RU2677790C1 - RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA, WHICH ENCODES SYNTHESIS OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN, INCLUDING AMINO ACID SEQUENCES OF PROTEIN F AND I OF EXTERNAL MEMBRANE AND ATOXIC VARIANT OF A PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN, ESCHERICHIA COLI PA-OPRF-ATOX-OPRI STRAIN - PRODUCER OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING SPECIFIED PROTEIN - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA, WHICH ENCODES SYNTHESIS OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN, INCLUDING AMINO ACID SEQUENCES OF PROTEIN F AND I OF EXTERNAL MEMBRANE AND ATOXIC VARIANT OF A PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN, ESCHERICHIA COLI PA-OPRF-ATOX-OPRI STRAIN - PRODUCER OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING SPECIFIED PROTEIN Download PDFInfo
- Publication number
- RU2677790C1 RU2677790C1 RU2017133128A RU2017133128A RU2677790C1 RU 2677790 C1 RU2677790 C1 RU 2677790C1 RU 2017133128 A RU2017133128 A RU 2017133128A RU 2017133128 A RU2017133128 A RU 2017133128A RU 2677790 C1 RU2677790 C1 RU 2677790C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oprf
- atox
- opri
- protein
- recombinant
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 44
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 title description 5
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 3
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 title description 2
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 title description 2
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims abstract description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 10
- 101150003900 oprI gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 5
- 101150071603 oprF gene Proteins 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 abstract description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 abstract description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 abstract description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 abstract 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract 1
- 208000032536 Pseudomonas Infections Diseases 0.000 abstract 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 10
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101900161471 Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088791 Elongation factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241001098565 Pseudomonas aeruginosa PA103 Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- MRMBZHPJVKCOMA-YJFSRANCSA-N biapenem Chemical compound C1N2C=NC=[N+]2CC1SC([C@@H]1C)=C(C([O-])=O)N2[C@H]1[C@@H]([C@H](O)C)C2=O MRMBZHPJVKCOMA-YJFSRANCSA-N 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 1-[(1r,6r)-9-azabicyclo[4.2.1]non-4-en-5-yl]ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CCC[C@@H]2CC[C@H]1N2 SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- NXUNZCGTTJVERX-UHFFFAOYSA-N CN(C1)C2C11C2C1 Chemical compound CN(C1)C2C11C2C1 NXUNZCGTTJVERX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001043564 Homo sapiens Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 101000708283 Oryza sativa subsp. indica Protein Rf1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101100295833 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) oprI gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003948 anatoxin Substances 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000025563 intercellular transport Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 101150084157 lrp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa (далее рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI) для медицинских и ветеринарных целей, а также к рекомбинантным штаммам Escherichia coli (далее Е. coli) и плазмидам для получения рекомбинантных белков.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of a hybrid recombinant protein comprising the amino acid sequences of the outer membrane F and I proteins and the atoxic variant of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (hereinafter OprF-aTox-OprI recombinant protein) for medical and veterinary purposes, as well as to recombinant strains Escherichia coli (hereinafter E. coli) and plasmids for the production of recombinant proteins.
Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa (далее P. aeruginosa)) - условно патогенный микроорганизм рода Pseudomonas является одним из основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний человека и псевдомоноза норок (геморрагической пневмонии). Благодаря неприхотливости в отношении питательных веществ и устойчивости к факторам внешней среды и лекарственным препаратам, в частности, к широкому спектру антибиотиков, синегнойные инфекции получили широкое распространение. Установлено, что около 5-10% здоровых людей являются носителями различных штаммов P. aeruginosa (в норме колонизируют кишечник) и около 70% пациентов, находящихся в стационаре [1].Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa (hereinafter P. aeruginosa)) - a conditionally pathogenic microorganism of the genus Pseudomonas is one of the main causative agents of purulent-inflammatory diseases of humans and pseudomonosis of minks (hemorrhagic pneumonia). Due to its unpretentiousness in relation to nutrients and resistance to environmental factors and drugs, in particular, to a wide range of antibiotics, Pseudomonas aeruginosa are widespread. It has been established that about 5-10% of healthy people carry various strains of P. aeruginosa (normally colonize the intestines) and about 70% of patients in the hospital [1].
Вакцинация может быть одним из эффективных средств защиты против условно патогенных микроорганизмов и, в частности, P. aeruginosa. С этой целью в СССР разрабатывались препараты на основе инактивированных бактерий, компонентов клеток и экзопродуктов: поливалентная синегнойная корпускулярная вакцина [2-4], пиоиммуноген [5-6], псевдомонас-вакцина [7-10]. В настоящее время все эти препараты по тем или иным причинам в клинической практике не используются.Vaccination can be one of the effective means of protection against opportunistic microorganisms and, in particular, P. aeruginosa. For this purpose, preparations were developed in the USSR on the basis of inactivated bacteria, cell components and exoproducts: a polyvalent pseudomonas corpuscular vaccine [2-4], pioimmunogen [5-6], pseudomonas vaccine [7-10]. Currently, all these drugs for one reason or another are not used in clinical practice.
В НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова г. Уфы для профилактики и терапии синегнойных инфекций был разработан препарат на основе экзотоксина А P. aeruginosa - анатоксин синегнойной палочки [11-12]. Но выпуск данного препарата был приостановлен в связи с реорганизацией предприятий.At the Research Institute of Vaccines and Serums named after Mechnikov, Ufa, for the prevention and treatment of Pseudomonas aeruginosa, a drug based on P. aeruginosa exotoxin A - Pseudomonas aeruginosa toxoid was developed [11-12]. But the release of this drug was suspended in connection with the reorganization of enterprises.
Создание эффективных иммунопрепаратов против синегнойной палочки сопряжено с трудностями, заключающимися в том, что патогенез инфекций, развивающихся с участием синегнойной палочки, обусловлен воздействием целого ряда факторов патогенности, среди которых выделить наиболее значимый для разработки вакцины представляется сложной задачей. Однако известно, что при инфицировании и проникновении возбудителя в ткани макроорганизма, первичные иммунные реакции формируются в основном на поверхностные антигены бактериальной клетки (компоненты мембраны и клеточной стенки).The creation of effective immunopreparations against Pseudomonas aeruginosa is fraught with difficulties in that the pathogenesis of infections developing with the participation of Pseudomonas aeruginosa is due to the influence of a number of pathogenicity factors, among which it is difficult to single out the most significant for vaccine development. However, it is known that during infection and penetration of the pathogen into the tissues of a macroorganism, primary immune responses are formed mainly on the surface antigens of a bacterial cell (membrane and cell wall components).
Исследование поверхностных белков выявило, что наибольшей иммуногенностью обладают некоторые белки наружной мембраны (outer protein - Opr) P. aeruginosa, которые отвечают за межклеточный транспорт и сохранение структуры бактериальной мембраны. Наиболее иммунологически исследован мажорный порообразующий белок F наружной мембраны (далее OprF) с молекулярной массой 37,6 кДа, который обладает высокой иммуногенностью. Эти данные обусловили исследования по разработке вакцин на основе очищенных мембранных белков [13]. Однако содержание белков наружной мембраны незначительно относительно суммарных белков бактериальной клетки, и получение подобных препаратов проблематично.A study of surface proteins revealed that some of the proteins of the outer membrane (Opr) of P. aeruginosa, which are responsible for intercellular transport and preservation of the structure of the bacterial membrane, are most immunogenic. The most immunologically studied major pore-forming protein F of the outer membrane (hereinafter OprF) with a molecular weight of 37.6 kDa, which has a high immunogenicity. These data led studies on the development of vaccines based on purified membrane proteins [13]. However, the protein content of the outer membrane is negligible relative to the total proteins of the bacterial cell, and obtaining such drugs is problematic.
Мембранный белок I (OprI) является структурным липопротеином и в большом количестве содержится в наружной мембране. Секвенирование гена белка OprI показало, что аминокислотная последовательность этого белка почти на 30% схожа с последовательностью липопротеина Е. coli [14]. Отличие заключается в том, что, OprI имеет один ковалентно-связанный жирнокислотный остаток, тогда как липопротеин Е. coli - три [15].Membrane protein I (OprI) is a structural lipoprotein and is found in large quantities in the outer membrane. Sequencing of the OprI protein gene showed that the amino acid sequence of this protein is almost 30% similar to the E. coli lipoprotein sequence [14]. The difference is that OprI has one covalently linked fatty acid residue, while E. coli lipoprotein has three [15].
