RU2679907C1 - Method for express dna extraction from unfrozen blood - Google Patents
Method for express dna extraction from unfrozen blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679907C1 RU2679907C1 RU2018108722A RU2018108722A RU2679907C1 RU 2679907 C1 RU2679907 C1 RU 2679907C1 RU 2018108722 A RU2018108722 A RU 2018108722A RU 2018108722 A RU2018108722 A RU 2018108722A RU 2679907 C1 RU2679907 C1 RU 2679907C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- dna
- samples
- frozen
- express
- Prior art date
Links
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 9
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 9
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102200036294 rs1695 Human genes 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 102100030943 Glutathione S-transferase P Human genes 0.000 description 7
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 description 7
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000249 far-infrared magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 102200052962 rs1137101 Human genes 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 102100038110 Arylamine N-acetyltransferase 2 Human genes 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 102200094900 rs1799930 Human genes 0.000 description 4
- 101000884399 Homo sapiens Arylamine N-acetyltransferase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000713305 Homo sapiens Sodium-coupled neutral amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 101710124361 Arylamine N-acetyltransferase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101150019103 NAT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 101150008380 gstp1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- FYZXEMANQYHCFX-UHFFFAOYSA-K tripotassium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetate Chemical compound [K+].[K+].[K+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O FYZXEMANQYHCFX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
- B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
- B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F31/00—Mixers with shaking, oscillating, or vibrating mechanisms
- B01F31/20—Mixing the contents of independent containers, e.g. test tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно, к молекулярной биологии, биохимии, клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для экспресс-выделения геномной ДНК человека из размороженной крови.The invention relates to biology and medicine, namely to molecular biology, biochemistry, clinical laboratory diagnostics and can be used for rapid isolation of human genomic DNA from thawed blood.
Выделение геномной ДНК является первым этапом молекулярно-генетических исследований. Массовое генотипирование, направленное на выявление генетических особенностей популяций, создание геномных библиотек, научные разработки, проводимые на больших выборках, требуют консервации биоматериала - источника геномной ДНК, поскольку срочное выделение ДНК из большого количества образцов затруднительно или невозможно, например, в экспедиционных условиях. Чаще для генотипирования используют ДНК, выделенную из крови, стабилизированной ЭДТА-К3 (трикалиевый этилендиаминтетраацетат или трилон Б, или ЭДТА). Образцы такой крови можно заморозить для длительного сохранения. Но предлагаемые на рынке молекулярно-биологической продукции коммерческие комплекты реагентов для выделения нуклеиновых кислот рассчитаны, в основном, на другие источники ДНК/РНК - плазму крови, соскобы эпит. клеток, мокроту, мочу и др. (http://www.dna-technology.ru/dnaproducts/reagents/), а также свежую незамороженную кровь (ООО НПФ «ЛИТЕХ»). Для образцов замороженной крови предлагается сорбентный способ выделения ДНК на магнитных частицах (ЗАО «Sileks»). Общая схема обработки крови сводится к лизису клеток образцов и высвобождению содержащихся в них нуклеиновых кислот, которые затем связываются на магнитных частицах. Адсорбированные нуклеиновые кислоты проходят ряд отмывок с использованием трех буферов из набора, после чего их элюируют (http://www.sileks.com/ru/production.php?folder=214). Многоэтапность выделения (лизис, отмывки, элюция), высокая стоимость набора (8000 руб./100 образцов), а также другие проблемы, указанные в инструкции (например, возможный низкий выход ДНК, связанный с неполным лизисом, неполным высушиванием или длительным хранением образца крови (http://www.sileks.com/ru/librarian/librarian_ajax.php?ajaxaction=GetObjectByVName&VName=Guideline_NAIsolation_Blood-DNA-RNA_ru.pdf), являются несомненными недостатками данного способа.Isolation of genomic DNA is the first step in molecular genetic research. Mass genotyping aimed at identifying the genetic characteristics of populations, creating genomic libraries, and scientific research carried out on large samples requires the conservation of biomaterial, the source of genomic DNA, since the urgent extraction of DNA from a large number of samples is difficult or impossible, for example, under field conditions. More often, DNA isolated from blood stabilized with EDTA-K3 (tripotassium ethylenediaminetetraacetate or trilon B, or EDTA) is used for genotyping. Samples of such blood can be frozen for long-term preservation. But the commercial sets of reagents for the isolation of nucleic acids on the molecular biological products market are designed mainly for other sources of DNA / RNA - blood plasma, scrapings of epit. cells, sputum, urine, etc. (http://www.dna-technology.ru/dnaproducts/reagents/), as well as fresh unfrozen blood (LLC NPF LITECH). For samples of frozen blood, a sorbent method for isolating DNA on magnetic particles is proposed (Sileks CJSC). The general scheme of blood processing is reduced to the lysis of the cells of the samples and the release of the nucleic acids contained in them, which then bind to magnetic particles. Adsorbed nucleic acids undergo a series of washes using three buffers from the kit, after which they are eluted (http://www.sileks.com/en/production.php?folder=214). The multi-stage isolation (lysis, washing, elution), the high cost of the kit (8000 rubles / 100 samples), as well as other problems indicated in the instructions (for example, a possible low DNA yield due to incomplete lysis, incomplete drying or long-term storage of a blood sample (http://www.sileks.com/en/librarian/librarian_ajax.php?ajaxaction=GetObjectByVName&VName=Guideline_NAIsolation_Blood-DNA-RNA_ru.pdf), are undoubted disadvantages of this method.
