RU2678122C1

RU2678122C1 - Method for producing reproductive products of mussels mytilus galloprovincialis lam

Info

Publication number: RU2678122C1
Application number: RU2017136662A
Authority: RU
Inventors: Надежда Владимировна Караванцева; Наталья Валериевна Поспелова; Николай Иванович Бобко; Михаил Валентинович Нехорошев
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-01-23

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method for producing reproductive products of mussels Mytilus galloprovincialis Lam. relates to biotechnology and conchioculture. Method comprises selection of mussels, preparation for spawning and temperature stimulation of spawning and spawning with the production of eggs and sperm cells. After spawning of mussels, the obtained reproductive products are passed twice through a gas sieve. For eggs, a sieve with a mesh diameter of 112 mcm and 56 mcm is used for eggs which are centrifuged four times at a speed of 3,000 rpm. For spermatozoids, a gas sieve with a mesh diameter of 56 mcm is used for sperm cells which are centrifuged 3 times for 10 minutes at a speed of 3,500 rpm and once at a speed of 3,000 rpm.

EFFECT: method provides the production of reproductive products of mussels.

1 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и конхиокультуре и предназначено для повышения эффективности работы морских ферм, а также может быть применено для биохимических и физиологических исследований половых продуктов мидий М. galloprovincialis Lam. в период нереста с целью получения биологически активных веществ, используемых в отечественной медицине и фармацевтическом производстве.The invention relates to biotechnology and conhioculture and is intended to increase the efficiency of marine farms, and can also be used for biochemical and physiological studies of the reproductive products of mussels M. galloprovincialis Lam. during the spawning period in order to obtain biologically active substances used in domestic medicine and pharmaceutical production.

Ранее отмечалось [1], что экономическая и экологическая эффективность работы морских ферм зависит от плодовитости выращиваемых моллюсков и качества посадочного материала. Успешность размножения культивируемых мидий обеспечивается не только количеством, но и качеством половых продуктов, которое может быть оценено по морфологическим, биохимическим и физиологическим показателям сперматозоидов и яйцеклеток [2, 3]. Однако решение этой задачи осложняется трудностью сбора необходимого материала и получения чистых суспензий половых клеток, поэтому количественный сбор и качественная очистка половых клеток от примесей представляют большой практический интерес.It was previously noted [1] that the economic and environmental performance of marine farms depends on the fecundity of farmed mollusks and the quality of planting material. The reproductive success of cultivated mussels is ensured not only by the quantity, but also by the quality of the reproductive products, which can be estimated by the morphological, biochemical, and physiological parameters of sperm and eggs [2, 3]. However, the solution to this problem is complicated by the difficulty of collecting the necessary material and obtaining pure suspensions of germ cells, therefore, the quantitative collection and qualitative purification of germ cells from impurities are of great practical interest.

Известный способ отбора половых продуктов мидий [8] заключается в сборе яйцеклеток на сите с размером ячеи 56 мкм. Но используя сито или газ невозможно собрать необходимое количество половых продуктов поскольку, если размеры яйцеклеток колеблются в диапазоне 50-80 мкм, то средний размер спермиев составляет 5 мкм, т.е. применение сита для сбора половых клеток самцов нецелесообразно. Недостатком является и то, что невозможно качественно, без примесей, получить суспензию половых клеток моллюсков.A known method for selecting the reproductive products of mussels [8] is to collect eggs on a sieve with a mesh size of 56 μm. But using a sieve or gas, it is impossible to collect the required amount of reproductive products because, if the size of the eggs varies in the range of 50-80 microns, the average sperm size is 5 microns, i.e. the use of sieves for collecting germ cells of males is impractical. The disadvantage is that it is impossible to qualitatively, without impurities, to obtain a suspension of sex cells of mollusks.

