RU2679055C2 - RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679055C2 RU2679055C2 RU2016152258A RU2016152258A RU2679055C2 RU 2679055 C2 RU2679055 C2 RU 2679055C2 RU 2016152258 A RU2016152258 A RU 2016152258A RU 2016152258 A RU2016152258 A RU 2016152258A RU 2679055 C2 RU2679055 C2 RU 2679055C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mbp
- protein
- fragment
- cho
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 23
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims description 8
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 12
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 title description 10
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 title description 10
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 12
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 8
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 6
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 abstract description 10
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 abstract description 8
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 abstract description 6
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 4
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000012743 FreeStyle Max reagent Substances 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 101100334106 Homo sapiens F10 gene Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
ВведениеIntroduction
Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к способу получения бифункциональной молекулы для терапии рассеянного склероза (PC). Объектом исследования является химерный белок, состоящий из модуля доставки - пептида основного белка миелина МВР84-106, слитного с цитотоксическим модулем - константным доменом иммуноглобулина человека. Аутоантиген - пептид основного белка миелина МВР84-106 является одним из основных биомаркеров патологических лимфоцитов, при этом имеет высокую стабильность к протеолитической деградации. Константный домен иммуноглобулина человека является естественным сигналом иммунной системы для деградации клетки-мишени по механизму комплимент-зависимой цитотоксичности. Объединение перечисленных модулей в единую молекулу позволяет получать бифункцональный цитотоксический белок, направленно элиминирующий специфические патологические лимфоциты при PC.The invention relates to biotechnology, namely: to a method for producing a bifunctional molecule for the treatment of multiple sclerosis (PC). The object of the study is a chimeric protein consisting of a delivery module - the peptide of the myelin basic protein MBP84-106, fused to the cytotoxic module - the constant domain of human immunoglobulin. Autoantigen - the peptide of the myelin basic protein MBP84-106 is one of the main biomarkers of pathological lymphocytes, while it has high stability to proteolytic degradation. The constant domain of human immunoglobulin is a natural signal of the immune system for the degradation of the target cell by the mechanism of compliment-dependent cytotoxicity. The combination of the above modules into a single molecule allows one to obtain a bifunctional cytotoxic protein that directionally eliminates specific pathological lymphocytes in MS.
Известны способы получения прототипов бифункциональных цитотоксических молекул в составе слитного белка на основе специфического пептида и токсических агентов на основе барназы, псевдомонадного токсина и константного Fc-домена антитела человека (Stepanov, А.V., Belogurov, A.A., Ponomarenko, N.A., Stremovskiy, О.A., Kozlov, L.V., Bichucher, А.М., et al. (2011). Design of Targeted В Cell Killing Agents. PloS One, 6(6), e20991. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0020991.t001). Прототипы препаратов иммунотоксинов высокоспецифично (с избирательностью до 5000 раз в сравнении с иммунотоксином не содержащим таргетного участка) взаимодействовали с клетками мишенями и вызывали значительный цитотоксический эффект. Вариантов использования слитного белка МВР84-106 и константного домена иммуноглобулина человека на сегодняшний день не известно.Known methods for producing prototypes of bifunctional cytotoxic molecules in a fusion protein based on a specific peptide and toxic agents based on barnase, pseudomonas toxin and the constant Fc domain of a human antibody (Stepanov, A.V., Belogurov, AA, Ponomarenko, NA, Stremovskiy, O .A., Kozlov, LV, Bichucher, A.M., et al. (2011). Design of Targeted by Cell Killing Agents. PloS One, 6 (6), e20991. Http://doi.org/10.1371/ journal.pone.0020991.t001). The prototypes of immunotoxin preparations highly specific (with selectivity up to 5,000 times compared to the immunotoxin not containing the targeted region) interacted with target cells and caused a significant cytotoxic effect. Options for using the fusion protein MBP84-106 and the constant domain of human immunoglobulin are not known today.
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая слитный белок МВР84-106 и константный домен иммуноглобулина человека. И способ получения белка MBP84-106-Fc для терапии рассеянного склероза.The invention relates to the field of biotechnology, in particular, a recombinant plasmid DNA encoding a fusion protein MBP 84-106 and a constant domain of human immunoglobulin is provided . And a method for producing MBP 84-106-Fc protein for the treatment of multiple sclerosis.
Уровень техникиState of the art
Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к способу получения бифункционального агента для терапии социально-значимого заболевания - рассеянного склероза (PC).The invention relates to biotechnology, namely: to a method for producing a bifunctional agent for the treatment of a socially significant disease - multiple sclerosis (PC).
Объектом разработки является пептид основного белка миелина МВР84-106, слитный с константным доменом иммуноглобулина человека. Аутоантиген - пептид основного белка миелина МВР84-106 является одним из основных биомаркеров патологических лимфоцитов при этом имеет высокую стабильность к протеолитической деградации. Константный домен иммуноглобулина человека является естественным сигналом иммунной системы для деградации клетки-мишени по механизму комплимент-зависимой цитотоксичности. Объединение перечисленных модулей в единую молекулу позволяет получать бифункцональный цитотоксический препарат, направленно элиминирующий специфические патологические лимфоциты при PC.The object of development is the peptide of the myelin basic protein MBP84-106, fused to the constant domain of human immunoglobulin. Autoantigen - the peptide of the myelin basic protein MBP84-106 is one of the main biomarkers of pathological lymphocytes and at the same time has high stability to proteolytic degradation. The constant domain of human immunoglobulin is a natural signal of the immune system for the degradation of the target cell by the mechanism of compliment-dependent cytotoxicity. The combination of these modules into a single molecule allows you to get a bifunctional cytotoxic drug that specifically eliminates specific pathological lymphocytes in MS.