С помощью набора реагентов BloodPrep™ (Applied Biosystems, США) по заверениям его поставщика, ООО "СПЕКТРТРЭЙДИНГ (Минск), можно выделить ДНК из большого количества (до 96 одновременно) образцов свежей или замороженной крови любых видов животных, клеток культур тканей или буккальных соскобов менее чем за 1 час. Однако данные реагенты и расходные материалы оптимизированы для использования исключительно в системах очистки нуклеиновых кислот Applied Biosystems (http://spt.by/index2.php?option=com_content&task=view&id=1007&Itemid=9&pop=1&page=0), что требует, очевидно, дополнительных вложений на их приобретение.Using the BloodPrep ™ reagent kit (Applied Biosystems, USA), assured by its supplier, SPECTRTRADING LLC (Minsk), DNA can be isolated from a large number (up to 96 simultaneously) of fresh or frozen blood samples of any animal species, tissue culture cells or buccal scrapings in less than 1 hour, however, these reagents and consumables are optimized for use exclusively in Applied Biosystems nucleic acid purification systems (http://spt.by/index2.php?option=com_content&task=view&id=1007&Itemid=9&pop=1&page=0) , which requires, obviously, additional investments on their pri Retenu.
Известен способ выделения ДНК из цельной венозной крови, стабилизированной ЭДТА, с помощью имеющегося на рынке реагента "ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь" производства ООО НПФ «Литех», г. Москва. Геномная ДНК, выделенная с помощью этого реагента, используется для выявления полиморфизмов в геноме человека методом ПЦР с флуоресцентной, в режиме реального времени, масс-спектрометрической и электрофоретической схемами детекции результата. По инструкции к реагенту (Руководство по применению «SNP»-экспресс. Универсальная система для выявления точечных мутаций в геноме человека, ООО НПФ «Литех», Москва, 2009), выделение ДНК проводят из образцов свежей цельной крови, стабилизированной ЭДТА или цитратом натрия. Способ включает забор 2 мл венозной крови в пробирку с антикоагулянтом, перенос 1 мл крови в пробирку Эппендорфа с крышкой и замком, центрифугирование при 3000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут, удаление плазмы, замораживание осадка при -20°С в течение 1 часа, размораживание при комнатной температуре, смешивание с реактивом «ДНК-экспресс-кровь» в соотношении 1:1, встряхивание в течение 10 секунд, осаждение капель на микроцентрифуге, прогревание при +99°С в течение 15 минут, центрифугирование и отбор супернатанта, содержащего искомую ДНК, т.е. 12 этапов, занимающих по времени около 1,5 часа для 1 образца крови. Кровь для выделения ДНК запрещено замораживать изначально, т.е. для процедуры выделения используется свежая не замороженная кровь, что является ограничением данного способа.A known method for the isolation of DNA from whole venous blood, stabilized with EDTA, using the available on the market reagent "DNA-EXPRESS blood" produced by LLC NPF Liteh, Moscow. Genomic DNA isolated using this reagent is used to detect polymorphisms in the human genome by PCR with fluorescence, real-time, mass spectrometric and electrophoretic schemes for detecting the result. According to the instructions for the reagent (SNP Express application manual. Universal system for detecting point mutations in the human genome, NPF Litekh LLC, Moscow, 2009), DNA is extracted from fresh whole blood samples stabilized with EDTA or sodium citrate. The method includes taking 2 ml of venous blood into an anticoagulant tube, transferring 1 ml of blood to an Eppendorf tube with a cap and a lock, centrifuging at 3000 rpm at room temperature for 5 minutes, removing plasma, freezing the precipitate at -20 ° C for 1 hour, thawing at room temperature, mixing with DNA-express-blood reagent in a ratio of 1: 1, shaking for 10 seconds, dropping drops on a microcentrifuge, heating at + 99 ° C for 15 minutes, centrifuging and selecting the supernatant containing the desired DNA i.e. 12 stages, which take about 1.5 hours in time for 1 blood sample. Blood for DNA isolation is prohibited from freezing initially, i.e. For the extraction procedure, fresh, not frozen blood is used, which is a limitation of this method.
