RU2679059C1

RU2679059C1 - Peptide and method of treatment of alzheimer's disease

Info

Publication number: RU2679059C1
Application number: RU2018114087A
Authority: RU
Inventors: Александр Олегович Морозов
Original assignee: Александр Олегович Морозов
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2019-02-05
Also published as: WO2019203686A1

Abstract

FIELD: biochemistry; medicine.SUBSTANCE: invention relates to biochemistry and medicine and is a peptide of the H[isoD][pS]GYEVHH formula, where the serine residue is phosphorylated, and the aspartic acid residue is isomerized.EFFECT: this peptide is capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with the metal-binding domain of human beta-amyloid and is used to treat Alzheimer's disease.5 cl, 3 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к биохимии и медицине и представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью (в однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH, где специальными кодами [isoD] и [pS] обозначены изомеризованный аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты и фосфорилированный аминокислотный остаток серина, соответственно. Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида. Автором настоящего изобретения показано, что указанный пептид может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера.The invention relates to biochemistry and medicine and is a peptide with the amino acid sequence (in single-letter codes) H [isoD] [pS] GYEVHH, where the special codes [isoD] and [pS] denote the isomerized amino acid residue of aspartic acid and the phosphorylated amino acid residue of serine, respectively . This peptide is capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with a metal-binding domain of human amyloid beta. The present inventor has shown that this peptide can be effectively used to treat Alzheimer's disease.

Болезнь Альцгеймера - это нейродегенеративное заболевание, одна из распространенных форм деменции, «старческого слабоумия». Чаще всего болезнь Альцгеймера развивается после 50 лет, хотя есть и случаи диагностики в более ранних возрастных периодах. (Cummings, J.L. (2004). Alzheimer's disease. N Engl J Med 351, 56-67.)Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease, one of the common forms of dementia, "senile dementia." Most often, Alzheimer's disease develops after 50 years, although there are cases of diagnosis in earlier age periods. (Cummings, J.L. (2004). Alzheimer's disease. N Engl J Med 351, 56-67.)

Названная по имени немецкого психиатра Алоиса Альцгеймера болезнь на данный момент диагностирована у порядка 46 миллионов человек в мире.Named after the German psychiatrist Alois Alzheimer, the disease is currently diagnosed in about 46 million people in the world.

У некоторых пациентов заболевание может быть связано с наследственными нарушениями, но у большинства пациентов заболевание встречается спорадически, без какой-либо определенной причины (Selkoe, DJ. (2001). Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81, 741-66).In some patients, the disease may be due to hereditary disorders, but in most patients the disease occurs sporadically, without any specific reason (Selkoe, DJ. (2001). Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81, 741- 66).

Симптомы болезни Альцгеймера проявляются медленно, и первым симптомом может быть лишь слабая забывчивость. На этой стадии индивидуумы могут забывать последние события, действия, имена знакомых людей или названия вещей и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. При прогрессировании болезни симптомы становятся более заметными и более серьезными. Это вынуждают людей, пораженных болезнью Альцгеймера, прибегать к медицинской помощи. Симптомы, характерные для средней стадии болезни Альцгеймера, включают забывание того, как выполнять простые функции, такие как приводить себя в порядок, при этом возникают проблемы с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на поздней стадии болезни Альцгеймера могут становиться боязливыми или агрессивными, могут уходить далеко от дома и, в конце концов, нуждаться в полном уходе.Symptoms of Alzheimer's disease appear slowly, and only weak forgetfulness may be the first symptom. At this stage, individuals may forget the latest events, actions, names of familiar people, or names of things and may not be able to solve simple mathematical problems. As the disease progresses, the symptoms become more visible and more serious. This forces people affected by Alzheimer's to seek medical attention. Symptoms characteristic of the middle stage of Alzheimer's include forgetting how to perform simple functions, such as tidying oneself, with problems with speech, understanding, reading or writing. Patients in the late stage of Alzheimer's disease may become fearful or aggressive, may go far from home and, in the end, need complete care.

Гистологически это заболевание характеризуется нейритными бляшками, главным образом ассоциированными с корой головного мозга, лимбической системой и базальными ганглиями. Основным компонентом указанных бляшек является пептид амилоид-бета (Аβ), который является продуктом расщепления белка-предшественника амилоида-бета (βАРР или АРР). АРР является трансмембранным гликопротеидом типа I, который содержит крупный эктопический N-концевой домен, трансмембранный домен и небольшой цитоплазматический С-концевой хвост. Альтернативный сплайсинг транскрипта одного гена АРР в хромосоме 21 приводит к нескольким изоформам, которые отличаются количеством аминокислот.Histologically, this disease is characterized by neuritic plaques, mainly associated with the cerebral cortex, limbic system and basal ganglia. The main component of these plaques is the amyloid beta (Aβ) peptide, which is the product of the cleavage of the amyloid beta precursor protein (βAPP or APP). APP is a type I transmembrane glycoprotein that contains a large ectopic N-terminal domain, a transmembrane domain, and a small cytoplasmic C-terminal tail. Alternative splicing of the transcript of one APP gene on chromosome 21 leads to several isoforms that differ in the number of amino acids.

