RU2682721C2 - Biological microchip for detection of tumor exosomes in serum of human for diagnosing colorectal cancer - Google Patents
Biological microchip for detection of tumor exosomes in serum of human for diagnosing colorectal cancer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2682721C2 RU2682721C2 RU2016145097A RU2016145097A RU2682721C2 RU 2682721 C2 RU2682721 C2 RU 2682721C2 RU 2016145097 A RU2016145097 A RU 2016145097A RU 2016145097 A RU2016145097 A RU 2016145097A RU 2682721 C2 RU2682721 C2 RU 2682721C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exosomes
- biological
- microchip
- immobilized
- biological microchip
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение (Technical Field)The technical field to which the invention relates (Technical Field)
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и биохимии, в частности, к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу. Предлагаемое изобретение может найти применение в иммунологии, клинической лабораторной диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в том числе колоректального рака.The invention relates to biotechnology, medicine and biochemistry, in particular, to analytical biochemistry and immunochemical analysis. The present invention can find application in immunology, clinical laboratory diagnostics, in the diagnosis of cancer, including colorectal cancer.
Уровень техники (Background Art)Background Art
Экзосомы это небольшие (40-100 нм) внеклеточные мембранные везикулы, секретируемые практически всеми типами клеток. Образование экзосом является необходимым условием жизнедеятельности многоклеточного организма, т.к. они принимают участие в межклеточных коммуникациях (везикулярный транспорт), позволяющих скоординировать биохимические процессы, протекающие в клетке. В настоящее время определение экзосом в биологических жидкостях (кровь, моча, слюна и т.д.) имеет огромное значение, поскольку они являются носителями маркеров различных заболеваний, в том числе онкологических. Кроме того, экзосомы являются перспективной системой доставки терапевтических агентов [
Формирование экзосом происходит в цитоплазме в составе мультивезикулярных телец. Экзосомы высвобождаются во внеклеточное пространство после слияния мембраны мультивезикулярного тельца и клеточной мембраны [Colombo М, Raposo G, Gery С. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. 2014 Annu Rev Cell Dev Biol. N 30. P. 255-289]. Поскольку опухолевые экзосомы формируются из эндоплазматической мембраны раковой клетки, репертуар имеющихся на их поверхности мембранных белков хорошо коррелирует с репертуаром мембранных белков экспортирующих их опухолевых клеток. Мембрана экзосомы состоит из липидов и содержит трансмембранные белки. Липидная оболочка защищает экзосомы от агрессивных ферментов, поэтому возможность их разрушения при транспортировке и хранении образцов невелика.The formation of exosomes occurs in the cytoplasm as part of multivesicular bodies. Exosomes are released into the extracellular space after the fusion of the multivesicular body and cell membrane membranes [Colombo M, Raposo G, Gery C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. 2014 Annu Rev Cell Dev Biol. N 30. P. 255-289]. Since tumor exosomes are formed from the endoplasmic membrane of a cancer cell, the repertoire of membrane proteins on their surface correlates well with the repertoire of membrane proteins of the tumor cells exporting them. The exosome membrane is composed of lipids and contains transmembrane proteins. The lipid shell protects exosomes from aggressive enzymes, so the possibility of their destruction during transportation and storage of samples is small.
Главными белками-маркерами экзосом являются трансмембранные белки-тетраспанины CD9, CD63, CD81 [
Все большее количество публикаций, свидетельствующих о роли экзосом в органоспецифическом метастазировании рака, подтверждают острую необходимость в создании простых инструментальных методов определения экзосомальных мембранных белковых маркеров в биологических жидкостях [Hoshino A., Costa-Silva В., Shen T.-L., Rodrigues G., Hashimoto A., Mark M.T., Molina H., Kohsaka S., Di Giannatale A., Ceder S., Singh S., Williams C, Soplop N., Uryu K., Pharmer L., King Т., Bojmar L., Davies A. E., Ararso Y., Zhang Т., Zhang H., Hernandez J., Weiss J.a M., Dumont-Cole V. D., Kramer K. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. 2015 Nature 527, 329-335].A growing number of publications demonstrating the role of exosomes in organ-specific cancer metastasis confirm the urgent need to create simple instrumental methods for determining exosomal membrane protein markers in biological fluids [Hoshino A., Costa-Silva B., Shen T.-L., Rodrigues G ., Hashimoto A., Mark MT, Molina H., Kohsaka S., Di Giannatale A., Ceder S., Singh S., Williams C, Soplop N., Uryu K., Pharmer L., King T., Bojmar L., Davies AE, Ararso Y., Zhang T., Zhang H., Hernandez J., Weiss Ja M., Dumont-Cole VD, Kramer K. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. 2015 Nature 527, 329-335].
Таким образом, анализ белкового состава сывороточных экзосом позволяет заметно увеличить чувствительность диагностики, прогнозирования и мониторинга лечения различных видов опухолей. Дополнительное преимущество in vitro диагностики экзосом - отсутствие болезненной и небезопасной хирургической биопсии тканей, что особенно важно при диагностике сложнодоступных опухолей.Thus, the analysis of the protein composition of serum exosomes can significantly increase the sensitivity of the diagnosis, prognosis and monitoring of treatment of various types of tumors. An additional advantage of in vitro diagnosis of exosomes is the absence of a painful and unsafe surgical tissue biopsy, which is especially important in the diagnosis of difficult to access tumors.
Обобщая вышесказанное, можно утверждать, что создание методов мультиплексного in vitro определения экзосом в биологических жидкостях, в том числе в сыворотке крови, имеет огромную практическую значимость.Summarizing the above, it can be argued that the creation of methods of multiplex in vitro determination of exosomes in biological fluids, including serum, is of great practical importance.
В области клинической диагностики разработаны несколько подходов, связанных с анализом содержимого экзосом. Самый распространенный из них - осаждение экзосом при помощи магнитных частиц и выделение микроРНК из содержимого экзосом.In the field of clinical diagnosis, several approaches have been developed related to the analysis of exosome contents. The most common of them is the deposition of exosomes using magnetic particles and the isolation of microRNAs from the contents of exosomes.
Новейшей разработкой в области in vitro диагностики экзосом является «жидкая биопсия». Например, тест «Prostate Cancer Liquid Biopsy Test» (компания Exosomes Diagnostics (http://www.exosomedx.com, Cambridge, MA 02139)) подразумевает проведение анализа микроРНК экзосом, выделенных из мочи для диагностики рака простаты. Кроме того, компания Exosomes Diagnostics разработала тест для диагностики рака легких «ExoDx Lung(ALK)». Метод основан на выделении и анализе экзосомальной РНК из плазмы крови для выявления мутации EML4-ALK. Эту методику пока нельзя причислить к «рутинному анализу» в клинической практике, т.к. внедрение этого метода задерживается из-за отсутствия стандартного способа выделения экзосом. Эта технологическая проблема активно обсуждается в современной литературе [Zeringer Е, Barta Т, Li М, Vlassov AV. Strategies for isolation of exosomes. 2015 Cold Spring Harb Protoc. N4. P. 319-323]. Существование принципиально различных подходов к выделению экзосом свидетельствует об отсутствии оптимального метода [Livshits М.А., Khomyakova Е., Evtushenko E.G., Lazarev V.N., Kulemin N.A., Semina S.E., Generozov E.V. & Govorun V.M. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. 2015 Nature. Scientific Reports 5:17319]. Применяемые на сегодняшний день методы основаны на специфической характеристике физической плотности или наличии специфических белковых маркеров на поверхности экзосом.The latest development in the field of in vitro diagnosis of exosomes is a “liquid biopsy”. For example, the “Prostate Cancer Liquid Biopsy Test” (Exosomes Diagnostics (http://www.exosomedx.com, Cambridge, MA 02139)) involves analysis of exosome microRNAs isolated from urine to diagnose prostate cancer. In addition, Exosomes Diagnostics has developed the ExoDx Lung (ALK) test for the diagnosis of lung cancer. The method is based on the isolation and analysis of exosomal RNA from blood plasma to detect the EML4-ALK mutation. This technique cannot yet be considered a “routine analysis” in clinical practice, as the introduction of this method is delayed due to the lack of a standard method for the isolation of exosomes. This technological problem is actively discussed in modern literature [Zeringer E, Barta T, Li M, Vlassov AV. Strategies for isolation of exosomes. 2015 Cold Spring Harb Protoc. N4. P. 319-323]. The existence of fundamentally different approaches to the isolation of exosomes indicates the absence of an optimal method [Livshits MA, Khomyakova E., Evtushenko E.G., Lazarev V.N., Kulemin N.A., Semina S.E., Generozov E.V. & Govorun V.M. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. 2015 Nature. Scientific Reports 5: 17319]. The methods used today are based on a specific characteristic of physical density or the presence of specific protein markers on the surface of exosomes.