Назначением настоящего изобретения является разработка способа экспресс-выделения ДНК из размороженной крови, позволяющего сократить процедуру выделения ДНК и использовать в качестве ее источника длительно хранящиеся образцы замороженной крови.The purpose of the present invention is to develop a method for the rapid isolation of DNA from thawed blood, which allows to shorten the procedure for DNA extraction and to use long-term samples of frozen blood as its source.
Назначение изобретения достигается способом экспресс-выделения ДНК из размороженной крови. Проводят забор 2 мл цельной венозной крови в пробирки, содержащие ЭДТА-К3, образцы замораживают при температуре - 25°С для хранения. В день выделения ДНК образцы размораживают при комнатной температуре, переносят по 0,6 мл крови в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл типа Эппендорф, с крышкой и замком Safe-Lock и смешивают с 0,6 мл реагента «ДНК-экспресс-кровь», встряхивают в течение 10 сек, проводят осаждение микрокапель на микроцентрифуге. Далее пробы помещают в твердотельный термостат при температуре +99°С и инкубируют в течение 15 мин, центрифугируют при 13000 об/мин в течение 30 сек и осуществляют отбор супернатанта, содержащего ДНК.The purpose of the invention is achieved by the method of rapid isolation of DNA from thawed blood. 2 ml of whole venous blood is sampled into tubes containing EDTA-K3, samples are frozen at a temperature of -25 ° C for storage. On the day of DNA extraction, the samples are thawed at room temperature, transferred 0.6 ml of blood into 1.5 ml plastic tubes of Eppendorf type, with a lid and Safe-Lock, and mixed with 0.6 ml of DNA-express blood reagent shake for 10 seconds, carry out the deposition of microdrops on a microcentrifuge. Next, the samples are placed in a solid-state thermostat at a temperature of + 99 ° C and incubated for 15 minutes, centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds, and DNA supernatant is collected.
Новизна изобретения:The novelty of the invention:
1. Реагент «ДНК-экспресс-кровь» производства НПФ «Литех (Москва), рекомендуемый для выделения ДНК из свежей незамороженной крови, 1. The reagent "DNA-express-blood" produced by NPF "Litech (Moscow), recommended for the isolation of DNA from fresh unfrozen blood,
стабилизированной антикоагулянтами, используется для выделения ДНК из замороженной крови, стабилизированной ЭДТА.stabilized by anticoagulants, used to isolate DNA from frozen blood, stabilized by EDTA.
2. Замороженные образцы крови, стабилизированной ЭДТА, могут храниться при -25°С в течение нескольких лет до использования для выделения ДНК и постановки метода полимеразной цепной реакции.2. Frozen samples of blood stabilized with EDTA can be stored at -25 ° C for several years before use for DNA isolation and formulation of the polymerase chain reaction method.
3. В процедуре выделения ДНК исключены этапы отделения плазмы и 1-часовой заморозки и последующего размораживания. Это экономит время выделения ДНК.3. The steps of plasma separation and 1-hour freezing and subsequent thawing are excluded in the DNA isolation procedure. This saves DNA isolation time.
В патентной и научной литературе отсутствуют сведения об аналогичном способе экспресс-выделения ДНК из размороженной крови.In the patent and scientific literature there is no information about a similar method of express DNA extraction from thawed blood.
Совокупность существенных признаков изобретения позволяет получить новый технический результат:The set of essential features of the invention allows to obtain a new technical result:
1. Уменьшение количества этапов выделения ДНК за счет исключения из протокола метода промежуточных этапов центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут, удаления плазмы и последующего замораживания в течение 1 часа и размораживания.1. Reducing the number of stages of DNA extraction due to the exclusion from the protocol of the method of the intermediate stages of centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes, removing the plasma and subsequent freezing for 1 hour and thawing.
2. Возможность длительного хранения замороженных образцов крови как источника геномной ДНК.2. The possibility of long-term storage of frozen blood samples as a source of genomic DNA.