Аβ пептид представляет собой соединение, которое обычно обнаруживается в биологических жидкостях, таких как кровь или цереброспинальная жидкость, в которых он присутствует в низких концентрациях от 0,5 до 5 нМ, и это одинаково как у здоровых людей, так и у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (Mayeux, R. et al. (1999). Plasma amyloid beta-peptide 1-42 and incipient Alzheimer's disease. Ann Neurol 46, 412-6; Seubert, P. et al. (1992). Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature 359, 325-7)Aβ peptide is a compound that is usually found in biological fluids, such as blood or cerebrospinal fluid, in which it is present in low concentrations of 0.5 to 5 nM, and this is the same in healthy people and in patients suffering from the disease Alzheimer's (Mayeux, R. et al. (1999). Plasma amyloid beta-peptide 1-42 and incipient Alzheimer's disease. Ann Neurol 46, 412-6; Seubert, P. et al. (1992). Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature 359, 325-7)

На настоящий момент, по всем имеющимся данным, можно сделать вывод, что 1-16 N-концевая область пептида Аβ является областью, которая несомненно участвует в наиболее убедительном и определяющем пути феномена формирования амилоидных бляшек.At the moment, according to all available data, it can be concluded that the 1-16 N-terminal region of the Aβ peptide is a region that undoubtedly participates in the most convincing and decisive pathway for the formation of amyloid plaques.

Было определено, что 1-16 N-концевая область бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к Аβ пептиду (Guilloreau, L., Damian, L., Coppel, Y., Mazarguil, H., Winterhalter, M. and Faller, P. (2006). Structural and thermo dynamical properties of Cull amyloid-beta16/28 complexes associated with Alzheimer's disease. J Biol Inorg Chem 11, 1024-38; Kozin, S.A., Zirah, S., Rebuffat, S., Hoa, G.H. and Debey, P. (2001). Zinc binding to Alzheimer's Abeta(1-16) peptide results in stable soluble complex. Biochem Biophys Res Commun 285, 959-64). В настоящее время выявлено, что амилоидные бляшки характеризуются аномально высокой концентрацией двухвалентных металлов и, в частности, цинка (Lovell, М.А., Robertson, J.D., Teesdale, W.J., Campbell, J.L. and Markesbery, W.R. (1998). Copper, iron and Zinc in Alzheimer's disease senile plaques. J Neurol Sci 158, 47-52). Некоторое количество исследований и экспериментов, как in vivo так и in vitro, показали, что высокие концентрации цинка вызывают преципитацию Аβ пептида, приводящую к образованию амилоидных бляшек. Кроме того, было показано, что амилоидные бляшки более значимо образуются в окружении нейронов в присутствии высокой концентрации ионов цинка (Frederickson, C.J. and Bush, A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals 14, 353-66; Frederickson, C.J., Suh, S.W., Silva, D. and Thompson, R.B. (2000). Importance of zinc in the central nervous system: the zinc-containing neuron. J Nutr 130, 1471S-83S).It was determined that the 1-16 N-terminal region of amyloid beta is a metal-binding domain where zinc (Zn) and copper (Cu) are attached to the Aβ peptide (Guilloreau, L., Damian, L., Coppel, Y., Mazarguil, H., Winterhalter, M. and Faller, P. (2006). Structural and thermo dynamical properties of Cull amyloid-beta16 / 28 complexes associated with Alzheimer's disease. J Biol Inorg Chem 11, 1024-38; Kozin, SA, Zirah, S., Rebuffat, S., Hoa, GH and Debey, P. (2001). Zinc binding to Alzheimer's Abeta (1-16) peptide results in stable soluble complex. Biochem Biophys Res Commun 285, 959-64). Currently, amyloid plaques have been identified to have an abnormally high concentration of divalent metals and, in particular, zinc (Lovell, MA, Robertson, JD, Teesdale, WJ, Campbell, JL and Markesbery, WR (1998). Copper, iron and Zinc in Alzheimer's disease senile plaques. J Neurol Sci 158, 47-52). A number of studies and experiments, both in vivo and in vitro, have shown that high concentrations of zinc cause precipitation of the Aβ peptide, leading to the formation of amyloid plaques. In addition, it has been shown that amyloid plaques are more significantly formed surrounded by neurons in the presence of a high concentration of zinc ions (Frederickson, CJ and Bush, AI (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals 14, 353-66; Frederickson, CJ, Suh, SW, Silva, D. and Thompson, RB (2000). Importance of zinc in the central nervous system: the zinc-containing neuron. J Nutr 130, 1471S-83S).