Известны способы получения прототипов бифункциональных цитотоксических молекул в составе слитного белка на основе специфического пептида и токсических агентов на основе барназы, псевдомонадного токсина и константного Fc-домена антитела человека (Stepanov, А.V., Belogurov, A.A., Ponomarenko, N.A., Stremovskiy, О.A., Kozlov, L.V., Bichucher, А.М., et al. (2011). Design of Targeted В Cell Killing Agents. PloS One, 6(6), e20991. Прототипы препаратов иммунотоксинов высокоспецифично (с избирательностью до 5000 раз в сравнении с иммунотоксином не содержащим таргетный участок) взаимодействовали с клетками мишенями и вызывали значительный цитотоксический эффект. Все представленные методики заключаются в генно-инженерном способе получения бифункциональных молекул, однако, способы получения слитного белка пептида основного белка миелина МВР84-106 с константным доменом иммуноглобулина человека, на настоящий момент не описаны.Known methods for producing prototypes of bifunctional cytotoxic molecules in a fusion protein based on a specific peptide and toxic agents based on barnase, pseudomonas toxin and the constant Fc domain of a human antibody (Stepanov, A.V., Belogurov, AA, Ponomarenko, NA, Stremovskiy, O .A., Kozlov, LV, Bichucher, AM, et al. (2011). Design of Targeted by Cell Killing Agents. PloS One, 6 (6), e20991. Prototypes of immunotoxin preparations are highly specific (with selectivity up to 5000 times in comparison with an immunotoxin not containing a targeted site) interacted with target cells and caused wali significant cytotoxic effect. All techniques are presented in the genetic engineering process for the preparation of bifunctional molecules, however, methods for producing the fused protein of the peptide of myelin basic protein MVR84-106 to a constant domain of human immunoglobulin at present not described.
Известна плазмида pYR-GCEVH, содержащая тяжелую цепь антитела HCAb к раку кишечника человека, и плазмида pYR-GCEVL, содержащая легкую цепь антитела к раку кишечника человека [Xiong Н., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. - 2005. - V. 38 (4). - P. 414-419]. Плазмида pYR-GCEVL включает в себя ген устойчивости к неомицину/генетицину под управлением раннего промотора вируса SV40 с удаленным энхансером. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования. Плазмида pYR-GCEVH включает в себя ген dhfr под управлением раннего промотора вируса SV40. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования.The known plasmid pYR-GCEVH containing the heavy chain of an HCAb antibody to human intestinal cancer and the plasmid pYR-GCEVL containing the light chain of an antibody to human intestinal cancer [Xiong N., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. - 2005 .-- V. 38 (4). - P. 414-419]. Plasmid pYR-GCEVL includes a neomycin / geneticin resistance gene driven by an early promoter of the SV40 virus with a deleted enhancer. Transcription of the light chain gene is controlled by CMV at the 5 'end and bovine growth hormone terminator (BGHT), at the 3' end there is a polyadenylation site. Plasmid pYR-GCEVH includes the dhfr gene under the control of the early promoter of the SV40 virus. Transcription of the light chain gene is controlled by CMV at the 5 'end and bovine growth hormone terminator (BGHT), at the 3' end there is a polyadenylation site.
Культура клеток dhfr (-) СНО (АТСС, США), дефицитных по дигидрофолатредуктазе (ДГФР), была ко-трансфецирована с использованием равных количеств плазмид pYR-GCEVH, pYR-GCEVL. После проведения нескольких раундов селекции была получена культура, клоны которой продуцировали химерные антитела с выходом от 30 до 100 мкг/мл кондиционированной среды [Xiong и др., 2005].A culture of dhfr (-) CHO cells (ATCC, USA) deficient in dihydrofolate reductase (DHFR) was co-transfected using equal amounts of pYR-GCEVH, pYR-GCEVL plasmids. After several rounds of selection, a culture was obtained whose clones produced chimeric antibodies with a yield of 30 to 100 μg / ml of conditioned medium [Xiong et al., 2005].
Известны плазмиды phCMV-VHRhD-g1C-neo и phCMV-VLRhD-KR-neo, кодирующие антитела против RhD антигена. Плазмида phCMV-VHRhD-g1C-neo содержит вариабельную и константную области тяжелой цепи под контролем главного раннего энхансера цитомегаловируса и промотор начала инициации транскрипции рекомбинантных тяжелых химерных цепей антитела, а также бактериальный ген устойчивости к неомицину под контролем раннего промотора SV40. Плазмида phCMV-VLRhDKR-neo содержит вариабельную и константную области легкой цепи под контролем раннего энхансера цитомегаловируса и промотор начала инициации транскрипции рекомбинантных легких химерных цепей антитела. В данной плазмиде ген устойчивости к неомицину под контролем раннего промотора SV40 был заменен геном dhfr из плазмиды pSV2-dhfr (Subramani S., Mulligan R., Berg P. Expression of the mouse dihydrofolatereductase complementary deoxyribonucleic acid in simian virus 40 vectors // Mol Cell Biol - 1981. - V. 1 (9). - P. 854-864). В обе плазмиды были внесены секреторные последовательности перед вариабельными доменами цепей антител, отделяющими их от интронных последовательностей. После проведения трансфекции клеточной линии СНО, дефицитной по гену ДГФР, и нескольких раундов селекции клонов, полученных из трансформированной культуры CHO-mAb с использованием МТХ (до 1000 нМ) и селективного антибиотика G418 (600 мкг/мл) были получены относительно устойчивые клоны с продукцией до 110 мкг/мл химерных антител [Chusainow J., Yang Y.S, Yeo J.H.M., Toh P.C., Asvadi P., Wong N.S.C., Miranda G.S. Yap. A Study of Monoclonal Antibody-Producing CHO Cell Lines: What Makes a Stable High Producer // Biotechnology and Bioengineering. - 2009. - V. 102 (4). - P. 1182-1196].Known plasmids phCMV-VHRhD-g1C-neo and phCMV-VLRhD-KR-neo encoding antibodies against RhD antigen. Plasmid phCMV-VHRhD-g1C-neo contains the variable and constant regions of the heavy chain under the control of the main early enhancer of the cytomegalovirus and the promoter of the initiation of transcription initiation of recombinant heavy chimeric chains of the antibody, as well as the bacterial neomycin resistance gene controlled by the SV40 early promoter. The plasmid phCMV-VLRhDKR-neo contains the variable and constant regions of the light chain under the control of the early enhancer of cytomegalovirus and the promoter of the initiation of transcription initiation of recombinant light chimeric chains of the antibody. In this plasmid, the neomycin resistance gene under the control of the early SV40 promoter was replaced by the dhfr gene from the pSV2-dhfr plasmid (Subramani S., Mulligan R., Berg P. Expression of the mouse dihydrofolatereductase complementary deoxyribonucleic acid in
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Изобретение решает задачу создания технологии для ускорения и повышения экономичности процесса получения препарата основного белка миелина МВР84-106, слитого с константной областью человеческого антитела F10 (MBP84-106-Fc).The invention solves the problem of creating technology to accelerate and increase the efficiency of the process of obtaining the preparation of the main myelin protein MBP84-106, fused to the constant region of the human antibody F10 (MBP 84-106-Fc ).
Технический результат достигается за счет увеличения уровня биологического синтеза MBP84-106-Fc клетками-продуцентами при использовании селективного цитостатического препарата (метотрексата).The technical result is achieved by increasing the level of biological synthesis of MBP 84-106-Fc by producer cells using a selective cytostatic drug (methotrexate).
Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, обозначенной pOptiVEC-MBP84-106-Fc, и содержащейThe problem is solved by constructing a recombinant plasmid DNA designated pOptiVEC-MBP 84-106 - Fc , and containing
- фрагмент плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающий промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), внутренний сайт связывания (IRIS), ген ДГФР, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, сайт начала репликации в Е. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования ДНК МВР84-106-Fc;- a fragment of the pOptiVEC ™ -TOPO® plasmid, including the promoter / enhancer of early human cytomegalovirus genes (CMV), the internal binding site (IRIS), the DHFR gene, the herpes virus thymidine kinase polyadenylation signal, the start site of replication in E. coli from pUC plasmid, β gene β-lactamases, as well as the following modifications - a single MluI restriction enzyme recognition site instead of the SalI restriction enzyme recognition site at position 23, single NheI and XhoI restriction enzyme recognition sites after the CMV promoter for cloning MBP 84-106 -Fc DNA;
- фрагмент ДНК, включающий фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК MBP84-106-Fc под контролем промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса человека (CMV);- a DNA fragment comprising the MBP 84-106 -Fc cDNA flanked by NheI and XhoI restriction sites under the control of a promoter / enhancer of early human cytomegalovirus (CMV) genes;
Также настоящее изобретение представляет способ получения культуры клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента MBP84-106-Fc путем трансфекции клеток упомянутой выше рекомбинантной плазмидной ДНК.The present invention also provides a method for producing a culture of Chinese hamster ovary CHO producer MBP 84-106-Fc by transfecting cells of the above recombinant plasmid DNA.
Также настоящее изобретение представляет линию клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента MBP84-106-Fc, называемую далее CHO-S18 и полученную путем трансфекции линии клеток СНО DG44 упомянутой выше рекомбинантной плазмиднойThe present invention also provides a Chinese hamster CHO ovary cell line producer MBP 84-106-Fc , hereinafter referred to as CHO-S18 and obtained by transfection of the CHO DG44 cell line of the aforementioned recombinant plasmid
ДНК.DNA
Также настоящее изобретение представляет способ получения MBP84-106-Fc, включающий:The present invention also provides a method for producing MBP 84-106 -Fc, comprising:
- культивирование в питательной среде упомянутой линии клеток культуры СНО-S18,- culturing in a nutrient medium mentioned cell line culture CHO-S18,
- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.- isolation of the obtained target protein from the culture fluid.
В частном варианте воплощения настоящего изобретения указанная плазмида может представлять собой плазмиду, состоящую из:In a particular embodiment of the present invention, said plasmid may be a plasmid consisting of:
фрагмента плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающего промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), обеспечивающий высокий уровень экспрессии целевых белков в клетках млекопитающих, внутренний сайт связывания рибосом (IRES), ген ДГФР для ауксотрофной селекции трансфецированных клеток СНО DG44 и геномной амплификации стабильных клеточных линий с использованием метатрексата, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса для правильной терминации и процессинга рекомбинантных транскриптов, сайт начала репликации в Е. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования кДНК МВР84-106;a fragment of the pOptiVEC ™ -TOPO® plasmid, including the promoter / enhancer of early human cytomegalovirus (CMV) genes, providing a high level of expression of target proteins in mammalian cells, an internal ribosome binding site (IRES), DHFR gene for auxotrophic selection of transfected CHO cells with DG44 amplification stable cell lines using metatrexate, a herpes virus thymidine kinase polyadenylation signal for the correct termination and processing of recombinant transcripts, the site of origin of replication in E. coli from pl pUC azmides, β-lactamase gene, as well as the following modifications - a single MluI restriction enzyme recognition site instead of the SalI restriction enzyme recognition site at position 23, single NheI and XhoI restriction enzyme recognition sites after the CMV promoter for cloning MBP 84-106 cDNA;
NheI/XhoI - фрагмента ДНК, включающего фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела F10, необходимого для секреции рекомбинантного константного фрагмента иммуноглобулина человека, слитного с фрагментом основного белка миелина 84-106 из клеток-продуцентов СНО в культуральную среду, кДНК фрагмента основного белка миелина МВР84-106, кодирующую фрагмент основного белка миелина, включающий в себя аминокислотные остатки данного белка с 84 по 106 включительно, и кДНК константного фрагмента иммуноглобулина человека, а именно константных доменов СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина изотипа IgG1 человека.NheI / XhoI - DNA fragment flanked by restriction sites NheI and XhoI cDNA of the leader peptide of the heavy chain of monoclonal antibody F10, necessary for the secretion of the recombinant constant fragment of human immunoglobulin fused to a fragment of the main myelin protein 84-106 from cell production medium CHO in culture cDNA fragment of myelin basic protein MBP 84-106 sequence encoding a fragment of myelin basic protein comprising the amino acid residues of the protein from 84 to 106, inclusive, and a cDNA fragment of the constant immun human globulin, namely the constant CH2 domain, CH3 immunoglobulin heavy chain human IgG1 isotype.
Наличие в плазмиде pOptiVEC-MBP84-106-Fc активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки СНО DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток СНО-K1), в среде, содержащей метотрексат.The presence in the plasmid pOptiVEC-MBP 84-106- Fc of the active DHFR gene under IRES control allows the selection and amplification of foreign sequences integrated into the genome of the CHO DG44 cell (dhfr - / - variant of the CHO-K1 cell line) in containing methotrexate.
Технический эффект изобретения заключается в том, что культура, трансфецированная плазмидой pOptiVEC-MBP884-106-Fc продуцирует бифункциональную молекулу MBP84-106-Fc для терапии рассеянного склероза в среду культивирования.A technical effect of the invention consists in that the culture of transfected plasmid pOptiVEC-MBP8 84-106 -Fc produces a bifunctional molecule of MBP 84-106 -Fc for treatment of multiple sclerosis in the culture medium.
Экспрессия бифункциональной молекулы MBP84-106-Fc может быть осуществлена в эукариотических клетках. Примером эукариотической клетки, пригодной для продукции слитного белка МВР84-106 с константным доменом иммуноглобулина человека, согласно настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (СНО). Примерами клеток яичников Cricetulus griseus (СНО), применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (СНО) клетки СНО DG44 (Invitrogen).The expression of the bifunctional molecule MBP 84-106 -Fc can be carried out in eukaryotic cells. An example of a eukaryotic cell suitable for the production of a fusion protein MBP 84-106 with a constant domain of human immunoglobulin according to the present invention are, but are not limited to, ovarian cells Cricetulus griseus (CHO). Examples of Cricetulus griseus ovary cells (CHO) useful in the framework of the present invention include, but are not limited to, Cricetulus griseus ovary cells (CHO) CHO DG44 cells (Invitrogen).