3. Экономия времени проведения процедуры выделения ДНК достигается за счет одновременной обработки большего количества проб крови, взятых у разных доноров в различное время, и за счет сокращения длительности выделения, составляющей около 30 минут для одного образца крови.3. Saving time for the DNA isolation procedure is achieved by simultaneously processing more blood samples taken from different donors at different times, and by reducing the isolation time of about 30 minutes for one blood sample.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Проводят забор образцов цельной венозной крови в количестве 2 мл каждый в стандартные стерильные вакуумные одноразовые пластиковые пробирки, содержащие ЭДТА-К3 (IMPROVE, China). Образцы замораживают при температуре -25°С для хранения. В день выделения ДНК образцы размораживают при комнатной температуре, переносят по 0,6 мл крови в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл типа Эппендорф, с крышкой и замком Safe-Lock (Eppendorf AG, Germany) и приливают по 0,6 мл реагента «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех», Москва). После вортексирования в течение 10 сек и осаждения микрокапель на микроцентрифуге пробы помещают в твердотельный термостат при температуре +99°C и инкубируют в течение 15 мин. Далее пробы центрифугируют при 13000 об/мин в течение 30 сек. Супернатант содержит ДНК, готовую для использования в ПНР.Samples of whole venous blood in an amount of 2 ml each are collected in standard sterile vacuum disposable plastic tubes containing EDTA-K3 (IMPROVE, China). Samples are frozen at -25 ° C for storage. On the day of DNA extraction, the samples are thawed at room temperature, transferred to 0.6 ml of blood into 1.5 ml plastic tubes of Eppendorf type, with a lid and Safe-Lock (Eppendorf AG, Germany) and 0.6 ml of reagent are added DNA-express-blood "(NPF" Litekh ", Moscow). After vortexing for 10 seconds and precipitating microdrops on a microcentrifuge, the samples are placed in a solid-state thermostat at a temperature of + 99 ° C and incubated for 15 minutes. Next, the samples are centrifuged at 13000 rpm for 30 seconds. The supernatant contains DNA ready for use in the NDP.
Таким образом, предлагаемый способ состоит из 10 этапов выделения ДНК - забор крови, замораживание, размораживание, перенос части крови в пробирки Эппендорфа, смешивание с реагентом «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех», Москва) в соотношении 1:1, вортексирование, осаждение микрокапель на микроцентрифуге, термостатирование, ультрацентрифугирование, отбор супернатанта - и не содержит промежуточных этапов замораживания в течение 1 часа и последующего размораживания, значительно удлиняющих процедуру выделения ДНК.Thus, the proposed method consists of 10 stages of DNA extraction - blood sampling, freezing, thawing, transferring part of the blood to Eppendorf tubes, mixing with DNA express blood reagent (NPF Litekh, Moscow) in a 1: 1 ratio, vortexing, deposition of microdrops on a microcentrifuge, temperature control, ultracentrifugation, selection of the supernatant - and does not contain intermediate stages of freezing for 1 hour and subsequent thawing, significantly lengthening the DNA isolation procedure.
Возможность применения полученных образцов ДНК для генотипиро-вания проверяли методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов, используя коммерческие комплекты реагентов «SNP-экспресс» (ООО НПФ Литех, Москва) для выявления однонуклеотидных полиморфизмов в гене глутатион-S-трансферазы P1, GSTP1 (rs1695, нуклеотидная замена 313A>G, аминокислотная замена Ilel05Val, альтернативное название GSTP1I105V), в гене рецептора лептина, LEPR (rs 1137101, нуклеотидная замена 668A>G, аминокислотная замена Gln223Arg, альтернативное название LEPRGln223Arg или Q223R), в гене ариламин-N-ацетилтрансферазы 2, NAT2 (rs1799930, нуклеотидная замена 590G>A, аминокислотная замена Argl97Gln, альтернативное название NAT2Mg197Gln).The possibility of using the obtained DNA samples for genotyping was tested by allele-specific polymerase chain reaction (PCR) with electrophoretic detection of results using commercial SNP-express reagent kits (NPF Litekh LLC, Moscow) to detect single nucleotide polymorphisms in the glutathione-S gene -transferases P1, GSTP1 (rs1695, nucleotide substitution 313A> G, amino acid substitution Ilel05Val, alternative name GSTP1 I105V ), in the leptin receptor gene, LEPR (rs 1137101, nucleotide substitution 668A> G, amino acid substitution Gln223Arg, alternative formerly known as LEPR Gln223Arg or Q223R), in the arylamine-N-