Именно поэтому в настоящее время считается, что блокирование взаимодействия Аβ пептида с цинком должно привести к уменьшению агрегации Аβ пептида в виде амилоидных бляшек и тем самым предотвратить патологии, связанные с этим взаимодействием.That is why it is currently believed that blocking the interaction of the Aβ peptide with zinc should lead to a decrease in the aggregation of the Aβ peptide in the form of amyloid plaques and thereby prevent pathologies associated with this interaction.

В патенте US 6001852 в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера предлагается Клиохинол, который является цинк-хелатирующим агентом.US Pat. No. 6,001,81852 discloses Clioquinol, which is a zinc chelating agent, for the treatment of Alzheimer's disease.

В патенте US 7018797 представлен метод ингибирования связывания β-амилоидных пептидов с α-7 никотиновым рецептором ацетилхолина для лечения нейродегенеративных заболеваний. В US 7018797, соединения, полученные из нафталина, в частности, 5,8-дигидрокси-транс-2-ди (N-пропиламино)-3-метил-1,2,3,4-тетрагидронафталин, были предложены в качестве соединений, которые могут подавлять связывание Аβ пептида с α-7 никотиновым рецептором ацетилхолина.US 7018797 discloses a method for inhibiting the binding of β-amyloid peptides to the α-7 nicotinic acetylcholine receptor for the treatment of neurodegenerative diseases. In US 7018797, compounds derived from naphthalene, in particular 5,8-dihydroxy-trans-2-di (N-propylamino) -3-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, were proposed as compounds, which can inhibit the binding of the Aβ peptide to the α-7 nicotinic acetylcholine receptor.

В US 7314724 в качестве лекарства против болезни Альцгеймера было предложено использование растворимых форм ламининов и их фрагментов (>10 кДа), которые способны связываться с Аβ и держать его в мономерном состоянии.In US 7314724, the use of soluble forms of laminins and fragments thereof (> 10 kDa) that are capable of binding to Aβ and keeping it in a monomeric state was proposed as a medicine against Alzheimer's disease.

Из документа WO 2010/115843, 14.10.2010 известна антигенная конструкция, содержащая антигенный пептид, соответствующий последовательности в пределах тау-белка, включающий фосфо-эпитоп, где пептидом является (а), модифицированный путем связывания с липофильным или гидрофобным фрагментом, который облегчает встраивание в липидный бислой липосомы, и (б), реконструированный в липосому так, что пептид презентирован на поверхности липосомы, для индукции иммунного ответа у животного, страдающего от нейродегенеративного расстройства. Указанная антигенная конструкция используется для лечения болезни Альцгеймера.From WO 2010/115843, 10/14/2010, an antigenic construct is known containing an antigenic peptide corresponding to a sequence within a tau protein, including a phospho epitope, where the peptide is (a), modified by binding to a lipophilic or hydrophobic fragment that facilitates insertion into a lipid bilayer of the liposome, and (b) reconstructed into the liposome so that the peptide is presented on the surface of the liposome to induce an immune response in an animal suffering from a neurodegenerative disorder. The indicated antigenic construct is used to treat Alzheimer's disease.

Из документа ЕА 12325, 28.08.2009 В1 известно использование 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты в способе лечения болезни Альцгеймера.From the document EA 12325, 08/28/2009 B1, the use of 3-amino-1-propanesulfonic acid in a method of treating Alzheimer's disease is known.

Из документа WO 2013/041962 28.03.2013 известно получение антитела для использования при лечении болезни Альцнеймера.From document WO 2013/041962 03/28/2013 it is known to obtain antibodies for use in the treatment of Alzneimer's disease.

В документе WO 2009/149485 17.12.2009 описана группа изобретений, которая относится к медицине и касается применения мимотопов для лечения β-амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера, где вышеуказанные мимотопы являются полипептидами, содержащими от 4 до 20 аминокислотных остатков, и способны вызывать in vivo образование антител к неукороченному Аβ1-40/42 и укороченным с N-конца формам АβрЕ3-40/42, Аβ3-40/42, Aβ11-40/42, AβpE11-40/42 и Aβ14-40/42 без нарушения физиологических функций передачи сигнала БПА.Document WO 2009/149485 12/17/2009 describes a group of inventions that relates to medicine and relates to the use of mimotopes for the treatment of β-amyloidosis, including Alzheimer's disease, where the above mimotopes are polypeptides containing from 4 to 20 amino acid residues, and are capable of causing in vivo the formation of antibodies to shortened Aβ1-40 / 42 and shortened from the N-terminus forms AβрЕ3-40 / 42, Аβ3-40 / 42, Aβ11-40 / 42, AβpE11-40 / 42 and Aβ14-40 / 42 without disturbing the physiological functions of transmission BPA signal.