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения МВР84-106-Fc, включающий выращивание трансформированных клеток эукариот в питательной среде и выделение полученных антител из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing MBP 84-106 -Fc, comprising growing transformed eukaryotic cells in a nutrient medium and isolating the resulting antibodies from the culture fluid.
Выращивание клеток эукариот осуществляют в атмосфере 5% СО2 в режиме культивирования с перемешиванием в синтетических средах, таких как среда OptiCHO, в течение 3-6 суток.The cultivation of eukaryotic cells is carried out in an atmosphere of 5% CO 2 in a culture mode with stirring in synthetic media, such as OptiCHO medium, for 3-6 days.
После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем белок может быть выделен и очищен методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.After growth, solid components, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration using a membrane, and then the protein can be isolated and purified by precipitation with salts using sodium sulfate or ammonium sulfate, affinity chromatography, ion exchange chromatography and etc.
Предложенные рекомбинантная плазмида pOptiVEC-MBP84-106-Fc и способ получения линии культивируемых клеток СНО, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc, впервые получены авторами данного изобретения, в научной и патентной литературе не описаны.The proposed recombinant plasmid pOptiVEC-MBP 84-106- Fc and a method for producing a cultured CHO cell line based on the use of the recombinant plasmid pOptiVEC-MBP 84-106 - Fc were first obtained by the authors of this invention, are not described in the scientific and patent literature.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pOptiVEC-MBP84-106-Fc.Example 1. Construction of recombinant plasmid DNA pOptiVEC-MBP 84-106 - Fc .
Конструирование плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc проводят по схеме, изложенной на фигуре 1, с использованием праймеров, приведенных в таблице 1.The construction of the plasmid pOptiVEC-MBP 84-106- Fc carried out according to the scheme set forth in figure 1, using the primers shown in table 1.
Последовательности:Sequences:
SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1
аминокислотная последовательность лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела F10monoclonal antibody F10 heavy chain leader peptide amino acid sequence
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2
нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид тяжелой цепи моноклонального антитела F10nucleotide sequence encoding a leader peptide of the heavy chain of a monoclonal antibody F10
SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3
нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент основного белка миелина 84-106 (МВР84-106)nucleotide sequence encoding a fragment of the main myelin protein 84-106 (MBP 84-106 )
SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 4
аминокислотная последовательность фрагмента основного белка миелина 84-106 (МВР84-106)amino acid sequence of a fragment of the main myelin protein 84-106 (MBP 84-106 )
SEQ ID NO: 5SEQ ID NO: 5
нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-фрагмент антитела IgG1 (домены СН2-СН3) человекаThe nucleotide sequence encoding the Fc fragment of an IgG1 antibody (CH2-CH3 domains)
SEQ ID NO: 6SEQ ID NO: 6
аминокислотная последовательность Fc-фрагмента антитела IgG1 (доменов СН2-СН3) человекаThe amino acid sequence of the Fc fragment of an IgG1 antibody (CH2-CH3 domains)
Итоговая последовательность:The final sequence:
NheINhei
XhoIXhoi
Жирным шрифтом отмечен сигнальный пептид, подчеркиванием выделена область Fc, между сигнальным пептидом и областью Fc находится последовательность МВР84-106, после области Fc находится нетранслируемая область. На 5'- и 3'-концах курсивом выделены сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI, соответственно. Результирующая генетическая конструкция изображена на фигуре 2.The signal peptide is marked in bold, the Fc region is underlined , the sequence MBP 84-106 is located between the signal peptide and the Fc region, and the untranslated region is located after the Fc region. At the 5'- and 3'-ends, the recognition sites for the restriction enzymes NheI and XhoI, respectively, are shown in italics. The resulting genetic construct is depicted in figure 2.
Пример 2. Получение линии CHO-S18, продуцента MBP84-106-Fc с применением плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc.Example 2. Obtaining line CHO-S18, producer MBP 84-106-Fc using the plasmid pOptiVEC-MBP 84-106 - Fc .
Для получения линии СНО-18, стабильного продуцента рекомбинантного слитного белка МВР84-106 с константным доменом иммуноглобулина человека проводят трансфекцию клеток яичника китайского хомячка СНО DG44 dhfr - плазмидой pOptiVEC-MBP84-106-Fc. Клетки культивируют в среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen). Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном пемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием реагента Freestyle МАХ (Invitrogen) [Freestyle MAX Reagent Protocol, http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/freestyle_max_reagent_man.pdf]. Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Преципитат готовят следующим образом: при комнатной температуре во флакон А вносят 18 мкг ДНК плазмиды в 1200 мкл среды OptiPRO SFM (Invitrogen), перемешивают, добавляют 15 мкл реагента Freestyle MAX (Invitrogen), инкубируют от 10 до 20 минут при комнатной температуре. После инкубации перемешивают пипетированием и по каплям вносят в культуральный флакон. Культуральный флакон инкубируют при температуре 37°С, 98% влажности, в атмосфере 8% СО2 и непрерывном перемешивании 130 об/мин.To obtain the CHO-18 line, a stable producer of the MBP 84-106 recombinant fusion protein with the constant domain of human immunoglobulin, transfection of Chinese hamster CHO DG44 dhfr ovary cells with plasmid pOptiVEC-MBP 84-106 - Fc is performed . Cells were cultured in CD DG44 medium (Invitrogen) supplemented with 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and containing 0.18% (v / v) Pluronic F-68 (Invitrogen). 30 ml cell suspension (4.5 ml cells) are seeded in 125 ml Erlenmeyer bottles with constant stirring on an orbital shaker at a frequency of 130 rpm and transfection is carried out after 20-24 hours using Freestyle MAX reagent (Invitrogen) [Freestyle MAX Reagent Protocol, http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/freestyle_max_reagent_man.pdf]. Plasmid DNA is added to the cells as a DNA liposome precipitate. The precipitate is prepared as follows: at room temperature, 18 μg of plasmid DNA is added to vial A in 1200 μl of OptiPRO SFM medium (Invitrogen), mixed, 15 μl of Freestyle MAX reagent (Invitrogen) is added, and incubated for 10 to 20 minutes at room temperature. After incubation, mix by pipetting and dropwise into the culture bottle. The culture bottle is incubated at a temperature of 37 ° C, 98% humidity, in an atmosphere of 8% CO 2 and continuous stirring 130 rpm
Через 48 ч после трансфекции клетки отмывают и помещают в ростовую среду CD OptiCHO (Invitrogen) (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 на 48 ч. Клетки инкубируют в селективной среде в течение двух недель, смену среды и поддержание концентрации клеток в среде проводят каждые трое суток.48 hours after transfection, the cells are washed and placed on OptiCHO growth medium (Invitrogen) CD (without thymidine and hypoxanthine) supplemented with 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and containing 0.18% (v / v) Pluronic F- 68 for 48 hours. Cells are incubated in selective medium for two weeks, changing the medium and maintaining the concentration of cells in the medium is carried out every three days.
