RU2676956C1 - Antibodies for binding of imiglucerase and use thereof in affinity chromatography - Google Patents
Antibodies for binding of imiglucerase and use thereof in affinity chromatography Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676956C1 RU2676956C1 RU2017130013A RU2017130013A RU2676956C1 RU 2676956 C1 RU2676956 C1 RU 2676956C1 RU 2017130013 A RU2017130013 A RU 2017130013A RU 2017130013 A RU2017130013 A RU 2017130013A RU 2676956 C1 RU2676956 C1 RU 2676956C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- imiglucerase
- antibody
- fragments
- antibodies
- Prior art date
Links
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 229960002127 imiglucerase Drugs 0.000 title claims abstract description 71
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 title description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 46
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 20
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 20
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- YBSQGNFRWZKFMJ-UHFFFAOYSA-N Cerebroside B Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YBSQGNFRWZKFMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 4-nitrophenyl beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 1
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010013457 Dissociation Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000034809 Product contamination Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 108010060162 alglucerase Proteins 0.000 description 1
- 229960003122 alglucerase Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049197 cerezyme Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000012414 sterilization procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к промышленной медицинской биотехнологии и может найти применение при хроматографической очистке имиглюцеразы из культуральных жидкостей клона-продуцента. Изобретение относится также к последовательностям к одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) антитела, к их моновалентным и двухвалентным (ди-антитело) формам, которые являются специфичными в отношении имиглюцеразы человека. Полноразмерные антитела, полученные с использованием данных фрагментов, также обладают способностью с высокой эффективностью связывать имиглюцеразу. Антитела или их фрагменты образуют комплексы с имиглюцеразой, способные диссоциировать в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. На основе антител/фрагментов создан иммуносорбент для выделения и очистки имиглюцеразы из культуральных жидкостей, применение которого позволяет получить препарат активной имиглюцеразы из культуральной жидкости за одну стадию, не содержащий детектируемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле загрязнений. Представленное техническое решение относится также к созданию усовершенствованного способа очистки имиглюцеразы с применением иммунохроматографии на высокоаффинном сорбенте. Изобретение относится также к последовательностям выделенных пептидов, имеющих высокую степень аффинности к имиглюцеразе.The invention relates to industrial medical biotechnology and may find application in the chromatographic purification of imiglucerase from culture fluids of a producer clone. The invention also relates to sequences for single-chain Fv fragments (scFv) of an antibody, for their monovalent and divalent (di-antibody) forms, which are specific for human imiglucerase. Full-sized antibodies obtained using these fragments also have the ability to bind imiglucerase with high efficiency. Antibodies or fragments thereof form complexes with imiglucerase capable of dissociating in the presence of 30 or more percent (v / v) of ethylene glycol or propylene glycol. Based on antibodies / fragments, an immunosorbent was created for the isolation and purification of imiglucerase from culture fluids, the use of which allows one to obtain an active imiglucerase preparation from a culture fluid in one step that does not contain any contaminants detected by polyacrylamide gel electrophoresis. The presented technical solution also relates to the creation of an improved method for the purification of imiglucerase using immunochromatography on a high affinity sorbent. The invention also relates to sequences of isolated peptides having a high degree of affinity for imiglucerase.
Рекомбинантная бета-глюкоцереброзидаза является аналогом лизосомальной бета-глюкоцереброзидазы человека (синонимы: имиглюцераза, бета-глюкоцереброзидаза, кислая бета-глюкозидаза, алглюцераза, глюкозилцерамидаза). Очищенная имиглюцераза представляет собой мономерный гликопротеин, в состав которого входят 497 аминокислотных остатков и олигосахаридный компонент. Имиглюцераза компенсирует функциональную недостаточность ферментативной активности бета-глюкоцереброзидазы. Имиглюцераза катализирует гидролиз гликолипида глюкоцереброзида до глюкозы и церамида и предупреждает накопление глюкоцереброзида в макрофагах, т.е. препятствует образованию клеток Гоше. Болезнь Гоше является самой распространенной из лизосомных болезней накопления. Развивается в результате недостаточности фермента глюкоцереброзидазы, которая приводит к накоплению глюкоцереброзида во многих тканях, включая селезенку, печень, почки, легкие, мозг и костный мозг. В настоящее время, для лечения этой болезни применяются препараты генноинженерной глюкоцереброзидазы, самым распространенным из которых является церезим (Cerezyme®; Genzyme) (Patrick В Deegan and Timothy M Cox (2012) Imiglucerase in the treatment of Gaucher disease: a history and perspective. Drug Des Devel Ther. 2012; 6: 81-106). Отмечаются высокие расходы на производство этого препарата, что обуславливает его значительную стоимость. В связи с этим имеется необходимость в разработке новых эффективных подходов для очистки глюкоцереброзидазы, позволяющих за минимальное число стадий получить высокочистый и активный препарат.Recombinant beta-glucocerebrosidase is an analogue of human lysosomal beta-glucocerebrosidase (synonyms: imiglucerase, beta-glucocerebrosidase, acidic beta-glucosidase, alglucerase, glucosylceramidase). Purified imiglucerase is a monomeric glycoprotein, which includes 497 amino acid residues and an oligosaccharide component. Immiglucerase compensates for the functional deficiency of the enzymatic activity of beta-glucocerebrosidase. Imiglucerase catalyzes the hydrolysis of glucocerebroside glycolipid to glucose and ceramide and prevents the accumulation of glucocerebroside in macrophages, i.e. prevents the formation of Gaucher cells. Gaucher disease is the most common of lysosomal storage diseases. It develops as a result of a deficiency of the glucocerebrosidase enzyme, which leads to the accumulation of glucocerebroside in many tissues, including the spleen, liver, kidneys, lungs, brain and bone marrow. Currently, genetically engineered glucocerebrosidase preparations are used to treat this disease, the most common of which is ceresim (Cerezyme®; Genzyme) (Patrick B Deegan and Timothy M Cox (2012) Imiglucerase in the treatment of Gaucher disease: a history and perspective. Des Devel Ther. 2012; 6: 81-106). High costs for the production of this drug are noted, which leads to its significant cost. In this regard, there is a need to develop new effective approaches for the purification of glucocerebrosidase, allowing for a minimum number of stages to obtain a highly pure and active drug.