Основной проблемой при in vitro анализе экзосом является гетерогенность их популяции в составе любой биологической жидкости. Наблюдаются различия как в плане физических, так и биохимических характеристик [Jeppesen DK, Hvam ML, Primdahl-Bengtson В, Boysen AT, Whitehead B, Dyrskjot L, Ornto TF, Howard KA, Ostenfeld MS. Comparative analysis of discrete exosome fractions obtained by differential centrifugation. 2014 J Extracell Vesicles. N 3. P. 25011; Tauro BJ, Greening DW, Mathias RA, Mathivanan S, Ji H, Simpson RJ. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. 2013 Mol Cell Proteomics. Vol. 12, N 3. P. 587-598]. Кроме того, любая биологическая жидкость, в том числе сыворотка крови и моча, содержит комплексы молекул или субклеточных образований, поэтому ни один из существующих методов выделения экзосом не может гарантировать получения экзосом только определенного вида.The main problem in the in vitro analysis of exosomes is the heterogeneity of their population in any biological fluid. Differences are observed both in terms of physical and biochemical characteristics [Jeppesen DK, Hvam ML, Primdahl-Bengtson B, Boysen AT, Whitehead B, Dyrskjot L, Ornto TF, Howard KA, Ostenfeld MS. Comparative analysis of discrete exosome fractions obtained by differential centrifugation. 2014 J Extracell Vesicles.
Готовых решений, предлагающих анализ экзосом в сыворотке крови, немного. Группа американских исследователей разработала высокочувствительный аналитический прибор для быстрого изучения микровезикул непосредственно в образцах крови пациентов [Shao Н, Chung J., Balaj L., et al., Lee H. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. 2012 Nat. Med. 18, 1835- 1840]. В основе метода лежит технология микрофлюидного биочипа. Кровь пропускают через специальный аппарат, в котором микровезикулы метят моноклональными антителами против CD63, связанными с магнитными наночастицами, а затем выявляют белковые профили с помощью миниатюрной детекторной системы, использующей ядерный магнитный резонанс.There are few ready-made solutions offering an analysis of exosomes in blood serum. A group of American researchers has developed a highly sensitive analytical instrument for the rapid study of microvesicles directly in patient blood samples [Shao H, Chung J., Balaj L., et al., Lee H. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. 2012 Nat. Med. 18, 1835-1840]. The method is based on microfluidic biochip technology. Blood is passed through a special apparatus in which microvesicles are labeled with anti-CD63 monoclonal antibodies bound to magnetic nanoparticles, and then protein profiles are detected using a miniature nuclear magnetic resonance detection system.
Еще одним изобретением является патент Российской Федерации №2520741 [Новый способ количественного определения и охарактеризования микровезикул в жидкостях организма человека /WO 2009092386 A new method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids. Дата публикации: 27.06.2014]. Описанный в данном патенте тест (ExoTest) - это анализ на базе сэндвич иммуноферментного анализа (ИФА), используемый для количественного и качественного анализа экзосом, полученных из биологических жидкостей человека (плазма крови, сыворотка, моча, слюна) или из супернатанта клеточных культур. Лунки планшета покрыты антителами, специфичными для всех экзосом или для конкретной субпопуляции экзосом. После загрузки в лунки образцов, экзосомы прикрепляются ко дну ячеек за счет иммуноаффинности. Далее они детектируются первичным антителом, которое в свою очередь, связывается с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. При добавлении субстрата происходит изменение окраски раствора (интенсивность цвета пропорциональна количеству экзосом, находящихся в ячейке). Помимо колориметрического анализа предлагаются также флуоресцентные и люминесцентные тесты. В ExoTest используется антитело против Rab5 для связывания экзосом, присутствующих в очищенных препаратах. В качестве антитела для детекции в ExoTest используется антитело, распознающее либо антиген CD63, либо другие антигены, экспрессируемые клетками-источниками экзосом, такие как кавеолин-1 - белок, ассоциированный с метастазирующим поведением опухолей.Another invention is the patent of the Russian Federation No. 2520741 [A new method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids. A new method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids. Date of publication: 06/27/2014]. The test described in this patent (ExoTest) is an analysis based on an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) used for the quantitative and qualitative analysis of exosomes obtained from human biological fluids (blood plasma, serum, urine, saliva) or from cell culture supernatant. Wells of the plate are coated with antibodies specific for all exosomes or for a specific subpopulation of exosomes. After loading samples into the wells, exosomes attach to the bottom of the cells due to immunoaffinity. They are then detected by a primary antibody, which in turn binds to a secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase. When the substrate is added, the color of the solution changes (the color intensity is proportional to the number of exosomes in the cell). In addition to colorimetric analysis, fluorescence and luminescent tests are also offered. ExoTest uses an anti-Rab5 antibody to bind the exosomes present in purified preparations. As an antibody for detection in ExoTest, an antibody is recognized that recognizes either CD63 antigen or other antigens expressed by exosome source cells, such as caveolin-1, a protein associated with metastatic tumor behavior.
Недостаток данного способа - отсутствие фенотипирования экзосом, поскольку тест является однопараметрическим. Одно антитело используется для связывания экзосом, одно - для детекции. Таким образом, одновременное определение нескольких молекулярных маркеров, представленных на поверхности экзосом, невозможно. Необходимость проведения дополнительных исследований увеличивает стоимость анализа для пациента.The disadvantage of this method is the lack of phenotyping of exosomes, since the test is one-parameter. One antibody is used to bind exosomes, and one is used for detection. Thus, the simultaneous determination of several molecular markers present on the surface of exosomes is impossible. The need for additional research increases the cost of analysis for the patient.
В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды (антитела, олигонуклеотиды и т.д.). Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа. Такой подход заменяет несколько индивидуальных ИФА тестов. Использование технологии микрочипов для проведения лабораторных исследований позволяет миниатюризировать и упростить процедуру анализа.Currently, the task of conducting multi-parameter analysis with a minimum volume of the test sample is solved using biological microarrays - arrays of elements containing immobilized biological probes (antibodies, oligonucleotides, etc.). The creation of biochips allowed the transfer of the macro variant of immunochemical analysis into the microchip format. This approach replaces several individual ELISA tests. The use of microchip technology for laboratory research allows miniaturization and simplification of the analysis procedure.
Существует изобретение, позволяющее анализировать экзосомы на микрочипе [патентная заявка WO 2015029979 Exosome analysis method, exosome analysis chip, and exosome analysis device Дата публикации: 05.03.2015]. Согласно описанию, способ состоит из нескольких стадий. На первой стадии происходит контакт образца, содержащего экзосомы, с подложкой (микрочипом), способной селективно связывать липидный бислой мембран. Подложка модифицирована соединениями, имеющими гидрофобную и гидрофильную цепи, что позволяет адсорбировать экзосомы из образца на подложке. Следующей стадией является процесс специфического связывания первой молекулы с соединениями, находящимися на поверхности экзосома. Процесс детекции бинарного комплекса первая молекула-экзосома на подложке происходит за счет специфического связывания с меченой молекулой. Меченая молекула (например, с флуоресцентной или ферментативной меткой) специфически взаимодействует с первой молекулой.There is an invention that allows the analysis of exosomes on a microchip [patent application WO 2015029979 Exosome analysis method, exosome analysis chip, and exosome analysis device Publication date: 03/05/2015]. According to the description, the method consists of several stages. At the first stage, a sample containing exosomes contacts with a substrate (microchip) capable of selectively binding the lipid membrane bilayer. The substrate is modified with compounds having a hydrophobic and hydrophilic chain, which allows adsorption of exosomes from the sample on the substrate. The next stage is the process of specific binding of the first molecule to compounds located on the surface of the exosome. The detection of the binary complex of the first exosome molecule on the substrate occurs due to specific binding to the labeled molecule. A labeled molecule (for example, with a fluorescent or enzymatic label) specifically interacts with the first molecule.