В документе WO 2006/121656 16.11.2006 описан способ для предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента, нуждающегося в такой профилактике или лечении. Способ включает введение эффективной дозы иммуногенного фрагмента Аβ с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способного вызывать иммунный ответ в форме антител к указанному фрагменту Аβ, где иммуногенный фрагмент содержит один или более линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров) Аβ, при этом указанный один или более 8-меров включают Аβ(21-28) (AEDVGSNK).WO 2006/121656 11/16/2006 describes a method for preventing or treating a disease associated with Aβ amyloid deposits in the brain of a patient in need of such prophylaxis or treatment. The method comprises administering an effective dose of an immunogenic fragment of Aβ with the absence of a T-cell epitope capable of eliciting an immune response in the form of antibodies to the specified fragment of Aβ, where the immunogenic fragment contains one or more linear peptides of 8 amino acids (8-measures) Aβ, while one or more than 8 measures include Aβ (21-28) (AEDVGSNK).

Из документа RU 2588143 С2, 27.06.2016 известно изобретение, которое относится к пептидному соединению Ra-R1-R2-R3-R4-Rb (I) или Ra-R4-R3-R2-R1-Rb (II), где Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой, Rb представляет собой гидроксильную группу С-концевой карбоксильной группы аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1 представляют собой HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE и EEAR. Данные пептидные соединения применяются для связывания с β-амилоидными пептидами и ингибирования полимеризации их в виде амилоидных бляшек, а также в качестве лекарственного средства или для подготовки или определения препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.From the document RU 2588143 C2, 06/27/2016, the invention is known which relates to the peptide compound Ra-R1-R2-R3-R4-Rb (I) or Ra-R4-R3-R2-R1-Rb (II), where Ra represents represents the N-terminal primary amine group of the amino acid R1 or R4, either free or substituted by an amino protecting group, Rb represents the hydroxyl group of the C-terminal carboxyl group of the amino acid R1 or R4, either free or substituted by a hydroxy protecting group, and R1-R2-R3- R4 or R4-R3-R2-R1 are HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE and EEAR. These peptide compounds are used to bind to β-amyloid peptides and inhibit their polymerization in the form of amyloid plaques, as well as a medicine or for the preparation or determination of drugs for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease.

Однако, к сожалению, несмотря на успехи в предотвращении образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным.However, unfortunately, despite the success in preventing the formation of amyloid plaques, the influence of known drugs on improving cognitive function in Alzheimer's disease is very limited on average.

Исходя из вышеизложенного, на настоящий момент существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(II) с β-амилоидным пептидом.Based on the foregoing, at the moment there is a need to obtain alternative effective agents for the treatment of Alzheimer's disease, including by reducing or preventing the binding of Zn (II) ions to the β-amyloid peptide.

Автором настоящего изобретения был получен пептид, соответствующий по своему аминокислотному составу фрагменту 6-14 человеческого бета-амилоида, но в отличие от него пептид по настоящему изобретению содержит химически модифицировнные аминокислотные остатки, а именно фосфорилированый остаток серина (обозначаемый как "[pS]") и изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты (обозначаемый как "[isoD]"). Пептид по настоящему изобретению имеет нонамерную (девяти-членную) аминокислотную последовательность H[isoD][pS]GYEVHH с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи (например, с ацетилированным N-концевым амином и амидированным С-концевым гидроксилом) и обозначается далее как "isoD-pS-nAβ". Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида. Автором настоящего изобретения показано, что указанный пептид может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера. На основе пептида создана также фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера. В качестве активного компонента в ней используется пептид "isoD-pS-nAβ" согласно изобретению. Остальные компоненты выбраны из круга нейтральных носителей и разбавителей и хорошо известны специалисту в данной области техники (например, физиологичекский раствор).The inventor obtained a peptide corresponding in its amino acid composition to fragment 6-14 of human amyloid beta, but in contrast to it, the peptide of the present invention contains chemically modified amino acid residues, namely a phosphorylated serine residue (denoted as "[pS]") and the isomerized aspartic acid residue (denoted as "[isoD]"). The peptide of the present invention has a non-intended (nine-membered) amino acid sequence H [isoD] [pS] GYEVHH with open or protected ends of the main polypeptide chain (for example, with an acetylated N-terminal amine and amidated C-terminal hydroxyl) and is referred to below as " isoD-pS-nAβ. " This peptide is capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with a metal-binding domain of human amyloid beta. The present inventor has shown that this peptide can be effectively used to treat Alzheimer's disease. Based on the peptide, a pharmaceutical composition has also been created for the treatment of Alzheimer's disease. As an active component, it uses the peptide "isoD-pS-nAβ" according to the invention. The remaining components are selected from a range of neutral carriers and diluents and are well known to those skilled in the art (e.g., physiological saline).