Иммуноаффинная хроматография является широко распространенным подходом при очистке белков, дающим возможность получить высокочистые и концентрированные препараты даже из сложного стартового материала (Jack, G.W. & Beer, D.J. (1996) Immunoaffinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59,187-196). Лиганд может быть как моно-, так и поликлональным антителом или же фрагментом антитела. Моноклональные антитела имеют ряд существенных преимуществ, так, их моноспецифичность дает большую воспроизводимость хроматоргафического процесса, а лиганд может быть наработан заново (Scopes, R.K. (1994) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edn. Springer-Verlag New York Inc., New York).Immunoaffinity chromatography is a widespread approach to protein purification, making it possible to obtain highly pure and concentrated formulations even from complex starting materials (Jack, G.W. & Beer, D.J. (1996) Immunoaffinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59,187-196). The ligand can be either a mono- or polyclonal antibody or an antibody fragment. Monoclonal antibodies have several significant advantages, for example, their monospecificity gives greater reproducibility of the chromatographic process, and the ligand can be re-generated (Scopes, RK (1994) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edn. Springer-Verlag New York Inc., New York )
В настоящее время известен способ получения активной имиглюцеразы с помощью мышиных моноклональных антител (Aerts, J.M., Donker-Koopman, W.E., Murray, G.J., Barranger, J.A., Tager, J.M., Schram, A.W. (1986) A procedure for the rapid purification in high yield of human glucocerebrosidase using irnmunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies. Anal. Biochem. 1; 154(2):655-63). Так же, разработано значительное число коммерческих моноклональных антител к имиглюцеразе, например, антитела производства Acris Antibodies и Aviva Systems Biology, но область применения данных антител ограничивается иммуногистохимией и аналитической биохимией, применение их в промышленной медицинской биотехнологии производителем не рассматривается.Currently, a method is known for producing active imiglucerase using murine monoclonal antibodies (Aerts, JM, Donker-Koopman, WE, Murray, GJ, Barranger, JA, Tager, JM, Schram, AW (1986) A procedure for the rapid purification in high yield of human glucocerebrosidase using irnmunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies. Anal. Biochem. 1; 154 (2): 655-63). Also, a significant number of commercial monoclonal antibodies to imiglucerase have been developed, for example, antibodies produced by Acris Antibodies and Aviva Systems Biology, but the field of application of these antibodies is limited by immunohistochemistry and analytical biochemistry; their use in industrial medical biotechnology is not considered by the manufacturer.
Однако, хотя моноклональные антитела производятся для большого количества мишеней и могут потенциально рассматриваться как основной источник аффинных лигандов (Cutler, Р. (1996) Affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59, 157-168), ряд проблем, связанных с происхождением и природой этих антител, должны учитываться при обсуждении их использования в GMP производстве. Очищенные с их помощью мишени, предполагаемые для терапевтического использования, должны проходить процедуры вирусной инактивации для минимизации рисков вирусной контаминации продукта (Barrowcliffe, T.W. (1993) Viral inactivation vs. biological activity. Dev. Biol. Stand. 81, 125-135, Burton, S.J. (1996) Affinity chromatography: production and regulatory considerations. Am. Biotechnol. Lab. 14, 64-66). В дополнение, моноклональные антитела могут быть относительно чувствительны к процедурам стерилизации колонки, что приводит к укорачиванию жизни колонки и загрязнению продукта фрагментами антител. Из-за потенциальной иммуногенности этих фрагментов, представляющих чужеродный мышиный белок, необходимы значительные усилия на стадии валидации процесса для подтверждения чистоты продукта. Также сама методика получения продуцентов моноклональных антител в большинстве случаев делает невозможным целенаправленное получение лигандов с желательными условиями элюции. Таким образом, логичным представляется поиск потенциальных аффинных лигандов с помощью фагового дисплея, при котором отбор кандидатов ведется в заранее обозначенных условиях (рН, ионная сила, не денатурирующие целевой белок условия элюции).However, although monoclonal antibodies are produced for a large number of targets and can potentially be considered as the main source of affinity ligands (Cutler, P. (1996) Affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59, 157-168), a number of problems associated with origin and nature these antibodies should be considered when discussing their use in GMP production. Purified targets intended for therapeutic use should undergo viral inactivation procedures to minimize the risks of viral contamination of the product (Barrowcliffe, TW (1993) Viral inactivation vs. biological activity. Dev. Biol. Stand. 81, 125-135, Burton, SJ (1996) Affinity chromatography: production and regulatory considerations. Am. Biotechnol. Lab. 14, 64-66). In addition, monoclonal antibodies may be relatively sensitive to column sterilization procedures, resulting in shortened column life and product contamination with antibody fragments. Due to the potential immunogenicity of these fragments, representing a foreign mouse protein, considerable efforts are required at the stage of validation of the process to confirm the purity of the product. Also, the very method of obtaining producers of monoclonal antibodies in most cases makes it impossible to purposefully obtain ligands with the desired elution conditions. Thus, it seems logical to search for potential affinity ligands using a phage display, in which candidates are selected under predetermined conditions (pH, ionic strength, non-denaturing target protein elution conditions).
Полученные аффинные лиганды, представляющие собой антитела и фрагменты антител, могут эффективно воспроизводиться в больших количествах. Так, современные методики ферментирования предполагают выход одноцепочечных фрагментов антител (scFv) до 1,2 г с литра (экспрессия в Е. coli), и полноразмерных антител до 5-12 г/л (экспрессия в ооцитах китайского хомячка) (
Задачей данного изобретения являлась разработка антител или фрагментов антител, пригодных для создания высокоэффективного иммуносорбента для промышленного выделения имиглюцеразы. Разработанные молекулы являются человеческими IgG1, или же их фрагментами, что выгодно отличает их от мышиных моноклональных антител. В частности, отсутствует иммунная реакция на потенциально загрязняющие препарат фрагменты антител, а в случае использования одноцепочных фрагментов, продуцируемых в Е. coli, отсутствует теоретическая возможность вирусной контаминации. Элюция с сорбента, созданного с применением данных антител (фрагментов антител), происходит в мягких условиях, в присутствии от 30 до 60 процентов этиленгликоля. Данные условия известны как не оказывающие заметного денатурирующего влияния на имиглюцеразу (Murray G.J., Youle R.J., Gandy S.E., Zirzow G.C., Barranger J.A. (1985) Purification of beta-glucocerebrosidase by preparative-scale high-performance liquid chromatography: the use of ethylene glycol-containing buffers for chromatography of hydrophobic glycoprotein enzymes. Anal Biochem. 1985 Jun; 147(2):301-10). Антитела не теряют своей связывающей способности при как минимум 50 актах сорбции/элюции, что делает возможным многократное использование сорбента. За одну стадию применение данного сорбента позволяет получить препарат активной, высокочистой имиглюцеразы из культуральной жидкости. Существенным признаком scFv и антител по изобретению, обусловленным их первичной структурой, является их способность специфично и в то же время обратимо связывать имиглюцеразу таким образом, что комплекс диссоциирует в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. Данное свойство непосредственно определяет получение технического результата изобретения - высокоэффективную очистку имиглюцеразы из культуральной жидкости в один этап, а также позволяет использовать предложеннные scFv и антитела в широком спектре биотехнологических применений, в том числе в различных диагностических целях.The objective of the invention was the development of antibodies or antibody fragments suitable for creating a highly effective immunosorbent for the industrial isolation of imiglucerase. The developed molecules are human IgG1, or fragments thereof, which distinguishes them from murine monoclonal antibodies. In particular, there is no immune response to potentially contaminating drug fragments of antibodies, and in the case of using single-chain fragments produced in E. coli, there is no theoretical possibility of viral contamination. Elution from the sorbent created using these antibodies (antibody fragments) occurs under mild conditions in the presence of 30 to 60 percent ethylene glycol. These conditions are known to have no significant denaturing effect on imiglucerase (Murray GJ, Youle RJ, Gandy SE, Zirzow GC, Barranger JA (1985) Purification of beta-glucocerebrosidase by preparative-scale high-performance liquid chromatography: the use of ethylene glycol- containing buffers for chromatography of hydrophobic glycoprotein enzymes. Anal Biochem. 1985 Jun; 147 (2): 301-10). Antibodies do not lose their binding ability with at least 50 acts of sorption / elution, which makes it possible to reuse the sorbent. In one stage, the use of this sorbent allows you to get the drug active, high-purity imiglucerase from the culture fluid. An essential feature of scFv and antibodies of the invention, due to their primary structure, is their ability to specifically and at the same time reversibly bind imiglucerase so that the complex dissociates in the presence of 30 percent or more (v / v) of ethylene glycol or propylene glycol. This property directly determines the receipt of the technical result of the invention - highly efficient purification of imiglucerase from the culture fluid in one step, and also allows the use of the proposed scFv and antibodies in a wide range of biotechnological applications, including for various diagnostic purposes.