Недостатком данного изобретения является использование неспецифической сорбции для захвата экзосом из образца. Происходит неселективный захват всех экзосом. Поскольку в крови помимо экзосом содержатся различные внеклеточные везикулы, например, такие как микропузырьки или апоптозные тела, велика вероятность того, что эти внеклеточные везикулы также будут адсорбированы на подложке.The disadvantage of this invention is the use of non-specific sorption to capture exosomes from a sample. Non-selective capture of all exosomes occurs. Since blood contains various extracellular vesicles in addition to exosomes, for example, such as microbubbles or apoptotic bodies, it is highly likely that these extracellular vesicles will also be adsorbed on the substrate.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующее изобретение: патентная заявка WO 2012048372 Assay for disease detection (Дата публикации 19.04.2012). Согласно описанию, анализ для обнаружения заболеваний включает следующие стадии: 1) выделение экзосом из биологического образца; 2) взаимодействие выделенных экзосом с микрочипом, содержащим множество антител или связывающих фрагментов антител; 3) захват экзосом на микрочипе путем связывания экзосом с одним или несколькими из множества антител или связывающих фрагментов антител; 4) обработка захваченных экзосом меченым агентом для выбранного маркера на поверхности экзосом. указывающего на их клеточное происхождение; 5) обнаружение подмножества экзосом, имеющих выбранный маркер; 6) идентификация репертуара связавшихся белков на поверхности экзосом, который является показателем заболевания. В предпочтительной форме, белковый маркер является частью конкретной сигнатуры заболевания, например, сердечно-сосудистых заболеваний или диабета. В частном случае, для колоректального рака, опухолевый маркер выбирают из ЕрСАМ (эпителиальная молекула клеточной адгезии), CEA (раково-эмбриональный антиген) или А33.As the closest analogue (prototype) of the technical solution that forms the basis of the present invention, the following invention can be cited: patent application WO 2012048372 Assay for disease detection (Publication date 04/19/2012). According to the description, the analysis for the detection of diseases includes the following stages: 1) isolation of exosomes from a biological sample; 2) the interaction of the selected exosomes with a microchip containing many antibodies or antibody binding fragments; 3) capture of exosomes on a microchip by binding exosomes to one or more of a variety of antibodies or antibody binding fragments; 4) treatment of the captured exosomes with a labeled agent for the selected marker on the surface of the exosomes. indicating their cellular origin; 5) detection of a subset of exosomes having a selected marker; 6) identification of the repertoire of bound proteins on the surface of exosomes, which is an indicator of the disease. In a preferred form, the protein marker is part of a particular signature of the disease, for example, cardiovascular disease or diabetes. In the particular case, for colorectal cancer, the tumor marker is selected from EpCAM (epithelial cell adhesion molecule), CEA (cancer-embryonic antigen), or A33.
В описанном техническом решении экзосомы выделяют из биологического образца методом ультрацентрифугирования, аффинной очистки или осаждения. Для анализа используют двумерные микрочипы DotScan™ с иммобилизоваными антителами к CD-белкам (или других поверхностным белкам), которые связываются с соответствующими CD антигенами (или другими поверхностными белками) на поверхности экзосом. Предпочтительно, массив антител включает в себя десять или более антител на твердой подложке. В качестве твердой подложки может быть использован любой подходящий материал, такой как стекло, пластик, микропористый кремний, целлюлоза, керамический материал, нитроцеллюлоза и др.In the described technical solution, exosomes are isolated from a biological sample by ultracentrifugation, affinity purification or sedimentation. For analysis, two-dimensional DotScan ™ microarrays with immobilized antibodies to CD proteins (or other surface proteins) that bind to the corresponding CD antigens (or other surface proteins) on the surface of exosomes are used. Preferably, the array of antibodies includes ten or more antibodies on a solid support. As a solid support, any suitable material can be used, such as glass, plastic, microporous silicon, cellulose, ceramic material, nitrocellulose, etc.
Недостатками прототипа являются: 1) необходимость предварительного выделения экзосом из биологического образца; 2) использование двумерных микрочипов.The disadvantages of the prototype are: 1) the need for preliminary isolation of exosomes from a biological sample; 2) the use of two-dimensional microchips.
Добавление этапа предварительного выделения экзосом из биологических жидкостей делает проведение анализа трудоемким, требует привлечения высококвалифицированного персонала, увеличивает время и стоимость анализа, при этом необходимы большие объемы биологических образцов.Adding the stage of preliminary isolation of exosomes from biological fluids makes the analysis time-consuming, requires the involvement of highly qualified personnel, increases the time and cost of the analysis, and large volumes of biological samples are required.
Недостатками двумерных микрочипов, в которых антитела или антигены закреплены непосредственно на поверхности носителя, являются низкая и неконтролируемая эффективность иммобилизации, низкая иммобилизационная емкость, наличие контакта иммобилизованных соединений с гидрофобной поверхностью носителя, что может приводить к потере биологической активности зондов белковой природы.The disadvantages of two-dimensional microarrays in which antibodies or antigens are attached directly to the surface of the carrier are low and uncontrolled immobilization efficiency, low immobilization capacity, the presence of contact of immobilized compounds with the hydrophobic surface of the carrier, which can lead to the loss of the biological activity of protein probes.
Таким образом, исходя из уровня техники, существует потребность в создании трехмерного биологического микрочипа и разработки способа детекции опухолевых экзосом непосредственно в сыворотке крови, лишенных указанных выше недостатков.Thus, based on the prior art, there is a need to create a three-dimensional biological microchip and to develop a method for detecting tumor exosomes directly in blood serum, devoid of the above disadvantages.
Раскрытие сущности изобретения (Disclosure of Invention)Disclosure of Invention
Задачами настоящего изобретения являются: 1) создание биологического микрочипа для обнаружения экзосом в сыворотке крови человека с целью диагностики колоректального рака; 2) разработка способа детекции экзосом в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе.The objectives of the present invention are: 1) the creation of a biological microchip for the detection of exosomes in human serum in order to diagnose colorectal cancer; 2) the development of a method for the detection of exosomes in human serum on a biological microchip.
Первая техническая задача решается за счет того, что создан биологический микрочип, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, сформированных на подложке методом фото- или химически индуцируемой полимеризации и содержащих одинаковые или различные по своей природе биологические молекулы (лиганды). Биологический микрочип может одновременно содержать элементы с иммобилизованными антителами против белков, представленных на поверхности экзосом, ассоциированных с колоректальным раком, и, при необходимости, дополнительно элементы, содержащие иммобилизованные антитела против мембранных белков тетраспанинов, относящихся к соответствующим CD антигенам, являющихся молекулярными маркерами экзосом. Также биологический микрочип содержит пустые гелевые элементы, не содержащие иммобилизованных зондов, для контроля неспецифических взаимодействий.The first technical problem is solved due to the fact that a biological microchip is created, which is an array of three-dimensional hydrogel elements formed on a substrate by photo- or chemically induced polymerization and containing biological molecules (ligands) that are the same or different in nature. A biological microchip can simultaneously contain elements with immobilized antibodies against proteins present on the surface of exosomes associated with colorectal cancer, and, if necessary, additionally elements containing immobilized antibodies against tetraspanin membrane proteins related to the corresponding CD antigens, which are molecular markers of exosomes. The biological microchip also contains empty gel elements that do not contain immobilized probes to control non-specific interactions.