Таким образом, авторами настоящего изобретения к рассмотрению предложено следующее.Thus, the authors of the present invention proposed the following.

1. Пептид "isoD-pS-nAβ", способный образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.1. The peptide "isoD-pS-nAβ", capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with a metal-binding domain of human amyloid beta.

2. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая эффективное количество пептида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.2. A pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease comprising an effective amount of a peptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

3. Способ снижения цинк-индуцированной агрегации бета-амилоида, включающий взаимодействие пептида согласно изобретению с бета-амилоидом.3. A method of reducing zinc-induced aggregation of beta-amyloid, comprising the interaction of the peptide according to the invention with beta-amyloid.

4. Способ образования цинк-опосредованных межмолекулярных комплексов пептид-бета-амилоид, включающий в взаимодействие пептида согласно изобретению с бета-амилоидом.4. The method of formation of zinc-mediated intermolecular complexes of the peptide-beta-amyloid, comprising the interaction of the peptide according to the invention with beta-amyloid.

5. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту эффективного колическтва фармацевтической композиции согласно изобретению.5. A method of treating Alzheimer's disease, comprising administering to the patient an effective amount of a pharmaceutical composition according to the invention.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

ПРИМЕР 1. Экспериментальное свидетельство способности "isoD-pS-nAβ" образовывать стабильные цинк-опосредованные межмолекулярные комплексы с металл-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.EXAMPLE 1. Experimental evidence of the ability of isoD-pS-nAβ to form stable zinc-mediated intermolecular complexes with the metal-binding domain of human amyloid beta.

Образование цинк-связанных комплексов между isoD-pS-nAβ (аналитом) и иммобилизованным пептидным фрагментом DAEFRHDSGYEVHHQK (лигандом), соответствующим металл-связывающему домену 1-16 бета-амилоида человека, Аβ(1-16), было исследовано с помощью биосенсора на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) в водных буферных системах при физиологических значениях рН. По результатам таких экспериментов рассчитывается значение константы диссоциации (Кд) взаимодействия субстанции и иммобилизованного лиганда. Если значение Кд равно или меньше 10^-4 М, то такое взаимодействие рассматривается в качестве биологически значимого.The formation of zinc-linked complexes between isoD-pS-nAβ (analyte) and the immobilized peptide fragment DAEFRHDSGYEVHHQK (ligand) corresponding to the metal-binding domain of human 1-16 beta-amyloid, Aβ (1-16), was investigated using a biosensor on the effect surface plasmon resonance (BPR) BIAcore 3000 (GE Healthcare, USA) in aqueous buffer systems at physiological pH values. Based on the results of such experiments, the value of the dissociation constant (Cd) of the interaction of the substance and the immobilized ligand is calculated. If the value of Cd is equal to or less than 10 ^-4 M, then this interaction is considered as biologically significant.

Перед каждым экспериментом лиофилизированные синтетические пептиды (чистота более 98%), которые использовались в качестве аналита или лиганда, растворяли в подходящей буферной системе. Концентрация каждого пептида в растворе определялась спектрофотометрически с использованием коэффициента экстинкции 1450 М^-1 cm^-1 при 276 нм (пик поглощения аминокислотного остатка Туг 10 в человеческом Аβ).Before each experiment, lyophilized synthetic peptides (purity greater than 98%), which were used as analyte or ligand, were dissolved in a suitable buffer system. The concentration of each peptide in the solution was determined spectrophotometrically using an extinction coefficient of 1450 M ^-1 cm ^-1 at 276 nm (peak absorption of the amino acid residue Tug 10 in human Aβ).

Сенсорный чип СМ5 с гидрофильной карбоксиметилированной декстрановой матрицей, подходящий буфер HBS (10 мМ HEPES, рН 7.4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.005% ПВА Р20), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-25 carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 2-(2-pyridinyldithio)-ethaneamine (PDEA), и цистеин, используемые в анализах, были закуплены у компании-производителя (BIAcore, GE, USA). Иммобилизация лиганда проводилась в соотвтествие с протоколами компании-производителя и с использованием соотвтествующих рабочих растворов.CM5 sensor chip with hydrophilic carboxymethylated dextran matrix, suitable HBS buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% PVA P20), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -25 carbodiimide (EDC ), N-hydroxysuccinimide (NHS), 2- (2-pyridinyldithio) -ethaneamine (PDEA), and the cysteine used in the analyzes were purchased from the manufacturer (BIAcore, GE, USA). Ligand immobilization was carried out in accordance with the manufacturer's protocols and using appropriate working solutions.