Антитело или фрагмент антитела для связывания имиглюцеразы по изобретению содержит вариабельный фрагмент тяжелой цепи, имеющий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, где аминокислотная последовательностью CDRH1 выбрана из группы SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, аминокислотная последовательностью CDRH2 выбрана из группы SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38; аминокислотная последовательность CDRH3 выбрана из группы SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39. Данное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный фрагмент легкой цепи каппа или лямбда, имеющий аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2, CDRL3, где аминокислотная последовательность CDRL1 выбрана из группы SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40; где аминокислотная последовательность CDRL2 выбрана из группы SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41;где аминокислотная последовательность CDRL3 выбрана из группы SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42. Антитело или его фрагмент по изобретению способны образовывать комплекс с имиглюцеразой, диссоцирующий в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля, что обеспечивает получение ряда технических результатов - возможность получения специфического комплекса с имиглюцеразой в присутствии большого количества загрязнений в неочищенном лизате, устранение возможности неспецифических взаимодействий, и, соответственно, возможность очистки имиглюцеразы из клеточного лизата за одну стадию хроматографической очистки. Представленные в настоящем изобретении фрагменты антител имеют установленную аминокислотную последовательность, на основании которой можно составить Fv, scFv, Fab, F(ab') фрагменты, диабоди, линейные антитела которые могут быть скомбинированы с другими аминокислотными последовательностями, для ориентированной посадки на сорбент, например, с полилизиновым тагом, различные комбинации фрагментов, их димеры, тримеры (диатела, триатела, тетратела, Bis-scFv, минитела, Fab2, Fab3) и так далее. Эти фрагменты антиген-связывающего участка любого антитела определяют специфичность его связывания с антигеном. Моновалентные F(ab) фрагменты имеют один антиген-связывающий сайт, тогда как двухвалентные F(ab')2 -фрагменты имеют две антигенсвязывающие области, которые связаны дисульфидными связями. Уменьшение F(ab')2 фрагментов дает 2 моновалентных Fab' фрагмента, которые имеют свободную сульфгидрильную группу, которая используется для конъюгации с другими молекулами. Fv фрагмент - это наименьший фрагмент, получаемый в результате ферментативного расщепления антител класса IgG и IgM. Fv фрагмент имеет антиген-связывающий сайт, состоящий из областей VH и ВК, но отсутствуют СН1 и CL области. Цепи VH и VL удерживаются вместе в Fv фрагменте нековалентными взаимодействиями.An antibody or antibody fragment for binding of an imiglucerase according to the invention contains a variable heavy chain fragment having the amino acid sequences CDRH1, CDRH2, CDRH3, where the amino acid sequence CDRH1 is selected from the group of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, the amino acid sequence of CDRH2 is selected from the group of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38; the amino acid sequence of CDRH3 is selected from the group of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39. This antibody or an antibody fragment contains a variable kappa or lambda light chain fragment having the amino acid sequences CDRL1, CDRL2, CDRL3, where the amino acid sequence CDRL1 is selected from the group of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40; where the amino acid sequence of CDRL2 is selected from the group of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41; where the amino acid sequence of CDRL3 is selected from the group of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42. The antibody or its fragment according to the invention is capable of forming a complex with imiglucerase dissociating in the presence of 30 or more percent (v / v) of ethylene glycol or propylene glycol, which provides a number of technical results - the possibility of obtaining a specific complex with imiglucerase in pris due to the large number of contaminants in the crude lysate, eliminating the possibility of nonspecific interactions, and, accordingly, the ability to purify imiglucerase from the cell lysate in one step of chromatographic purification. Antibody fragments presented in the present invention have an established amino acid sequence based on which Fv, scFv, Fab, F (ab ') fragments, diabody, linear antibodies can be combined that can be combined with other amino acid sequences for oriented landing on the sorbent, for example, with polylysine tag, various combinations of fragments, their dimers, trimers (diatel, triatel, tetra, Bis-scFv, minitel, Fab2, Fab3) and so on. These fragments of the antigen-binding region of any antibody determine the specificity of its binding to the antigen. Monovalent F (ab) fragments have one antigen-binding site, while divalent F (ab ') 2 fragments have two antigen-binding regions that are linked by disulfide bonds. A decrease in F (ab ') 2 fragments gives 2 monovalent Fab' fragments that have a free sulfhydryl group, which is used for conjugation with other molecules. An Fv fragment is the smallest fragment resulting from enzymatic cleavage of antibodies of the IgG and IgM class. The Fv fragment has an antigen-binding site consisting of VH and BK regions, but the CH1 and CL regions are absent. The VH and VL chains are held together in the Fv fragment by non-covalent interactions.
Методы генной инженерии позволяют получать вариабельные одноцепочечные фрагменты (scFv), которые представляют собой фрагменты типа Fv и включают домены VH и VL, соединенные гибким пептидом. Когда линкер имеет длину по меньшей мере 12 остатков, фрагменты ScFv в основном мономерные. Манипуляция ориентации V-доменов и длины линкера создает различные формы молекул Fv. Линкеры, которые в длину 3-11 остатков, дают ScFv молекулы, которые не могут фолдировать в функциональный домен Fv. Эти молекулы связываются со второй молекулой ScFv, создавая двухвалентное диатело - димер фрагмента антитела формата scFv, "diabody". Диатело может быть и биспецифическое (Бис-scFv), а может и моноспецифическое дивалентное. Если длина линкера составляет менее трех остатков, молекулы scFv объединяться в тритела или тетратела. Мультивалентные scFv обладают большей функциональной аффинностью связывания со своими антигенами-мишенями, чем их аналоги одновалентные из-за связывания с двумя антигенами-мишенями, что уменьшает скорость диссоциации фрагмента антитела. Минитела представляют собой scFv-СН3 слитые белки, которые собираются в двухвалентные димеры. Миниатюрные фрагменты scFv могут быть сгенерированы с содержанием двух различных вариабельных доменов, что позволяет этим Бис-scFv молекулам одновременно связываться с двумя различными эпитопами. Генетические методы также используются для создания биспецифических (Fab-димеров) и Fab2 триспецифических Fab тримеров (Fab3). Эти фрагменты антител способны связываться с 2 (Fab2) или 3 (Fab3) различными антигенами сразу. В дополнение, на основании данных о включении данных фрагментов в состав антитела, могут быть созданы камелидные антитела (нанотела, nanobody), которые содержат набор специфических Heavy Chain Antibodies (hcAb), исключительно состоящих из гомодимера тяжелых цепей и не имеют легких цепей. Fab часть этих антител называется VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела), является наименьшей антиген-связывающей областью, найденной в природе. Нанотела представляют собой рекомбинантные домены из VHH, способные связывать антигены. Они очень стабильны и могут быть получены в огромном количестве с помощью традиционных систем, таких как бактерии и, таким образом, представляет собой перспективный инструмент для диагностических и терапевтических целей. Нанотела также могут быть экспрессированы непосредственно in vivo.Genetic engineering methods allow the production of variable single chain fragments (scFv), which are Fv type fragments and include VH and VL domains connected by a flexible peptide. When the linker has a length of at least 12 residues, ScFv fragments are mostly monomeric. Manipulating the orientation of the V domains and the length of the linker creates various forms of Fv molecules. Linkers, which are 3-11 residues in length, give ScFv molecules that cannot fold into the functional domain of Fv. These molecules bind to the second ScFv molecule, creating a divalent diatelo - dimer of the antibody fragment of scFv format, "diabody". The diatelo may be bispecific (Bis-scFv), or it may be monospecific divalent. If the linker is less than three residues long, scFv molecules are combined into tritel or tetratel. Multivalent scFvs have greater functional affinity for binding to their target antigens than their monovalent counterparts due to binding to two target antigens, which reduces the rate of dissociation of the antibody fragment. Minibodies are scFv-CH3 fusion proteins that assemble into divalent dimers. Miniature scFv fragments can be generated containing two different variable domains, which allows these Bis-scFv molecules to simultaneously bind to two different epitopes. Genetic methods are also used to create bispecific (Fab dimers) and Fab2 trispecific Fab trimers (Fab3). These antibody fragments are capable of binding to 2 (Fab2) or 3 (Fab3) different antigens immediately. In addition, based on the data on the inclusion of these fragments in the composition of antibodies, camelid antibodies (nanobodies, nanobody) can be created that contain a set of specific Heavy Chain Antibodies (hcAb), exclusively consisting of a heavy chain homodimer and not have light chains. The Fab portion of these antibodies, called VHH (antibody heavy chain variable domain), is the smallest antigen binding region found in nature. Nanobodies are recombinant VHH domains capable of binding antigens. They are very stable and can be obtained in large quantities using traditional systems such as bacteria and, thus, is a promising tool for diagnostic and therapeutic purposes. Nanobodies can also be expressed directly in vivo.