Существенные признаки, характеризующие биологический микрочип согласно настоящему изобретению:The essential features characterizing the biological microchip according to the present invention:
1. Биологический микрочип допускает одновременное проведение различных иммунологических реакций, например, взаимодействие антител с тетраспанинами экзосом и взаимодействие антител к трансмембранному белку экзосом с детекцией образовавшихся комплексов при помощи одного или смеси конъюгатов с флуоресцентной или другой меткой.1. A biological microchip allows the simultaneous implementation of various immunological reactions, for example, the interaction of antibodies with exosome tetraspanins and the interaction of antibodies to the exosome transmembrane protein with the detection of the complexes formed using one or a mixture of conjugates with a fluorescent or other label.
2. Ячейки гидрогелевого биочипа обладают значительно большей иммобилизационной емкостью по сравнению с элементами планарных микрочипов, что повышает возможность образования бинарного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома и увеличивает чувствительность анализа.2. Cells of the hydrogel biochip have a significantly higher immobilization capacity compared to planar microarray elements, which increases the possibility of the formation of a binary complex of an immobilized antibody-exosome and increases the sensitivity of the analysis.
3. Иммобилизованные антитела сохраняют свою биологическую активность благодаря гидрофильным свойствам гелевой ячейки.3. Immobilized antibodies retain their biological activity due to the hydrophilic properties of the gel cell.
4. В качестве исследуемых объектов согласно настоящему изобретению предпочтительно предлагаются экзосомы, находящиеся в сыворотке крови человека.4. As test objects according to the present invention, exosomes present in human serum are preferably provided.
4. Для иммуноанализа экзосом в качестве иммобилизованных лигандов используют антитела против белков, ассоциированных с колоректальным раком, представленных на поверхности экзосом (например, антигена А33 и/или семейства раково-эмбрионального антигена) и, при необходимости, дополнительно антитела против мембранных белков-маркеров экзосом (например, тетраспанинов CD9, CD63, CD 81).4. For immunosynthesis of exosomes, antibodies against proteins associated with colorectal cancer present on the surface of exosomes (for example, A33 antigen and / or the cancer-embryonic antigen family) are used as immobilized ligands and, if necessary, additional antibodies against membrane protein markers of exosomes (e.g. tetraspanins CD9, CD63, CD 81).
5. В качестве антител, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой природы, такие как моноклональные антитела, поликлональные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела, а также пептидные и нуклеотидные аналоги антител.5. Protein compounds, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, various types of mini antibodies, including Fab fragments and single chain antibodies, as well as peptide and nucleotide analogs of antibodies, can act as antibodies immobilized in gel cells.
Способ изготовления биологического микрочипа описан в примере 1, фотография биологического микрочипа в проходящем свете приведена на Фиг. 1 (один из возможных вариантов схемы биочипа).A method of manufacturing a biological microchip is described in Example 1, a photograph of a biological microchip in transmitted light is shown in FIG. 1 (one of the possible options for the biochip scheme).
Вторая техническая задача решается за счет того, что разработанный способ детекции экзосом в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе согласно настоящему изобретению включает проведение нескольких стадий:The second technical problem is solved due to the fact that the developed method for the detection of exosomes in human serum on a biological microchip according to the present invention includes several stages:
а) взаимодействие биологического микрочипа с образцом сыворотки крови человека с образованием специфических бинарных иммунных комплексов соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с молекулами, представленными на поверхности экзосом;a) the interaction of a biological microchip with a sample of human blood serum with the formation of specific binary immune complexes of compounds immobilized in the hydrogel cells of the microchip with molecules present on the surface of exosomes;
б) детекция поверхностных маркеров связавшихся экзосом с образованием тройных комплексов иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело;b) detection of surface markers of bound exosomes with the formation of triple complexes of an immobilized antibody-exosome-labeled antibody;
в) регистрация результатов иммуноанализа;c) recording the results of immunoassay;
г) определение фенотипа, то есть конкретного типа молекул на поверхности экзосом.d) determination of the phenotype, that is, a specific type of molecule on the surface of exosomes.
Существенные признаки, характеризующие способ детекции экзосом согласно настоящему изобретению:The essential features characterizing the method of detection of exosomes according to the present invention:
1. Способ настоящего изобретения позволяет проводить множественный параллельный иммунологический анализ экзосом.1. The method of the present invention allows for multiple parallel immunological analysis of exosomes.
2. Определение экзосом в сыворотке крови проводят при помощи сэндвич-иммуноанализа. В этом случае биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемого соединения, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемые экзосомы, и происходит образование специфического бинарного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома. Образование комплекса обеспечивается за счет специфичного взаимодействия иммобилизованных антител с белками-мишенями, представленными на поверхности экзосом.2. Determination of exosomes in serum is carried out using a sandwich immunoassay. In this case, the biological microchip contains immobilized antibodies against the analyte, the reaction medium in step a ) contains the exosomes being analyzed, and a specific binary complex of the immobilized antibody-exosome is formed. The formation of the complex is ensured by the specific interaction of immobilized antibodies with target proteins present on the surface of exosomes.
3. После инкубации микрочипа с образцом, содержащим анализируемые экзосомы, проводится детекция образовавшихся бинарных комплексов в соответствующих ячейках микрочипа с помощью меченых антител, специфичных к экзосомальным мембранным и/или трансмембранным белкам. При этом происходит образование тройного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело. Схема сэндвич-иммуноанализа на биологическом микрочипе приведена на Фиг. 2.3. After incubation of the microchip with a sample containing the analyzed exosomes, the binary complexes formed in the corresponding cells of the microchip are detected using labeled antibodies specific for exosomal membrane and / or transmembrane proteins. In this case, the formation of a triple complex of an immobilized antibody-exosome-labeled antibody occurs. A biological microarray sandwich immunoassay diagram is shown in FIG. 2.
4. Для сэндвич-иммуноанализа возможен также вариант когда стадии а) и б) объединены в одну. В этом случае реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит проявляющие антитела, что сокращает время проведения анализа, так как инкубации микрочипа с анализируемыми экзосомами и детекция происходят одновременно.4. For a sandwich immunoassay, an option is also possible when stages a) and b) are combined into one. In this case, the reaction medium at stage a) additionally contains developing antibodies, which reduces the analysis time, since the incubation of the microchip with the analyzed exosomes and detection occur simultaneously.
5. Регистрация результатов иммуноанализа проводится с использованием флуоресценции либо хемилюминесценции непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Антитела, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции). Кроме того, в качестве метки могут быть использованы, например, полупроводниковые нанокристаллы (квантовые точки), либо золотые наночастицы. Чем выше концентрация анализируемых экзосом в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.5. Registration of the results of immunoassay is carried out using fluorescence or chemiluminescence directly from the gel elements of the microchip. The antibodies used for detection may contain fluorescent labels, biotin, or conjugates to proteins or other compounds capable of participating in reactions leading to light emission (chemiluminescence or bioluminescence). In addition, for example, semiconductor nanocrystals (quantum dots) or gold nanoparticles can be used as a label. The higher the concentration of the analyzed exosomes in the sample, the higher the signal recorded from the corresponding gel cells of the microchip.
Способ детекции экзосом в сыворотке крови с помощью биологического микрочипа описан в примере 2, пример флуоресцентного изображения биологического микрочипа после проведения анализа в сыворотке крови приведен на Фиг. 3А.A method for detecting exosomes in blood serum using a biological microchip is described in Example 2; an example of a fluorescence image of a biological microchip after analysis in blood serum is shown in FIG. 3A.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на чертежи и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.Further, the invention will be disclosed in more detail with reference to the drawings and examples, which are given solely to illustrate and explain the essence of the claimed invention, but which are not intended to limit the scope of claims.