Наиболее близким к заявляемому является способ отбора половых продуктов мидий [1], в котором осуществляют отбор мидий в морской среде, подготовку их к нересту, для чего очищают створки мидий и содержимое желудков. Затем проводят температурную стимуляцию нереста. От момента стимуляции начало нереста самцов происходит через 15 мин., у самок - через 20-30 мин. После нереста выполняют осаждение половых клеток и очищение полученных осадков от морской воды и биоотложений. Для этого используют многократное центрифугирование половых продуктов со скоростью 3000-3500 об./мин., при которой половые клетки хорошо концентрируются. Яйцеклетки, осевшие на дно емкости, отделяют от пробы воды и центрифугируют со скоростью 3000 об./мин. Суспензию сперматозоидов, активность которых сохраняется до 2 суток, поступают следующим образом. Вначале центрифугируют 2-3 раза по 10 мин. до получения прозрачного раствора над осадком. Затем надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в небольшом количестве фильтрованной морской воды и переносят в другие пробирки, оставляя на дне 0,1-0,2 мл пробы, содержащей посторонние примеси. При центрифугировании на дно пробирки вместе с половыми клетками оседают примеси биоотложений моллюсков. Для получения чистой пробы половых продуктов суспензию клеток 4 раза переносят в чистые пробирки, оставляя на дне 0,05-0,1 мл пробы, содержащей примеси, и вновь центрифугируют при 3000 об./мин. На заключительном этапе воду над осадком максимально удаляют. Недостатком способа является то, что большое количество половых продуктов теряется при осаждении и очистке и затруднительно получить на выходе достаточное количество половых клетки даже в условиях промышленного производства.Closest to the claimed one is a method for selecting mussel sex products [1], in which mussels are selected in the marine environment, prepared for spawning, for which mussels and gastric contents are cleaned. Then carry out temperature stimulation of spawning. From the moment of stimulation, the beginning of spawning of males occurs after 15 minutes, in females - after 20-30 minutes. After spawning, germination of the germ cells and purification of the resulting sediments from sea water and biodegradation are performed. To do this, use multiple centrifugation of the reproductive products at a speed of 3000-3500 rpm./min., In which the reproductive cells are well concentrated. The eggs that settle to the bottom of the container are separated from the water sample and centrifuged at a speed of 3000 rpm. A suspension of sperm, the activity of which persists for up to 2 days, proceed as follows. First, centrifuged 2-3 times for 10 minutes. until a clear solution is obtained over the precipitate. Then the supernatant is removed, the precipitate is dissolved in a small amount of filtered seawater and transferred to other tubes, leaving 0.1-0.2 ml of the sample containing impurities at the bottom. When centrifuged at the bottom of the tube, along with the reproductive cells, impurities of mollusk biodegradation settle. To obtain a pure sample of reproductive products, the cell suspension is transferred 4 times to clean tubes, leaving 0.05-0.1 ml of the sample containing impurities at the bottom and centrifuged again at 3000 rpm. At the final stage, water above the sediment is removed as much as possible. The disadvantage of this method is that a large number of reproductive products is lost during deposition and purification and it is difficult to obtain a sufficient amount of reproductive cells at the output, even in industrial production.

Задачей изобретения «Способ получения половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis Lam.» является увеличение количества отбираемых половых клеток, а также получение чистых суспензий сперматозоидов и яйцеклеток черноморских мидий.The objective of the invention "A method for producing sexual products of mussel Mytilus galloprovincialis Lam." Is to increase the number of sex cells taken, as well as obtaining pure suspensions of sperm and egg cells of the Black Sea mussels.

Техническим результатом изобретения является количественный отбор чистых половых продуктов мидий: яйцеклеток и сперматозоидов, что повышает эффективность биохимических и физиологических исследований для мидийных ферм. Кроме того, количественный отбор чистых половых продуктов мидий позволяет использовать их как сырье для получения биологически активных веществ, используемых в отечественной медицине и фармацевтическом производстве.The technical result of the invention is the quantitative selection of pure sex products of mussels: eggs and sperm, which increases the effectiveness of biochemical and physiological studies for mussel farms. In addition, the quantitative selection of pure sex products of mussels allows them to be used as raw materials for the production of biologically active substances used in domestic medicine and pharmaceutical production.