Фрагменты имеют преимущества по сравнению с полноразмерными антителами для некоторых целей - например, они достаточно малы, чтобы проникать в ткани, в которые полноразмерные антитела не могут проникать. Это преимущество используется в терапевтических и иммуногистохимических процедурах. Фрагменты антител, как правило, не имеют гликозилирования, что позволяет их производить в прокариотических системах экспрессии. Отсутствие домена Fc является существенным преимуществом для первичных антител, используемых в иммуногистохимических и других целях, так как они значительно уменьшают неспецифическое связывание с рецептором Fc. Фрагменты антител не имеющие Fc-области, имеют редуцированное неспецифическое связывание. Нанотела могут быть использованы также для коиммунопреципитации или в сочетании с флуоресцентными белками для отслеживания в реальном времени внутриклеточных мишеней в живых клетках.Fragments have advantages over full-sized antibodies for some purposes — for example, they are small enough to penetrate tissues into which full-sized antibodies cannot penetrate. This advantage is used in therapeutic and immunohistochemical procedures. Antibody fragments, as a rule, do not have glycosylation, which allows them to be produced in prokaryotic expression systems. The absence of the Fc domain is a significant advantage for primary antibodies used for immunohistochemical and other purposes, since they significantly reduce nonspecific binding to the Fc receptor. Antibody fragments lacking an Fc region have reduced non-specific binding. Nanobodies can also be used for co-immunoprecipitation or in combination with fluorescent proteins for real-time tracking of intracellular targets in living cells.
По своей способности к распознаванию имиглюцеразы человека in vitro и in vivo полноразменое антитело, включающее в свой состав раскрытые в настоящем изобретении фрагменты, равно как и фрагменты scFv моновалентного антитела и их комбинации, аналогичны. При этом фрагменты scFv моновалентного антитела и их комбинации, не имеющие Fc-доменов, за счет меньшего размера молекулы лучше проникают в ткани in vivo и оказывают меньшее иммуногенное действие при введении человеку в диагностических целях.In their ability to recognize human imiglucerase in vitro and in vivo, a full-sized antibody comprising the fragments disclosed in the present invention, as well as scFv fragments of a monovalent antibody and their combinations, are similar. Moreover, scFv fragments of a monovalent antibody and their combinations that do not have Fc domains, due to the smaller size of the molecule, penetrate better into tissues in vivo and have less immunogenic effect when administered to humans for diagnostic purposes.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Фиг. 1. Сенсограммы накопления комплексов AT1(mAb 2D4)-Аг (А) или AT2(mAb 2L18)-Аг (В), полученные методом BLI на Octet QKe. Аг серийно разводился от 900 нМ с шагом 2 при постоянном количестве иммобилизованного AT. Панель (С) представляет схему нековалентной ориентированной иммобилизации AT на поверхность сенсора. На панели (D) представлены вычисленные константы скоростей ассоциаций (ka), диссоциаций (kd), значения KD, их погрешности (KD error), вычисленные значения максимально возможного количества образованных комплексов (Rmax) и статистический параметр коэффициента детерминации (R2).FIG. 1. Sensograms of accumulation of the AT1 (mAb 2D4) -Ag (A) or AT2 (mAb 2L18) -Ag (B) complexes, obtained by the BLI method on Octet QKe. Ar was serially diluted from 900 nM in increments of 2 with a constant amount of immobilized AT. Panel (C) is a diagram of non-covalent oriented AT immobilization on the sensor surface. Panel (D) presents the calculated association rate constants (ka), dissociations (kd), KD values, their errors (KD error), calculated values of the maximum possible number of complexes formed (Rmax), and the statistical parameter of the determination coefficient (R2).
Фиг. 2. Сенсограммы накопления комплексов AT1(mAb 2D4)-Аг (А) или AT2(mAb 2L18)-Аг (В), полученные методом BLI на Octet QKe, многократные циклы адсорбции-регенерации.FIG. 2. Sensograms of accumulation of the AT1 (mAb 2D4) -Ag (A) or AT2 (mAb 2L18) -Ag (B) complexes obtained by the BLI method on Octet QKe, multiple adsorption-regeneration cycles.
Фиг. 3. Хроматограмма препарата очищенной имиглюцеразы на 2L18 Sepharose.FIG. 3. Chromatogram of the preparation of purified imiglucerase on 2L18 Sepharose.
Фиг. 4. Препарат имиглюцеразы до и после сорбции на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose.FIG. 4. Imiglucerase preparation before and after sorption on columns with 2D4 Sepharose and 2L18 Sepharose.
Фиг. 5. Хроматограмма получения церезима из бессывороточной КЖ на аффинном сорбенте 2L18Sepharose.FIG. 5. Chromatogram of obtaining ceresim from serum-free QOL on an affinity sorbent 2L18Sepharose.
Фиг. 6. Иммуноаффинная очистка имиглюцеразы на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose из безсывороточной среды.FIG. 6. Immunoaffinity purification of imiglucerase on columns with 2D4 Sepharose and 2L18 Sepharose from serum-free medium.
Фиг. 7. Иммуноаффинная очистка имиглюцеразы на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose из среды с 4% FBS.FIG. 7. Immunoaffinity purification of imiglucerase on columns with 2D4 Sepharose and 2L18 Sepharose from medium with 4% FBS.
Все использованные штаммы бактерий, плазмиды, праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР), рекомбинантные белки, а также клеточная линия, продуцирующая антитела, коммерчески доступны.All used bacterial strains, plasmids, polymerase chain reaction primers (PCR), recombinant proteins, and also the antibody producing cell line are commercially available.