Экзотоксин А - один из главных патогенетических факторов при развитии генерализированных форм инфекций, вызываемых P. aeruginosa [16]. Данный секретируемый белок имеет молекулярную массу около 70 кДа и состоит из полипептидной цепи длиной в 613 аминокислот, формирующей следующие домены: N-концевой домен I (аминокислотные остатки 1-252), необходимый для взаимодействия с поверхностью клеток-мишеней; домен II (аминокислотные остатки 253-404), обеспечивающий эффективный перенос токсина в цитозоль клеток; С-концевой домен III (аминокислотные остатки 405-613), отвечающий за цитотоксическую функцию [17]. Механизм цитотоксического действия экзотоксина А состоит в следующем: экзотоксин А взаимодействует с рецептором α2-макроглобулина, белком родственным рецептору липопротеина низкой плотности (LRP1) или CD91, присутствующим на эпителиальных и антиген презентирующих клетках. После связывания с рецептором токсин проникает в клетку при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза, где происходит расщепление домена II в области REDLK при помощи фуриновой протеазы. Домен III, обладающий токсической активностью, катализирует инактивацию эукариотического фактора элонгации 2 (eEF-2) при помощи АДФ-рибозилирования, что приводит к ингибированию белкового синтеза и клеточной гибели [18]. Для защиты организма от поражения экзотоксином А возможно использование препаратов анатоксина, то есть очищенного нативного токсина, химически обработанного для устранения токсичности и сохранения иммуногенности. Созданные для иммунотерапии и иммунопрофилактики отечественные препараты на основе экзотоксина А представляли собой атоксичные формы белка, полученные очисткой культуральной токсинсодержащей среды P. aeruginosa, с последующей детоксикацией [19-22]. Показано, что после их применения в организме человека и животных происходило образование протективных антител. Однако трудоемкость технологических этапов получения, очистки, обезвреживания, а также нестандартность методов оценки специфической активности препаратов, обуславливают целесообразность создания вакцин на основе рекомбинантного анатоксина.Exotoxin A is one of the main pathogenetic factors in the development of generalized infections caused by P. aeruginosa [16]. This secreted protein has a molecular weight of about 70 kDa and consists of a polypeptide chain of 613 amino acids in length, forming the following domains: N-terminal domain I (amino acid residues 1-252), necessary for interaction with the surface of target cells; domain II (amino acid residues 253-404), which ensures the effective transfer of the toxin into the cytosol of cells; C-terminal domain III (amino acid residues 405-613), which is responsible for cytotoxic function [17]. The mechanism of the cytotoxic effect of exotoxin A is as follows: exotoxin A interacts with the α2-macroglobulin receptor, a protein related to low density lipoprotein receptor (LRP1) or CD91, present on epithelial and antigen presenting cells. After binding to the receptor, the toxin enters the cell via receptor-mediated endocytosis, where domain II is cleaved in the REDLK region using a furin protease. Domain III, which has toxic activity, catalyzes the inactivation of eukaryotic elongation factor 2 (eEF-2) by ADP-ribosylation, which leads to inhibition of protein synthesis and cell death [18]. To protect the body from damage by exotoxin A, it is possible to use preparations of anatoxin, that is, a purified native toxin chemically treated to eliminate toxicity and preserve immunogenicity. Domestic preparations based on exotoxin A created for immunotherapy and immunoprophylaxis were atoxic forms of the protein obtained by purification of P. aeruginosa culture toxin-containing medium, followed by detoxification [19-22]. It was shown that after their use in the human and animal body, the formation of protective antibodies occurred. However, the complexity of the technological stages of obtaining, cleaning, neutralizing, as well as the non-standard methods for assessing the specific activity of drugs, determine the feasibility of creating vaccines based on recombinant toxoid.
В настоящее время при создании вакцинных препаратов большое внимание уделяется использованию генно-инженерных методов. Суть их заключается во встраивании генов, отвечающих за синтез отдельных протективных антигенов возбудителя, в геном непатогенного микроорганизма (например, Е. coli или Saccharomyces cerevisiae). В процессе культивирования полученных продуцентов синтезируются целевые продукты, которые после универсальной очистки могут использоваться для приготовления вакцины. Такая стратегия позволяет вычленить и использовать наиболее иммуногенные компоненты бактерии. При этом в процессе производства вакцин исключается контакт с культурами патогенных микроорганизмов, что является существенным технологическим преимуществом, обеспечивающим безопасность персонала и окружающей среды.Currently, when creating vaccine preparations, much attention is paid to the use of genetic engineering methods. Their essence lies in the integration of genes responsible for the synthesis of individual protective antigens of the pathogen into the genome of a non-pathogenic microorganism (for example, E. coli or Saccharomyces cerevisiae). During the cultivation of the obtained producers, the target products are synthesized, which, after universal purification, can be used to prepare the vaccine. This strategy allows you to isolate and use the most immunogenic components of the bacterium. Moreover, in the process of vaccine production, contact with cultures of pathogenic microorganisms is excluded, which is a significant technological advantage that ensures the safety of personnel and the environment.
Ранее были получены две рекомбинантные формы белка OprF P. aeruginosa (полноразмерная и С-концевая область, включающая 192-342 аминокислотные остатки). Показано, что эти белки обладали иммуногенными свойствами, сыворотки к ним проявляли бактериостатический эффект. Рекомбинантные формы белка OprF, а также иммунные сыворотки к ним способствовали защите мышей от экспериментальной инфекции, вызываемой P. aeruginosa [23]. С целью разработки препарата, предназначенного для стимуляции антитоксического иммунитета, то есть для нейтрализации значимого фактора патогенности экзотоксина А, получены рекомбинантный экзотоксина [24] и его атоксические формы [25]. Получены два гибридных рекомбинантных белка: первый (рекомбинантный белок OprF-ETA P. aeruginosa) содержал слитые аминокислотные последовательности белка OprF и атоксической формы экзотоксина А P. aeruginosa, а второй (рекомбинантный белок F-I наружной мембраны P. aeruginosa) содержал слитые аминокислотные последовательности двух мембранных белков OprF и OprI. Показано, что эти белки обладали протективным эффектом, который оказался в полтора раза выше, чем при использовании отдельных рекомбинантных белков OprF или анатоксина [26, 27].Two recombinant forms of the OprF protein of P. aeruginosa (full-size and C-terminal region, including 192-342 amino acid residues) were previously obtained. It was shown that these proteins had immunogenic properties, and their serum showed a bacteriostatic effect. Recombinant forms of the OprF protein, as well as their immune sera, helped protect mice from experimental infection caused by P. aeruginosa [23]. In order to develop a drug designed to stimulate antitoxic immunity, that is, to neutralize a significant pathogenicity factor of exotoxin A, recombinant exotoxin [24] and its atoxic forms [25] were obtained. Two hybrid recombinant proteins were obtained: the first (P. aeruginosa recombinant OprF-ETA protein) contained the fused amino acid sequences of the OprF protein and the atoxic form of P. aeruginosa exotoxin A, and the second (the P. aeruginosa recombinant FI outer membrane protein) contained two membrane fusion amino acids OprF and OprI proteins. It was shown that these proteins had a protective effect, which turned out to be one and a half times higher than when using individual recombinant OprF or toxoid proteins [26, 27].
Несмотря на удовлетворительные защитные свойства, эти гибридные рекомбинантные белки обладали некоторыми недостатками. В очищенном препарате OprF-ETA искомый полноразмерный гибридный белок составлял только одну треть всех рекомбинантных продуктов. Вероятно, при синтезе гибридного рекомбинантного белка OprF-ETA в клетках штамма-продуцента, кроме образования целевого продукта накапливалось несколько укороченных вариантов. Этот факт может вызвать затруднения при стандартизации препарата, предназначенного для получения вакцины. Другой гибридный белок (рекомбинантный белок F-I) включал только последовательности мембранных белков. Для эффективной иммунологической защиты организма от P. aeruginosa, кроме присутствия антител, связывающихся с поверхностными антигенами микроорганизма, важно достаточное содержание антител для нейтрализации молекул токсина, продуцируемого бактериями.Despite the satisfactory protective properties, these hybrid recombinant proteins had some disadvantages. In the purified OprF-ETA preparation, the desired full-length fusion protein comprised only one third of all recombinant products. Probably, during the synthesis of the OprF-ETA hybrid recombinant protein in the cells of the producer strain, in addition to the formation of the target product, several shortened variants accumulated. This fact may cause difficulties in standardizing the preparation for the preparation of the vaccine. Another fusion protein (recombinant protein F-I) included only membrane protein sequences. For the effective immunological defense of the body against P. aeruginosa, in addition to the presence of antibodies that bind to the surface antigens of the microorganism, it is important that the antibody content is sufficient to neutralize the toxin molecules produced by the bacteria.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является получение штамма-продуцента, содержащего плазмиду, кодирующую гибридный рекомбинантный белок, лишенный указанных недостатков.Thus, it is an object of the present invention to provide a producer strain comprising a plasmid encoding a fusion recombinant protein devoid of these disadvantages.
Заявляется:Declares:
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI P. aeruginosa, размером 8217 пар оснований, расщепляющаяся в результате гидролиза специфическими нуклеазами рестрикции: Xba I-Hind III фрагмент ДНК, размером 177 пар оснований, содержащая последовательность сайта посадки рибосомы и последовательности, кодирующие стартовый кодон и шесть гистидинов; Hind III- Hind III фрагмент ДНК размером 1059 пар оснований, содержащего последовательность гена oprF P. aeruginosa; Hind III-Xho I фрагмент ДНК размером 1598 пар оснований, кодирующий первые два и часть третьего домена экзотоксина А P. aeruginosa; Xho I-Xho I фрагмент ДНК размером 210 пар оснований, содержащий последовательность гена oprI P. aeruginosa; Sph I - Hind III фрагмент ДНК размером 425 пар оснований, содержащего модифицированный промотор бактериофага Т7, лактозный оперон, последовательность сайта посадки рибосомы и последовательности, кодирующие стартовый кодон и шесть гистидинов; EcoR I - BamH I фрагмент ДНК размером 57 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы, стартовый ATG-кодон и последовательность, кодирующую шесть гистидинов, при этом в результате экспрессии данной конструкции происходит синтез рекомбинантного продукта с массой около 110 кДа.1. Recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI, encoding the synthesis of recombinant protein OprF-aTox-OprI P. aeruginosa, size 8217 base pairs, cleaved by hydrolysis of specific restriction nucleases: Xba I-Hind III DNA fragment, size 177 pairs bases containing the sequence of the ribosome landing site and sequences encoding the start codon and six histidines; Hind III - Hind III DNA fragment with a size of 1059 base pairs containing the sequence of the oprF gene of P. aeruginosa; Hind III-Xho I DNA fragment with a size of 1598 base pairs encoding the first two and part of the third domain of P. aeruginosa exotoxin A; Xho I-Xho I DNA fragment of 210 bp containing the P. aeruginosa oprI gene sequence; Sph I - Hind III DNA fragment 425 bp in size containing the modified T7 bacteriophage promoter, lactose operon, ribosome landing site sequence and sequences encoding a start codon and six histidines; EcoR I - BamH I DNA fragment with a size of 57 base pairs containing the ribosome landing site, the start ATG codon and the sequence encoding six histidines, and the expression of this construct results in the synthesis of a recombinant product with a mass of about 110 kDa.