Краткое описание чертежей (Brief Description of Drawings)Brief Description of Drawings
Фиг. 1 демонстрирует вид гидрогелевого биологического микрочипа для обнаружения экзосом в проходящем свете. Каждое соединение иммобилизовано в четырех повторах. Биологический микрочип содержит следующие молекулярные зонды: антитела против CD81, антитела против А33, антитела против CD147, пустые гелевые ячейки.FIG. 1 shows a view of a hydrogel biological microchip for detecting exosomes in transmitted light. Each compound was immobilized in four repetitions. The biological microchip contains the following molecular probes: antibodies against CD81, antibodies against A33, antibodies against CD147, empty gel cells.
Фиг. 2 демонстрирует схему сэндвич-иммуноанализа экзосом на биологическом микрочипе. Показано образование тройного комплекса иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело.FIG. 2 shows a sandwich immunoassay of exosomes on a biological microchip. The formation of a triple complex immobilized antibody-exosome-labeled antibody is shown.
Фиг. 3 представляет результаты определения экзосом в сыворотке крови человека с диагнозом колоректальный рак.FIG. 3 presents the results of determination of exosomes in human serum with a diagnosis of colorectal cancer.
Флуоресцентные изображения гидрогелевого биологического микрочипа после проведения иммунофлуоресцентного анализа экзосом в сыворотке крови (А) и экзосом, выделенных по методу [Thery С., Amigorena S., Raposo G. & Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. 2006 Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3.22] из данной сыворотки крови (Б).Fluorescence images of a hydrogel biological microchip after immunofluorescence analysis of exosomes in serum (A) and exosomes isolated by the method of [Thery C., Amigorena S., Raposo G. & Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids . 2006 Curr. Protoc.
(В) Контроль неспецифических взаимодействий. Флуоресцентное изображение гидрогелевого биологического микрочипа после инкубации с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека).(B) Control of non-specific interactions. Fluorescence image of a hydrogel biological microchip after incubation with "isotype control" (mouse antibodies of the IgG isotype against human IgG).
(Г) Диаграмма флуоресцентных сигналов, получаемых после иммунофлуоресцентного анализа экзосом на биочипе.(D) Diagram of fluorescent signals obtained after immunofluorescence analysis of exosomes on a biochip.
Фиг. 4 Анализ экзосом, выделенных из клеточной линии НТ29, на биологическом микрочипе.FIG. 4 Analysis of exosomes isolated from the HT29 cell line on a biological microchip.
(A) Флуоресцентные изображения биочипа после проведения иммунофлуоресцентного анализа экзосом, выделенных из клеточной линии НТ29.(A) Fluorescence images of the biochip after immunofluorescence analysis of exosomes isolated from the HT29 cell line.
(Б) Контроль неспецифических взаимодействий. Флуоресцентное изображение гидрогелевого биологического микрочипа после инкубации с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека).(B) Control of non-specific interactions. Fluorescence image of a hydrogel biological microchip after incubation with "isotype control" (mouse antibodies of the IgG isotype against human IgG).
(B) Диаграмма флуоресцентных сигналов, получаемых после иммунофлуоресцентного анализа экзосом на биочипе.(B) Diagram of fluorescence signals obtained after immunofluorescence analysis of exosomes on a biochip.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Настоящее изобретение обеспечивает биологический микрочип для множественного параллельного иммунологического анализа поверхностных маркеров экзосом в сыворотке крови человека. Биочип представляет собой массив гидрогелевых элементов. Нанесенные на подложку гидрогелевые ячейки с иммобилизованными соединениями получают в ходе реакции радикальной сополимеризации по запатентованной технологии [Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547 (Б.И.П.М. N 32, 20.11.2003). International Application PCT/RU 01/004204, WO 03/033539]. Методика изготовления биологического микрочипа приведена в примере 1. Связывание лиганда с гидрогелевой матрицей возможно как напрямую при его иммобилизации в процессе формирования геля, так и опосредованно. В качестве примеров опосредованного связывания лиганда с гидрогелевой матрицей может служить иммобилизация через образование специфических комплексов типа авидин (стрептавидин)-биотин или иммобилизация через образование специфических комплексов типа металл-хелат, например, образование связи между иммобилизованной на гидрогелевой матрице нитрилотриуксусной кислотой со связанным с ней координационными связями атомом никеля и рекомбинантным белком, содержащим полигистидиновый фрагмент, и др.The present invention provides a biological microchip for multiple parallel immunological analysis of surface exosome markers in human serum. The biochip is an array of hydrogel elements. Hydrogel cells with immobilized compounds deposited on a substrate are obtained in the course of a radical copolymerization reaction using a patented technology [Mirzabekov AD, Rubina A.Yu., Pankov SV, Method for the polymerization immobilization of biological macromolecules and composition for its implementation, RF Patent N 2216547 (B.I.P.M. N 32, 11.20.2003). International Application PCT / RU 01/004204, WO 03/033539]. The method of manufacturing a biological microchip is shown in example 1. The binding of the ligand to the hydrogel matrix is possible both directly during its immobilization in the process of gel formation, and indirectly. As examples of indirect binding of a ligand to a hydrogel matrix, immobilization through the formation of specific complexes such as avidin (streptavidin) -biotin or immobilization through the formation of specific complexes of the metal-chelate type, for example, the formation of a bond between the nitrilotriacetic acid immobilized on a hydrogel matrix and its associated coordination bonds by a nickel atom and a recombinant protein containing a polyhistidine fragment, etc.
Биологический микрочип может одновременно содержать ячейки с различными иммобилизованными лигандами, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. В качестве лигандов, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой природы, такие как моноклональные антитела, поликлональные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела (scFv и др.), а также небелковой природы, например, нуклеотидные и пептидные аналоги антител. Тип используемых в анализе лигандов определяется рядом факторов, например, аффинностью антител, стабильностью, возможностью иммобилизации антител и введения в них метки (флуоресцентной метки, ферментной метки путем получения конъюгатов и др).A biological microchip can simultaneously contain cells with different immobilized ligands, and an individual compound is immobilized in each individual cell. Ligands immobilized in gel cells may include compounds of a protein nature, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, various types of mini antibodies, including Fab fragments and single chain antibodies (scFv, etc.), as well as non-protein nature, for example , nucleotide and peptide analogs of antibodies. The type of ligands used in the analysis is determined by a number of factors, for example, the affinity of antibodies, stability, the possibility of immobilization of antibodies and the introduction of labels (fluorescent labels, enzyme labels by obtaining conjugates, etc.).
Например, в качестве иммобилизованных лигандов могут быть использованы, антитела против тетраспанинов CD9, CD63, CD81, CD147, против антигена А33, против белков семейства раково-эмбрионального антигена и др. (Фиг. 1). Биологический микрочип также содержит пустые гелевые ячейки для контроля неспецифических взаимодействий.For example, antibodies can be used as immobilized ligands against antibodies against tetraspanins CD9, CD63, CD81, CD147, against antigen A33, against proteins of the cancer-embryonic antigen family, etc. (Fig. 1). The biological microchip also contains empty gel cells to control non-specific interactions.