В настоящем исследовании использовалась нативная scFv библиотека сделанная на основе фагмиды pSEX81 с разнообразием примерно 109; штаммы Е. coli XL10-Gold и XL1-Blue и TG1; праймеры полимеразной цепной реакции (Евроген), клеточная линия СНО-k. Препарат имиглюцеразы был предоставлен АО ГЕНЕРИУМ.In the present study, a native scFv library based on the phagemid pSEX81 with a variety of about 10 9 was used ; E. coli strains XL10-Gold and XL1-Blue and TG1; polymerase chain reaction primers (Eurogen), CHO-k cell line. The preparation of imiglucerase was provided by JSC GENERIUM.
Все последовательности, включение которых в состав антитела обеспечивало его связывание с имиглюцеразой, были найдены методом фагового дисплея.All sequences, the inclusion of which in the composition of the antibody ensured its binding to imiglucerase, were found by phage display.
Пример 1. Фаговый дисплей.Example 1. Phage display.
Селекции проводились в Maxisorb Immunotubes (Nunc, Wiebaden, Germany) с адсорбированной на поверхности имиглюцеразой и заблокированных раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS (50 mM аммония ацетата, рН 6.0, 800 mM NaCl и 0,1% Tween 80). Для каждой селекции, приблизительно 1012 фаговых частиц заблокированных в буфере AAcTS с 2% обезжиренного молока, добавлялись в иммунотьюбы и инкубировались при постоянном вращении в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем, раствор удалялся и иммунотьюбы промывались 10 раз в AAcTS. Связавшиеся фаги элюировались 2 мл буфера AAcSE (50 mM аммония ацетата, рН 6.0, 800 mM NaCl, 50% этиленгликоля (Applichem)). Элюат использовался для инфицирования 40 ml Escherichia coli XL 1-blue находившихся в экспоненциальной фазе роста в среде 2YT (12.5 μg/ml tetracycline) при 37°С. Для продукции фаговых частиц, эти клетки после рассева на чашки дополнительно заражались хелперным фагом M13KO7 (Thermo Fisher Scientific) и инкубировались 10-12 часов при 30°С.Selection was carried out in Maxisorb Immunotubes (Nunc, Wiebaden, Germany) with imiglucerase adsorbed on the surface and blocked with a solution of 2% skim milk in AAcTS buffer (50 mM ammonium acetate, pH 6.0, 800 mM NaCl and 0.1% Tween 80). For each selection, approximately 10 12 phage particles blocked in AAcTS buffer with 2% skim milk were added to immunotubes and incubated with constant rotation for 2 hours at room temperature. Then, the solution was removed and the immunotubes were washed 10 times in AAcTS. Bound phages were eluted with 2 ml of AAcSE buffer (50 mM ammonium acetate, pH 6.0, 800 mM NaCl, 50% ethylene glycol (Applichem)). The eluate was used to infect 40 ml of Escherichia coli XL 1-blue exponentially growing in 2YT medium (12.5 μg / ml tetracycline) at 37 ° C. For the production of phage particles, these cells after sieving on plates were additionally infected with the helper phage M13KO7 (Thermo Fisher Scientific) and incubated for 10-12 hours at 30 ° C.
Обогащение библиотек определялось по увеличению числа клонов, выросших на чашках после заражения элюированными фаговыми частицами и по увеличению сигнала в ИФА, где сорбировавшиеся на иммобилизованной имиглюцеразе фаговые частицы прокрашивались анти-М13 антителами мечеными пероксидазой хрена (HRP) (Sigma).Library enrichment was determined by the increase in the number of clones grown on plates after infection with eluted phage particles and by the increase in signal in ELISA, where phage particles adsorbed on immobilized imiglucerase were stained with anti-M13 antibodies labeled with horseradish peroxidase (HRP) (Sigma).
Пример 2. Скрининг клонов.Example 2. Screening of clones.
Препарат фагмид из обогащенной библиотеки выделялся с помощью центрифужных микроколонок по стандартной методике (Qiagen). Последовательности, кодирующие scFv, вырезались из фагмид по сайтам NcoI/NotI и лигировались в экспрессионный вектор pHOG по тем же сайтам. Лигазной смесью трансформировались клетки Escherichia coli TGI, после чего отдельные клоны наращивались для экспрессии scFv в 96 и 384-луночных плашках. Имиглюцераза (3 (μg/ml) сорбировалась на поверхность MAXISORP ИФА планшетов (Nunc). Планшеты блокировались раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS. Культуральные жидкости, содержащие scFv, смешивались 1:1 с раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS и вносились в лунки планшетов в 2 повторах. После инкубации с культуральной жидкостью планшет 1 промывался 30 мин с буфером AAcSE, планшет 2-с AAcTS для выявления специфических байндеры, элюирующихся в 50% этиленгликоле. Детекция осуществлялась с использованием 9Е10 anti-c myc mAb и HRP-коньюгированными anti-mouse антителами козы (Abcam).The phagemid preparation from the enriched library was isolated using centrifuge microcolumns according to the standard procedure (Qiagen). Sequences encoding scFv were excised from phagemids at NcoI / NotI sites and ligated into the pHOG expression vector at the same sites. Escherichia coli TGI cells were transformed with a ligase mixture, after which individual clones were expanded to express scFv in 96 and 384-well plates. Imiglucerase (3 (μg / ml) was adsorbed onto the surface of MAXISORP ELISA plates (Nunc). The plates were blocked with a solution of 2% skim milk in AAcTS buffer. Culture fluids containing scFv were mixed 1: 1 with a solution of 2% skim milk in AAcTS buffer and introduced after repeated incubation with the culture fluid,
Для дальнейшей оценки разнообразия определялись нуклеотидные последовательности позитивных клонов.For further diversity assessment, nucleotide sequences of positive clones were determined.
Пример 3. Получение одноцепочечных фрагментов, связывающих имиглюцеразу.Example 3. Obtaining single-chain fragments that bind imiglucerase.
В результате секвенирования клонов были определены нуклеотидные последовательности 7-ми одноцепочных фрагментов антител scFv (2D4, 2С11, 2L18, 2Е8, 2F9, 2D11, 3B12).As a result of clone sequencing, the nucleotide sequences of 7 single-chain scFv antibody fragments were determined (2D4, 2C11, 2L18, 2E8, 2F9, 2D11, 3B12).
Клон 2D4 встречался наиболее часто (около 50% всех клонов). Клоны 2F9 и 2D11 имели идентичную аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (но отличающуюся нуклеотидную) и разные легкие цепи. 2L18 и 3В12 имели идентичный CDRH3. Остальные клоны были уникальны и не имели гомологии по CDR (Табл. 1).Clone 2D4 was most common (about 50% of all clones). Clones 2F9 and 2D11 had the identical amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain (but different nucleotide) and different light chains. 2L18 and 3B12 had identical CDRH3. The remaining clones were unique and did not have CDR homology (Table 1).