Через 14 дней после помещения в селективные условия в культуре остаются клетки, способные существовать без добавления в среду тимидина и гипоксантина. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащей 8 мМ L-Глутамина, 0,18% Pluronic F-68, 50 нМ метотрексата.14 days after being placed in selective conditions, cells remain in the culture that can exist without the addition of thymidine and hypoxanthine to the medium. When the culture reaches a population doubling time of 24 hours, the medium is completely replaced with CD DG44 medium containing 8 mM L-Glutamine, 0.18% Pluronic F-68, 50 nM methotrexate.
Через 14 дней после помещения в среду, содержащую метотрексат, остаются только клетки, способные существовать в присутствии 50 нМ метотрексата. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащую 8 мМ L-Глутамина, 0,18% (v/v) Pluronic F-68, 100 нМ метотрексата.14 days after being placed in a medium containing methotrexate, only cells that can exist in the presence of 50 nM methotrexate remain. When the culture reaches a population doubling time of 24 hours, the medium is completely replaced with CD DG44 medium containing 8 mM L-Glutamine, 0.18% (v / v) Pluronic F-68, 100 nM methotrexate.
Данную процедуру увеличения концентрации метотрексата проводят до тех пор, пока не будет достигнута устойчивость клеток к концентрации метотрексата равной 500 нМ.This procedure for increasing the concentration of methotrexate is carried out until the cells are resistant to a concentration of 500 nM methotrexate.
Таким образом, получают культуру CHO-S18, клетки которой стабильно продуцируют MBP84-106-Fc в культуральную жидкость с выходом до 20 мкг/мл среды при культивировании в условиях перемешивания со скоростью 130 об/мин.Thus, a CHO-S18 culture is obtained, the cells of which stably produce MBP 84-106-Fc in the culture fluid with a yield of up to 20 μg / ml of medium under cultivation under stirring at a speed of 130 rpm.
Пример 3. Получение, выделение и очистка белкового продукта с помощью линии клеток CHO-S18, продуцирующей MBP84-106-Fc.Example 3. Obtaining, isolation and purification of the protein product using the cell line CHO-S18, producing MBP 84-106-Fc .
Получение белкового продукта с применением линии CHO-S18 производят в колбах Эрленмейера различного объема без рассекателей в ростовой среде CD OptiCHO (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и 0,18% (v/v) Pluronic F-68 без добавления дополнительных количеств питательных веществ при постоянном перемешивании с частотой 135 об/мин при температуре 37°С, 98% влажности в атмосфере 8% СО2. Культивирование для получения белкового продукта производят не менее 14 дней.Obtaining a protein product using the CHO-S18 line is carried out in Erlenmeyer flasks of various volumes without dividers in the growth medium CD OptiCHO (without thymidine and hypoxanthine) with the addition of 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and 0.18% (v / v ) Pluronic F-68 without adding additional amounts of nutrients with constant stirring at a frequency of 135 rpm at a temperature of 37 ° C, 98% humidity in the atmosphere of 8% CO 2 . Cultivation to obtain a protein product is done for at least 14 days.
После окончания культивирования для получения продукта MBP84-106-Fc от культуры CHO-S18 полученную кондиционированную среду от культуры CHO-S18 центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант смешивают в соотношении 4:1 с Буфером для нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН=7.0) и наносят на подготовленную Белок А-агарозную колонку (Gibco BRL, США). При элюции используют Буфер для элюции (100 мМ глицина, рН 3,0) и Нейтрализующий буфер (1 М Трис-HCl, рН 8,0). Колонку с 2 мл Белок А-агарозы промывают 3 раза по 4 мл Буфером для нанесения. Далее наносят смесь супернатанта кондиционированной среды и Буфера для нанесения. Образец наносят при комнатной температуре с помощью перистальтического насоса. После нанесения образца колонку промывают 3 раза по 20 мл Буфером для нанесения. Смывание белка MBP84-106-Fc с колонки производят с помощью 6 фракций по 2 мл Буфера для элюции. К образцу добавляют Нейтрализующий буфер в соотношении 1 часть буфера на 9 частей прошедшего через колонку Буфера для элюции.After cultivation to obtain the product MBP 84-106-Fc from the CHO-S18 culture, the resulting conditioned medium from the CHO-S18 culture was centrifuged at 4000 rpm for 30 minutes. The supernatant was mixed in a 4: 1 ratio with Application Buffer (50 mM Tris-HCl, pH = 7.0) and applied to the prepared Protein A-agarose column (Gibco BRL, USA). For elution, an Elution Buffer (100 mM glycine, pH 3.0) and a Neutralizing Buffer (1 M Tris-HCl, pH 8.0) are used. A 2 ml column A-agarose protein is washed 3 times with 4 ml of Application buffer. Next, a mixture of conditioned medium supernatant and application buffer is applied. The sample is applied at room temperature using a peristaltic pump. After applying the sample, the column is washed 3 times with 20 ml of Application buffer. The washing of the MBP 84-106-Fc protein from the column is carried out using 6 fractions of 2 ml of Elution buffer. A neutralizing buffer is added to the sample at a ratio of 1 part buffer to 9 parts passed through the column of elution buffer.
Полученные образцы выделенного белка MBP84-106-Fc диализуют против ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4) и хранят при температуре +4°С.The obtained samples of the isolated protein MBP 84-106-Fc are dialyzed against FSB (phosphate buffered saline, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.76 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) and stored at a temperature of + 4 ° C.
Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят как с использованием электрофоретического метода, так и аналитической гель-проникающей ВЭЖХ.Evaluation of the homogeneity and degree of purification of the drug is carried out using both the electrophoretic method and analytical gel-penetrating HPLC.