Биологический микрочип допускает одновременное проведение иммунологических реакций для мультиплексного определения поверхностных маркеров экзосом. Например, первой реакцией может быть взаимодействие экзосомы с антителом к тетраспанину с образованием комплекса антитело к CD антигену-экзосома. Одновременно с этим, если экзосома произошла из раковой клетки и содержит трансмембранный белок, отвечающий за метастазирование, будет происходить образование комплекса антитело к CD антигену-экзосома-антитело к трансмембранному белку, ассоциированному с колоректальным раком.The biological microchip allows simultaneous immunological reactions to multiplex the determination of surface markers of exosomes. For example, the first reaction may be the interaction of an exosome with an anti-tetraspanin antibody to form an antibody-CD antigen-exosome complex. At the same time, if the exosome originated from a cancer cell and contains a transmembrane protein responsible for metastasis, the formation of the antibody-CD complex antigen-exosome-antibody to transmembrane protein associated with colorectal cancer will form.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ множественного параллельного иммуноанализа экзосом на биологическом микрочипе, включающий проведение нескольких стадий:The present invention also provides a method for multiple parallel immunoassay of exosomes on a biological microchip, comprising the steps of:
а) взаимодействие биологического микрочипа с образцом сыворотки крови человека с образованием специфических бинарных иммунных комплексов соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с молекулами, представленными на поверхности экзосом;a) the interaction of a biological microchip with a sample of human blood serum with the formation of specific binary immune complexes of compounds immobilized in the hydrogel cells of the microchip with molecules present on the surface of exosomes;
б) детекция поверхностных маркеров связавшихся экзосом с образованием тройных комплексов иммобилизованное антитело-экзосома-меченое антитело;b) detection of surface markers of bound exosomes with the formation of triple complexes of an immobilized antibody-exosome-labeled antibody;
в) регистрация результатов иммуноанализа;c) recording the results of immunoassay;
г) определение фенотипа, то есть конкретного типа молекул на поверхности экзосом.d) determination of the phenotype, that is, a specific type of molecule on the surface of exosomes.
Детекцию результатов иммуноанализа осуществляют предпочтительно флуориметрически. Антитела и другие соединения, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хемо- или биолюминесценции). В качестве метки могут быть использованы также полупроводниковые нанокристаллы (так называемые квантовые точки), либо золотые наночастицы.The detection of immunoassay results is preferably carried out fluorimetrically. Antibodies and other compounds used for detection may contain fluorescent labels, biotin, or conjugate to proteins or other compounds capable of participating in reactions leading to light emission (chemo- or bioluminescence). Semiconductor nanocrystals (the so-called quantum dots) or gold nanoparticles can also be used as a label.
В качестве анализируемых объектов для количественного иммунологического анализа способом по изобретению предпочтительно предлагаются: экзосомы, находящиеся в сыворотке крови человека.As the analyzed objects for quantitative immunological analysis by the method according to the invention are preferably proposed: exosomes located in human serum.
Дополнительно при необходимости обнаружение экзосом может быть проведено также с предварительным выделением экзосом из биологического образца или клеточных культур, например, методом ультрацентрифугирования.Additionally, if necessary, the detection of exosomes can also be carried out with preliminary isolation of exosomes from a biological sample or cell cultures, for example, by ultracentrifugation.
Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 2. Схема сэндвич-иммуноанализа на биологическом микрочипе приведена на Фиг. 2. В качестве проявляющих антител используют, например, конъюгаты антител против тетраспанинов с флуоресцентными красителями или биотином. В качестве флуоресцентных красителей используют, например, цианиновый 3 (Су3), цианиновый 5 (Су5), флуоресцеин, Texas Red, но не ограничиваясь ими. Флуоресцентные изображения микрочипов после проведения анализа показаны на Фиг. 3А, Фиг. 3Б, Фиг. 3В, Фиг. 4А, Фиг. 4Б. В случае использования флуоресцентной метки, регистрацию флуоресцентных сигналов с ячеек микрочипа проводят с помощью флуоресцентных микроскопов (Пример 2).The general procedure for conducting an immunoassay using biological microarrays is described in Example 2. A sandwich immunoassay for a biological microarray is shown in FIG. 2. As developing antibodies, for example, conjugates of antibodies against tetraspanins with fluorescent dyes or biotin are used. As fluorescent dyes use, for example, cyanine 3 (Cy3), cyanine 5 (Cy5), fluorescein, Texas Red, but not limited to. The fluorescence images of the microarrays after analysis are shown in FIG. 3A, FIG. 3B, FIG. 3B, FIG. 4A, FIG. 4B. In the case of using a fluorescent label, the registration of fluorescent signals from the cells of the microchip is carried out using fluorescence microscopes (Example 2).
В качестве образцов для анализа используются разбавленная или неразбавленная сыворотка крови человека (Пример 2). Дополнительно способ позволяет использовать разбавленный или неразбавленный супернатант культуральной среды, например, в качестве препаратов сравнения (Пример 3).As samples for analysis, diluted or undiluted human blood serum is used (Example 2). Additionally, the method allows the use of diluted or undiluted supernatant of the culture medium, for example, as reference preparations (Example 3).
Примеры осуществления настоящего изобретения.Embodiments of the present invention.
Пример 1. Изготовление биологического микрочипаExample 1. The manufacture of a biological microchip
Биологические микрочипы с иммобилизованными антителами против трансмембранных белков и белков-тетраспанинов изготавливали по запатентованному методу [Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547 (Б.И.П.М. N 32, 20.11.2003). International Application PCT/RU 01/004204, WO 03/033539]. Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры на основе метакриламида, а также подлежащие иммобилизации антитела (моноклональные антитела против CD81, CD 147, А33 (BD Biosciences, США/ «HansaBioMed», Эстония)), наносили с помощью робота QArray («Genetix», Великобритания) в виде микрокапель объемом 0,1 нл на поверхность активированного Bind Silane стеклянного слайда Corning (Corning 2947 Micro Slides, США). Концентрация каждого антитела в стоковом растворе составляла 1 мг/мл. Полимеризацию гелевых ячеек проводили при UV облучении (354 нм). После завершения полимеризации биочипы отмывали в течение 40 минут (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, 20 мин, комнатная температура), промывали дистиллированной водой, и высушивали. Получали трехмерные гелевые элементы полусферической формы диаметром 100 мкм.Biological microarrays with immobilized antibodies against transmembrane proteins and tetraspanin proteins were made according to the patented method [Mirzabekov AD, Rubina A.Yu., Pankov SV, Method for the polymerization immobilization of biological macromolecules and composition for its implementation, RF Patent N 2216547 (B.I.P.M. N 32, 11.20.2003). International Application PCT / RU 01/004204, WO 03/033539]. A polymerization mixture containing gelling monomers based on methacrylamide, as well as antibodies to be immobilized (monoclonal antibodies against CD81,
Для уменьшения неспецифических взаимодействий чипы обрабатывали блокирующим буфером (1% раствор поливинилового спирта в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl в течение 1 ч, затем промывали дистиллированной водой и высушивали. Качество полученных чипов проверяли в проходящем свете с помощью биочип-анализатора, снабженного программным обеспечением TestChip и QualityControl (ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН), Россия). В результате проверки качества отбраковывали чипы, для которых отклонения значений радиусов гелевых элементов превышали 5% внутри каждого чипа и 8% между всеми чипами данной партии.To reduce nonspecific interactions, the chips were treated with blocking buffer (1% solution of polyvinyl alcohol in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl for 1 h, then washed with distilled water and dried. The quality of the obtained chips was checked in transmitted light using a biochip analyzer equipped with TestChip and QualityControl software (V. A. Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS (IMB RAS), Russia). As a result of a quality check, chips were rejected for which deviations of cos gel elements exceed 5% in each chip, and 8% of the chips between all parties.
Фотография биологического микрочипа в проходящем свете после процедуры проверки качества представлена на Фиг. 1.A photograph of a biological microchip in transmitted light after a quality control procedure is shown in FIG. one.
Пример 2. Иммуноанализ молекулярных маркеров экзосом с использованием гидрогелевых микрочиповExample 2. Immunoassay of molecular markers of exosomes using hydrogel microarrays
Для иммуноанализа использовали биологические микрочипы, структура которых показана на Фиг. 1, содержащие элементы с иммобилизованными антителами против белков-тетраспанинов (CD81, CD147), антитела против белка А33 И пустые гелевые ячейки для контроля неспецефической сорбции.For immunoassay, biological microarrays were used, the structure of which is shown in FIG. 1, containing elements with immobilized antibodies against tetraspanin proteins (CD81, CD147), antibodies against protein A33 and empty gel cells to control non-specific sorption.