Специалистам известны различные способы экспрессии антител и фрагментов антител как в прокариотических клетках, таких как E.coli, (Pluckthun A. Bio/Technology 9:545-551, 1991; Gavilondo J, Larrick J.W. Biotechniques 29:128-132, 134-136, 2000), так и в культурах клеток высших эукариот (Reff М.Е. Curr Opinion Biotech. 4:573-576, 1993; Trill J.J. et al., Curr. Opinion Biotech 6:553-560, 1995). В данном случае, для получения аффинных лигандов была выбрана экспрессия в культуре эукариотических клеток. Для этого последовательности scFv были переформатированы в легкие и тяжелые цепи полноразмерных человеческих IgG1, которые были затем клонированы в экспрессионный вектор, экспрессия с которого осуществлялась под контролем CMV промотора. Полученными векторами были трансфецированы клетки СНО (клеточная линия СНО-k; продуктивность стабильных клонов составила около 0,7 грамма с литра культуры. Антитела из культуральной жидкости были выделены с помощью аффинной хроматографии на сорбенте MabSelect SuRe; способ получения антител и фрагментов детально описан в инструкциях к колонкам (https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1353507340364/litdoc28940348_20161014190936.pdf). Так же, антитела могут быть выделены любым известным в настоящее время способом. То же самое относится к способу получения сорбента для связывания имиглюцеразы, несущего антитела определенной структуры. Он может быть сделан по классической методике, известной с 1979 года (J.Biochem. 1979 Apr;85(4):1091-8. Activation of Sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent. Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N.), но так же возможно использование любых альтернативных методик ковалентной пришивки белков к сорбенту. Приведенные ниже примеры подтверждают высокую эффективность связывания с имиглюцеразой антител, полученных согласно изобретению.Various methods for expressing antibodies and antibody fragments are known to those skilled in the art as in prokaryotic cells, such as E. coli, (Pluckthun A. Bio / Technology 9: 545-551, 1991; Gavilondo J, Larrick JW Biotechniques 29: 128-132, 134-136 , 2000), as well as in higher eukaryotic cell cultures (Reff, M.E. Curr Opinion Biotech. 4: 573-576, 1993; Trill JJ et al., Curr. Opinion Biotech 6: 553-560, 1995). In this case, to obtain affinity ligands, expression was selected in a culture of eukaryotic cells. For this, scFv sequences were reformatted into light and heavy chains of full-length human IgG1, which were then cloned into an expression vector, expression of which was carried out under the control of the CMV promoter. CHO cells were transfected with the obtained vectors (CHO-k cell line; stable clone productivity was about 0.7 grams per liter of culture. Antibodies from the culture fluid were isolated by affinity chromatography on MabSelect SuRe sorbent; the method for producing antibodies and fragments is described in detail in the instructions to the columns (https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1353507340364/litdoc28940348_20161014190936.pdf). Also, antibodies can be isolated by any method currently known. The same applies to the method receiving sorbent for with binding of an imiglucerase carrying an antibody of a certain structure, which can be done according to the classical technique known since 1979 (J. Biochem. 1979 Apr; 85 (4): 1091-8. Activation of Sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N.), but it is also possible to use any alternative methods for covalently attaching proteins to the sorbent. The following examples confirm the high binding efficiency of the antibodies obtained according to the invention with imiglucerase.
Обладая знаниями о последовательностях CDR, обеспечивающих высокую аффинность к имиглюцеразе антител, несущих их в своем составе, и общего знания современного уровня техники квалифицированный специалист может сконструировать антитело любого известного к настоящему времени формата, включающее любую из раскрытых аминокислотных последовательностей, любым удобным способом наработать его в прокариотах или эукариотах, почистить, пришить на сорбент и провести хроматографическую очистку имиглюцеразы в указанных условиях. Так как моновалентные и двухвалентные фрагменты scFv и их эквивалентные варианты согласно изобретению могут быть получены посредством экспрессии кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует любую из полипептидных молекул, описанных выше, является частью настоящего изобретения, также как и способ экспрессии такой нуклеиновой кислоты. Для рекомбинантной экспрессии моновалентного и двухвалентного scFv и его эквивалентных вариантов могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие адекватные регуляторные последовательности, включая промотор, терминатор, энхансер, последовательность полиаденилирования, маркерные гены и другие подходящие последовательности. Такими векторами могут быть плазмиды. Многие известные протоколы и методы модификации нуклеиновых кислот, например получение конструкций нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция, мутагенез, секвенирование, введение ДНК в клетки, экспрессия генов, анализ белка и т.п., подробно описаны в нескольких руководствах, таких, например, как, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, или Short Protocols in Molecular Biology, Second edition, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1992 или Erlich HA PCR Technology, Stockton Press, 1989.Having knowledge of the CDR sequences that provide high affinity for the imiglucerase antibodies that carry them, and general knowledge of the state of the art, a qualified person can construct an antibody of any format currently known, including any of the disclosed amino acid sequences, in any convenient way to generate it in prokaryotes or eukaryotes, clean, sew on the sorbent and chromatographic purify imiglucerase under the indicated conditions. Since the monovalent and divalent scFv fragments and their equivalent variants according to the invention can be obtained by expression of a nucleic acid coding sequence, a nucleic acid sequence that encodes any of the polypeptide molecules described above is part of the present invention, as well as a method for expressing such a nucleic acid . For recombinant expression of monovalent and divalent scFv and its equivalent variants, suitable vectors containing adequate regulatory sequences may be selected or constructed, including promoter, terminator, enhancer, polyadenylation sequence, marker genes and other suitable sequences. Such vectors may be plasmids. Many well-known protocols and methods for modifying nucleic acids, for example, obtaining nucleic acid constructs, polymerase chain reaction, mutagenesis, sequencing, introducing DNA into cells, gene expression, protein analysis, etc., are described in detail in several manuals, such as, for example , Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, or Short Protocols in Molecular Biology, Second edition, Ausubel et al., Eds. John Wiley & Sons, 1992 or Erlich HA PCR Technology, Stockton Press, 1989.
После их продуцирования моновалентные и двухвалентные фрагменты scFv и их эквивалентные варианты могут быть использованы в любом способе, требующем применения пептидного реагента, обладающего способностью с высокой аффинностью обратимо связывать имиглюцеразу. Помимо способа аффинной хроматографии они могут быть использованы, например, для создания диагностического продукта, включенного в набор реагентов, который, помимо специфически связывающегося агента, включает в себя один или несколько реагентов для определения уровня связывания указанного агента с клетками или с имиглюцеразой, не связанной с клетками, как обсуждалось выше.After their production, monovalent and divalent scFv fragments and their equivalent variants can be used in any method requiring the use of a peptide reagent with the ability to reversibly bind imiglucerase with high affinity. In addition to the affinity chromatography method, they can be used, for example, to create a diagnostic product included in a reagent kit, which, in addition to a specific binding agent, includes one or more reagents for determining the level of binding of the specified agent to cells or to non-linked imiglucerase cells, as discussed above.
Другие аспекты настоящего изобретения и способы их осуществления очевидны каждому специалисту. Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение его притязаний и объема.Other aspects of the present invention and methods for their implementation are obvious to everyone skilled in the art. For a better understanding of the present invention, the following are examples that should not be construed as limiting its claims and scope.
Пример 4. Аффинная хроматография имигюцеразы.Example 4. Affinity chromatography of imigucerase.
В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. При иммобилизации одного из компонентов комплекса получается специфический сорбент (так называемая "неподвижная фаза" для второго его компонента, если соблюдаются все условия, необходимые для образования этого комплекса. Хроматография может быть проведена с использованием различных приборов и приспособлений и даже без них, путем простой сорбции макромолекулы, выделяемой из подвижной фазы, на специфическом сорбенте (который часто бывает даже одноразового употребления).The principle of affinity chromatography is based on the distinguishing feature of biologically active substances to form stable, specific and reversible complexes. When immobilizing one of the components of the complex, a specific sorbent is obtained (the so-called "stationary phase" for its second component, if all the conditions necessary for the formation of this complex are met. Chromatography can be carried out using various instruments and devices and even without them, by simple sorption macromolecules secreted from the mobile phase on a specific sorbent (which is often even single use).