Технический результат изобретения достигается тем, что в способе отбора половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis выполняют сбор мидий, подготовку к нересту и температурную стимуляцию нереста, предусматривающую помещение отдельных экземпляров мидий в емкости с фильтрованной водой температурой 18-20°С с поддержанием температуры в течение нереста, а также осаждение половых продуктов и их очищение от биоотложений и морской воды. Для осаждения и очищения половые продукты четырежды центрифугируют со скоростью 3000 об./мин., каждый раз помещая в чистые пробирки. Для яйцеклеток проводят центрифугирование со скоростью 3000 об./мин., а для сперматозоидов центрифугирование проводят 3 раза по 10 мин со скоростью 3500 об./мин. и один раз со скоростью 3000 об./мин. Дополнительно водится новая операция количественного отбора половых продуктов после нереста мидий, для чего яйцеклетки пропускают дважды через газ-сито с диаметром ячей 112 мкм и 56 мкм соответственно, а сперматозоиды пропускают дважды через газ-сито с диаметром ячеи 56 мкм.The technical result of the invention is achieved by the fact that in the method of selection of reproductive products of mussels Mytilus galloprovincialis, mussels are collected, prepared for spawning and temperature stimulation of spawning, which involves the placement of individual specimens of mussels in a container with filtered water at a temperature of 18-20 ° C with maintaining the temperature during spawning as well as the deposition of reproductive products and their purification from biological deposition and sea water. For sedimentation and purification, the reproductive products are centrifuged four times at a speed of 3000 rpm./min., Each time placed in clean tubes. For eggs, centrifugation is carried out at a speed of 3000 rpm., And for spermatozoa, centrifugation is carried out 3 times for 10 minutes at a speed of 3500 rpm. and once at a speed of 3000 rpm. Additionally, a new operation is carried out for the quantitative selection of sexual products after spawning of mussels, for which the eggs are passed twice through a gas sieve with a mesh diameter of 112 μm and 56 μm, respectively, and sperm cells are passed twice through a gas sieve with a mesh diameter of 56 μm.

Общими операциями с прототипом являются подготовка мидий к нересту, температурная стимуляция и осаждение половых продуктов путем многократного центрифугирования со скоростью 3000-3500 об./мин, а также очищение от примесей и биоотложений 4-кратным центрифугированием.General operations with the prototype are the preparation of mussels for spawning, temperature stimulation and sedimentation of sexual products by repeated centrifugation at a speed of 3000-3500 rpm./min, as well as purification from impurities and biological deposition by 4-fold centrifugation.

Новым по сравнению с прототипом является дополнительная операция количественного отбора половых продуктов, которую проводят перед осаждением и очищением яйцеклеток и сперматозоидов, позволяющая сконцентрировать яйцеклетки на сите, отчистить материал от фекалий и получить максимальное количество половых клеток при массовом нересте черноморских мидий. Новым является повышение качества очистки, т.к. очищение сперматозоидов проводят в два этапа, когда пробу трижды центрифугируют со скоростью 3500 об./мин. по 10 мин, а затем со скоростью 3000 об./мин.New in comparison with the prototype is an additional operation of quantitative selection of sexual products, which is carried out before deposition and purification of eggs and spermatozoa, which allows you to concentrate the eggs on a sieve, cleanse material from feces and obtain the maximum number of germ cells during mass spawning of Black Sea mussels. New is improving the quality of cleaning, as sperm purification is carried out in two stages, when the sample is centrifuged three times at a speed of 3500 rpm. 10 minutes, and then at a speed of 3000 rpm.

Пример реализации способа.An example implementation of the method.

Подготовка к нересту. Отбор проб мидий проводили в феврале и апреле. Моллюсков с длиной створки от 5 до 7 см в возрасте 2-х лет отбирали с фермы, расположенной в б. Ласпи, с глубины 2 м. Пол и стадию зрелости гонад моллюсков определяли по 6-ти бальной шкале на мазке гонад с помощью микроскопа МБИ-6 [5]. Нерест моллюсков, проходящих 5-ю стадию репродуктивного цикла, вызывали по методике температурной стимуляции нереста [4]. Всего проанализировано 109 моллюсков.Preparation for spawning. Mussels were sampled in February and April. Mollusks with a leaf length of 5 to 7 cm at the age of 2 years were selected from a farm located in b. Laspi, from a depth of 2 m. The sex and maturity stage of mollusk gonads was determined on a 6-point scale on a gonad smear using an MBI-6 microscope [5]. Spawning of mollusks passing the 5th stage of the reproductive cycle was caused by the method of temperature stimulation of spawning [4]. A total of 109 mollusks were analyzed.