БППР эксперименты были проведен на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США). Синтетический пептид Ас-DAEFRHDSGYEVHHQKGGGGC-NH₂ ("Aβ(1-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys") был использован в качестве лиганда, который иммобилизировали через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналита использовали синтетический пептид Ас-H[isoD][pS]GYEVHH-NH₂ ("isoD-pS-nAβ"). Концентрации образцов растворов каждого аналита были 0, 2, 5, 10, 15 и 20 микромолей). На рисунке 1 представлены полученные наборы кинетических кривых связывания (сенсограммы БППР) аналита "isoD-pS-nAβ" c иммобилизованным Аβ(1-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) после вычитания контрольного фона. Измерения проводились при 25°С в 10 мМ HEPES буфере (рН 6,8), содержащем различные концентрации аналита (0, 2, 5, 10, 15 и 20 микромолей, кривые 1-6, соответственно) в присутствии 100 мкМ Zn.BDPR experiments were performed on a BIAcore 3000 instrument (GE Healthcare, USA). The synthetic peptide Ac-DAEFRHDSGYEVHHQKGGGGC-NH ₂ ("Aβ (1-16) -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys") was used as a ligand that was immobilized via a disulfide bond of the thiol group of the C-terminal cysteine residue. The synthetic peptide Ac-H [isoD] [pS] GYEVHH-NH ₂ ("isoD-pS-nAβ") was used as an analyte. The concentration of sample solutions of each analyte was 0, 2, 5, 10, 15 and 20 micromoles). Figure 1 shows the obtained sets of kinetic binding curves (BPR sensograms) of the isoD-pS-nAβ analyte with immobilized Aβ (1-16) -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) after subtraction of the control background. The measurements were carried out at 25 ° C in 10 mM HEPES buffer (pH 6.8) containing various analyte concentrations (0, 2, 5, 10, 15, and 20 micromoles, curves 1-6, respectively) in the presence of 100 μM Zn.

На основании полученых данных было найдено, что константа диссоциации цинк-опосредованных взаимодействий между "isoD-pS-nAβ" и иммобилизованным Aβ(1-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys составляет (5±0.7)×10^-7 М.Based on the data obtained, it was found that the dissociation constant of zinc-mediated interactions between isoD-pS-nAβ and immobilized Aβ (1-16) -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys is (5 ± 0.7) × 10 ^-7 M.

Таким образом, показано образование стабильных межмолекулярных комплексов между металл-связывающим доменом бета-амилоида и тестируемым пептидом в присутствии ионов цинка. При этом в отсутствии ионов цинка никаких взаимодействий зафиксированно не было. Следовательно, пептид согласно изобретению представляет собой средство, способное образовать стабильный межмолекулярный комплекс с металл-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.Thus, the formation of stable intermolecular complexes between the metal-binding domain of amyloid beta and the test peptide in the presence of zinc ions is shown. Moreover, in the absence of zinc ions, no interactions were recorded. Therefore, the peptide according to the invention is an agent capable of forming a stable intermolecular complex with a metal-binding domain of human beta-amyloid.

ПРИМЕР 2. Анализ влияния "isoD-pS-nAβ" на образование цинк-индуцированных агрегатов человеческого бета-амилоида (Аβ42) методом корреляционной спектроскопии (динамического лазерного светорассеяния).EXAMPLE 2. Analysis of the effect of "isoD-pS-nAβ" on the formation of zinc-induced aggregates of human beta-amyloid (Aβ42) by correlation spectroscopy (dynamic laser light scattering).

Размер цинк-индуцированных агрегатов пептидов Аβ42 определяли методом корреляционной спектроскопии, используя анализатор размера частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания), позволяющий измерять диаметр частиц в диапазоне от 0.6 нм до 10 мкм. Измерения проводили при температуре 25°С в соответствии с инструкцией производителя. Метод корреляционной спектроскопии основан на определении коэффициента диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света. Размер частиц определяется по формуле Стокса-Эйнштейна, которая связывает коэффициент диффузии с гидродинамическим радиусом частицы. При этом предполагается, что частица имеет сферическую форму.The size of zinc-induced aggregates of Aβ42 peptides was determined by correlation spectroscopy using a Zetasizer Nano ZS particle size analyzer (Malvern Instruments Ltd., United Kingdom), which allows measuring particle diameters in the range from 0.6 nm to 10 μm. The measurements were carried out at a temperature of 25 ° C in accordance with the manufacturer's instructions. The method of correlation spectroscopy is based on the determination of the diffusion coefficient of dispersed particles in a liquid by analyzing the correlation function of fluctuations in the intensity of scattered light. Particle size is determined by the Stokes-Einstein formula, which relates the diffusion coefficient to the hydrodynamic radius of the particle. It is assumed that the particle has a spherical shape.