Очищенные полноразмерные антитела по изобретению или scFv пришивали на сефарозу (Sepharose 6В, GE Healthcare), активированную эпихлоргидрином. На 1 мл сефарозы в среднем можно пришить около 10 мг белка (количество оценивалось по разнице концентрации антител в растворе до и после пришивки).The purified full length antibodies of the invention or scFv were sutured onto sepharose (Sepharose 6B, GE Healthcare) activated with epichlorohydrin. On average, about 10 mg of protein can be sewn per ml of Sepharose (the amount was estimated by the difference in the concentration of antibodies in the solution before and after sewing).
В работе использовались следующие буферные растворы: PBS, рН 7.4 (Буфер А), 20 mM NaP, 1М NaCl, рН 7.4 (Буфер В), 20 mM NaP, 1М NaCl, 60% этиленгликоль рН 6.0 (Буфер С).The following buffer solutions were used in the work: PBS, pH 7.4 (Buffer A), 20 mM NaP, 1 M NaCl, pH 7.4 (Buffer B), 20 mM NaP, 1 M NaCl, 60% ethylene glycol pH 6.0 (Buffer C).
Пример 5. Получение полноразмерных антител на основе одноцепочечных фрагментов.Example 5. Obtaining full-sized antibodies based on single-chain fragments.
На основе одноцепочечных фрагментов 2D4 и 2L18 были созданы человеческие антитела класса IgG1, пригодные для промышленного производства и сохранившие способность специфично формировать комплекс с имиглюцеразой, диссоциирующий в присутствии 30 и более процентов этиленгликоля:Based on single-stranded fragments 2D4 and 2L18, human antibodies of the IgG1 class were created, suitable for industrial production and retaining the ability to specifically form a complex with imiglucerase, which dissociates in the presence of 30 or more percent ethylene glycol:
Пример 6. Измерение аффинности антител.Example 6. Measurement of the affinity of antibodies.
Определение констант связывания разработанных антител проводили, используя метод биослойной интерферометрии на приборе Octet QKe согласно рекомендациям производителя. Биосенсоры protA (PALL corp) с иммобилизованным белком А согласно рекомендациям производителя. Стандартным буфером для SPR являлся PBSTB (10 мМ Na-фосфат, 150 мМ NaCl, 0.005%-ный твин-20, 0,01%-ный BSA, рН 7,4). Далее в стандартном буфере иммобилизовали на экспериментальные сенсоры исследуемое антитело до величины накопления слоя 1 нм. для чего в течение 300 сек при 1000 об/мин проводилась параллельная ассоциация серии из 7 концентраций имиглюцеразы. Далее после 600 секунд диссоциации сенсоры регенерировали 0,1 М GlyHCl, рН 2,0. Таким образом, с сенсоров удалялись как имиглюцераза, так и исследуемое антитело, после чего цикл повторялся. Анализ сенсограмм проводили, используя программу ForteBio Data Analysis.The binding constants of the developed antibodies were determined using the bio-layer interferometry method on an Octet QKe instrument according to the manufacturer's recommendations. ProtA biosensors (PALL corp) with immobilized protein A according to the manufacturer's recommendations. The standard buffer for SPR was PBSTB (10 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl, 0.005% tween-20, 0.01% BSA, pH 7.4). Then, in a standard buffer, the test antibody was immobilized onto experimental sensors to a layer accumulation value of 1 nm. why for 300 seconds at 1000 rpm a parallel association of a series of 7 concentrations of imiglucerase was carried out. Then after 600 seconds of dissociation, the sensors regenerated 0.1 M GlyHCl, pH 2.0. Thus, both imiglucerase and the test antibody were removed from the sensors, after which the cycle was repeated. Sensogram analysis was performed using ForteBio Data Analysis software.
Измерения аффинности анти-имиглюцеразных антител показали специфическое связывание с имиглюцеразой. Оба антитела, 2D4 и 2L18, показали сходные константы диссоциации, 41.3 нМ и 12 нМ соответственно (Фиг. 1).The affinity measurements of anti-imiglucerase antibodies showed specific binding to imiglucerase. Both antibodies, 2D4 and 2L18, showed similar dissociation constants, 41.3 nM and 12 nM, respectively (Fig. 1).
Пример 7. Оценка стабильности полноразмерных антител по изобретению.Example 7. Evaluation of the stability of the full-sized antibodies of the invention.
Оценка стабильности антител проводилась на приборе Octet QKe аналогично процедуре, описанной ниже (Пример 8), с тем отличием, что отсутствовала стадия диссоциации, а регенерация проводилась в буфере AAcSE, при этом с сенсоров удалялась только имиглюцераза, но не антитела.The stability of antibodies was assessed on an Octet QKe instrument similarly to the procedure described below (Example 8), with the difference that there was no dissociation step and regeneration was performed in AAcSE buffer, with only imiglucerase but not antibodies removed from the sensors.
50-кратное повторение циклов адсорбции-регенерации не выявило заметного снижения антиген-связывающей способности антител (Фиг. 2).A 50-fold repetition of adsorption-regeneration cycles did not reveal a noticeable decrease in the antigen-binding ability of antibodies (Fig. 2).
Таким образом, антитела демонстрируют высокую стабильность в используемых условиях, что делает возможным многократное использование сорбента на их основе.Thus, antibodies demonstrate high stability in the conditions used, which makes it possible to reuse the sorbent based on them.
Пример 8. Очистка имиглюцеразы аффинной хроматографией.Example 8. Purification of imiglucerase by affinity chromatography.
Индивидуальные связывающие имиглюцеразу антитела, полученные в результате селекций в фаговом дисплее, были присоединены к хроматографической матрице, и их связывающая емкость, сохранение активности, чистота и условия элюции были изучены. Данный пример иллюстрирует результат очистки имиглюцеразы раскрытым в изобретении способом.Individual imiglucerase binding antibodies obtained by selection in a phage display were attached to a chromatographic matrix, and their binding capacity, activity retention, purity and elution conditions were studied. This example illustrates the result of purification of imiglucerase as disclosed in the invention.
Колонки с полученным по настоящему изобретению сорбентом были присоединены к хроматографическим системам 
Образцы, наносившиеся на аффинные колонки: имиглюцераза (АО «ГЕНЕРИУМ») с удельной активностью 40 ед/мг, концентрация белка 0.24 мг/мл в PBS с 2% этиленгликолем; бессывороточная среда с экспрессирующей имиглюцеразу культуры клеток (1,2 ед/мл активности); содержащая 4% FBS среда с экспрессирующей имиглюцеразу культуры клеток (1,6 ед/мл активности).Samples applied to affinity columns: imiglucerase (JSC GENERIUM) with a specific activity of 40 units / mg, protein concentration 0.24 mg / ml in PBS with 2% ethylene glycol; serum-free medium with cell culture expressing imiglucerase (1.2 u / ml activity); containing 4% FBS medium with expressing imiglucerase cell culture (1.6 u / ml activity).
Исходные образцы и образцы, полученные в результате хроматографии белковых фракций, анализировались с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях.The original samples and samples obtained by chromatography of protein fractions were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions.