2. Штамм бактерий Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцент рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI P. aeruginosa, полученный путем трансформации родительского штамма бактерий Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI по п. 1.2. The bacterial strain E. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI is a producer of the recombinant protein OprF-aTox-OprI P. aeruginosa obtained by transformation of the parent strain of bacteria E. coli BL21 (DE3) recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI under
3. Способ получения рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI P. aeruginosa с использованием штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI по п. 2, включающий его культивирование в питательной среде, разрушение клеток микроорганизма и выделение «телец-включений», очистку полученного продукта с использованием аффинной хроматографии на никель-активированных сорбентах и растворением с ренатурацией очищенного препарата в нативных условиях при помощи ступенчатого диализа.3. A method of obtaining a recombinant protein OprF-aTox-OprI P. aeruginosa using E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI according to
Техническим результатом заявленного изобретения является: 1) рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина А P. aeruginosa; 2) штамм Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцент гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина А P. aeruginosa; 3) способ получения указанного белка гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина А P. aeruginosa.The technical result of the claimed invention is: 1) recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI, encoding the synthesis of a hybrid recombinant protein OprF-aTox-OprI, comprising the amino acid sequences of the outer membrane proteins F and I and the atoxic variant of P. aeruginosa exotoxin A; 2) E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI - producer of the hybrid recombinant protein OprF-aTox-OprI, including the amino acid sequences of the outer membrane proteins F and I and the atoxic variant of P. aeruginosa exotoxin A; 3) a method for producing said protein of the OprF-aTox-OprI fusion protein, comprising the amino acid sequences of the outer membrane proteins F and I and the atoxic variant of P. aeruginosa exotoxin A.
В сравнении с рекомбинантным белком OprF-ETA, препарат рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI является более гомогенным. В результате капиллярного электрофореза выявлено, что выход полноразмерного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI составлял 96,4%, в отличие от рекомбинантного белка OprF-aTox, который присутствовал в количестве 34,17% в очищенном препарате (Рис. 3).Compared to the recombinant OprF-ETA protein, the preparation of the recombinant OprF-aTox-OprI protein is more homogeneous. As a result of capillary electrophoresis, it was found that the yield of the full-size recombinant protein OprF-aTox-OprI was 96.4%, in contrast to the recombinant protein OprF-aTox, which was present in an amount of 34.17% in the purified preparation (Fig. 3).
В сравнении с рекомбинантным белком F-I, препарат рекомбинантный белок содержит в своем составе аминокислотную последовательность экзотоксина А P. aeruginosa (атоксический вариант), что в результате иммунизации, может обеспечивать стимуляцию защитных эффектов против одного из основных факторов патогенности синегнойной палочки экзотоксина А.Compared with the recombinant protein F-I, the recombinant protein preparation contains the amino acid sequence of P. aeruginosa exotoxin A (atoxic variant), which, as a result of immunization, can stimulate protective effects against one of the main pathogenicity factors of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.
В сравнении со способом получения гибридных рекомбинантных белков OprF-ETA и F-I, способ получения гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI усовершенствован. Способ включает получение «телец-включений», содержащих целевой рекомбинантный продукт, которые после дальнейшего лизиса в растворе мочевине используются для хроматографической очистки. Это позволяет получать рекомбинантный препарат с более высоким уровнем очистки.Compared to the method for producing the hybrid recombinant proteins OprF-ETA and F-I, the method for producing the hybrid recombinant protein OprF-aTox-OprI is improved. The method includes obtaining "Taurus inclusions" containing the desired recombinant product, which, after further lysis in a urea solution, are used for chromatographic purification. This allows you to get a recombinant drug with a higher level of purification.
Технической задачей изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующей гибридный рекомбинантный белок, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa (OprF-aTox-OprI) и штамма-продуцента рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI с использованием Е. coli штамма BL21(DE3).An object of the invention is the production of recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI, encoding a hybrid recombinant protein comprising the amino acid sequences of the outer membrane proteins F and I and the atoxic variant of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (OprF-aTox-OprI) and recombinant protein producer recombinant OprF-aTox-OprI using E. coli strain BL21 (DE3).
Указанная задача решалась созданием рекомбинантной плазмидной ДНК рРА-OPRF-ATOX-OPRI и штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI.This problem was solved by the creation of recombinant plasmid DNA pRA-OPRF-ATOX-OPRI and E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI.
Плазмида pPA-OPRF-ATOX-OPRI имеет 8217 пар оснований и характеризуется наличием следующих фрагментов:Plasmid pPA-OPRF-ATOX-OPRI has 8217 base pairs and is characterized by the presence of the following fragments:
Hind III фрагмент ДНК размером 1059 пар оснований, содержащего последовательность гена oprF P. aeruginosa.Hind III DNA fragment 1059 base pairs in size containing the P. aeruginosa oprF gene sequence.
Hind III - Xho I - фрагмент ДНК размером 1598 пар оснований, кодирующую первые два и часть третьего домена экзотоксина А P. aeruginosa.Hind III - Xho I is a 1598 bp DNA fragment that encodes the first two and part of the third domain of P. aeruginosa exotoxin A.
Xho I - Xho I - фрагмент ДНК размером 210 пар оснований, содержащего последовательность гена oprI P. aeruginosa.Xho I — Xho I — 210 bp DNA fragment containing the P. aeruginosa oprI gene sequence.
Xba I - Hind III - фрагмент ДНК размером 177 пар оснований, содержащего последовательность сайта посадки рибосомы и последовательности, кодирующие стартовый кодон и шесть гистидинов.Xba I - Hind III - a 177 bp DNA fragment containing the sequence of the ribosome landing site and the sequences encoding the start codon and six histidines.
Sph I - Hind III - фрагмент ДНК размером 425 пар оснований, содержащего модифицированный промотор бактериофага Т7, лактозный оперон, последовательность сайта посадки рибосомы и последовательности кодирующие стартовый кодон и шесть гистидинов.Sph I - Hind III is a 425 base pair DNA fragment containing the modified promoter of the T7 bacteriophage, the lactose operon, the sequence of the ribosome landing site and the sequence encoding the start codon and six histidines.
EcoR I - BamH I фрагмент ДНК размером 57 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы, стартовый ATG-кодон и последовательность, кодирующую шесть гистидинов.EcoR I - BamH I DNA fragment 57 bp in size containing the ribosome landing site, the starting ATG codon and the sequence encoding six histidines.
Заявленный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI, закодированный в плазмиде рРА-OPRF-ATOX-OPRI имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.The claimed recombinant protein OprF-aTox-OprI encoded in the plasmid pRA-OPRF-ATOX-OPRI has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
На фиг. 1 представлена схема плазмиды pPA-OPRF-ATOX-OPRI. X - сайт рестрикции Xho I, Н - сайт рестрикции Hind III, oprF - последовательность, кодирующая OprF, I - последовательность, кодирующая первый домен экзотоксина А, II - последовательность, кодирующая второй домен экзотоксина А, ΔIII - последовательность, кодирующая третий делеционный домен экзотоксина A, oprI - последовательность, кодирующая OprI, 6His - последовательность, кодирующая шесть гистидинов, кан - ген устойчивости к канамицину.In FIG. 1 is a schematic diagram of the plasmid pPA-OPRF-ATOX-OPRI. X is the restriction site Xho I, H is the restriction site Hind III, oprF is the sequence encoding OprF, I is the sequence encoding the first domain of exotoxin A, II is the sequence encoding the second domain of exotoxin A, ΔIII is the sequence encoding the third deletion domain of exotoxin A, oprI - sequence encoding OprI, 6His - sequence encoding six histidines, kan - kanamycin resistance gene.
На фиг.2 представлен анализ белковых продуктов, полученных в результате экспрессии в клетках Е. coli последовательностей рекомбинантных генов, расположенных в плазмиде pPA-OPRF-ATOX-OPRI.Figure 2 presents the analysis of protein products obtained by expression in E. coli cells of sequences of recombinant genes located in the plasmid pPA-OPRF-ATOX-OPRI.
Фиг. 2А - ПААГ окрашенный Кумасси R-250, Фиг. 2Б - нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга с сывороткой к рекомбинантному анатоксину, Фиг. 2В - нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга с сывороткой к рекомбинантному белку OprF, Фиг. 2Г - нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга с сывороткой к рекомбинантному OprI.FIG. 2A - PAG colored Coomassie R-250, FIG. 2B - nitrocellulose membrane after immunoblotting with serum to recombinant toxoid, FIG. 2B is a nitrocellulose membrane after immunoblotting with serum to the recombinant OprF protein, FIG. 2G - nitrocellulose membrane after immunoblotting with serum to recombinant OprI.
На фиг. 2А Треки: 1 - продукты не индуцированного продуцента рекомбинантного белка; 2 - продукты индуцированного продуцента рекомбинантного белка; 3 - очищенный гибридный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI; 4 - маркер молекулярной массы (#SM0661; тяжелые фрагменты 200, 150 и 120 кДа); 5 -очищенный гибридный рекомбинантный белок OprF-aTox.In FIG. 2A Tracks: 1 - products of an uninduced producer of a recombinant protein; 2 - products of an induced producer of a recombinant protein; 3 - purified fusion recombinant protein OprF-aTox-OprI; 4 - molecular weight marker (# SM0661; heavy fragments of 200, 150 and 120 kDa); 5-purified hybrid recombinant protein OprF-aTox.
На фиг. 2Б, В, Г Треки: 1, 5, 9 - биомасса исходных нетрансформированньгх клеток штамма BL21(DE3); 2 - рекомбинантный белок аТох; 3, 7, 10 - гибридный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI; 4, 8 - гибридный рекомбинантный белок OprF-aTox; 6 - рекомбинантный белок OprFIn FIG. 2B, C, D Tracks: 1, 5, 9 - biomass of the initial non-transformed cells of strain BL21 (DE3); 2 - recombinant protein aTox; 3, 7, 10 - hybrid recombinant protein OprF-aTox-OprI; 4, 8 - hybrid recombinant protein OprF-aTox; 6 - recombinant protein OprF
На фиг. 3 представлен анализ очищенного гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI методом капиллярного электрофореза в сравнении с гибридным рекомбинантным белком OprF-aTox.In FIG. Figure 3 shows the analysis of purified OprF-aTox-OprI fusion protein recombinant by capillary electrophoresis in comparison with the OprF-aTox fusion protein recombinant.