Препараты рекомбинантных белка MBP84-106-Fc, полученные в ходе выделения с помощью аффинной хроматографии на Белок А-агарозе, анализируют на хроматографической ВЭЖХ системе Knauer (Германия), оснащенной колонкой Супердекс-200-10/300GL. Исследование проводят в протекающем буфере А (100 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5). Детекцию осуществляют при длине волны 230 нм УФ-детектором 2600 (UV detector 2600).Preparations of the recombinant protein MBP 84-106-Fc obtained by isolation using affinity chromatography on Protein A-agarose were analyzed on a Knauer chromatographic HPLC system (Germany) equipped with a Superdex-200-10 / 300GL column. The study is carried out in flowing buffer A (100 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, pH 7.5). Detection is carried out at a wavelength of 230 nm by a UV detector 2600 (UV detector 2600).
Элюция MBP84-106-Fc с колонки происходит в интервале 31-34 мин от момента старта проведения хроматографического анализа. Данные хроматографического анализа свидетельствуют о более чем 98%-ной чистоте полученного препарата рекомбинантных антител. Elution of MBP 84-106-Fc from the column occurs in the range of 31-34 min from the start of chromatographic analysis. The data of chromatographic analysis indicate more than 98% purity of the resulting preparation of recombinant antibodies.
Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля используют неокрашенный белковый маркер молекулярных весов (Fermentas, Великобритания). Перед внесением к 15 мкл образца антител добавляют 5 мкл Буфера для нанесения с 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (200 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 400 мМ 2-МЭ, 4% натрия додецилсульфат, 0,01% бромофеноловый синий, 40%-ный глицерин). Образцы для внесения на гель инкубируют при температуре 95°С в течение 5 мин.Electrophoresis is carried out in a 10% polyacrylamide gel. An unpainted protein molecular weight marker (Fermentas, UK) is used as a control. Before adding to 15 μl of an antibody sample, add 5 μl of Application Buffer with 2-mercaptoethanol (2-ME) (200 mm Tris-HCl, pH 6.8, 400 mm 2-ME, 4% sodium dodecyl sulfate, 0.01% bromophenol blue, 40% glycerin). Samples for application to the gel are incubated at a temperature of 95 ° C for 5 minutes.
Полученные образцы продукта MBP84-106-Fc (Фиг. 3) характеризуются следующими показателями:The obtained samples of the product MBP 84-106-Fc (Fig. 3) are characterized by the following indicators:
- гомогенность препарата не менее 98% (по данным гель-электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с денситометрией);- the homogeneity of the drug is not less than 98% (according to gel electrophoresis in a 10% polyacrylamide gel with densitometry);
- молекулярная масса - 28119 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов);- molecular weight - 28119 Yes (according to gel electrophoresis with protein markers of molecular weights);
Пример 4. Получение, выделение и очистка MBP84-106-Fc с применением гель-проникающей хроматографииExample 4. Obtaining, isolation and purification of MBP 84-106-Fc using gel permeation chromatography
После окончания культивирования для получения препарата рекомбинантного MBP84-106-Fc полученную кондиционированную среду от культуры CHO-S18 центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант смешивают в соотношении 4:1 с Буфером для нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН 7,0) и наносят на подготовленную Белок А-агарозную колонку (Gibco BRL, США). При элюции используют Буфер для элюции (100 мМ глицина, рН 3,0) и Нейтрализующий буфер (1 М Трис-HCl, рН 8,0). Колонку с 2 мл Белок А-агарозы промывают 3 раза по 4 мл Буфером для нанесения. Далее наносят смесь супернатанта кондиционированной среды и Буфера для нанесения. Образец наносят при комнатной температуре с помощью перистальтического насоса. После нанесения образца колонку промывают 3 раза по 20 мл Буфером для нанесения. Смывание препарата рекомбинантного Fc-MBP с колонки производят с помощью 6 фракций по 2 мл Буфера для элюции. К образцу добавляют Нейтрализующий буфер в соотношении 1 часть буфера Полученные образцы выделенных антител диализуют против ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4), концентрируют с помощью Amicon Ultracel (10000NMWL) до 4 мл (15 мин 4°С, 5000g) и хранят при температуре +4°С. Проводят гель-фильтрационную хроматографию с использованием хроматографической колонки Superdex 75 16/600 GL (GE Healthcare Life Sciences). Буфер нанесения: ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4). Скорость потока: 2,5 мл/мин. Очищенная фракция препарата рекомбинантного Fc-MBP выходит с 0,4 по 0,47 объем колонки. Типичная хроматограмма процесса очистки представлена на фигуре 4.After cultivation, to obtain the recombinant MBP 84-106-Fc preparation, the resulting conditioned medium from the CHO-S18 culture was centrifuged at 4000 rpm for 30 minutes. The supernatant is mixed in a 4: 1 ratio with Application Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.0) and applied to the prepared Protein A-agarose column (Gibco BRL, USA). For elution, an Elution Buffer (100 mM glycine, pH 3.0) and a Neutralizing Buffer (1 M Tris-HCl, pH 8.0) are used. A 2 ml column A-agarose protein is washed 3 times with 4 ml of Application buffer. Next, a mixture of conditioned medium supernatant and application buffer is applied. The sample is applied at room temperature using a peristaltic pump. After applying the sample, the column is washed 3 times with 20 ml of Application buffer. Rinse off the recombinant Fc-MBP preparation from the column using 6 fractions of 2 ml Elution Buffer. A neutralizing buffer in the ratio of 1 part of the buffer is added to the sample. The obtained samples of the isolated antibodies are dialyzed against PBS (phosphate-buffered saline, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.76 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4), concentrated using Amicon Ultracel (10000NMWL) to 4 ml (15 min 4 ° C, 5000g) and stored at + 4 ° C. Gel filtration chromatography was performed using a Superdex 75 16/600 GL chromatography column (GE Healthcare Life Sciences). Application buffer: PBS (phosphate buffered saline, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.76 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4). Flow rate: 2.5 ml / min. The purified fraction of the recombinant Fc-MBP preparation leaves from 0.4 to 0.47 column volume. A typical chromatogram of the cleaning process is presented in figure 4.
Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят как с использованием электрофоретического метода, так и иммуноферментного анализа. Элюция препарата рекомбинантного MBP84-106-Fc с колонки происходит в интервале 0,4-0,47 объема колонки от момента старта проведения хроматографической очистки.Evaluation of the homogeneity and degree of purification of the drug is carried out using both the electrophoretic method and enzyme-linked immunosorbent assay. The elution of the recombinant MBP 84-106-Fc preparation from the column occurs in the range of 0.4-0.47 column volume from the start of chromatographic purification.