Специфическая активность в препаратах имиглюцеразы определялась с помощью хромогенного теста с использованием 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида (Sigma) в качестве субстрата.The specific activity in imiglucerase preparations was determined using a chromogenic test using 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (Sigma) as a substrate.
Содержание остаточных белков FBS (BSA, иммуноглобулины) оценивалось с помощью иммуноферментных наборов Cygnus (Bovine Serum Albumin (BSA) Assay и Bovine IgG Assay).The content of residual FBS proteins (BSA, immunoglobulins) was evaluated using the Cygnus immunoenzyme kits (Bovine Serum Albumin (BSA) Assay and Bovine IgG Assay).
Результат: Имиглюцераза как на 2D4 Sepharose, так и на 2L18 сходит одним четко выраженным пиком при элюции буфером С (Фиг. 3).Result: Imiglucerase on both 2D4 Sepharose and 2L18 converges with one distinct peak upon elution with buffer C (Fig. 3).
Содержание остаточных белков FBS незначительно, около или менее 1% от общего белка в элюате (Табл. 3). Эксперименты с сорбцией на колонки препарата очищенной имиглюцеразы показали сорбционную емкость колонок около 1.8-2.7 мг имиглюцеразы на мл сорбента (основной пик, элюция буфером С). После 10 циклов сорбции-десорбции емкость колонки осталась прежней; активность имиглюцеразы в элюате полностью сохраняется (Табл.2).The residual protein content of FBS is insignificant, about or less than 1% of the total protein in the eluate (Table 3). Experiments with sorption of purified imiglucerase onto the columns of the preparation showed a sorption capacity of the columns of about 1.8-2.7 mg of imiglucerase per ml of sorbent (main peak, elution with buffer C). After 10 cycles of sorption-desorption, the column capacity remained the same; the activity of imiglucerase in the eluate is fully preserved (Table 2).
Протеолитическая деградация имиглюцеразы так же отсутствует, все фракции демонстрируют единственную широкую полосу, соответствующую гликозилированной имиглюцеразе (Фиг. 4) Наработка имиглюцеразы культурой эукариотических клеток может происходить как в безсывороточной среде, так и в среде, содержащей FBS, каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. В элюате, полученном из сред с экспрессионных культур (Фиг. 5), видимые белковые примеси также отсутствуют (Фиг. 6, Фиг. 7).Proteolytic degradation of imiglucerase is also absent, all fractions show a single wide band corresponding to glycosylated imiglucerase (Fig. 4). Imiglucerase production by eukaryotic cell culture can occur both in serum-free medium and in medium containing FBS, each of the methods has its advantages and disadvantages. . In the eluate obtained from media from expression cultures (Fig. 5), visible protein impurities are also absent (Fig. 6, Fig. 7).
Claims (6)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130013A RU2676956C1 (en) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Antibodies for binding of imiglucerase and use thereof in affinity chromatography |
| PCT/RU2018/000491 WO2019039968A1 (en) | 2017-08-25 | 2018-07-24 | Antibodies for binding imiglucerase and use of same for affinity chromatography |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130013A RU2676956C1 (en) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Antibodies for binding of imiglucerase and use thereof in affinity chromatography |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676956C1 true RU2676956C1 (en) | 2019-01-11 |
Family
ID=65025135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017130013A RU2676956C1 (en) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Antibodies for binding of imiglucerase and use thereof in affinity chromatography |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676956C1 (en) |
| WO (1) | WO2019039968A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2802582C1 (en) * | 2019-12-26 | 2023-08-30 | ЭлДжи КЕМ, ЛТД. | Follicle stimulating hormone purification method |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990007573A1 (en) * | 1988-12-23 | 1990-07-12 | Genzyme Corporation | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
| RU2581058C2 (en) * | 2009-10-19 | 2016-04-10 | Амикус Терапьютикс, Инк. | New compositions for preventing or treating degenerative diseases of central nervous system |
-
2017
- 2017-08-25 RU RU2017130013A patent/RU2676956C1/en not_active IP Right Cessation
-
2018
- 2018-07-24 WO PCT/RU2018/000491 patent/WO2019039968A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990007573A1 (en) * | 1988-12-23 | 1990-07-12 | Genzyme Corporation | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
| RU2581058C2 (en) * | 2009-10-19 | 2016-04-10 | Амикус Терапьютикс, Инк. | New compositions for preventing or treating degenerative diseases of central nervous system |
Non-Patent Citations (6)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2802582C1 (en) * | 2019-12-26 | 2023-08-30 | ЭлДжи КЕМ, ЛТД. | Follicle stimulating hormone purification method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019039968A1 (en) | 2019-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huse et al. | Purification of antibodies by affinity chromatography | |
| RU2553214C2 (en) | Methods of purifying single-domain antigen-binding molecules | |
| EP2170960B1 (en) | Single-domain antigen-binding proteins that bind mammalian igg | |
| KR101838039B1 (en) | Method of increasing protein purity using protein a based chromatography | |
| TW201402605A (en) | Protease-regulated antibodies | |
| CN114787193B (en) | Anti-polymerase monoclonal antibodies and uses thereof | |
| US9815891B2 (en) | Monospecific polypeptide reagents | |
| JP7037148B2 (en) | A separating agent for human serum-derived IgG polyclonal antibody and a method for separating human serum-derived IgG polyclonal antibody using the same. | |
| CN114450406A (en) | Preparation method of fragmentation type intein and recombinant polypeptide using same | |
| D'Agostino et al. | Affinity purification of IgG monoclonal antibodies using the D-PAM synthetic ligand: chromatographic comparison with protein A and thermodynamic investigation of the D-PAM/IgG interaction | |
| Abi-Ghanem et al. | Immunoaffinity chromatography: a review | |
| EP2239267A1 (en) | Tag peptide and use thereof | |
| Fujita-Yamaguchi | Affinity chromatography of native and recombinant proteins from receptors for insulin and IGF-I to recombinant single chain antibodies | |
| RU2676956C1 (en) | Antibodies for binding of imiglucerase and use thereof in affinity chromatography | |
| Moricoli et al. | Blocking monocyte transmigration in in vitro system by a human antibody scFv anti-CD99. Efficient large scale purification from periplasmic inclusion bodies in E. coli expression system | |
| CN113683692B (en) | SARS-CoV-2N protein antibody and its application | |
| Bellofiore et al. | Identification and refinement of a peptide affinity ligand with unique specificity for a monoclonal anti-tenascin-C antibody by screening of a phage display library | |
| Pearce et al. | Linear gene fusions of antibody fragments with streptavidin can be linked to biotin labelled secondary molecules to form bispecific reagents | |
| JP7298607B2 (en) | Affinity carrier using mutant VHH antibody | |
| CN110950969B (en) | Fusion protein with immunoglobulin binding capacity | |
| US20110189790A1 (en) | Methods of Predicting Antibody Solubility | |
| RU2764795C1 (en) | Monoclonal antibody against the c-terminal fragment of anti-mullerian hormone | |
| WO2023035226A1 (en) | Anti-ang2 antibody, preparation method therefor, and application thereof | |
| US20160237144A1 (en) | Thermus thermophilus slyd fkbp domain specific antibodies | |
| Tillib et al. | Extending Linker Sequences between Antigen-Recognition Modules Provides More Effective Production of Bispecific Nanoantibodies in the Periplasma of E. coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190826 |