После извлечения из морской воды мидий очищали от обрастаний и тщательно промывали фильтрованной морской водой. Моллюсков выдерживали в фильтрованной морской воде в течение 12 часов (с полной сменой воды через 6 часов) для освобождения желудков от содержимого. В весенне-зимний период температура морской воды, в среднем, составляла 10-12°С, в осенний - 20°С.При этом, во время осеннего нереста, моллюсков, после освобождения желудков от содержимого, помещали на 2 часа в холодильник при температуре 5°С.After extraction from sea water, the mussels were cleaned of fouling and washed thoroughly with filtered sea water. The mollusks were kept in filtered seawater for 12 hours (with a complete change of water after 6 hours) to release the stomachs from their contents. In the spring-winter period, the temperature of sea water, on average, was 10-12 ° C, in the autumn - 20 ° C. At the same time, during the autumn spawning, the mollusks, after releasing the stomachs from their contents, were placed for 2 hours in a refrigerator at a temperature 5 ° C.

Нерест. Для стимуляции нереста мидий рассаживали по 1 экз. в пластмассовые стаканы емкостью 0,5 л с фильтрованной водой (t_воды=18-20°С), поддерживая выбранную температуру в течение эксперимента. В течение нереста выделяемые моллюсками фекалии удаляли из сосудов при помощи дозатора. У самцов начало нереста отмечалось через 15 мин. от момента стимуляции, у самок - через 20-30 мин. Общая продолжительность нереста в условиях эксперимента составляла в среднем 4-6 часов. Выметанные яйцеклетки сразу оседали на дно, образовывая желто-оранжевый осадок, подвижные сперматозоиды оставались во взвешенном состоянии, образуя суспензию бело-кремового цвета. Чтобы исключить попадание в пробы гермафродитных особей, осуществляли контроль однородности полученных проб на мазке суспензии ПП под микроскопом. По окончании эксперимента мидий извлекали из стаканов и возвращали на мидийную ферму.Spawning. To stimulate spawning, mussels were planted in 1 copy. in plastic beakers 0.5 liters with filtered water (t _water = 18-20 ° C) while maintaining the temperature selected for the experiment. During spawning, feces secreted by the mollusks were removed from the vessels using a dispenser. In males, the beginning of spawning was noted after 15 minutes. from the moment of stimulation, in females - after 20-30 minutes. The total duration of spawning under experimental conditions averaged 4-6 hours. Swollen eggs immediately sank to the bottom, forming a yellow-orange precipitate, motile spermatozoa remained in suspension, forming a suspension of white-cream color. To exclude hermaphroditic specimens from entering the samples, we monitored the uniformity of the obtained samples on a smear of the PP suspension under a microscope. At the end of the experiment, the mussels were removed from the glasses and returned to the mussel farm.

Количественный отбор яйцеклеток и сперматозоидов мидий. Для количественного отбора половых клеток, их отбирали на сито и промывали фильтрованной морской водой. Морскую воду фильтровали через ядерные мембраны с диаметром пор 1 мкм. Суспензию яйцеклеток переносили в чистый стакан, объемом 0,5 литров содержащий 200 мл фильтрованной воды. Для первой промывки использовали газ с диаметром ячеи 112 мкм, пропуская через него яйцеклетки в стакан с фильтрованной водой, при этом фекалии оставались на газе. На втором этапе яйцеклетки промывали через газ диаметром ячеи 56 мкм, яйцеклетки с небольшим количеством воды оставались на сите, далее их переносили в центрифужные пробирки (V=15 мл). Суспензию сперматозоидов дважды промывали фильтрованной морской водой объемом 200 мл, пропуская через газ диаметром ячеи 56 мкм. Фекалии оставались на сите, а спермин переходили в чистую воду. Затем половые клетки переносили в центрифужные стаканы (V=200 мл).Quantitative selection of eggs and sperm of mussels. For quantitative selection of germ cells, they were selected on a sieve and washed with filtered seawater. Sea water was filtered through nuclear membranes with a pore diameter of 1 μm. The egg suspension was transferred into a clean glass, 0.5 liter containing 200 ml of filtered water. For the first washing, a gas with a mesh diameter of 112 μm was used, passing the eggs through it into a glass with filtered water, while the feces remained on the gas. At the second stage, the eggs were washed through a gas with a mesh diameter of 56 μm, the eggs with a small amount of water remained on a sieve, then they were transferred to centrifuge tubes (V = 15 ml). The sperm suspension was washed twice with filtered seawater with a volume of 200 ml, passing through a gas with a mesh diameter of 56 μm. The feces remained on the sieve, and spermine passed into clean water. Then the germ cells were transferred to centrifuge glasses (V = 200 ml).