На фиг. 3А представлен капиллярный электрофорез гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI. Процентное соотношение полипептидных фракций: Пик 1 - 0,3%; Пик 2 - 1%; Пик 3 - 2,3%; Пик 4 - 96,4% - искомый белок OprF-aTox OprI На фиг. 3Б представлен капиллярный электрофорез гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox. Процентное соотношение полипептидных фракций: Пик 1 - 4,75%; Пик 2 - 13,79%; Пик 3 - 17,78%; Пик 4 - 22,47%; Пик 5 - 7,04%; Пик 6-34,17% -полноразмерный белок OprF-aTox.In FIG. 3A shows capillary electrophoresis of the OprF-aTox-OprI fusion recombinant protein. The percentage of polypeptide fractions: Peak 1 - 0.3%; Peak 2 - 1%; Peak 3 - 2.3%;
В таблице 1 представлены данные по анализу защитных свойств гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI от живой вирулентной культуры P. aeruginosa штамма РА103 в сравнении с гибридным рекомбинантным белком OprF-aTox и комплексом из отдельных белков OprF и аТох.Table 1 presents data on the analysis of the protective properties of the OprF-aTox-OprI fusion recombinant protein from a live virulent culture of P. aeruginosa strain PA103 in comparison with the OprF-aTox fusion recombinant protein and a complex of individual OprF and aTox proteins.
Штамм Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI получен трансформацией клеток родительского штамма Е. coli BL21(DE3), с использованием традиционной генно-инженерной технологии.The strain E. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI obtained by transformation of cells of the parent strain of E. coli BL21 (DE3), using traditional genetic engineering technology.
Штамм Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI характеризуется следующими признаками: Культурально-морфологические признаки:Strain E. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI is characterized by the following characteristics: Cultural and morphological characteristics:
Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.The cells are small, straight, thickened, rod-shaped, gram-negative, non-spore.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре «Дифко» колонии круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, светло-бежевые, края ровные. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.Cells grow well on simple nutrient media. When growing on Difco agar, the colonies are round, smooth, convex, cloudy, shiny, light beige, the edges are even. When growing in liquid media (on a minimal medium with glucose or LB broth) they form an intense smooth turbidity.
Физико-биологические признаки:Physico-biological signs:
Аэроб. Температурный диапазон роста 4-42°С при оптимуме рН в пределах 6,5-7,5.Aerobe. The temperature range of growth is 4-42 ° C at optimum pH in the range of 6.5-7.5.
В качестве источника азота микроб использует минеральные соли в аммонийной и нитратной формах и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.As a source of nitrogen, the microbe uses mineral salts in ammonium and nitrate forms and organic compounds in the form of amino acids, peptone, tryptone, yeast extract, etc.
В качестве источника углерода микроб использует аминокислоты, глицерин, углеводы. Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл).The microbe uses amino acids, glycerin, carbohydrates as a carbon source. Cells are resistant to kanamycin (up to 100 μg / ml).
Штамм Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцент рекомбинантного белка OprF-aTox-Oprl.Strain E. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - producer of the recombinant protein OprF-aTox-Oprl.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма:The method, conditions and composition of the medium for storage of the strain:
LB-бульон с 10% глицерином и антибиотиками при -70°С в ампулах и в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°С.LB broth with 10% glycerol and antibiotics at -70 ° C in ampoules and in a lyophilized state in ampoules at 4 ° C.
Штамм Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI идентифицирован по «Определителю Берги» (1974) как штамм вида Е. coli.The E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI was identified by the Bergi Identifier (1974) as a strain of the species E. coli.
Особенностью заявляемого способа является разработка технологии, позволяющей получать комплексный высокоочищенный антиген P. aeruginosa сравнительно более простым способом и в более короткие сроки по сравнению с традиционными методами получения бактериальных белков. При этом в одном белковом препарате объединены поверхностные антигены, необходимые для стимуляции иммунитета против микробной клетки и анатоксин, необходимый для стимуляции иммунитета, с целью нейтрализации экзотоксина А. Объединение трех антигенов в одном белковом препарате способствует более унифицированному методу их получения.A feature of the proposed method is the development of technology that allows to obtain complex highly purified P. aeruginosa antigen in a relatively simpler way and in a shorter time compared to traditional methods for producing bacterial proteins. At the same time, the surface antigens necessary to stimulate immunity against the microbial cell and the toxoid necessary to stimulate the immune system to neutralize exotoxin A are combined in one protein preparation.The combination of three antigens in one protein preparation contributes to a more unified method for their preparation.
Способ включает следующие этапы:The method includes the following steps:
Культивирование в питательной среде штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI;Culture in a medium of E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI;
Осаждение биомассы центрифугированием;Precipitation of biomass by centrifugation;
Выделение «телец-включений»;The allocation of "Taurus-inclusions";
Разрушение «телец-включений» при растворении их в денатурирующем буфере, содержащем 8 М мочевину.The destruction of the "Taurus-inclusions" when dissolved in denaturing buffer containing 8 M urea.
Очистка с помощью аффинной хроматографии на никель-активированных сорбентах;Purification by affinity chromatography on nickel-activated sorbents;
Ренатурация очищенного рекомбинантного анатоксина с помощью ступенчатого диализа.Renaturation of purified recombinant toxoid by step dialysis.
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения рекомбинантного анатоксина являются следующие:The optimal conditions for the individual stages of the production of recombinant toxoid are as follows:
Получение препарата рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI с использованием «телец-включений»;Preparation of recombinant protein OprF-aTox-OprI using "Taurus-inclusions";
Разрушение «телец-включений» осуществляют в результате растворения биомассы в 8 М буферном растворе мочевины;The destruction of "Taurus inclusions" is carried out as a result of dissolution of biomass in 8 M urea buffer solution;
Удаление нерастворимых компонентов клетки осуществляют центрифугированием;Removal of insoluble components of the cell is carried out by centrifugation;
Хроматографическую очистку проводят в 8 М буферном растворе мочевины, с использованием аффинного связывания рекомбинантного белка, который содержит дополнительную шести гистидиновую последовательность на N-конце;Chromatographic purification is performed in an 8 M urea buffer solution using affinity binding of a recombinant protein that contains an additional six histidine sequence at the N-terminus;
Ренатурацию проводят при температуре 4°С путем ступенчатого диализа против физиологического раствора (0,9% NaCl).Renaturation is carried out at a temperature of 4 ° C by stepwise dialysis against physiological saline (0.9% NaCl).
Выход рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI в результате применения способа в оптимальном режиме составляет не менее 7,7 мг очищенного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI с 1 л культуральной среды.The output of the recombinant protein OprF-aTox-OprI as a result of applying the method in the optimal mode is at least 7.7 mg of purified recombinant protein OprF-aTox-OprI with 1 l of culture medium.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.The essence and advantages of the claimed group of inventions is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI.Example 1. Obtaining a recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI.
Основой для получения плазмиды ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI служила плазмидная конструкция, предназначенная для экспрессии слитого рекомбинантного белка OprF-aTox P. aeruginosa (pPA-OPRF-ATOX) [26]. Данная конструкция представляла собой плазмиду рЕТ28(b) со встроенным по сайту рестрикции Hind III фрагментом ДНК, содержащим последовательность гена oprF и встроенным по сайтам Hind III и Xho I геном экзотоксина А P. aeruginosa с делецией области кодирующей 106 С-концевых аминокислотных остатков.The basis for the preparation of the pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA plasmid was the plasmid construct designed for expression of the P. aeruginosa OprF-aTox (pPA-OPRF-ATOX) fusion recombinant protein [26]. This construct was a plasmid pET28 (b) with a DNA fragment inserted at the Hind III restriction site containing the oprF gene sequence and a P. aeruginosa exotoxin A gene inserted at the Hind III and Xho I sites with a deletion of the region encoding 106 C-terminal amino acid residues.
В качестве матрицы для получения гена oprI служила плазмидная конструкция, предназначенная для экспрессии рекомбинантного белка OprI [21]. При амплификации гена oprI с целью его встраивания в конструкцию с геном анатоксина использовалась следующая пара праймеров: 5'- ААССTCGAGCAGCAGCСАСТССAAAGAAАС и 5'-ТТССТСGAGТТАСТТGCGGCTGGCТТТТТСС. Первый праймер соответствовал 67-88 нуклеотидам последовательности гена oprI, а второй был комплементарен концу гена oprI. Оба праймера содержали на 5'-конце дополнительный сайт рестрикции Xho I (подчеркнут).The plasmid construct designed for expression of the recombinant OprI protein served as a matrix for the oprI gene [21]. The amplification of the oprI gene in order to integrate it into the construct with the toxoid gene used the following pair of primers: 5'- ААС СTCGAG CAGCAGCСАСССАAAGAAАС and 5'-ТТС СТСGAG ТТАСТТGCGGCTGGCТТТТСС. The first primer corresponded to 67-88 nucleotides of the oprI gene sequence, and the second was complementary to the end of the oprI gene. Both primers contained an additional Xho I restriction site (underlined) at the 5'-end.