Электрофорез проводят в 12%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля используют неокрашенный белковый маркер молекулярных весов (Fermentas, Великобритания). Перед внесением к 15 мкл образца антител добавляют 5 мкл Буфера для нанесения с 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (200 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 400 мМ 2-МЭ, 4% натрия додецилсульфат, 0,01% бромофеноловый синий, 40%-ный глицерин). Образцы для внесения на гель инкубируют при температуре 95°С в течение 5 мин.Electrophoresis is carried out in a 12% polyacrylamide gel. An unpainted protein molecular weight marker (Fermentas, UK) is used as a control. Before adding to 15 μl of an antibody sample, add 5 μl of Application Buffer with 2-mercaptoethanol (2-ME) (200 mm Tris-HCl, pH 6.8, 400 mm 2-ME, 4% sodium dodecyl sulfate, 0.01% bromophenol blue, 40% glycerin). Samples for application to the gel are incubated at a temperature of 95 ° C for 5 minutes.
Иммуноферментный анализ препарата рекомбинатного MBP84-106-Fc, приведенный на фигуре 5, проводили с использованием антивидовых антител анти-Fc (anti-human anti-Fc hrp Sigma Aldrich). Препарат рекомбинатного MBP84-106-Fc анализировали в двукратных разведениях от 6 до 50 нг/мл (в соответсвии с оптической плотностью белка). В качестве калибровки и положительного контроля использовалась титровка препарата поликлональных очищенных антител человека из сыворотки крови (hAb) при концентрации от 6 до 50 нг/мл.An enzyme-linked immunosorbent assay of the recombinant MBP 84-106 -Fc preparation shown in Figure 5 was performed using anti-human anti-Fc anti-human anti-Fc hrp Sigma Aldrich antibodies. The recombinant MBP 84-106-Fc preparation was analyzed in double dilutions from 6 to 50 ng / ml (in accordance with the optical density of the protein). As calibration and positive control, titration of the preparation of polyclonal purified human antibodies from blood serum (hAb) was used at a concentration of from 6 to 50 ng / ml.
Полученные образцы препарата рекомбинантного MBP84-106-Fc характеризуются следующими показателями:The obtained samples of the drug recombinant MBP 84-106 -Fc are characterized by the following indicators:
- гомогенность препарата не менее 98% (по данным гель-электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле с денситометрией);- the homogeneity of the drug is not less than 98% (according to gel electrophoresis in a 12% polyacrylamide gel with densitometry);
- молекулярная масса - 28000 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов);- molecular weight - 28,000 Yes (according to gel electrophoresis with protein markers of molecular weights);
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:The invention is illustrated by the following graphic materials:
Фиг. 1. Схема конструирования экспрессионной плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc. PCMV - CMV промотор; EMCV IRES - независимый сайт инициирования рибосомы; NheI, XhoI - эндонуклеазы рестрикцииFIG. 1. Scheme for constructing the expression plasmid pOptiVEC-MBP 84-106 -Fc. P CMV - CMV promoter; EMCV IRES is an independent ribosome initiation site; NheI, XhoI - restriction endonucleases
Фиг. 2. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc со следующими обозначениями: bla promoter - промотор гена β-лактамазы, CMV promoter -промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, CMV Forward priming site -сайт отжига праймера CMV Forward, МВР84-106 - пептид основного белка миелина, Fc -константный домен тяжелой цепи антитела F10 человека, EMCV IRES reverse primer binding site - сайт отжига праймера EMCV IRES reverse primer, EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR - ген дигидрофолатредуктазы, TK polyA - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, pUC origin - последовательность, отвечающая за репликацию плазмиды pUC, Ampicillin (bla) resistance gene - ген устойчивости к антибиотику ампициллину. MluI, SphI, XhoI, SacII, NheI, NdeI, XbaI, SalI, BglII, PvuI - сайты эндонуклеаз рестрикции.FIG. 2. Physical map of the recombinant plasmid pOptiVEC-MBP 84-106- Fc with the following notation: bla promoter — promoter of the β-lactamase gene, CMV promoter — promoter / promoter of early cytomegalovirus genes, CMV Forward priming site — site for primer annealing CMV Forward, MVP 84-106 - peptide of the myelin basic protein, Fc constant domain of the human F10 antibody heavy chain, EMCV IRES reverse primer binding site - site for primer annealing EMCV IRES reverse primer, EMCV IRES - internal ribosome binding site (IRES) of encephalomyocarditis virus, DHFR - gene dihydrofolate reductase, TK polyA - virus thymidine kinase polyadenylation signal herpes, pUC origin - the sequence responsible for the replication of the plasmid pUC, Ampicillin (bla) resistance gene - the antibiotic resistance gene ampicillin. MluI, SphI, XhoI, SacII, NheI, NdeI, XbaI, SalI, BglII, PvuI are restriction endonuclease sites.
Фиг. 3. Электрофореграмма с денситометрией рекомбинантного препарата MBP84-106-Fc со следующими обозначениями: кДа - белковые стандарты молекулярного веса; Е1 - объединенная фракция препарата MBP84-106-Fc; kDa - единица молекулярного веса, килодальтон.FIG. 3. Electrophoregram with densitometry of the recombinant preparation MBP 84-106-Fc with the following designations: kDa — protein standards of molecular weight; E1 - the combined fraction of the drug MBP 84-106-Fc ; kDa is the unit of molecular weight, kilodaltons.
Фиг. 4. Профиль гель-фильтрационной хроматографии с использованием колонки Superdex75 для финальной очистки препарата рекомбинатного MBP84-106-FcFIG. 4. Profile of gel filtration chromatography using a Superdex75 column for final purification of the recombinant MBP 84-106-Fc preparation
Фиг. 5. Иммуноферментный анализ по специфическому узнаванию антител анти-Fc (anti-human) с препаратом рекомбинатного Fc-MBP. В качестве калибровки и положительного контроля использовалась титровка препарата поликлональных очищенных антител человека из сыворотки крови (hAb) при концентрации от 6 до 50 нг/мл.FIG. 5. Enzyme-linked immunosorbent assay for specific recognition of anti-Fc antibodies (anti-human) with a recombinant Fc-MBP preparation. As calibration and positive control, titration of the preparation of polyclonal purified human antibodies from blood serum (hAb) was used at a concentration of from 6 to 50 ng / ml.
Таблица 1. Структура использованных олигонуклеотидов.Table 1. The structure of the used oligonucleotides.