Для проведения сэндвич иммуноанализа, на биочипы наносили 65 мкл раствора образца. В случае анализа экзосом, содержащихся в сыворотке крови, использовали неразбавленную сыворотку крови. Инкубацию проводили при 37°С в течение 20 ч. После кратковременной (20 мин) отмывки в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, микрочипы проявляли смесью конъюгатов проявляющих антител (anti-A33biot+anti-CD81biot+anti-CD9-biot+anti-CD63biot) (65 мкл, 0,01 мг/мл, 1 ч, 37°С). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, 20 мин, комн. температура) инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем Су5 (15 мин, 37°С, 0,01 мг/мл). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,01% Твин-20, 20 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов. Конъюгаты антител с биотином и стрептавидин, меченный флуоресцентной меткой, получали по известным методикам (например, описанным в Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996). Схема сэндвич-иммуноанализа на биологическом микрочипе приведена на Фиг. 2.To conduct a sandwich immunoassay, 65 μl of the sample solution was applied to biochips. In the case of analysis of exosomes contained in blood serum, undiluted blood serum was used. Incubation was carried out at 37 ° C for 20 h. After short-term (20 min) washing in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, 0.15 M NaCl, 0.01% Tween-20, the microchips showed a mixture of conjugates showing antibodies (anti-A33biot + anti-CD81biot + anti-CD9-biot + anti-CD63biot) (65 μl, 0.01 mg / ml, 1 h, 37 ° C). After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.01% Tween-20, 20 min, room temperature), they were incubated with a solution of streptavidin with Su5 fluorescent dye (15 min, 37 ° C, 0.01 mg / ml). After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.01% Tween-20, 20 min, room temperature), registration of fluorescent signals was started. Conjugates of antibodies with biotin and streptavidin labeled with a fluorescent label were obtained by known methods (for example, described in Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996). A biological microarray sandwich immunoassay diagram is shown in FIG. 2.
Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный сканер, (Genepix 4200А (Molecular Devices, США)). Величины флуоресцентных сигналов рассчитывали с помощью программного обеспечения Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, США). Для интерпретации результатов использовали интенсивность флуоресценции F635 median, полученную в программе Genepix Pro 6.0. В случае флуоресцентной детекции возможно использование флуоресцентного микроскопа, разработанного в ИМБ РАН, Россия [Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A., Fluorescence data analysis on gel-based biochips. 2002 J. Biomol. Screening 7, 247-257].A fluorescence scanner (Genepix 4200A (Molecular Devices, USA)) was used to measure fluorescent signals. The values of fluorescence signals were calculated using the software Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, USA). To interpret the results, the F635 median fluorescence intensity obtained in the program Genepix Pro 6.0 was used. In the case of fluorescence detection, it is possible to use a fluorescence microscope developed at the IMB RAS, Russia [Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A., Fluorescence data analysis on gel-based biochips. 2002 J. Biomol. Screening 7, 247-257].
На биочипы наносили образец сыворотки крови больного с КРР (колоректальный рак, IV стадия). В качестве препарата сравнения использовали препарат экзосом, выделенный из данной сыворотки. Для контроля неспецифических взаимодействий биочип инкубировали с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека, Pierce, 1 мкг/мл), сравнивали с флуоресцентными сигналами, полученными после иммунофлуоресцентного определения экзосом в сыворотке.A blood serum sample of a patient with CRC (colorectal cancer, stage IV) was applied to biochips. An exosome preparation isolated from a given serum was used as a comparison drug. To control non-specific interactions, the biochip was incubated with an “isotype control” (mouse IgG isotype antibodies against human IgG, Pierce, 1 μg / ml), compared with serum fluorescent signals obtained after immunofluorescence determination of exosomes.
Выделение экзосом из сыворотки проводили по методу [Thery С., Amigorena S., Raposo G. & Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. 2006 Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3.22]. Осуществляли последовательное центрифугирование сыворотки крови для осаждения разрушенных компонентов клетки, а затем ультрацентрифугирование при 100000 g в течение 70 мин. Размер частиц в препаратах экзосом оценивали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.Exosomes were isolated from serum by the method of [Thery C., Amigorena S., Raposo G. & Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. 2006 Curr. Protoc.
Результаты иммунофлуоресцентного выявления экзосом в сыворотке крови, в выделенном препарате экзосом, а также «изотип контроль» представлены на Фиг. 3. Данный эксперимент позволяет сравнить результаты анализа экзосом в составе сыворотки крови и анализа выделенной фракции экзосом и показать возможность определения экзосом на биологическом микрочипе без их выделения из биологического образца.The results of immunofluorescence detection of exosomes in serum, in an isolated exosome preparation, as well as the “isotype control” are presented in FIG. 3. This experiment allows you to compare the results of analysis of exosomes in the blood serum and analysis of the selected exosome fractions and show the possibility of determining exosomes on a biological microchip without isolation from a biological sample.
Пример 3. Иммунофлуоресцентный анализ на биочипах экзосом, выделенных из клеточной линии НТ29 (клетки аденокарциномы толстого кишечника)Example 3. Immunofluorescence analysis on exosome biochips isolated from the HT29 cell line (colon adenocarcinoma cells)
Препарат экзосом (супернатант из клеточной линии НТ29) был предварительно проверен методом трансмиссионной электронной микроскопии. Далее препарат экзосом из клеточной линии НТ29 наносили на биочипы. Для контроля неспецифических взаимодействий биочип инкубировали с «изотип контролем» (мышиные антитела изотипа IgG против IgG человека, Pierce, 1 мкг/мл), сравнивали с флуоресцентными сигналами, полученными после иммунофлуоресцентного определения экзосом в сыворотке. Иммуноанализ проводили по методике, описанной в примере 2.The exosome preparation (supernatant from the HT29 cell line) was previously tested by transmission electron microscopy. Next, the exosome preparation from the HT29 cell line was applied to biochips. To control non-specific interactions, the biochip was incubated with an “isotype control” (mouse IgG isotype antibodies against human IgG, Pierce, 1 μg / ml), compared with serum fluorescent signals obtained after immunofluorescence determination of exosomes. Immunoassay was carried out according to the method described in example 2.
Результаты иммунофлуоресцентного выявления экзосом, полученных из клеточной культуры, представлены на Фиг. 4. Обнаружение связывания экзосом клеточной линии НТ29 (клетки аденокарциномы толстой кишки) с антителами против белка А33 закономерно. Известно, что антиген А33 - гликопротеин клеточной поверхности тонкой кишки и эпителия ободочной кишки, высокогомологичен белкам семейства иммуноглобулинов. Локализация А33 в тканях кишечника и высокий уровень экспрессии дают возможность использовать его в качестве мишени при иммунотерапии рака толстой кишки [Belov L, Zhou J, Christopherson RI. Cell surface markers in colorectal cancer prognosis. 2010 Int J MolSci. 12(1):78-113].The results of immunofluorescence detection of exosomes obtained from cell culture are shown in FIG. 4. The detection of the binding of exosomes of the cell line HT29 (cells of the colon adenocarcinoma) with antibodies against protein A33 is natural. It is known that the A33 antigen, a glycoprotein of the cell surface of the small intestine and the epithelium of the colon, is highly homologous to proteins of the immunoglobulin family. Localization of A33 in the intestinal tissues and a high level of expression make it possible to use it as a target in immunotherapy of colon cancer [Belov L, Zhou J, Christopherson RI. Cell surface markers in colorectal cancer prognosis. 2010 Int J MolSci. 12 (1): 78-113].