Реакционная смесь для ПЦР состояла из 5 мкл исследуемого образца ДНК и 20 мкл рабочей амплификационной смеси, содержащей 0,2 мкл рабочего раствора Taq-полимеразы. Амплификацию проводили в автоматическом термоциклере Терцик («ДНК-Технология», Москва). Программа амплификации, соответственно инструкции, включала следующий температурный режим - 1 цикл при 93°C в течение 1 мин, 35 циклов с этапами денатурации ДНК в течение 10 сек при 93°C, отжига праймеров в течение 10 сек при 64°C и синтеза цепей в течение 20 сек при 72°C, и 1 цикл при 72°C в течение 1 мин. Анализ ПЦР-продуктов проводили после их электрофоретического разделения в 50 мл 3%-агарозного геля на 50×ТАЕ-буфере, в который до застывания вносили 5 мкл 1% раствора бромистого этидия. В каждом геле вырезали два ряда лунок - для детекции аллеля дикого (нормального) типа и редкого (мутантного) аллеля. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде светящихся полос. Гели анализировали в УФ-трансиллюминаторе ЕСХ-15М (Vilber Lourmat, Франция) с помощью гельдокументирующей видеосистемы GL-2 (Россия).The PCR reaction mixture consisted of 5 μl of the studied DNA sample and 20 μl of the working amplification mixture containing 0.2 μl of Taq polymerase working solution. Amplification was carried out in the Tertsik automatic thermal cycler (DNA-Technology, Moscow). The amplification program, according to the instructions, included the following temperature regime - 1 cycle at 93 ° C for 1 min, 35 cycles with DNA denaturation steps for 10 sec at 93 ° C, primer annealing for 10 sec at 64 ° C and chain synthesis for 20 sec at 72 ° C, and 1 cycle at 72 ° C for 1 min. The analysis of PCR products was carried out after electrophoretic separation in 50 ml of 3% agarose gel in 50 × TAE buffer, into which 5 μl of a 1% solution of ethidium bromide was added before solidification. Two rows of wells were cut out in each gel — to detect the wild (normal) type allele and the rare (mutant) allele. Fragments of the analyzed DNA appeared in the form of luminous bands. The gels were analyzed in an ECX-15M UV transilluminator (Vilber Lourmat, France) using a GL-2 gel-documenting video system (Russia).
Изобретение иллюстрируется фотографиями электрофореграмм, представленными на Фиг. 1-4.The invention is illustrated by photographs of electrophoregrams shown in FIG. 1-4.
Фиг. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации полиморфного локуса LEPRGln223Arg гена рецептора лептина LEPR. Образцы ДНК выделяли предлагаемым способом из замороженной крови тубаларов, хранившейся до постановки ПЦР три года при -25°C. Верхний ряд - аллель LEPRGln223, нижний ряд - аллель LEPR223Arg. Дорожки: К- - отрицательный контрольный образец; 2,3,6,8,11,12,14,15 - гомозиготный нормальный генотип LEPRGln223Gln; 1,4,5,7,9,10 - гетерозиготный генотип LEPRGln223Arg; 13 - гомозиготный мутантный генотип LEPRArg223Arg.FIG. 1. Electrophoregram of amplification products of the polymorphic LEPR locus Gln223Arg of the LEPR leptin receptor gene. DNA samples were isolated by the proposed method from frozen blood of tubalars, which had been stored for three years at -25 ° C before PCR. The upper row is the LEPR Gln223 allele, the lower row is the LEPR 223Arg allele. Lanes: K- - negative control sample; 2,3,6,8,11,12,14,15 - homozygous normal LEPR Gln223Gln genotype; 1,4,5,7,9,10 - heterozygous genotype LEPR Gln223Arg ; 13 - homozygous mutant genotype LEPR Arg223Arg .