Заявка № 2016152258/10(083704) (дата подачи 29.12.2016, заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической зимии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук(ИБХ РАН), RU)Application No. 2016152258/10 (083704) (filing date 12/29/2016, applicant Federal State Budgetary Institution of Science, Institute of Bioorganic Zymia named after Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov of the Russian Academy of Sciences (IBCh RAS), RU)
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOptiVEC-MBP84-106-Fc, КОДИРУЮЩАЯ КОНСТАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СЛИТНОГО С ФРАГМЕНТОМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК – ПРОДУЦЕНТОВ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА MBP84-106-Fc ДЛЯ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗАRecombinant plasmid DNA pOptiVEC-MBP 84-106 -Fc, encoding the constant HUMAN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT, fused to a fragment of myelin basic protein, eukaryotic cells LINE - producers of these proteins AND METHOD FOR PRODUCING PROTEIN MBP 84-106 -Fc FOR TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS
Последовательности:Sequences:
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 1
аминокислотная последовательность лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела F10monoclonal antibody F10 heavy chain leader peptide amino acid sequence
MAWVWTLLFLMAAAQSAQAMAWVWTLLFLMAAAQSAQA
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO: 2
нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид тяжелой цепи моноклонального антитела F10nucleotide sequence encoding a leader peptide of the heavy chain of a monoclonal antibody F10
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCAATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCA
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO: 3
нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент основного белка миелина 84-106 (MBP84-106)nucleotide sequence encoding a fragment of the myelin basic protein 84-106 (MBP 84-106 )
GAAAACCCGGTAGTCCACTTCTTCAAGAATATTGTGACGCCGCGTACTCCGCCGCCATCTCAGGGCAAAGAAAACCCGGTAGTCCACTTCTTCAAGAATATTGTGACGCCGCGTACTCCGCCGCCATCTCAGGGCAAA
SEQ ID NO:4 SEQ ID NO: 4
аминокислотная последовательность фрагмента основного белка миелина 84-106 (MBP84-106)amino acid sequence of the fragment of the main protein of myelin 84-106 (MBP 84-106 )
ENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGK ENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGK
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO: 5
нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-фрагмент антитела IgG1 (домены CH2-CH3) человекаThe nucleotide sequence encoding the Fc fragment of an IgG1 antibody (CH2-CH3 domains)
GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:6 SEQ ID NO: 6
аминокислотная последовательность Fc-фрагмента антитела IgG1 (доменов CH2-CH3) человекаamino acid sequence of the Fc fragment of human IgG1 antibody (CH2-CH3 domains)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152258A RU2679055C2 (en) | 2016-12-29 | 2016-12-29 | RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152258A RU2679055C2 (en) | 2016-12-29 | 2016-12-29 | RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016152258A RU2016152258A (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152258A3 RU2016152258A3 (en) | 2018-07-02 |
| RU2679055C2 true RU2679055C2 (en) | 2019-02-05 |
Family
ID=62813949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016152258A RU2679055C2 (en) | 2016-12-29 | 2016-12-29 | RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2679055C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2430161C2 (en) * | 2009-07-09 | 2011-09-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | RECOMBINANT PLASMID DNA pQe30_PS-CFP2/TurboYFP_MBP7, CODING PROTEIN PS-CFP2/TurboYFP_MBP7, STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pQe30_PS-CFP2/TurboYFP_MBP7 - SAID PROTEIN PRODUCENT AND METHOD OF OBTAINING PROTEIN PS-CFP2/TurboYFP_MBP7 |
| RU2555533C2 (en) * | 2013-05-23 | 2015-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment |
-
2016
- 2016-12-29 RU RU2016152258A patent/RU2679055C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2430161C2 (en) * | 2009-07-09 | 2011-09-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | RECOMBINANT PLASMID DNA pQe30_PS-CFP2/TurboYFP_MBP7, CODING PROTEIN PS-CFP2/TurboYFP_MBP7, STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pQe30_PS-CFP2/TurboYFP_MBP7 - SAID PROTEIN PRODUCENT AND METHOD OF OBTAINING PROTEIN PS-CFP2/TurboYFP_MBP7 |
| RU2555533C2 (en) * | 2013-05-23 | 2015-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СТЕПАНОВ А.В. и др., НАПРАВЛЕННАЯ ЭЛИМИНАЦИЯ МИЕЛИНРЕАКТИВНЫХ В-КЛЕТОК С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОТОКСИНОВ - ЛИГАНДОВ АНТИГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ, ACTA NATURAE, 2015, Т. 7, Н.2 (25), с. 79-85. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016152258A (en) | 2018-07-02 |
| RU2016152258A3 (en) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8410259B2 (en) | Recombinant expression vector elements (REVES) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells | |
| US20220213500A1 (en) | Expression Process | |
| JP5452835B2 (en) | Production of IgM by transformed cells and its quantification method | |
| JP7378106B2 (en) | Production of seleno-biologics in genomically recoded organisms | |
| US11046975B2 (en) | Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same | |
| TR201802431T4 (en) | Protein production method. | |
| RU2555533C9 (en) | Recombined plasmid dna coding chimeric antibody against human tumour necrosis factor-alpha, eukaryotic cell line producing chimeric antibody, and method of chimeric antibody obtainment | |
| CN107108691B (en) | Method for producing protein | |
| RU2679055C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA POPTIVEC-MBP84-106-Fc ENCODING CONSTANT FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN FUSED WITH FRAGMENT OF MYELIN BASIC PROTEIN, EUKARYOTIC CELL LINES - PRODUCERS OF SPECIFIED PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING MBP84-106-Fc PROTEIN FOR MULTIPLE SCLEROSIS THERAPY | |
| RU2656142C1 (en) | Recombinant plasmid dna pbipr-abiga1fi6-ht for obtaining recombinant immunoglobulin a igoth iga1 | |
| EP1678308B1 (en) | Expression vector for secreting antibody fragment using e. coli signal sequence and method for mass-producing antibody fragment | |
| EP2396410A1 (en) | Method for producing protein | |
| RU2801178C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT IGA2m1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN IN MAMMALIAN CELLS | |
| Kinna | Improved production and purification of recombinant proteins from mammalian expression systems | |
| RU2671477C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA OF pBiPr-ABIgA2m1F16-ht TO OBTAIN RECOMBINANT IMMUNOGLOBULIN A OF ISOTYPE IgA2m1 | |
| RU2664184C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pBiIPr-ABIgA1FI6-INTHT FOR OBTAINING RECOMBINANT IGA1 ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN | |
| CN104968791B (en) | Optimized expression cassettes for expressing polypeptides with high yield |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20190520 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191230 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210520 |