Процесс амплификации гена oprI состоял из следующих стадий: прогревания при 95°С в течение 3 минут; 35 циклов ПЦР (94°С - 30 секунд, 65°С - 30 сек, 72°С - 20 сек и инкубации при 72°С в течении 1 мин. ПЦР проводили при следующих реакционных условиях: 50 mM KCl, 10 mM Tris - HCl, 0,1% Triton Х-100, 1,5 mM MgCl, 0,120 mM dNTP, (рН 9,0). На 50 мкл реакционной смеси использовали 3 ед. TAQ-полимеразы (Fermentas) и 0,1 мкг геномной ДНК. Реакцию проводили в амплификаторе Palm Cycler (Corbett Research, Австралия).The amplification process of the oprI gene consisted of the following stages: heating at 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of PCR (94 ° С - 30 seconds, 65 ° С - 30 sec, 72 ° С - 20 sec and incubations at 72 ° С for 1 min. PCR was carried out under the following reaction conditions: 50 mM KCl, 10 mM Tris - HCl, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl, 0.120 mM dNTP, (pH 9.0) 3 units of TAQ polymerase (Fermentas) and 0.1 μg of genomic DNA were used per 50 μl of the reaction mixture The reaction was carried out in a Palm Cycler thermocycler (Corbett Research, Australia).
Амплифицированную ДНК обработали рестриктазой Xho I. Одновременно этой же рестриктазой обработали плазмидную конструкцию, предназначенную для экспрессии слитого рекомбинантного белка OprF-aTox.The amplified DNA was digested with Xho I restriction enzyme. At the same time, the plasmid construct designed to express the OprF-aTox recombinant fusion protein was digested with the same restriction enzyme.
Оба рестрикта очищали в агарозном геле и объединили в одну конструкцию в результате реакции лигирования. В результате была получена рекомбинантная плазмида pPA-OPRF-ATOX-OPRI (фиг. 1). Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка, полученная в результате трансляции встроенных слитых генов в плазмиде pPA-OPRF-ATOX-OPRI (осуществлялась в компьютерной программе OMIGA), представлена на втором рисунке (фиг. 2).Both restrictions were purified on an agarose gel and combined into one construct as a result of the ligation reaction. As a result, the recombinant plasmid pPA-OPRF-ATOX-OPRI was obtained (Fig. 1). The amino acid sequence of the recombinant protein obtained by translation of the integrated fusion genes in the plasmid pPA-OPRF-ATOX-OPRI (carried out in the OMIGA computer program) is shown in the second figure (Fig. 2).
Пример 2. Получение штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцента рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI.Example 2. Obtaining a strain of E. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - producer of the recombinant protein OprF-aTox-OprI.
Штамм-продуцент Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI получали путем трансформации клеток родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой рРА-OPRF-ATOX-OPRI с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде, содержащей канамицин (50 мкг/мл) при температуре 37°С.The strain producing E. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI was obtained by transforming the cells of the parent strain E. coli BL21 (DE3) with the recombinant plasmid pRA-OPRF-ATOX-OPRI, followed by selection of recombinant clones in a medium containing kanamycin (50 μg / ml ) at a temperature of 37 ° C.
Первичный отбор рекомбинантных плазмид проводили с использованием рестриктного анализа и секвенирования.The primary selection of recombinant plasmids was performed using restriction analysis and sequencing.
Далее отбор продуцентов проводили по способности контролируемого синтеза рекомбинантного белка в клетках. Для этого инокулировали бактериальной колонией 3 мл среды LB, содержащей канамицин в концентрации 50 мкг в мл. Выращивали в термостатированном шейкере со скоростью орбитального вращения 170 об/мин в течение 12-16 часов и температуре 37°С. Затем в 5 мл свежей среды вносили 250 мкл выросшей культуры и инкубировали в прежних условиях в течение 1,5-2 часа до достижения культурой активной фазы роста (0,6 оптических единиц при длине волны 600 нм). Добавляли 5 мкл 1 М водного раствора химического индуктора изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (далее ИПТГ). Инкубацию продолжали в прежних условиях 3 часа, после чего осаждали полученную биомассу.Further, the selection of producers was carried out according to the ability of the controlled synthesis of recombinant protein in cells. For this, 3 ml of LB medium containing kanamycin at a concentration of 50 μg per ml was inoculated with a bacterial colony. Grown in a thermostatically controlled shaker with an orbital rotation speed of 170 rpm for 12-16 hours and a temperature of 37 ° C. Then, 250 μl of the grown culture was added to 5 ml of fresh medium and incubated under the previous conditions for 1.5–2 hours until the culture reached the active growth phase (0.6 optical units at a wavelength of 600 nm). Added 5 μl of a 1 M aqueous solution of a chemical inducer of isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (hereinafter IPTG). Incubation was continued under the previous conditions for 3 hours, after which the resulting biomass was besieged.
В качестве контроля использовали бактериальную культуру продуцента, инкубированную при тех же условиях, но без добавления ИПТГ. Белковые продукты анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле по методу Лэммли.As a control, a producer bacterial culture incubated under the same conditions, but without the addition of IPTG, was used. Protein products were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis according to the Laemmli method.
В результате экспрессии конструкции pPA-OPRF-ATOX-OPRI в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) наблюдался синтез рекомбинантного продукта с массой около 110 кДа (фиг. 3А). Расчетная масса рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI составляла 107,2 кДа. Рекомбинантный белок имел на N-конце дополнительную аминокислотную последовательность, включающую шесть гистидиновых остатков для их очистки в колонках с Ni-сефарозой.As a result of expression of the pPA-OPRF-ATOX-OPRI construct in E. coli cells of strain BL21 (DE3), a synthesis of a recombinant product with a mass of about 110 kDa was observed (Fig. 3A). The calculated mass of the recombinant OprF-aTox-OprI protein was 107.2 kDa. The recombinant protein had an additional amino acid sequence at the N-terminus including six histidine residues for their purification in Ni-Sepharose columns.
Пример 3. Получение препарата высокоочищенного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI из штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI.Example 3. Obtaining a preparation of highly purified recombinant protein OprF-aTox-OprI from E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI.
Получение рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI проводили в 4 этапа:Obtaining recombinant protein OprF-aTox-OprI was carried out in 4 stages:
1 этап. Культивирование штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI с индукцией экспрессии рекомбинантного гена.
2 этап. Выделение «телец-включений»2 stage. Isolation of Taurus Inclusions
3 этап. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI.3 stage. Chromatographic purification of the recombinant OprF-aTox-OprI protein.
4 этап.Растворение и ренатурация рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI.Stage 4: Dissolution and renaturation of the recombinant protein OprF-aTox-OprI.
Культивирование штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI с индукцией экспрессии рекомбинантного гена.Cultivation of E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI with induction of expression of the recombinant gene.
Выращивали посевной материал штамма Е. coli PA-OPRF-ATOX-OPRI в 1 л среды LB содержащей канамицин в концентрации 50 мкг в мл. Культивирование проводили течение 12 ч при температуре 37°С в термостатированном шейкере со скоростью орбитального вращения 170 об/мин.Inoculated E. coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI in 1 L of LB medium containing kanamycin at a concentration of 50 μg per ml. Cultivation was carried out for 12 hours at a temperature of 37 ° C in a thermostated shaker with an orbital rotation speed of 170 rpm.
Полученную культуру асептически вносили в лабораторный ферментер ФА-10 фирмы «Проинтех» с 10 л стерильной среды LB, содержащей канамицин в концентрации 50 мкг в мл. Выращивание в ферментере проводили при температуре 37°С, концентрации растворенного кислорода 30%, оборотов мешалки 300 об/мин.The resulting culture was aseptically introduced into the FA-10 laboratory fermenter of the Prointech company with 10 L of sterile LB medium containing kanamycin at a concentration of 50 μg per ml. Cultivation in the fermenter was carried out at a temperature of 37 ° C, a dissolved oxygen concentration of 30%, a stirrer revolutions of 300 rpm.
При достижении плотности культуры 0,6 оптических единиц при длине волны 600 нм в ферментер вносили 10 мл 1 М водного раствора ИПТГ. Инкубацию продолжали в прежних условиях 3 часа.When the culture density reached 0.6 optical units at a wavelength of 600 nm, 10 ml of a 1 M IPTG aqueous solution was introduced into the fermenter. Incubation continued under previous conditions for 3 hours.
Выделение «телец-включений»Isolation of Taurus Inclusions
Биомассу осаждали в центрифуге Beckman Avanti J-E (ротор JA-14) со скоростью вращения 4000 об/мин в течение 10 мин. Осадок собирали и растворяли в 300 мл фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 5 mM EDTA, 7 mМ β-меркаптоэтанола и обрабатывали ультразвуком (bight, 3 сек, 3 раза).Biomass was besieged in a Beckman Avanti J-E centrifuge (JA-14 rotor) at a speed of 4000 rpm for 10 minutes. The precipitate was collected and dissolved in 300 ml of phosphate buffer (pH 7.2) containing 5 mM EDTA, 7 mM β-mercaptoethanol and sonicated (bight, 3 sec, 3 times).
Полученный лизат центрифугировали на центрифуге Beckman Avanti J-E (ротор JA-14) 10000 об/мин при 4°С в течение 30 минут. Осадок собирали и растворяли в 300 мл следующего раствора: Tris-HCl (40 mM, рН 8,8), 10 mМ NaCl, 6 mМ MgCl2, 10 mМ СаСl2. К суспензии добавляли 3 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и 15 мкл ДНКазы I. Повторно обрабатывали ультразвуком и инкубировали при 37°С в течение 15 минут. Осаждали на центрифуге Beckman Avanti J-E (ротор JA-14) 10000 об/мин при 4°С в течение 30 минут.The resulting lysate was centrifuged on a Beckman Avanti JE centrifuge (JA-14 rotor) 10,000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes. The precipitate was collected and dissolved in 300 ml of the following solution: Tris-HCl (40 mM, pH 8.8), 10 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 10 mM CaCl 2 . To the suspension were added 3 μl of RNase A (10 mg / ml) and 15 μl of DNase I. Re-sonicated and incubated at 37 ° C for 15 minutes. Precipitated on a Beckman Avanti JE centrifuge (JA-14 rotor) 10,000 rpm at 4 ° C for 30 minutes.
