tumor, mm. I - the size of the tumor before the introduction of bacteria; II -
На фиг. 3 показано влияние внутриопухолевого введения S.pyogenes на выживаемость мышей с гепатомой 22а (А) и саркомой S37 (Б). 1 - группа контрольных мышей, 2 - животные, получающие внутриопухолевое введение Streptococcus pyogenes М39 «Гуров», 3 - Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM). Достоверность различий по критерию Гехана при росте гепатомы 22а (А): между 1 и 2 p<0,001, между 2 и 3 p<0,01, между 1 и 3 не достоверно. При росте саркомы S37 (Б) различия не достоверны. Медиана выживаемости: (А) 1 - 24, 2 - 14, 3 - 34; (Б) 1 - 40, 2 - 40, 3 - 54 суток.FIG. 3 shows the effect of intratumoral administration of S. pyogenes on the survival of mice with hepatoma 22a (A) and S37 sarcoma (B). 1 - a group of control mice, 2 - animals receiving intratumoral administration of Streptococcus pyogenes M39 "Gurov", 3 - Streptococcus pyogenes (pT7 ErmEMM). Reliability of differences according to the Gekhan criterion with the growth of hepatoma 22a (A): between 1 and 2 p <0.001, between 2 and 3 p <0.01, between 1 and 3 is not reliable. With the growth of sarcoma S37 (B), the differences are not significant. Survival median: (A) 1 - 24, 2 - 14, 3 - 34; (B) 1 - 40, 2 - 40, 3 - 54 days.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что рекомбинантный штамм Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) является более эффективным ингибитором опухолевого роста клеток по сравнению с исходным штаммом «Гуров», проявляя при этом меньшую патогенность и лучшую выживаемость.Based on the data obtained, it can be concluded that the recombinant strain of Streptococcus pyogenes (pT7ErmEMM) is a more effective inhibitor of tumor cell growth compared to the original Gurov strain, showing lower pathogenicity and better survival.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152829A RU2685947C2 (en) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | RECOMBINANT STREPTOCOCCUS PYOGENES (pT7ErmEMM) STRAIN - TUMOR GROWTH INHIBITOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152829A RU2685947C2 (en) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | RECOMBINANT STREPTOCOCCUS PYOGENES (pT7ErmEMM) STRAIN - TUMOR GROWTH INHIBITOR |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016152829A3 RU2016152829A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152829A RU2016152829A (en) | 2018-07-02 |
| RU2685947C2 true RU2685947C2 (en) | 2019-04-23 |
Family
ID=62813986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016152829A RU2685947C2 (en) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | RECOMBINANT STREPTOCOCCUS PYOGENES (pT7ErmEMM) STRAIN - TUMOR GROWTH INHIBITOR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2685947C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221351B1 (en) * | 1989-10-03 | 2001-04-24 | David S. Terman | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds |
| RU2472856C2 (en) * | 2010-05-24 | 2013-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) | RECOMBINANT PLASMID pVA891-2 [mutR], METHOD OF PRODUCING mutR GENE-MUTANT STRAINS OF Streptococcus pyogenes, RECOMBINANT STRAINS OF Streptococcus pyogenes (VERSIONS) FOR PREVENTING STREPTOCOCCAL INFECTIONS |
-
2016
- 2016-12-30 RU RU2016152829A patent/RU2685947C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221351B1 (en) * | 1989-10-03 | 2001-04-24 | David S. Terman | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds |
| RU2472856C2 (en) * | 2010-05-24 | 2013-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) | RECOMBINANT PLASMID pVA891-2 [mutR], METHOD OF PRODUCING mutR GENE-MUTANT STRAINS OF Streptococcus pyogenes, RECOMBINANT STRAINS OF Streptococcus pyogenes (VERSIONS) FOR PREVENTING STREPTOCOCCAL INFECTIONS |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HOBOHM U., Fever and cancer in perspective, Cancer Immunology, Immunotherapy, 2001, Vol.50, Issue 8, pp.391-396. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016152829A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152829A (en) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2684749T3 (en) | Methods to build vaccines without antibiotic resistance | |
| US9198950B2 (en) | Recombinant bacterium comprising a toxin/antitoxin system | |
| KR101750007B1 (en) | Solid cancer agent using bacteria | |
| CN102741407B (en) | Transformation plasmid | |
| CN104837506A (en) | Immunomodulatory minicells and methods of use | |
| KR102683896B1 (en) | Expression Vector for Secreting GM-CSF and Anticancer Recombinant Microbials Transformed thereby | |
| EP2891711B1 (en) | Lactobacillus mutant, nucleotide sequence for lactobacillus mutant and primers for nucleotide sequence of lactobacillus mutant | |
| CN111333713B (en) | Lactobacillus plantarum for expressing antibacterial peptide gene | |
| CN101448940A (en) | Method of constructing gene transport support | |
| RU2685947C2 (en) | RECOMBINANT STREPTOCOCCUS PYOGENES (pT7ErmEMM) STRAIN - TUMOR GROWTH INHIBITOR | |
| WO2011026447A1 (en) | New antibiotic containing simulacrum antibody, preparation method and application thereof | |
| CN117384267A (en) | Exopalaemon carinicauda antibacterial peptide, encoding gene EcCrustin, recombinant strain and application thereof | |
| KR20160062289A (en) | Novel Salmonella for treatment of cancer, and use thereof | |
| KR101773580B1 (en) | Novel Salmonella for treatment of cancer, and use thereof | |
| Israr et al. | Lactic acid bacteria as vectors: a novel approach for mucosal vaccine delivery | |
| KR101421575B1 (en) | Salmonellae having improved inducible gene expression and use thereof | |
| RU2640250C2 (en) | Method for introgression of pathogenic streptococcus genes in chromosomal dna of probiotic strain of enterococcus faecium l3 for expression in piles | |
| WO2024096122A1 (en) | Microorganism that regulates toll-like receptor 5 (tlr5) activation ability, and method for producing same | |
| TWI678209B (en) | Probiotic composition for preventing, improving or alleviating pancreatic cancer and application thereof | |
| KR101576355B1 (en) | Novel strain having dextranase activity and use thereof | |
| CN112359060B (en) | Recombinant vector containing targeted mutant KRAS fusion gene, fusion protein and protein complex, and construction method and application thereof | |
| RU2689903C1 (en) | Freshly isolated strain of bordetella pertussis bacteria - producer of a complex of protective antigens for production of cell-free pertussis vaccine | |
| RU2677668C2 (en) | Lactobacillus helveticus d75 and d76 strains and preparation therewith | |
| KR20240099400A (en) | Drugs and applications for the treatment and/or prevention of cancer | |
| Avila-Campos | Bacteroides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20181217 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191231 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210519 |