Фиг. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации полиморфного локуса GSTP1I105V гена глутатион-S-трансферазы Пи1 GSTP1. Образцы ДНК выделяли предлагаемым способом из замороженной крови телеутов, хранившейся до исследования 8 лет при -25°C (4 образца ДНК, дорожки 1-4) и по инструкции к реагенту «ДНК-экспресс-кровь» (1 образец ДНК пациента терапевтической клиники, русского по национальности, дорожка 5). Верхний ряд - аллель GSTP11105, нижний ряд - аллель GSTP1105V. Дорожки: К- - отрицательный контрольный образец; дорожки 1-4 - гетерозиготный генотип GSTP1I105V, дорожка 5 - гомозиготный нормальный генотип GSTP1I105I.FIG. 2. Electrophoregram of amplification products of the GSTP1 I105V polymorphic locus of the glutathione-S-transferase Pi1 GSTP1 gene. DNA samples were isolated by the proposed method from frozen Teleuts blood, stored until 8 years at -25 ° C (4 DNA samples, lanes 1-4) and according to the instructions for the DNA-express-blood reagent (1 DNA sample from a patient in a therapeutic clinic) Russian by nationality, track 5). The upper row is the GSTP11105 allele, the lower row is the GSTP1 105V allele. Lanes: K- - negative control sample; lanes 1-4 — heterozygous genotype GSTP1 I105V ,
Фиг. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации полиморфного локуса GSTP1I105V гена глутатион-S-трансферазы Пи1 GSTP1. Образцы ДНК выделяли из замороженной крови беременных женщин предлагаемым способом (5 образцов ДНК, дорожки 1-5) и из свежей незамороженной крови беременных женщин по коммерческой инструкции к реагенту «ДНК-экспресс-кровь» (10 образцов ДНК, дорожки 6-15): К- - отрицательный контрольный образец; дорожки 1,5,7,9,12-14 - гомозиготный нормальный генотип GSTP1I105I, дорожки 2-4, 10-11,15 - гетерозиготный генотип GSTP1I105V, дорожки 6,8 - гомозиготный мутантный генотип GSTP1V105V.FIG. 3. Electrophoregram of amplification products of the GSTP1 I105V polymorphic locus of the glutathione-S-transferase Pi1 GSTP1 gene. DNA samples were isolated from the frozen blood of pregnant women by the proposed method (5 DNA samples, lanes 1-5) and from fresh unfrozen blood of pregnant women according to the commercial instructions for the DNA-express blood reagent (10 DNA samples, lanes 6-15): K- - negative control sample;
Фиг. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации полиморфного локуса NAT2Arg197Gln гена ариламин-N-ацетилтрансферазы 2 NAT2. Образцы ДНК выделяли из крови 5 беременных женщин двумя способами: 1. из образцов свежей незамороженной крови по коммерческой инструкции к реагенту «ДНК-экспресс-кровь» (5 образцов ДНК, дорожки 1-5) и образцов замороженной крови предлагаемым способом (5 образцов ДНК, дорожки 1*-5*): К- - отрицательный контрольный образец; дорожки 1,1*, 5,5* - гомозиготные нормальные генотипы 2-х женщин NAT2Arg197Arg,, дорожки 2,2*, 3,3*, 4,4* - гетерозиготные генотипы 3-х женщин NAT2Arg197Gln, одинаково определенные в двух образцах ДНК, выделенных от каждой женщины с помощью коммерческого способа и предлагаемого способа.FIG. 4. Electrophoregram of amplification products of the polymorphic locus NAT2 Arg197Gln of the arylamine-N-
При выполнении поставленной задачи были проведены четыре ПЦР-исследования.When fulfilling the task, four PCR studies were performed.
Исследование №1 (Фиг. 1.). Обследовано 15 образцов замороженной крови, забранной в экспедиционных условиях у представителей коренных народов республики Алтай, тубаларов, исторически проживающих по берегам реки Бия. До постановки ПЦР образцы крови хранились при - 25°C в течение трех лет. Генотипирование проводили по локусу LEPRGln223Arg гена рецептора лептина LEPR. Треки ДНК, представленные на Фиг. 1, свидетельствуют об успешно полученных результатах ПЦР-исследования, т.е. о пригодности ДНК, выделенной предлагаемым способом из образцов длительно хранящейся замороженной крови, для генотипирования методом ПЦР.Study No. 1 (Fig. 1.). 15 samples of frozen blood taken under expeditionary conditions from representatives of the indigenous peoples of the Altai Republic, Tubalars, historically living along the banks of the Biya River, were examined. Prior to PCR, blood samples were stored at - 25 ° C for three years. Genotyping was performed at the LEPR Gln223Arg LEPR receptor gene locus. The DNA tracks shown in FIG. 1, indicate the successfully obtained results of PCR studies, i.e. the suitability of DNA isolated by the proposed method from samples of long-stored frozen blood for genotyping by PCR.
Исследование №2 (Фиг. 2). Образцы замороженной крови взяты из коллекции образцов, собранной в экспедиционных условиях у представителей тюркского коренного малочисленного народа, телеутов, проживающих в южных районах Кемеровской области. Коллекция хранится в замороженном состоянии при -25°C 8 лет. Выделение ДНК провели предлагаемым способом. Для сравнения взята свежая кровь у 1 пациента, находившегося на стационарном лечении в терапевтической клинике г. Новокузнецка. Выделение его ДНК провели из свежей не замороженной крови. Генотипирование проводили по генному локусу GSTP1I105V. Результаты электрофореза представлены на Фиг. 3. Полученные одинаковые яркие треки ДНК во всех образцах свидетельствуют, что ДНК, выделенная предлагаемым способом, не отличается от ДНК, выделенной из незамороженной крови по коммерческой инструкции по пригодности к использованию в методе ПЦР.Study No. 2 (Fig. 2). Frozen blood samples were taken from a collection of samples collected under expeditionary conditions from representatives of the Turkic indigenous people, teleuts living in the southern regions of the Kemerovo region. The collection is stored frozen at -25 ° C for 8 years. DNA isolation was carried out by the proposed method. For comparison, fresh blood was taken from 1 patient who was hospitalized in a therapeutic clinic in Novokuznetsk. His DNA was isolated from fresh, not frozen blood. Genotyping was performed on gene locus GSTP1 I105V. Electrophoresis results are shown in FIG. 3. The obtained identical bright DNA tracks in all samples indicate that the DNA isolated by the proposed method does not differ from DNA isolated from unfrozen blood according to the commercial instructions for suitability for use in the PCR method.