Для полидисперсной популяции частиц анализатор Zetasizer Nano ZS дает распределение частиц по размеру, для чего используется программа CONTIN, являющаяся частью его программного обеспечения. Программа использует математический алгоритм, позволяющий из всех возможных распределений частиц по размеру выбрать то, которое наилучшим образом описывает экспериментально определяемую корреляционную функцию. Программа также определяет средний размер частиц в полидисперсной популяции, который использовался в данной работе для сравнительное анализа.For a polydisperse population of particles, the Zetasizer Nano ZS analyzer gives a particle size distribution, which uses the CONTIN program, which is part of its software. The program uses a mathematical algorithm that allows you to choose from all possible particle size distributions the one that best describes the experimentally determined correlation function. The program also determines the average particle size in the polydisperse population, which was used in this work for comparative analysis.

Пробы для определения размера агрегатов пептидов методом корреляционной спектроскопии готовились следующим образом. 100 мкл раствора пептида Аβ42 с концентрацией 30 мкМ в буфере А (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4) смешивали с 20 мкл раствора хлорида цинка концентрацией 150 мМ в буфере А в одноразовой микрокювете BRAND UV (BRAND GMBH, Германия) и немедленно использовали для определения размера агрегатов. Для определения влияния пептида isoD-pS-nAβ на цинк-индуцированную агрегацию Аβ42 к 100 мкл раствора Аβ42 предварительно добавляли 1 мкл раствора пептида isoD-pS-nAβ в буфере А с концентрацией, позволяющей получать желаемое молярное соотношение данных пептидов и Аβ42 в интервале от 1 до 10, инкубировали смесь 10 мин при комнатной температуре, после чего вносили цинк как описано выше. Конечная концентрация Аβ42 в анализируемой пробе составляла 25 мкМ, молярное отношение цинк/Аβ42 было 1:1, а молярное отношение между isoD-pS-nAβ и Аβ42 составляло 1:1, 3:1 и 10:1.Samples for determining the size of peptide aggregates by correlation spectroscopy were prepared as follows. 100 μl of a solution of Aβ42 peptide with a concentration of 30 μM in buffer A (10 mm HEPES, 150 mm NaCl, pH 7.4) was mixed with 20 μl of a solution of zinc chloride with a concentration of 150 mm in buffer A in a disposable BRAND UV microcuvette (BRAND GMBH, Germany) and immediately used to determine the size of the aggregates. To determine the effect of the isoD-pS-nAβ peptide on zinc-induced aggregation of Aβ42, 100 μl of a solution of isoD-pS-nAβ peptide in buffer A with a concentration that allows to obtain the desired molar ratio of these peptides to Aβ42 in the range from 1 to 10, the mixture was incubated for 10 min at room temperature, after which zinc was added as described above. The final concentration of Aβ42 in the analyzed sample was 25 μM, the molar ratio of zinc / Aβ42 was 1: 1, and the molar ratio between isoD-pS-nAβ and Aβ42 was 1: 1, 3: 1 and 10: 1.

Результаты показаны на рис. 2 - влияние "isoD-pS-nAβ" на цинк-зависимую агрегацию человеческого бета-амилоида Аβ42.The results are shown in fig. 2 - effect of "isoD-pS-nAβ" on zinc-dependent aggregation of human beta-amyloid Aβ42.

Из приведенных на Рис. 2 данных следует, что добавление isoD-pS-nAβ существенно снижает способность Аβ42 подвергаться цинк-индуцированой агрегации. При этом при повышении концентрации субстанции в смесях процесс ингибирования такой агрегации усиливается.From the ones shown in Fig. From the data 2 it follows that the addition of isoD-pS-nAβ significantly reduces the ability of Aβ42 to undergo zinc-induced aggregation. Moreover, with an increase in the concentration of the substance in mixtures, the process of inhibition of such aggregation increases.

ПРИМЕР 3. Улучшение когнитивных функций мышиной модели («АβРР/PS1») болезни Альцгеймера под действием внутривенного введения "isoD-pS-nAβ" экспериментальным животным.EXAMPLE 3. Improvement of the cognitive functions of the mouse model ("AβPP / PS1") of Alzheimer's disease under the influence of intravenous administration of "isoD-pS-nAβ" to experimental animals.