Осаждение половых клеток, очищение от морской воды и фекальных пеллет.Precipitation of germ cells, purification from sea water and fecal pellets.

Для получения чистого материала применяли многократное центрифугирование. Яйцеклетки центрифугировали при скорости 3000 об./мин., вследствие чего половые клетки хорошо концентрировались, оболочка клеток не разрушалась и содержимое не переходило в раствор.To obtain pure material used multiple centrifugation. The eggs were centrifuged at a speed of 3000 rpm./min., As a result of which the germ cells were well concentrated, the cell membrane was not destroyed, and the contents did not pass into solution.

Скорости центрифугирования установлены авторами экспериментально, путем многократного исследования состава проб под микроскопом.The centrifugation rates were established by the authors experimentally, by repeatedly studying the composition of samples under a microscope.

Поскольку сперматозоиды довольно подвижны и практически не оседают на дно сосуда, всю суспензию, полученную за время нереста, центрифугировали в стаканах (V=200 мл) при скорости 3500 об./мин. 3 раза по 10 минут до получения прозрачного раствора над осадком. Надосадочную жидкость удаляли, осадок суспензировали в небольшом количестве фильтрованной морской воды и переносили в пробирки (V=15 мл), оставляя на дне 0,1-0,2 мл пробы, содержащей посторонние примеси и вновь центрифугировали при 3000 об./мин.Since the spermatozoa are quite mobile and practically do not settle to the bottom of the vessel, the entire suspension obtained during spawning was centrifuged in glasses (V = 200 ml) at a speed of 3500 rpm. 3 times for 10 minutes until a clear solution is obtained over the precipitate. The supernatant was removed, the precipitate was suspended in a small amount of filtered seawater and transferred to test tubes (V = 15 ml), leaving 0.1-0.2 ml of the sample containing impurities at the bottom and centrifuged again at 3000 rpm.

При центрифугировании на дно пробирки вместе с половыми клетками оседали примеси фекалий моллюсков. Для получения чистых проб ПП суспензии клеток 4 раза переносили в чистые пробирки, оставляя на дне 0,05 -0,1 мл пробы, содержащей примеси. На заключительном этапе воду над осадком ПП максимально удаляли при помощи дозатора. В результате получали чистые однородные пробы живых клеток - сперматозоидов и яйцеклеток.During centrifugation at the bottom of the tube, admixtures of mollusk feces settled together with the reproductive cells. To obtain pure PP samples, cell suspensions were transferred 4 times to clean tubes, leaving 0.05-0.1 ml of the sample containing impurities at the bottom. At the final stage, the water above the PP sediment was maximally removed with the help of a dispenser. As a result, pure homogeneous samples of living cells — sperm and ova — were obtained.

Масса половых продуктов, полученных от одной самки, достигала 360 мг сухого веса, у самцов - 70 мг сухого веса. Заявляемое изобретение было апробировано при выполнении исследований биохимического состава сперматозоидов и яйцеклеток мидий [1, 6, 7].The mass of sexual products obtained from one female reached 360 mg of dry weight, in males - 70 mg of dry weight. The claimed invention was tested in studies of the biochemical composition of spermatozoa and mussel eggs [1, 6, 7].

Литературные источники, принятые во внимание:Literary sources taken into account:

1. Караванцева Н.В., Поспелова Н.В., Бобко Н.И., Нехорошев М.В. Методика отбора половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis Lam. Системы контроля окружающей среды. - Севастополь, 2012. - Вып. 17. - С. 184-187.1. Karavanseva N.V., Pospelova N.V., Bobko N.I., Nekhoroshev M.V. Methods of selection of reproductive products of mussel Mytilus galloprovincialis Lam. Environmental control systems. - Sevastopol, 2012. - Issue. 17. - S. 184-187.

2. Пиркова А.В. Размножение мидии Mytilus galloprovincialis Lam. и элементы биотехнологии ее культивирования: автореф. дисс. на соискание учен, степени канд. биол. наук: спец. 03.00.18 «Гидробиология» / А.В. Пиркова. - Севастополь, 1994. - 25 с.2. Pirkova A.V. Reproduction of mussel Mytilus galloprovincialis Lam. and elements of biotechnology of its cultivation: author. diss. for the degree of Cand. biol. Sciences: special. 03.00.18 "Hydrobiology" / A.V. Pirkova. - Sevastopol, 1994 .-- 25 p.