Исследование №3 (Фиг. 3).Study No. 3 (Fig. 3).
Образцы крови взяты у 15 беременных женщин, находившихся на сохранении беременности в роддомах г. Новокузнецка, в разное время в течение 4-х месяцев. Образцы крови 5 женщин до выделения ДНК и постановки ПЦР хранили в замороженном состоянии при -25°C от одной недели до 3-х месяцев, и ДНК выделяли из образцов предлагаемым способом. ДНК 10 других женщин выделяли из свежей незамороженной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» по коммерческой инструкции (ООО НПФ «ЛИТЕХ»). Генотипирование проводили по генному локусу GSTP1I105V. Результаты электрофореза продуктов амплификации представлены на Фиг. 3. Не выявлено различий в интенсивности свечения треков ДНК, выделенной двумя способами, и варианты генотипов легко определяются в исследуемых образцах.Blood samples were taken from 15 pregnant women who were still pregnant in maternity hospitals in Novokuznetsk, at different times for 4 months. Blood samples of 5 women before DNA extraction and PCR staging were stored frozen at -25 ° C from one week to 3 months, and DNA was isolated from the samples by the proposed method. DNA of 10 other women was isolated from fresh unfrozen blood using the reagent "DNA-express-blood" according to commercial instructions (LLC NPF "LITEH"). Genotyping was performed on gene locus GSTP1 I105V. The results of electrophoresis of amplification products are presented in FIG. 3. There were no differences in the intensity of the luminescence of DNA tracks isolated in two ways, and variants of genotypes are easily determined in the studied samples.
Исследование №4 (Фиг. 4.). Образцы крови взяты у 5 беременных женщин, находившихся на сохранении беременности в роддомах г. Новокузнецка. Половина каждого образца крови была немедленно использована для выделения геномной ДНК с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» по соответствующей инструкции к реагенту (ООО НПФ «ЛИТЕХ»). Полученные образцы ДНК были заморожены до постановки ПЦР. Вторая половина каждого образца крови была сразу же после забора заморожена и хранилась до выделения ДНК при -25°С в течение 4-х месяцев, после чего все образцы были одновременно разморожены и использованы для выделения ДНК по предлагаемому способу. Генотипирование проводили по генному локусу NAT2Arg197Gln. Результаты электрофореза продуктов амплификации представлены на Фиг. 4. Не выявлено различий в наличии и интенсивности свечения треков и вариантах генотипов каждой женщины, определенных предлагаемым способом из замороженной крови и коммерческим способом из незамороженной крови.Study No. 4 (Fig. 4.). Blood samples were taken from 5 pregnant women who were still pregnant in maternity hospitals in Novokuznetsk. Half of each blood sample was immediately used to isolate genomic DNA using the reagent "DNA-express-blood" according to the appropriate instructions for the reagent (LLC NPF LITECH). The obtained DNA samples were frozen prior to PCR. The second half of each blood sample was frozen immediately after collection and stored until DNA isolation at -25 ° C for 4 months, after which all samples were simultaneously thawed and used to isolate DNA according to the proposed method. Genotyping was performed using the NAT2 gene locus Arg197Gln . The results of electrophoresis of amplification products are presented in FIG. 4. There were no differences in the presence and intensity of the glow of the tracks and variants of the genotypes of each woman identified by the proposed method of frozen blood and commercial method of unfrozen blood.