Для оценки влияния субстанции "isoD-pS-nAβ" на характеристики памяти и обучения экспериментальных животных была использована стандартная методика оценки пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Водный лабиринт Морриса является классическим инструментом для оценки пространственной памяти, зависящей от функции гиппокампа. Важно отметить, что именно в гиппокампе у пациентов при болезни Альцгеймера и у трасгенных мышей линии «АβРР/PS1» агрессивно развивается церебральный амилоидоз. Были использованы три группы семимесячных мышей: интактные животные линии «АβРР/PS1» (N «intact» = 9 голов), инъектированные препаратом "isoD-pS-nAβ" мыши линии «АβРР/PS1» (N «isoD-pS-nAβ» = 8 голов; препарат вводился внутривенно в дозе 5 мг/кг три раза - в возрасте 4, 5 и 6 месяцев), и контрольные мыши дикого типа (N «wt» = 10 голов). Результаты анализа пространственной памяти животных, полученные в этом тесте, продемонстрировали значительную разницу между интактными и инъектированными мышами линии «АβРР/PS1» (рис. 3) - анализ пространственной памяти интактных животных линии «АβРР/PS1» (N «intact» = 9 голов, сплошная линия, черные кружочки), инъектированных препаратом «isoD-pS-nAβ» мышей линии «АβРР/PS1» (N «isoD-pS-nAβ» = 8 голов, возраст 7 мес., прерывистая линия, черные треугольнички), и контрольных мышей дикого типа (N «wt» = 10 голов, пунктирная линия, пустые треугольнички) в водном лабиринте Морриса. Размер бассейна 180 см, платформа расположена стационарно. На оси ординат указано время, затраченное животными на поиск платформы при последовательных тестированиях в течение 5 дней.To assess the effect of the substance "isoD-pS-nAβ" on the characteristics of memory and training of experimental animals, a standard method for assessing spatial memory in the Morris water maze was used. Morris Water Maze is a classic tool for assessing spatial memory depending on the function of the hippocampus. It is important to note that cerebral amyloidosis aggressively develops in the hippocampus in patients with Alzheimer's disease and in transgenic AβPP / PS1 mice. Three groups of seven-month-old mice were used: intact animals of the AβPP / PS1 line (N intact = 9 animals) injected with the isoD-pS-nAβ mouse of the AβPP / PS1 mouse (N isoD-pS-nAβ) = 8 animals; the drug was administered intravenously at a dose of 5 mg / kg three times at the age of 4, 5 and 6 months), and wild-type control mice (N “wt” = 10 animals). The results of the analysis of the spatial memory of animals obtained in this test showed a significant difference between the intact and injected mice of the AβPP / PS1 line (Fig. 3) - the analysis of the spatial memory of intact animals of the AβPP / PS1 line (N "intact" = 9 goals , solid line, black circles) injected with the isoD-pS-nAβ preparation of AβPP / PS1 mice (N isoD-pS-nAβ = 8 animals, 7 months old, dashed line, black triangles), and wild-type control mice (N "wt" = 10 animals, dashed line, empty triangles) in the water maze Morris. The size of the pool is 180 cm, the platform is stationary. On the ordinate axis, the time spent by the animals searching for the platform during sequential testing for 5 days is indicated.

Начиная с 3-го дня обучения время, которое требовалось контрольным животным (дикого типа) и инъектированным препаратом «isoD-pS-nAβ» трансгенным мышам для нахождения платформы, достоверно сокращалось. В то же время в группе интактных мышей линии «АβРР/PS1» это время оставалось таким же, как и на 1-й день обучения. Таким образом, было показано, что систематические внутривенные инъекции «isoD-pS-nAβ» (в дозах по 5 мг/кг) приводили к улучшению способности животных к обучению и поддержанию долговременной памяти по сравнению с интактной контрольной группой трансгенных мышей, что свидетельствует о существенном когнитивно-стимулирующем эффекте этой субстанции.Starting from the 3rd day of training, the time required for control animals (wild-type) and transgenic mice injected with the isoD-pS-nAβ preparation was significantly reduced. At the same time, in the group of intact mice of the AβPP / PS1 line, this time remained the same as on the 1st day of training. Thus, it was shown that systematic intravenous injections of isoD-pS-nAβ (in doses of 5 mg / kg) led to an improvement in the ability of animals to learn and maintain long-term memory compared with the intact control group of transgenic mice, which indicates a significant cognitive-stimulating effect of this substance.

Claims

1. The peptide H [isoD] [pS] GYEVHH with open or protected ends of the main polypeptide chain (for example, with an acetylated N-terminal amine and amidated C-terminal hydroxyl), capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with a metal-binding domain of human beta amyloid.

2. A pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease, comprising an effective amount of a peptide according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

3. A method of reducing zinc-induced aggregation of beta-amyloid, including the interaction of the peptide according to claim 1 with beta-amyloid.

4. The method of forming zinc-mediated intermolecular complexes of the peptide-beta-amyloid, comprising the interaction of the peptide according to claim 1 with beta-amyloid.

5. A method of treating Alzheimer's disease, comprising administering to the patient an effective amount of a pharmaceutical composition according to claim 2.