3. Cosson J., Groison A. - L., Suquet M. et al. Studying sperm motility in marine fish: an overview on the state of the art // J. Appl. Ichthyol. - 2008. - No 24. - P. 460-486.3. Cosson J., Groison A. - L., Suquet M. et al. Studying sperm motility in marine fish: an overview on the state of the art // J. Appl. Ichthyol. - 2008 .-- No. 24.- P. 460-486.

4. Newel R., Thompson R. Reduced clearance rates associated with spawning in the mussel, Mytilus edulis (L) (Bivalvia, Mytilidae) / R. Newel, R. Thompson // Mar. Biol. Lett. - 1984. - Vol. 5, №1. - P. 21-23.4. Newel R., Thompson R. Reduced clearance rates associated with spawning in the mussel, Mytilus edulis (L) (Bivalvia, Mytilidae) / R. Newel, R. Thompson // Mar. Biol. Lett. - 1984. - Vol. 5, No. 1. - P. 21-23.

5. Пиркова A.B., Столбова H.T., Ладыгина Л.В. Сезонная динамика нереста мидии Mytilus galloprovincialis Lam. в иловых поселениях разных районах Черного моря // Гидробиол. журн. - 1994. - 30, №2. - С.22 - 27.5. Pirkova A.B., Stolbova H.T., Ladygina L.V. Seasonal dynamics of spawning of mussel Mytilus galloprovincialis Lam. in silt settlements of different regions of the Black Sea // Gidrobiol. journal - 1994. - 30, No. 2. - S. 22 - 27.

6. Караванцева Н.В. Половая структура мидий Mytilus galloprovincialis (Lam.) обитающих у берегов Крыма // Экология моря. -2009. - Вып. 77. - С. 57-61.6. Karavanseva N.V. Sexual structure of mussels Mytilus galloprovincialis (Lam.) Living off the coast of Crimea // Ecology of the Sea. -2009. - Vol. 77. - S. 57-61.

7. Иванов В.К, Караванцева Н.В., Нехорошев М.В. Содержание липидов и каротиноидов в выметанных половых продуктах черноморской Mytilus galloprovincialis Lam. // Мор. экол. журн. - 2009. - Т. 4, №1. - С. 84.7. Ivanov V.K., Karavantseva N.V., Nekhoroshev M.V. The content of lipids and carotenoids in the swept out sex products of the Black Sea Mytilus galloprovincialis Lam. // Mor. eco-friendly. journal - 2009. - T. 4, No. 1. - S. 84.

8. Холодов В.И. Выращивание мидий и устриц в Черном море /В.И. Холодов, А.В. Пиркова., Л.В Ладыгина / под ред. В.Н. Еремеева // Национальная академия наук Украины, Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского. - Севастополь. - 2010. - 424 с.8. Kholodov V.I. Cultivation of mussels and oysters in the Black Sea / V.I. Kholodov, A.V. Pirkova., L.V. Ladygina / ed. V.N. Eremeeva // National Academy of Sciences of Ukraine, Institute of Biology of the South Seas named after A.O. Kovalevsky. - Sevastopol. - 2010 .-- 424 p.

Claims

A method for producing reproductive products of mussels Mytilus galloprovincialis Lam., Including selection of mussels, preparation for spawning and temperature stimulation of spawning, spawning to obtain eggs and sperm, as well as sedimentation of reproductive products and purification from biological deposits and sea water by 4-fold centrifugation at a speed of 3000 3500 rpm, whereby the reproductive products are placed in clean tubes each time, and a centrifugation speed of 3000 rpm is chosen for the eggs, characterized in that after the spawning of mussels, the resulting reproductive products are passed twice through a sieve gas, moreover a sieve with a mesh diameter of 112 μm and 56 μm is used for eggs, and a sieve gas with a mesh diameter of 56 μm is used for spermatozoa, then centrifugation is carried out 3 times in 10 minutes for sedimentation and purification of spermatozoa at a speed of 3500 rpm min and once at a speed of 3000 rpm