Осадок растворяли в 200 мл фосфатного буфера, содержащего 5 mM EDTA, 20% сахарозы и 1% Triton Х-100 и инкубировали 10 минут при 4°С. Затем центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин, 4°С. Процедуру повторяли дважды.The precipitate was dissolved in 200 ml of phosphate buffer containing 5 mM EDTA, 20% sucrose and 1% Triton X-100 and incubated for 10 minutes at 4 ° C. Then it was centrifuged for 30 minutes at 10,000 rpm, 4 ° C. The procedure was repeated twice.
Хроматографическая очистка рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI.Chromatographic purification of the recombinant OprF-aTox-OprI protein.
Полученный осадок растворяли в одном литре следующего раствора: 8 М мочевина; 0,1 M NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН - 8,0. Растворение биомассы проводили в орбитальном шейкере при вращении 70 об/мин в течение 12 ч при комнатной температуре.The resulting precipitate was dissolved in one liter of the following solution: 8 M urea; 0.1 M NaH 2 PO 4 ; 0.01 M Tris-HCl; pH is 8.0. The biomass was dissolved in an orbital shaker with a rotation of 70 rpm for 12 hours at room temperature.
Затем осаждали нерастворимую фракцию в центрифуге Beckman Avanti J-E (ротор JA-14) со скоростью вращения 10000 об/мин при комнатной температуре в течение часа. Супернатант переносили в чистую стерильную колбу.An insoluble fraction was then precipitated in a Beckman Avanti J-E centrifuge (JA-14 rotor) at a speed of 10,000 rpm at room temperature for one hour. The supernatant was transferred to a clean, sterile flask.
К супернатанту добавляли 20 мл суспензии Ni-агарозы (QIAGEN), и инкубировали 1 час на комнатной температуре в орбитальном шейкере при легком покачивании (60 об/мин).To the supernatant was added 20 ml of a suspension of Ni-agarose (QIAGEN), and incubated for 1 hour at room temperature in an orbital shaker with gentle shaking (60 rpm).
Полученную суспензию пятью этапами пропускали через колонку для хроматографии (Bio-Rad) объемом 250 мл и диаметром 5 см. В результате из колонки удалялась жидкая фаза лизата, и оставался сорбент со связанным рекомбинантным белком.The suspension was passed through five stages through a chromatography column (Bio-Rad) with a volume of 250 ml and a diameter of 5 cm in five steps. As a result, the lysate liquid phase was removed from the column and the sorbent with the bound recombinant protein remained.
Далее через колонку пропускали два литра промывочного первого раствора (8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН - 6,3) и 500 мл второго отмывочного раствора (8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН - 5,9).Next, two liters of the washing first solution (8 M urea; 0.1 M NaH 2 PO 4 ; 0.01 M Tris-HCl; pH 6.3) and 500 ml of the second washing solution (8 M urea; 0, 1 M NaH 2 PO 4 ; 0.01 M Tris-HCl; pH 5.9).
Для элюции рекомбинантного белка через колонку пропускали элюционный раствор (8 М мочевина; 0,1 M NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН - 4,5), собирая фракции, содержащие рекомбинантный белок. С аликвотами от собранных фракций проводили оценочный электрофорез в полиакриламидном геле.To elute the recombinant protein, an elution solution (8 M urea; 0.1 M NaH 2 PO 4 ; 0.01 M Tris-HCl; pH 4.5) was passed through the column, collecting fractions containing the recombinant protein. Aliquots of the collected fractions were evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis.
Растворение и ренатурация рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI. Ступенчатый диализ проводили при температуре 4°С, с использованием магнитной мешалки.Dissolution and renaturation of the recombinant OprF-aTox-OprI protein. Step dialysis was carried out at a temperature of 4 ° C using a magnetic stirrer.
Диализный мешок, наполненный 100 мл хроматографически очищенного рекомбинантного белка, помещали в емкость, содержащую 1 литр следующего раствора: 6 М мочевина; физиологический раствор (0,9% NaCl). Через два часа поочередно меняли буферные растворы с содержанием 4, 2 и 1 М мочевины.A dialysis bag filled with 100 ml of chromatographically purified recombinant protein was placed in a container containing 1 liter of the following solution: 6 M urea; saline (0.9% NaCl). After two hours, the buffer solutions containing 4, 2 and 1 M urea were alternately changed.
Затем в емкость для диализа наливали физиологический раствор (0,9% NaCl). Его трижды меняли каждые два часа.Then, physiological saline (0.9% NaCl) was poured into the dialysis container. It was changed three times every two hours.
Содержание белка в препарате определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм. При расчете концентрации рекомбинантных белков использовали коэффициент экстинкции 0.96, рассчитанный в программе OMIGA.The protein content in the preparation was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. When calculating the concentration of recombinant proteins, an extinction coefficient of 0.96 calculated using the OMIGA program was used.
Препараты очищенного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI хранили в аликвотах по 10 мл в стерильных пробирках при -70°С.Preparations of purified recombinant protein OprF-aTox-OprI were stored in 10 ml aliquots in sterile tubes at -70 ° C.
Пример 4. Оценка чистоты и специфичности препарата рекомбинантного белка OprF-aTox-Oprl.Example 4. Assessment of the purity and specificity of the preparation of the recombinant protein OprF-aTox-Oprl.
Оценку чистоты препарата рекомбинантного белка проводили визуально по окрашенному раствором Кумасси R-250 полиакриламидному гелю (фиг. 3А) и методом капиллярного электрофореза на приборе QIAxcel Advanced Sistem (Qiagen Германия).The purity of the recombinant protein preparation was assessed visually using a Coomassie R-250 stained polyacrylamide gel solution (Fig. 3A) and capillary electrophoresis on a QIAxcel Advanced Sistem instrument (Qiagen Germany).
В препарате очищенного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI отсутствовали примеси белков клеток-продуцента (фиг. 3А, трек 3). В результате капиллярного электрофореза выявлено, что выход гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI составил 96,4%. При этом в препарате присутствовали примеси, которые визуально не были заметны при электрофорезе в ПААГ (фиг. 4Б).In the preparation of purified recombinant protein OprF-aTox-OprI there were no impurities of the producer cell proteins (Fig. 3A, track 3). As a result of capillary electrophoresis, the yield of the hybrid recombinant protein OprF-aTox-OprI was 96.4%. At the same time, impurities were present in the preparation that were not visually noticeable during electrophoresis in SDS page (Fig. 4B).
Полноразмерный белок OprF-aTox, который синтезировался в результате экспрессии исходной плазмиды pPA-OPRF-ATOX, присутствовал в количестве 34,17%. Помимо основной фракции в препарате было несколько фракций укороченных вариантов рекомбинантного белка. В общей сложности выявлено шесть пиков в результате капиллярного электрофореза (фиг. 3А, трек 5 и фиг. 4Б).The full-length OprF-aTox protein, which was synthesized by expression of the original plasmid pPA-OPRF-ATOX, was present in an amount of 34.17%. In addition to the main fraction, there were several fractions of shortened recombinant protein variants in the preparation. A total of six peaks were detected as a result of capillary electrophoresis (Fig. 3A,
Очищенный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI был специфичным в иммуноблоттинге при реакции с мышиной сывороткой против рекомбинантных белков OprF и OprI, а также против синегнойного анатоксина, в той же степени, что и с отдельными рекомбинантными белками, против которых были получены данные сыворотки (фиг. 3Б, В и Г).The purified recombinant protein OprF-aTox-OprI was specific for immunoblotting when it was reacted with mouse serum against recombinant OprF and OprI proteins, as well as against Pseudomonas toxoid, to the same extent as with the individual recombinant proteins against which serum data were obtained (Fig. 3B, C and D).
Пример 5. Оценка защитных свойств рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI.Example 5. Evaluation of the protective properties of the recombinant protein OprF-aTox-OprI.
Для оценки защитных свойств рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI использовали живую вирулентную культуру P. aeruginosa штамма РА103, который характеризуется высоким уровнем синтеза экзотоксина А и подобен большинству штаммов, встречающихся в клинике.To evaluate the protective properties of the OprF-aTox-OprI recombinant protein, a live virulent culture of P. aeruginosa strain PA103 was used, which is characterized by a high level of exotoxin A synthesis and is similar to most strains found in the clinic.
Исследование рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI проводили в сравнении с комплексом отдельных белков OprF и анатоксина, а также со слитым рекомбинантным белком OprF-aTox. Для этой цели сформировали три группы животных. Первая группа состояла из мышей, получавших инъекции по 50 мкг гибридного белка OprF-aTox-OprI. Второй группе животных вводили препарат слитого рекомбинантного белка OprF-aTox в дозе 50 мкг на мышь. Третью группу животных иммунизировали комплексом из отдельных рекомбинантных белков OprF (25 мкг) и анатоксина (50 мкг). Препараты белков вводили двукратно с двухнедельным интервалом. Через две недели после курса иммунизации мышам вводили различные дозы (от 6,25 до 100 млн. микробных клеток) живой вирулентной культуры P. aeruginosa. Подсчет погибших и выживших животных проводили в течение семи последующих дней (табл.1). Для группы животных, иммунизированных слитым белком OprF-aTox-OprI ЛД50 составил 53,59 млн. м.к.; мышей иммунизированных слитым белком OprF-aTox - 40,61 млн. м.к.; комплексом белков OprF и анатоксина - 46,66 млн. м.к.The study of the recombinant protein OprF-aTox-OprI was carried out in comparison with the complex of individual proteins OprF and toxoid, as well as with the fused recombinant protein OprF-aTox. For this purpose, formed three groups of animals. The first group consisted of mice injected with 50 μg of the OprF-aTox-OprI fusion protein. The second group of animals was injected with the preparation of the fused recombinant protein OprF-aTox at a dose of 50 μg per mouse. The third group of animals was immunized with a complex of individual recombinant proteins OprF (25 μg) and toxoid (50 μg). Protein preparations were administered twice at a two-week interval. Two weeks after the course of immunization, mice were given various doses (from 6.25 to 100 million microbial cells) of a live virulent culture of P. aeruginosa. Counting of dead and surviving animals was carried out over the next seven days (Table 1). For a group of animals immunized with the OprF-aTox-OprI fusion protein, LD 50 was 53.59 million mk; mice immunized with OprF-aTox fusion protein - 40.61 million mk; a complex of OprF proteins and toxoid - 46.66 million m3
Ссылки.References
1. Зверев В.В., Бойченко М.Н. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2: учеб. пособие для студентов учреждений высшего профессионального образования М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - С. 4801. Zverev V.V., Boychenko M.N. Medical microbiology, virology and immunology. In 2 volumes. Volume 2: textbook. manual for students of institutions of higher professional education M .: GEOTAR-Media, 2010. - P. 480
2. Мороз А.Ф., Констанинов Б.А., Анциферова Н.Г., Радкевич С.А., Ковырялкина О.В. Применение поливалентной синегнойной вакцины для профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений в кардиохирургии // Современная госпитальная инфекция. Тезисы докладов. Л., - 1980, - С. 92.2. Moroz A. F., Konstaninov B. A., Antsiferova N. G., Radkevich S. A., Kovyryalkina O. V. The use of multivalent pseudomonas vaccine for the prevention of postoperative purulent-septic complications in cardiac surgery // Modern hospital infection. Abstracts of reports. L., - 1980, - S. 92.