Следовательно, предлагаемый способ экспресс-выделения ДНК из размороженной крови с целью постановки ПЦР позволяет использовать для выделения геномной ДНК с целью генотипирования длительно (до нескольких лет) хранящуюся в замороженном состоянии кровь, а также экономить время на процедуру выделения ДНК за счет уменьшения ее длительности и количества этапов.Therefore, the proposed method for the express isolation of DNA from thawed blood for the purpose of PCR allows the use of genomic DNA for the purpose of genotyping for a long time (up to several years), blood stored in a frozen state, and also save time on the procedure for DNA extraction by reducing its duration number of stages.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108722A RU2679907C1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method for express dna extraction from unfrozen blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108722A RU2679907C1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method for express dna extraction from unfrozen blood |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2679907C1 true RU2679907C1 (en) | 2019-02-14 |
Family
ID=65442656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018108722A RU2679907C1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method for express dna extraction from unfrozen blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2679907C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104845963A (en) * | 2014-02-14 | 2015-08-19 | 天津市农业质量标准与检测技术研究所 | Method for high flux rapid extraction of vegetable single seed DNA |
-
2018
- 2018-03-12 RU RU2018108722A patent/RU2679907C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104845963A (en) * | 2014-02-14 | 2015-08-19 | 天津市农业质量标准与检测技术研究所 | Method for high flux rapid extraction of vegetable single seed DNA |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| БЕЛИК В.П. и др. Анализ эффективности методов пробоподготовки ДНК, предлагаемых Российскими производителями. "Naukowa przestrzec Europy - 2010": materialy VI Miẹdzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji. (Przemyśl, 07-15 kwietnia 2010 roku.) - Przemyśl, 2010. - P. 41-45. * |
| БЕЛИК В.П. и др. Анализ эффективности методов пробоподготовки ДНК, предлагаемых Российскими производителями. "Naukowa przestrzec Europy - 2010": materialy VI Miẹdzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji. (Przemyśl, 07-15 kwietnia 2010 roku.) - Przemyśl, 2010. - P. 41-45. СЫЧЕВ Д.А. и др. Генотипирование по CYP2C19 - фармакогенетический подход к персонализации терапии пациентов после стентирования коронарных сосудов. 2012 г. [Найдено 15.11.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://www.lytech.ru/articles_131.htm . * |
| МАНИАТИС Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984, стр. 265. * |
| СЫЧЕВ Д.А. и др. Генотипирование по CYP2C19 - фармакогенетический подход к персонализации терапии пациентов после стентирования коронарных сосудов. 2012 г. [Найдено 15.11.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://www.lytech.ru/articles_131.htm . * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107385040B (en) | Amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets | |
| ES2206485T3 (en) | ISOLATION OF NUCLEIC ACID. | |
| US20080176320A1 (en) | Selective Lysis of Sperm Cells | |
| RU2003126575A (en) | HIGH-SENSITIVE METHOD FOR DETECTING CYTOZINE METHYLING STRUCTURES | |
| RU2720713C1 (en) | Set of synthetic oligonucleotides for detecting of coronavirus rna | |
| CA2933252A1 (en) | Methods and probes for identifying gene alleles | |
| US20170166956A1 (en) | Methods for DNA Preparation for Multiplex High Throughput Targeted Sequencing | |
| EP2964780B1 (en) | Discrimination of blood type variants | |
| AU2016282350A1 (en) | Targeted enrichment of long nucleotide sequences using microfluidic partitioning | |
| CN114134220A (en) | PCR reaction solution for blood detection and kit thereof | |
| RU2679907C1 (en) | Method for express dna extraction from unfrozen blood | |
| JP6959312B2 (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphism | |
| US10160965B2 (en) | Method and materials for nucleic acids extraction and purification | |
| RU2005127807A (en) | APPLICATION OF A NEW POLYMORPHISM IN THE HSGKI GENE FOR DIAGNOSTIC OF HYPERTENSION AND APPLICATION OF GENES OF THE SGK FAMILY FOR DIAGNOSTIC AND THERAPY OF AN EXTENDED Q / T SYNDROME | |
| JPH099967A (en) | Nucleic acid synthesis | |
| KR20060035684A (en) | Method for extracting nucleic acids from human body fluids and compositions there for | |
| RU2649064C1 (en) | Set of synthetic oligonucleotides for determination of sequence of 1 intron, adjacent to 2 exon, genes of hla i and ii class system (hla-a and hla-drb1) | |
| RU2337141C2 (en) | Method of allel-specific pcr for cattle genetic typing by kappa-casein a and b gene allels | |
| US10144951B2 (en) | Method and materials to deplete impurities for extraction and purification of nucleic acids from stool | |
| KR101700622B1 (en) | A DNA marker for breed discrimination of dog and discriminating method using the same | |
| CN101974634B (en) | Toxoplasma gondii rapid detection kit and preparation method thereof | |
| RU2762759C1 (en) | METHOD FOR SAMPLE PREPARATION OF SARS-CoV-2 CORONAVIRUS ISOLATES AND OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR ITS IMPLEMENTATION | |
| JPH1080279A (en) | Synthesis of nucleic acid | |
| CN112094927B (en) | Primer group, detection reagent and detection kit for identifying nucleic acids of rhesus monkey and human | |
| Karl et al. | Cost-effective sequence-based nonhuman primate MHC class I genotyping from RNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200313 |