Несмотря на то, что антиген А33 присутствует в нормальных (не опухолевых) тканях кишечника, радиоактивно меченые антитела против А33 селективно связываются с клетками опухоли кишечника, а также с метастатически пораженными клетками [Scott, A.M.; Lee, F.T.; Jones, R.; Hopkins, W.; MacGregor, D.; Cebon, J.S.; Hannah, A.; Chong, G; Paul, U.; Papenfuss, A.; Rigopoulos, A.; Sturrock, S.; Murphy, R.; Wirth, V.; Murone, C.; Smyth, F.E.; Knight, S.; Welt, S.; Ritter, G.; Richards, E.; Nice, E.C.; Burgess, A.W.; Old, L.J. A phase I trial of humanized monoclonal antibody A33 in patients with colorectal carcinoma: Biodistribution, pharmacokinetics, and quantitative tumor uptake. 2005 Clin. Cancer Res. 11, 4810-4817]. Исследования показали, что антиген А33 является высокостабильным, полураспад комплекса с радиоактивно мечеными антителами свыше двух дней. Для того, чтобы объяснить эти свойства, авторы исследовали возможность того, что А33 является составной частью плотного белкового комплекса. Такое свойство поверхностной устойчивости может вносить свой вклад в длительное удержание диагностических антител, а также их способности проникать в солидные опухоли.Although the A33 antigen is present in normal (non-tumor) intestinal tissues, radiolabeled anti-A33 antibodies selectively bind to intestinal tumor cells as well as metastatically affected cells [Scott, A.M .; Lee, F.T .; Jones, R .; Hopkins, W .; MacGregor, D .; Cebon, J.S .; Hannah, A .; Chong, G; Paul, U .; Papenfuss, A .; Rigopoulos, A .; Sturrock, S .; Murphy, R .; Wirth, V .; Murone, C .; Smyth, F.E .; Knight, S .; Welt, S .; Ritter, G .; Richards, E .; Nice, E.C .; Burgess, A.W .; Old, L.J. A phase I trial of humanized monoclonal antibody A33 in patients with colorectal carcinoma: Biodistribution, pharmacokinetics, and quantitative tumor uptake. 2005 Clin. Cancer Res. 11, 4810-4817]. Studies have shown that the A33 antigen is highly stable, the half-life of the complex with radioactively labeled antibodies for more than two days. In order to explain these properties, the authors investigated the possibility that A33 is an integral part of a dense protein complex. This property of surface resistance can contribute to the long-term retention of diagnostic antibodies, as well as their ability to penetrate solid tumors.
Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что на биологическом микрочипе с иммобилизованными антителами против белков, представленных на поверхности экзосом, возможно определение экзосом непосредственно в сыворотке крови без предварительного их выделения. Способ, предложенный в данном техническом решении, обеспечивает выполнение поставленных данным изобретением задач.Analyzing the results, we can conclude that on a biological microchip with immobilized antibodies against proteins present on the surface of exosomes, it is possible to determine exosomes directly in the blood serum without prior isolation. The method proposed in this technical solution ensures the implementation of the tasks set by this invention.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016145097A RU2682721C2 (en) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | Biological microchip for detection of tumor exosomes in serum of human for diagnosing colorectal cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016145097A RU2682721C2 (en) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | Biological microchip for detection of tumor exosomes in serum of human for diagnosing colorectal cancer |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016145097A3 RU2016145097A3 (en) | 2018-05-17 |
| RU2016145097A RU2016145097A (en) | 2018-05-17 |
| RU2682721C2 true RU2682721C2 (en) | 2019-03-21 |
Family
ID=62152103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016145097A RU2682721C2 (en) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | Biological microchip for detection of tumor exosomes in serum of human for diagnosing colorectal cancer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2682721C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114924083A (en) * | 2022-06-28 | 2022-08-19 | 上海万何圆生物科技有限公司 | Aptamer-based fluorescence polarization detection method for extracellular vesicles and application thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003033539A1 (en) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Composition for polymerising immobilisation of biological molecules and method for producing said composition |
| WO2006062427A1 (en) * | 2004-11-24 | 2006-06-15 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Method for quantitatively detecting biological toxins |
| US20080003599A1 (en) * | 2004-12-28 | 2008-01-03 | Dary Ekaterina L | Biological Microchip for Multiple Parallel Immunoassay of Compounds and Immunoassay Metods Using Said Microchip |
| RU2520741C2 (en) * | 2008-01-25 | 2014-06-27 | Хансабиомед Ою | Novel method for measuring and describing microvesicles in human fluids |
-
2016
- 2016-11-17 RU RU2016145097A patent/RU2682721C2/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003033539A1 (en) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Composition for polymerising immobilisation of biological molecules and method for producing said composition |
| WO2006062427A1 (en) * | 2004-11-24 | 2006-06-15 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Method for quantitatively detecting biological toxins |
| US20080003599A1 (en) * | 2004-12-28 | 2008-01-03 | Dary Ekaterina L | Biological Microchip for Multiple Parallel Immunoassay of Compounds and Immunoassay Metods Using Said Microchip |
| RU2520741C2 (en) * | 2008-01-25 | 2014-06-27 | Хансабиомед Ою | Novel method for measuring and describing microvesicles in human fluids |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHAILENDER S.N. et. al. Microfluidic device (ExoChip) for on-chip isolation, quantification and characterization of circulating exosomes // Lab. Chip., 2014, V.11, pp.1891-1900. * |
| SHAILENDER S.N. et. al. Microfluidic device (ExoChip) for on-chip isolation, quantification and characterization of circulating exosomes // Lab. Chip., 2014, V.11, pp.1891-1900. ZHANG P. et. al. Ultrasensitive microfluidic analysis of circulating exosomes using a nanostructured graphene oxide/polydopamine coating // Lab. Chip., 22.03.2016, V.33, pp.3033-3042. * |
| ZHANG P. et. al. Ultrasensitive microfluidic analysis of circulating exosomes using a nanostructured graphene oxide/polydopamine coating // Lab. Chip., 22.03.2016, V.33, pp.3033-3042. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016145097A3 (en) | 2018-05-17 |
| RU2016145097A (en) | 2018-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6526870B2 (en) | Methods to aid in detection of breast cancer, polypeptide probe sets, and polynucleotide arrays | |
| US20220074929A1 (en) | Quantification, isolation, and characterization of exosomes using droplet-based and well-based microfluidic systems | |
| JP5159619B2 (en) | Biomarker for ovarian cancer: CTAP3-related protein | |
| US20190033316A1 (en) | Methods and kits for the diagnosis of cancer | |
| WO2017087940A1 (en) | Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles | |
| WO2006128362A1 (en) | Method and its kit for quantitatively detecting specific analyte with single capturing agent | |
| US20170065978A1 (en) | Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles | |
| JP2009545747A (en) | Method and system for detecting and / or sorting targets | |
| US9708665B2 (en) | Spatial biomarker of disease and detection of spatial organization of cellular receptors | |
| JP2004516489A (en) | Protein chip, method for producing the same, detection system using the protein chip, and method using the detection system | |
| Nevídalová et al. | Capillary electrophoresis–based immunoassay and aptamer assay: A review | |
| EP2536844A1 (en) | Means and methods for diagnosing pancreatic cancer | |
| RU2682721C2 (en) | Biological microchip for detection of tumor exosomes in serum of human for diagnosing colorectal cancer | |
| JP6998626B2 (en) | An immunological composition for diagnosing lung cancer using an autoantibody-antigen conjugate, a method for diagnosing lung cancer using the same, and a kit for diagnosing lung cancer containing the same. | |
| CA2698437A1 (en) | Marker sequences for rheumatoid arthritis and use thereof | |
| WO2024001798A1 (en) | Nucleic acid aptamer-based extracellular vesicle fluorescence polarization detection method and application thereof | |
| US20140371090A1 (en) | Method and kit for determining- antibody sensitivity and clone cell strain | |
| CN110462404B (en) | Method of testing a subject for the likelihood of suffering from pancreatic cancer | |
| US20140186293A1 (en) | Immunoglobulin-bound extracellular vesicles and uses thereof | |
| Li et al. | Microfluidic chip for cancer cell detection and diagnosis | |
| JP6873460B2 (en) | How to test a subject for possible pancreatic cancer | |
| JPWO2019013332A1 (en) | Method for suppressing non-specific binding to a binding protein for a surface molecule of eukaryotic cell membrane or exosome immobilized on a carrier | |
| RU2788198C1 (en) | Method for isolation and analysis of exosomes | |
| US20100280224A1 (en) | Marker sequences for multiple sclerosis and use thereof | |
| Kim et al. | Enhancement of capture sensitivity for circulating tumor cells in a breast cancer patient's blood by silicon nanowire platform |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200207 Effective date: 20200207 |