3. Мороз А.Ф. Применение поливалентной вакцины с защитным эффектом против Pseudomonas aeruginosa // I Всесоюзная конференция по ранам и раневой инфекции. М., - 1977, - С. 73-74.3. Moroz A.F. The use of a multivalent vaccine with a protective effect against Pseudomonas aeruginosa // I All-Union Conference on Wounds and Wound Infections. M., - 1977, - S. 73-74.
4. Титова Т.И., Сидорова Т.Н., Радкевич С.А. и др. Получение и изучение свойств поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины // Журн. микробиол. - 1985. - №8. - С. 80-844. Titova T.I., Sidorova T.N., Radkevich S.A. and others. Obtaining and studying the properties of the polyvalent corpuscular pseudomonas vaccine // Zh. microbiol. - 1985. - No. 8. - S. 80-84
5. Станиславский Е.С., Joo I. Вакцины против Pseudomonas aeruginosa инфекции: итоги и перспективы исследований // Бактериальные антигены, Сборник трудов - Москва, - 1982. - С.3-14.5. Stanislavsky ES, Joo I. Vaccines against Pseudomonas aeruginosa infections: results and research prospects // Bacterial antigens, Proceedings - Moscow, - 1982. - P.3-14.
6. Станиславский Е.С., Joo I., Северцева М.К. и др. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена-вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa II Журн. микробиол. - 1982. - №5. - С. 70-756. Stanislavsky E.S., Joo I., Severtseva M.K. et al. Immunological efficacy and safety in the experiment of a pioimmunogen vaccine against infection with Pseudomonas aeruginosa II Zhurn. microbiol. - 1982. - No. 5. - S. 70-75
7. Бандман О.А., Едвабная Л.С., Булк В.Ф. и др. Бесклеточная вакцина псевдомонас: иммунохимическая характеристика и иммуногенность // Журн. микробиол. - 1987. - №11. - С. 44-47.7. Bandman O.A., Edvabnaya L.S., Bulk V.F. et al. Cell-free vaccine pseudomonas: immunochemical characterization and immunogenicity // Zh. microbiol. - 1987. - No. 11. - S. 44-47.
8. Едвабная Л.С., Зайднер И.Г., Макаренко Т.А. и др. Белковые протективные антигены Pseudomonas aeruginosa // Журн. микробиол. - 1985. - №11. - С. 18-23.8. Edabnaya L.S., Zaydner I.G., Makarenko T.A. and other Protein protective antigens of Pseudomonas aeruginosa // Zh. microbiol. - 1985. - No. 11. - S. 18-23.
9. Макаренко Т.А., Балаян С.С, Сергиенко А.И. и др. Иммунологический ответ у доноров-добровольцев, иммунизированных вакциной псевдомонас // Журн. микробиол. - 1991.-№11.-С.39-41.9. Makarenko T.A., Balayan S.S., Sergienko A.I. et al. Immunological response in volunteer donors immunized with the pseudomonas vaccine // Zh. microbiol. - 1991.-No.11.-C.39-41.
10. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa // Журн. микробиол. - 1996. - №2. - С. 7-9.10. Makarenko T.A., Stanislavsky E.S. Immunological study of cell wall proteins of Pseudomonas aeruginosa // Zh. microbiol. - 1996. - No. 2. - S. 7-9.
11. Пат. 1410527 С СССР, С12Р 1/04. Способ получения экзотоксина А синегнойной палочки // Н.А. Михайлова, Т.Н. Кузнецова, Ф.А. Шаймухаметов, А.Ф. Мороз, И.А. Баснакьян. - Заявл. 10.09.86; Опубл. 09.06.95 // БИПМ. - 1995,11. Pat. 1410527 From the USSR,
12. Пат. 1481962 С СССР, А61К 35/74. Способ обезвреживания очищенного экзотоксина А синегнойной палочки // Н.А. Михайлова, Ф.А. Шаймухаметов, Т.Н. Кузнецова, А.Ф. Мороз. - Заявл. 15.07.87; Опубл. 09.06.95 // БИПМ. - 1995.12. Pat. 1481962 From the USSR, A61K 35/74. The method of disposal of purified exotoxin A Pseudomonas aeruginosa // N.A. Mikhailova, F.A. Shaimukhametov, T.N. Kuznetsova, A.F. Frost. - Declared. 07/15/87; Publ. 06/09/95 // BIPM. - 1995.
13. Lee NG, Jung SB, Ahn BY, Kim YH, Kim JJ, Kim DK, Kim IS, Yoon SM, Nam SW, Kim HS, Park WJ. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy // Vaccine - 2000 - №18 - P. 1952-1961.13. Lee NG, Jung SB, Ahn BY, Kim YH, Kim JJ, Kim DK, Kim IS, Yoon SM, Nam SW, Kim HS, Park WJ. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy // Vaccine - 2000 - No. 18 - P. 1952-1961.
14. Получение рекомбинантного I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и оценка его антигенных свойств / Гатыпова Е.В. [и др.] //: Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - М., 2008. - N 6. - С. 50-5314. Obtaining recombinant I outer membrane of Pseudomonas aeruginosa and evaluation of its antigenic properties / Gatypova EV [et al.] //: J. Microbiology, Epidemiology, and Immunology. - M., 2008. - N 6. - S. 50-53
15. Гатыпова Е.В. Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойств, диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 2009, 116 с.15. Gatypova E.V. Obtaining recombinant proteins OprL and OprI of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa and study of their immunobiological properties, dissertation for the degree of candidate of biological sciences, Moscow, 2009, 116 pp.
16. Liu P. V. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. I. Factors that influence the production of exotoxin A. J. Infect. Dis. 1986 128:506-513.16. Liu P. V. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. I. Factors that influence the production of exotoxin A. J. Infect. Dis. 1986 128: 506-513.
17. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F. and McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3 A angstrom resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 1320-1324.17. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F. and McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3 A angstrom resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 1320-1324.
18. Armstrong S., Yates S.P. and Merrill A.R. Insight into the Catalytic Mechanism of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A. The journal of biological chemistry, 2002, Vol. 277, No. 48, Issue of November 29, pp. 46669-46675.18. Armstrong S., Yates S.P. and Merrill A.R. Insight into the Catalytic Mechanism of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A. The journal of biological chemistry, 2002, Vol. 277, No. 48, Issue of November 29, pp. 46669-46675.
19. Бодрова Г.Н. Получение и изучение активности антитоксической противосинегнойной плазмы. Диссертация на соискание уч. степ. канд. мед. наук. 1997.19. Bodrova G.N. Obtaining and studying the activity of antitoxic anti-Pseudomonas plasma. The dissertation for the competition. step. Cand. honey. sciences. 1997.
20. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Шаймухаметов Ф.А., Мороз А.Ф. и Баснакьян И.А. Пат. 1410527 С СССР, С12Р 1/04. Заявл. 10.09.86; Опубл. 09.06.95.20. Mikhailova N.A., Kuznetsova T.N., Shaimukhametov F.A., Moroz A.F. and Basnakyan I.A. Pat. 1410527 From the USSR,
21. Михайлова Н.А., Шаймухаметов Ф.А., Кузнецова Т.Н., Мороз А.Ф. Пат. 1481962 С СССР А61К 35/74. Способ обезвреживания очищенного экзотоксина А синегнойной палочки. Заявл. 15.07.87; Опубл. 09.06.95.21. Mikhailova N.A., Shaimukhametov F.A., Kuznetsova T.N., Moroz A.F. Pat. 1481962 From the USSR A61K 35/74. The method of disposal of purified exotoxin A Pseudomonas aeruginosa. Claim 07/15/87; Publ. 06/09/95.
22. Подгорная Л.Г., Дзюбан Н.Ф. Антигенные свойства анатоксина синегнойнолй палочки и протективное действие антитоксической противосинегнойной сыворотки. Ж. микроб. 1986, №6 67-69.22. Podgornaya L.G., Dzyuban N.F. Antigenic properties of Pseudomonas aeruginosa toxoid and the protective effect of antitoxic anti-Pseudomonas serum. J. microbe. 1986, No. 6 67-69.
23. Kaloshin А.А., Gatypova E.V., Mikhailova N.A. Obtaining Recombinant Forms of the Outer Membrane Protein F of Pseudomonas aeruginosa and Assessment of Their Immunogenic Properties. Applied Biochemistry and Microbiology, 2011, 47(8):780-788.23. Kaloshin A.A., Gatypova E.V., Mikhailova N.A. Obtaining Recombinant Forms of the Outer Membrane Protein F of Pseudomonas aeruginosa and Assessment of Their Immunogenic Properties. Applied Biochemistry and Microbiology, 2011, 47 (8): 780-788.
24. Исаков M.A., Калошин A.A., Михайлова Н.А. Получение рекомбинантного экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa. Биотехнология. 2009, №3, с. 29-33.24. Isakov M.A., Kaloshin A.A., Mikhailova N.A. Obtaining recombinant exotoxin A Pseudomonas aeruginosa. Biotechnology. 2009, No. 3, p. 29-33.
25. Исаков М.А., Солдатенкова А.В, Калошин А.А., Михайлова Н.А. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. №.2, с. 37-42.25. Isakov M.A., Soldatenkova A.V., Kaloshin A.A., Mikhailova N.A. Study of the immunobiological properties of recombinant atoxic forms of exotoxin A Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2011. No.2, p. 37-42.
26. Калошин А.А., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Пат. 2529359 Российская Федерация, МПК 2529359 С2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рРА-OPRF-ETA, кодирующая синтез рекомбинантного белка OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA OPRF-ETA- продуцент рекомбинантного белка OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa. Заявл. 19.09.2012; Опубл. 27.03.2014, Бюл. №9 - 2 с.26. Kaloshin A.A., Soldatenkova A.V., Mikhailova N.A. Pat. 2529359 Russian Federation, IPC 2529359 C2. Recombinant plasmid DNA pRA-OPRF-ETA encoding the synthesis of recombinant protein OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli strain PA OPRF-ETA-producer of recombinant protein OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, and a method for producing recombinant Eprinomonas aeruginosa protein PPR aerudinosa aeruginosa. Claim 09/19/2012; Publ. 03/27/2014, Bull. No. 9 - 2 p.
27. Калошин А.А., Михайлова Н.А. Пат. 2537006 Российская Федерация, МПК 2537006 С2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRFI, кодирующая гибридный рекомбинантный белок F-I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA- OPRFI-продуцент гибридного рекомбинантного белка F-I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и способ получения гибридного рекомбинантного белка F-I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa. Заявл. 25.10.2011; Опубл. 27.12.2014, Бюл. №36 - 13 с.27. Kaloshin A.A., Mikhailova N.A. Pat. 2537006 Russian Federation, IPC 2537006 C2. Recombinant plasmid DNA pPA-OPRFI encoding a fusion recombinant protein F-I of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa, a strain of Escherichia coli PA-OPRFI-producer of the hybrid recombinant protein F-I of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa, and a method for producing a hybrid recombinant Pseudomonas aeruginosa protein of recombinant aerosol recombinant aerobinosa.
К заявке «Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-OPRF-ATOX-OPRI -продуцент гибридного рекомбинантного белка, и способ получения указанного белка»To the application “Recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI, encoding the synthesis of a hybrid recombinant protein comprising the amino acid sequences of the outer membrane proteins F and I and the atoxic variant of exotoxin A Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli strain PA-OPRF-ATOX-OPRI hybrid recombinant protein, and method for producing said protein "
Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI P. aeruginosa SEQ ID NO: 1Amino acid sequence of the recombinant protein OprF-aTox-OprI P. aeruginosa SEQ ID NO: 1
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017133128A RU2677790C1 (en) | 2017-09-22 | 2017-09-22 | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA, WHICH ENCODES SYNTHESIS OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN, INCLUDING AMINO ACID SEQUENCES OF PROTEIN F AND I OF EXTERNAL MEMBRANE AND ATOXIC VARIANT OF A PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN, ESCHERICHIA COLI PA-OPRF-ATOX-OPRI STRAIN - PRODUCER OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING SPECIFIED PROTEIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017133128A RU2677790C1 (en) | 2017-09-22 | 2017-09-22 | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA, WHICH ENCODES SYNTHESIS OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN, INCLUDING AMINO ACID SEQUENCES OF PROTEIN F AND I OF EXTERNAL MEMBRANE AND ATOXIC VARIANT OF A PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN, ESCHERICHIA COLI PA-OPRF-ATOX-OPRI STRAIN - PRODUCER OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING SPECIFIED PROTEIN |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2677790C1 true RU2677790C1 (en) | 2019-01-21 |
Family
ID=65084996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017133128A RU2677790C1 (en) | 2017-09-22 | 2017-09-22 | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA, WHICH ENCODES SYNTHESIS OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN, INCLUDING AMINO ACID SEQUENCES OF PROTEIN F AND I OF EXTERNAL MEMBRANE AND ATOXIC VARIANT OF A PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN, ESCHERICHIA COLI PA-OPRF-ATOX-OPRI STRAIN - PRODUCER OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING SPECIFIED PROTEIN |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2677790C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2529359C2 (en) * | 2012-09-19 | 2014-09-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | RECOMBINANT PLASMID DNA pPA-OPRF-ETA CODING SYNTHESIS OF RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, STRAIN Escherichia coli PA-OPRF-ETA PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa AND METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa |
| RU2537006C2 (en) * | 2011-10-25 | 2014-12-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRFI DNA CODING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE, STRAIN Escherichia coli PA-OPRFI PRODUCING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE AND METHOD FOR PRODUCING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE |
-
2017
- 2017-09-22 RU RU2017133128A patent/RU2677790C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2537006C2 (en) * | 2011-10-25 | 2014-12-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRFI DNA CODING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE, STRAIN Escherichia coli PA-OPRFI PRODUCING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE AND METHOD FOR PRODUCING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE |
| RU2529359C2 (en) * | 2012-09-19 | 2014-09-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | RECOMBINANT PLASMID DNA pPA-OPRF-ETA CODING SYNTHESIS OF RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, STRAIN Escherichia coli PA-OPRF-ETA PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa AND METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СОЛДАТЕНКОВА А.В. и др. Получение рекомбинантного слитого белка OprF-aTox Pseudomonasd aeruginosa, обладающего защитными свойствами, Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 2016, Т.16, N2, стр.96-100. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Williamson et al. | A genetically engineered vaccine against the alpha-toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental gas gangrene | |
| JP3370672B2 (en) | C. perfringens vaccine | |
| JP4283872B2 (en) | Microbial protein, microorganisms producing this protein, and use of the protein in vaccines and tuberculosis detection | |
| JPH08503602A (en) | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria | |
| JP5249326B2 (en) | Inactivated staphylococcal whole cell vaccine | |
| US20080274145A1 (en) | Deacylation of Lps in Gram Negative Bacteria | |
| US20100203588A1 (en) | Polypeptides for inducing a protective immune response against staphylococcus aureus | |
| KR100338894B1 (en) | Vaccine compositions | |
| US20180237480A1 (en) | Staphylococcal antigens | |
| CN101843899B (en) | Methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) recombinant multivalent subunit genetic engineering vaccine and method for preparing same | |
| Angelos et al. | Identification and characterization of complete RTX operons in Moraxella bovoculi and Moraxella ovis | |
| Carr et al. | Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems | |
| US20150050311A1 (en) | Novel method for the preparation of a strain-adapted vaccine | |
| RU2529359C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pPA-OPRF-ETA CODING SYNTHESIS OF RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, STRAIN Escherichia coli PA-OPRF-ETA PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa AND METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT PROTEIN OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa | |
| RU2677790C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRF-ATOX-OPRI DNA, WHICH ENCODES SYNTHESIS OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN, INCLUDING AMINO ACID SEQUENCES OF PROTEIN F AND I OF EXTERNAL MEMBRANE AND ATOXIC VARIANT OF A PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN, ESCHERICHIA COLI PA-OPRF-ATOX-OPRI STRAIN - PRODUCER OF HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING SPECIFIED PROTEIN | |
| RU2537006C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pPA-OPRFI DNA CODING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE, STRAIN Escherichia coli PA-OPRFI PRODUCING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE AND METHOD FOR PRODUCING HYBRID RECOMBINANT F-I PROTEIN OF Pseudomonas aeruginosa OUTER MEMBRANE | |
| TWI614026B (en) | Recombinant avibacterium paragallinarum flfa fimbrium subunit vaccine for infectious coryza of chickens, preparation method and use thereof | |
| JP2011116659A (en) | Medicine for swine atrophic rhinitis comprising recombinant dermonecrotic toxoid | |
| RU2486243C1 (en) | POLYNUCLEOTIDE ENCODING MUTANT RECOMBINANT IgA1 PROTEASE OF Neisseria meningitidis OF SEROGROUP B, RECOMBINANT PLASMID DNA COMPRISING SAID POLYNUCLEOTIDE, HOST CELL CONTAINING SAID PLASMID DNA, RECOMBINANT IgA1 PROTEASE OF Neisseria memingitidis OF SEROGROUP B, METHOD OF PRODUCING MATURE FORM OF IgA1 PROTEASE | |
| JPH09187284A (en) | Protective epitope for adenylcyclase-hemolysin(ac-hly) and their application for therapy and prevention of bordetella infection | |
| Liu et al. | Construction and characterization of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing the babA2/ureI fusion gene of Helicobacter pylori | |
| Wang et al. | Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase | |
| JPS58146596A (en) | Recombinant dna, microorganism transformed therewith and its use | |
| RU2453599C1 (en) | NUCLEIC ACID CODING FUNCTIONALLY ACTIVE RECOMBINANT IgAL PROTEASE NEISSERIA MENINGITIDIS OF SEROGROUP B, RECOMBINANT PLASMID DNA CONTAINING NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING ACTIVE IgAL PROTEASE, PRODUCER STRAIN CONTAINING PLASMID DNA PRODUCING MATURE FORM OF IgAL PROTEASE, RECOMBINANT Ig PROTEASE NEISSERIA MENINGITIDIS OF SEROGROUP B, METHOD FOR PRODUCING MATURE FORM IgAL PROTEASE SHOWING IMMUNOGENIC AND PROTECTIVE PROPERTIES | |
| RU2793753C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pPA-FlicC ENCODING SYNTHESIS OF RECOMBINANT FLAGELLIN-C PSEUDOMONAS AERUGINOSA, STRAIN ESCHERICHIA COLI PA-FlicC - PRODUCER OF THE HYBRID RECOMBINANT PROTEIN AND A METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEIN |