RU2676910C1 - Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains - Google Patents

Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains Download PDF

Info

Publication number
RU2676910C1
RU2676910C1 RU2018116821A RU2018116821A RU2676910C1 RU 2676910 C1 RU2676910 C1 RU 2676910C1 RU 2018116821 A RU2018116821 A RU 2018116821A RU 2018116821 A RU2018116821 A RU 2018116821A RU 2676910 C1 RU2676910 C1 RU 2676910C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
strains
longum
biocompatibility
studied
bifidobacteria
Prior art date
Application number
RU2018116821A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Олег Валерьевич Бухарин
Наталья Борисовна Перунова
Елена Валерьевна Иванова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук
Priority to RU2018116821A priority Critical patent/RU2676910C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2676910C1 publication Critical patent/RU2676910C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: method for determining the biocompatibility level of strains of bifidobacteria and/or lactobacilli is proposed. Method involves separately growing strains in a liquid medium and co-incubating their supernatants separately with a suspension of cells of the Bifidobacterium lognum MC-42 test strain. Washed cells of the test strain are cultured in nutrient broth, the supernatant is separated, and the previously co-incubated strain is then cultured, pre-grown on a dense nutrient medium, determine its growth properties, anti-lysozyme activity, biofilm formation. Calculate the level of biocompatibility of strains – B, (%) according to the formula:, where GPo and GPk are growth properties of the strains in experience and control, unit OP; BFFo and BFFk – biofilm formation, units OP; ALAo and ALAe – anti-lysozyme activity, mcg/ml*OP. With a value of B equal to or more than 50 %, the biocompatibility of strains of bifidobacteria and/or lactobacilli is considered high.EFFECT: method allows to determine the level of biocompatibility of strains in a consortium of probiotic bacteria.1 cl, 4 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине и может использоваться в научно-исследовательских и производственных бактериологических лабораториях с целью получения консорциума бифидобактерий и/или лактобактерий с высокой биосовместимостью для производства лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.The invention relates to microbiology, biotechnology and medicine and can be used in research and production bacteriological laboratories with the aim of obtaining a consortium of bifidobacteria and / or lactobacilli with high biocompatibility for the production of therapeutic and prophylactic agents of probiotic orientation, biologically active additives and bacterial preparations.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерий и лактобактерий.Due to adverse environmental conditions, stress, antibacterial, radiation and chemotherapy, dysbiosis resulting from past diseases, the number of people suffering from disorders of the normal microflora of the body increases. For the treatment and prevention of these disorders, increasing attention is being paid to both drugs with a probiotic effect, and food products containing representatives of the normal intestinal microflora - bifidobacteria and lactobacilli.

Проблема коррекции дисбиозов толстого кишечника человека можно рассматривать как общемедицинскую, поскольку нарушения микробиоценоза существенно в патогенезе большого количества заболеваний различной этиологии, в том числе и патологии висцеральных органов [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 260 с.].The problem of correcting dysbiosis of the human large intestine can be regarded as general medical, since microbiocenosis disorders are essential in the pathogenesis of a large number of diseases of various etiologies, including the pathology of visceral organs [Bukharin, O.V. Microsymbiocenosis / O.V. Bukharin, N.B. Perunova - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. - 260 p.].

В настоящее время в мире продолжается поиск консорциумов пробиотических микроорганизмов с высоким лечебно-профилактическим эффектом. Большинство пробиотических препаратов создается на основе бифидобактерий и лактобактерий, являющихся наиболее значимыми представителями микросимбиоценоза человека и выполняющими многофункциональную роль в поддержании гомеостаза хозяина [Шендеров Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Общие и избранные разделы проблемы / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2005. - №2. - С. 23-26; Бухарин, О.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 127-139].Currently, the world continues to search for consortia of probiotic microorganisms with a high therapeutic effect. Most probiotic preparations are based on bifidobacteria and lactobacilli, which are the most significant representatives of human microsymbiocenosis and perform a multifunctional role in maintaining host homeostasis [B. Shenderov Probiotics, prebiotics and synbiotics. General and selected sections of the problem / B.A. Shenderov // Food Ingredients. Raw materials and additives. - 2005. - No. 2. - S. 23-26; Bukharin, O.V. Bifidoflora in associative human symbiosis / O.V. Bukharin, N.B. Perunova, E.V. Ivanova. - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. S. 127-139].

Важной причиной не всегда убедительной клинической эффективности применяемых пробиотиков является то, что нередко при создании консорциума микроорганизмов пробиотического действия подбираются виды бактерий без учета их биосовместимости, что приводит к подавлению жизнеспособности микроорганизмов и утрате практически значимых свойств.An important reason for the not always convincing clinical effectiveness of the used probiotics is that often when creating a consortium of microorganisms of probiotic action, bacterial species are selected without taking into account their biocompatibility, which leads to a suppression of the viability of microorganisms and the loss of practically significant properties.

Известно наличие межвидового антагонизма у лактобактерий, реализуемого за счет продукции биологически активных соединений (молочная кислота, лактоцины, перекись водорода и т.д.) [Глушанова Н.А. Биосовместимость пробиотических и резидентных лактобацилл / Н.А. Глушанова, А.И. Блинов // Тезисы VII Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2005» // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2005. - №1. - С. 31].The presence of interspecific antagonism in lactobacilli, realized through the production of biologically active compounds (lactic acid, lactocins, hydrogen peroxide, etc.), is known [Glushanova N.A. Biocompatibility of probiotic and resident lactobacilli / N.A. Glushanova, A.I. Pancakes // Abstracts of the VII Slavic-Baltic Scientific Forum "St. Petersburg - Gastro-2005" // Gastroenterology of St. Petersburg. - 2005. - No. 1. - S. 31].

В результате пробиотические бифидобактерии и лактобактерий могут вступать в конкурентные взаимоотношения как между собой в консорциуме, так и с нормофлорой толстого кишечника человека, и лишь транзиторно сохраняется в организме, не всегда оказывая клиническое действие.As a result, probiotic bifidobacteria and lactobacilli can enter into competitive relationships both among themselves in the consortium and with the normoflora of the human large intestine, and only transiently remains in the body, not always exerting a clinical effect.

Получение консорциума штаммов с высокой биосовместимостью имеет преимущества в обеспечении эффективной и быстрой коррекции микроэкологических нарушений с выраженным лечебно-профилактическим действием.Obtaining a consortium of strains with high biocompatibility has advantages in providing effective and quick correction of microecological disorders with a pronounced therapeutic and prophylactic effect.

Известен способ индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, заключающийся в выявлении адгезивной активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии, к буккальному эпителию пациента, определении биосовместимости исследуемых пробиотических препаратов с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента [патент РФ 2428468, C12N 1/20, A61K 35/74, 2011].A known method for the individual selection of probiotic preparations containing lactobacilli and / or bifidobacteria for the elimination of conditionally pathogenic microorganisms isolated from the patient in the study for intestinal dysbiosis, which consists in identifying the adhesive activity of probiotic preparations containing lactobacilli and / or bifidobacteria, determining buccal the biocompatibility of the studied probiotic preparations with indigenous lactobacilli and bifidobacteria of the patient [RF patent 2428468, C12N 1/20, A61K 35/74, 201 one].

В известном способе для определения биосовместимости пробиотических и индигенных лактобактерий и бифидобактерий используют капельную методику. Проводят наложение капель двух исследуемых штаммов с отступом в 1-2 мм друг от друга и оценку особенности их роста в месте контакта на питательном агаре. Культуры считают биосовместимыми в случае обнаружения роста двух исследуемых культур, сходного с ростом в контроле. При задержке или отсутствии роста одной из культур взаимоотношения между ними рассматриваются как антагонистические и культуры считаются не совместимыми.In the known method for determining the biocompatibility of probiotic and indigenous lactobacilli and bifidobacteria using the drip technique. The droplets of the two studied strains are superimposed indented 1-2 mm from each other and the features of their growth at the contact point on nutrient agar are evaluated. Cultures are considered biocompatible in the case of detecting the growth of two studied cultures, similar to the growth in the control. If one of the cultures is delayed or not growing, the relationships between them are considered as antagonistic and cultures are considered incompatible.

Однако такой подход не позволяет определить уровень биосовместимости, так как метод является качественным.However, this approach does not allow to determine the level of biocompatibility, since the method is qualitative.

Известен способ получения консорциума бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, предусматривающий совместное культивирование в питательной среде входящих в него штаммов [патент РФ 2491332, C12N 1/20, A61K 35/74, А23С 9/12, A23L 1/29, 2013].A known method of obtaining a consortium of bifidobacteria for the preparation of bacterial preparations and biologically active food supplements intended for the correction of the microflora of the gastrointestinal tract of people over 14 years of age, providing for the joint cultivation of the strains included in it [RF patent 2491332, C12N 1/20, A61K 35/74, A23C 9/12, A23L 1/29, 2013].

Данный способ основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них. Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование входящих в него штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материал каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), соответствующую 1 млрд. клеток бифидобактерий.This method is based on a preliminary study and selection for co-cultivation of strains according to the principle of biocompatibility and taking into account the growth kinetics of each of them. An algorithm for creating a consortium of bifidobacteria is the joint cultivation of the strains included in it, taking into account the duration of the exponential growth phase of each of them, based on which the time point of inoculation of the nutrient medium during the phased introduction of monoculture inocula is determined. For this, a strictly quantitative ratio of the seed of each strain is selected. According to the optical turbidity standard, the concentration of colony forming units (CFU / ml) is established corresponding to 1 billion bifidobacteria cells.

Такой же подход использован при получении консорциумов бифидобактерий и лактобактерий, используемых для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей в различные его возрастные периоды [патенты РФ 2180348, 2180915, 2180914, C12N 1/20, A61K 35/74, А23С 9/12, 2002].The same approach was used to obtain consortia of bifidobacteria and lactobacilli used for the preparation of bacterial preparations, starter cultures for fermented milk products, fermented and non-fermented food products, biologically active additives designed to correct the microflora of people in its various age periods [RF patents 2180348, 2180915, 2180914, 2180914 , C12N 1/20, A61K 35/74, A23C 9/12, 2002].

Основным недостатком известных способов является то, что при создании консорциумов бифидобактерий и лактобактерий учитывается только их рост и резистентность к среде. Однако из-за широкого видового разнообразия пробиотических составляющих в консорциуме существует высокий риск конкурентных или нейтральных взаимоотношений пробиотических культур как в консорциуме, так и с микрофлорой человека [Глушанова Н.А. Исследование ауто-, изо- и гомоантагонизма пробиотических штаммов лактобацилл / Н.А. Глушанова, Н.Б. Вербицкая, Л.Н. Петров, А.И. Блинов, Б.А. Шендеров // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - №6 (44). - С. 138-142; Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих условия пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю Чичерин., И.П. Погорельский, И.А. Лундовских // Экспериментальная гастроэнтерология. - 2011. - №3. - С. 6-11].The main disadvantage of the known methods is that when creating consortia of bifidobacteria and lactobacilli, only their growth and resistance to the environment are taken into account. However, due to the wide species diversity of probiotic components in the consortium, there is a high risk of competitive or neutral relations between probiotic cultures both in the consortium and with human microflora [Glushanova N.A. The study of auto-, iso- and homoantagonism of probiotic strains of lactobacilli / N.A. Glushanova, N.B. Verbitskaya, L.N. Petrov, A.I. Blinov, B.A. Shenderov // Bulletin of the VSNS SB RAMS. - 2005. - No. 6 (44). - S. 138-142; Darmov I.V. The survival of probiotic microorganisms in vitro, simulating the digestive conditions in humans / I.V. Darmov, I.U. Chicherin., I.P. Pogorelsky, I.A. Lundovskikh // Experimental gastroenterology. - 2011. - No. 3. - S. 6-11].

Технический результат, на достижение которого направлено патентуемое изобретение, заключается в разработке способа определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий.The technical result to which the patented invention is directed is to develop a method for determining the level of biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli.

Для достижения указанного технического результата заявляемый способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий, включает следующие этапы:To achieve the technical result of the claimed method of determining the level of biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli, includes the following steps:

- выращивание каждого из исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе;- growing each of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli separately in a liquid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator;

- центрифугирование полученных бульонных культур при 3200 об/мин в течение 15 минут и отделение супернатантов от микробных клеток путем пропускания через мембранные фильтры;- centrifugation of the resulting broth cultures at 3200 rpm for 15 minutes and the separation of supernatants from microbial cells by passing through membrane filters;

- выращивание тест-штамма В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе и приготовление из выросшей культуры одномиллиардной взвеси (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия;- growing test strain B. longum MS-42 in a solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator and preparing one billionth suspension (optical density 3 McF) from a grown culture on a 0.9% sodium chloride solution;

- соинкубирование супернатантов исследуемых штаммов, каждого в отдельности, с одномиллиардной взвесью тест-штамма В. longum МС-42 в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СО2-инкубаторе;- co-incubation of the supernatants of the studied strains, each individually, with a one billionth suspension of the test strain B. longum MS-42 in a ratio of 1: 2 for 1 hour in a CO 2 incubator;

- центрифугирование всех проб при 3200 об/мин в течение 15 минут, отмывание клеток тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендирование отмытых клеток В. longum МС-42 в питательный бульон и культивирование при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе, центрифугирование полученных проб и отделение супернатантов от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры;- centrifugation of all samples at 3200 rpm for 15 minutes, washing the cells of the test strain B. longum MC-42 three times with 0.9% sodium chloride solution, resuspending the washed cells of B. longum MC-42 in a nutrient broth and culturing at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator, centrifuging the samples and separating the supernatants from the microbial cells by passing through membrane filters;

- выращивание, каждого исследуемого штамма микроорганизмов в отдельности, на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе и приготовление из каждой выросшей культуры одномиллиардной взвеси (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия;- growing, each studied strain of microorganisms separately, on a solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator and preparing one billionth suspension (optical density 3 McF) from each grown culture on a 0.9% sodium chloride solution;

- приготовление опытных проб путем смешивания полученных взвесей исследуемых штаммов с супернатантами В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8, причем проводят смешивание супернатанта В. longum МС-42 соответственно с взвесью того исследуемого штамма, с которым ранее он был соинкубирован;- preparation of experimental samples by mixing the obtained suspensions of the studied strains with supernatants of B. longum MS-42 and nutrient broth in a ratio of 1: 1: 8, moreover, the supernatant of B. longum MS-42 is mixed with a suspension of the studied strain with which it was previously was incubated;

- приготовление контроля из полученных взвесей исследуемых штаммов микроорганизмов с питательным бульоном в соотношении 1:9;- preparation of control from the obtained suspensions of the studied strains of microorganisms with nutrient broth in a ratio of 1: 9;

- культивирование опытных и контрольных проб при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе;- cultivation of experimental and control samples at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator;

- определение значения показателя ростовых свойств, антилизоцимной активности и биопленкообразования исследуемых штаммов в опытных и контрольных пробах;- determination of the value of the indicator of growth properties, antilysocyme activity and biofilm formation of the studied strains in experimental and control samples;

- расчет показателя уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:- calculation of the indicator of the level of biocompatibility of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli with the test strain B. longum MS-42 according to the formula:

Figure 00000001
Figure 00000001

где В - показатель уровня биосовместимости, %;where B is an indicator of the level of biocompatibility,%;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП450;RSo - growth properties of strains in the experiment, units OP 450 ;

PCk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП450;PCk - growth properties of the strains in the control, units OP 450 ;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП630;BPOo - biofilm formation of strains in the experiment, units OP 630 ;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП630;BPOk - biofilm formation of strains in the control, units OP 630 ;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*OD;ALAo - antilysocyme activity of the strains in the experiment, μg / ml * OD;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*OD,ALAk - antilysocyme activity of the strains in the control, μg / ml * OD,

при этом при значении показателя уровня биосовместимости равном либо больше 50% биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой.however, when the value of the level of biocompatibility is equal to or greater than 50%, the biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli is considered high.

Техническим результатом изобретения является тот факт, что заявляемый способ позволяет определить уровень биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий и использовать полученные данные при получении консорциумов бифидобактерий и/или лактобактерий пробиотического действия, используемых для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.The technical result of the invention is the fact that the claimed method allows to determine the level of biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli and use the data obtained to obtain consortia of bifidobacteria and / or lactobacilli of probiotic action used to obtain starter cultures, probiotic preparations, biologically active additives and food products.

При изучении регуляторных межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе авторами экспериментально установлена возможность определения «свой-чужой» по оппозитному (усиление/подавление) эффекту базовых физиологических характеристик (репродукция и адаптация) микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 187-203]. Это позволило дифференцировать по наличию синергизма или антагонизма «свои» и «чужие» микросимбионты. Этот метод хорошо зарекомендовал себя для оценки чужеродности пробиотических культур Е. coli М-17 (с островом патогенности) и Е. coli ЛЭГМ-18 (без острова патогенности) [Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Андрющенко СВ. Межмикробное распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» пробиотических штаммов Escherichia coli М-17 и Escherichia coli ЛЭГМ-18 // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2016. №3, С. 3-9]. Тестирование культуры Е. coli М-17 выявило угнетение изучаемых биологических признаков, что позволило отнести Е. coli М-17 к «чужим» видам, хотя она использовалась в коммерческом препарате «Колибактерин» (снят с производства) в прошлом. Тогда как Е. coli ЛЭГМ-18 (без этого фрагмента) подлежала оценке как «своя», поскольку резко усиливала свои биологические характеристики.When studying regulatory intermicrobial interactions in microsymbiocenosis, the authors experimentally established the possibility of determining “friend or foe” by the opposite (enhancement / suppression) effect of the basic physiological characteristics (reproduction and adaptation) of microorganisms in a pair of “dominant-associate” [Bukharin, O.V. Microsymbiocenosis / O.V. Bukharin, N.B. Perunova - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. P. 187-203]. This made it possible to differentiate by the presence of synergism or antagonism, “our” and “alien” microsymbionts. This method has proven itself to assess the foreignness of probiotic cultures of E. coli M-17 (with pathogenicity island) and E. coli LEGM-18 (without pathogenicity island) [Bukharin OV, Perunova NB, Ivanova E.V. ., Andryushchenko SV. Intermicrobial recognition of “friend or foe” in a pair of “dominant associate” probiotic strains of Escherichia coli M-17 and Escherichia coli LEGM-18 // Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2016. No. 3, S. 3-9]. Testing the culture of E. coli M-17 revealed inhibition of the studied biological traits, which allowed attributing E. coli M-17 to “alien” species, although it was used in the commercial preparation “Kolibacterin” (discontinued) in the past. Whereas E. coli LEGM-18 (without this fragment) was subject to assessment as “own”, since it sharply enhanced its biological characteristics.

При разработке заявляемого изобретения мы опирались на ранее выявленный нами феномен микробного распознавания в паре «доминант-ассоциант», основанный на принципе индукции метаболитов в результате предварительного соинкубирования с супернатантом ассоциантов и формировании обратной связи в паре «доминант-ассоциант». При этом соинкубирование микробных культур с метаболитами проводили в несколько этапов, оценивая результат по изменению базовых параметров физиологических функций микросимбионтов [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 184-186].In developing the claimed invention, we relied on the phenomenon of microbial recognition previously identified by us in a pair of “dominant associate”, based on the principle of induction of metabolites as a result of preliminary co-incubation with the supernatant of associates and the formation of feedback in a pair of “dominant associate”. Moreover, co-incubation of microbial cultures with metabolites was carried out in several stages, evaluating the result by changing the basic parameters of the physiological functions of microsymbionts [Bukharin, O.V. Microsymbiocenosis / O.V. Bukharin, N.B. Perunova - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. P. 184-186].

В проведенных экспериментах в качестве исследуемых культур были использованы 12 штаммов бифидобактерий и лактобактерий. В том числе 6 производственных культур: Bifidobacterium bifidum 791 (ВНИИ Генетика Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика), номер депозита ЦМПМ №В-3300 и Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского) №80), Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов (ГКПМ), Россия, №900811), Lactobacillus fermentum 90Т-С4 (ГКПМ, Россия, №900812), Lactobacillus acidophilus К3Ш24 (№42 в ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского или №В-3190 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика), Lactobacillus acidophilus 100аш (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ № В-3190), Lactobacillus acidophilus NK1 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ № В-8957 (В центральной лаборатории ВНИМИ №22/10)) и 6 клинических штаммов, изолированных при изучении микроэкологического состояния толстого кишечника человека: В. bifidum 218, В. longum 315, В. pseudocatenulatum 138, L. acidophilus 15, L. plantarum 34, В. adolescentis 189.In our experiments, 12 strains of bifidobacteria and lactobacilli were used as the studied cultures. Including 6 industrial crops: Bifidobacterium bifidum 791 (All-Russian Research Institute of Genetics, All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM FSUE GosNIIgenetika), deposit number TsMPM No. V-3300 and the State collection of microorganisms of normal microflora of the Federal State Budget Scientific Institution named after G.N. Gabrichevsky Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare named after G.N. Gabrichevsky) No. 80), Lactobacillus plantarum 8P-A3 (State collection of pathogenic microorganisms (GKPM), Russia, No. 900811), Lactobacillus fermentum 90T-C4 (GKPM, Russia, No. 900812), Lactobacillus acidophilus K3Sh24 ( No. 42 in the State Committee for the National Economy, Federal Medical Research Institute named after G.N. Gabrichevsky or No. В- 3190 at VKPM FSUE GosNIIgenetika), Lactobacillus acidophilus 100ash (VKPM FSUE GosNIIgenetika, VKPM No. B-3190), Lactobacillus acidophilus NK1 (VKPM FSUE GosNIIgenetika, VKPM No. V-8957 and clinical laboratory No. 6 V22 10) isolated when studying the microecological state of the human large intestine: B. bifidum 218, B. longum 315, B. pseudocatenulatum 138, L. acidophilus 15, L. plantarum 34, B. adolescentis 189.

Микроорганизмы данных видов были нами использованы в работе, поскольку являются одними из наиболее значимых представителей микрофлоры организма человека, выполняя многофункциональную роль в поддержании гомеостаза организма и часто входят в состав лечебно-профилактических препаратов (про- и синбиотиков).We used the microorganisms of these species in our work because they are one of the most significant representatives of the microflora of the human body, playing a multifunctional role in maintaining the homeostasis of the body and are often part of therapeutic and prophylactic drugs (pro and synbiotic).

Для определения биосовместимости был использован тест-штамм Bifidobacterium longum МС-42 (ранее идентифицированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-1987 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №210 в качестве Bifidobacterium adolescentis МС-42; в настоящее время по данным полногеномного секвенирования идентифицирован как Bifidobacterium longum МС-42 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/4263942).To determine the biocompatibility, the test strain Bifidobacterium longum MS-42 was used (previously identified in VKPM FSUE GosNIIgenetika, deposit number TsMPM No. V-1987 and GKNM Federal State Budget Scientific Research Institute named after G.N.Gabrichevsky No. 210 as Bifidobacterium adolescentis MS-42; according to the data of genome sequencing, it is currently identified as Bifidobacterium longum MC-42 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/4263942).

Использование в качестве тест-штамма В. longum МС-42 обусловлено тем, что данный вид бифидобактерий характерен для детей и взрослых и выделяется у 40-60% детей первого года жизни и 70-75% детей старшего возраста и взрослых [Бухарин, О.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 42-49]. Кроме того, известна возможность использования В. longum МС-42 в микробном распознавании чужеродности клинических штаммов микроорганизмов в микросимбиоценозе кишечника человека [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 194-203].Use as a test strain of B. longum MS-42 is due to the fact that this type of bifidobacteria is characteristic of children and adults and stands out in 40-60% of children of the first year of life and 70-75% of older children and adults [Bukharin, O. AT. Bifidoflora in associative human symbiosis / O.V. Bukharin, N.B. Perunova, E.V. Ivanova. - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. S. 42-49]. In addition, it is known that B. longum MS-42 can be used in microbial recognition of the foreignness of clinical microorganism strains in human intestinal microsymbiocenosis [Bukharin, O.V. Microsymbiocenosis / O.V. Bukharin, N.B. Perunova - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. S. 194-203].

Авторами были проведены следующие эксперименты.The authors conducted the following experiments.

Исследуемые культуры бифидобактерий и лактобактерий выращивали в жидкой питательной среде, а тест-штамм В. longum МС-42 - на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO2-инкубаторе (BINDER, Германия).The studied cultures of bifidobacteria and lactobacilli were grown in a liquid nutrient medium, and the test strain B. longum MC-42 was grown in solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator (BINDER, Germany).

Затем из бульонных культур бифидобактерий и лактобактерий получали супернатанты, отделяя надосадок от бактериальных клеток центрифугированием при 3200 об/мин в течение 15 минут и фильтрацией внеклеточной жидкости через мембраны «Millipore» с диаметром пор 0,2 мкм.Then supernatants were obtained from bifidobacteria and lactobacilli broth cultures, separating the supernatant from the bacterial cells by centrifugation at 3200 rpm for 15 minutes and filtering the extracellular fluid through Millipore membranes with a pore diameter of 0.2 μm.

Параллельно из выросшей культуры тест-штамма В. longum МС-42 готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности (1×109 КОЕ/мл, 3 McF).In parallel, from the grown culture of the test strain B. longum MS-42, a one billionth suspension was prepared according to the turbidity standard (1 × 10 9 CFU / ml, 3 McF).

Далее соинкубировали супернатанты исследуемых бифидобактерий и лактобактерий, каждого в отдельности, с взвесью тест-штамма В. longum МС-42 (1×109 КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия).Next, the supernatants of the studied bifidobacteria and lactobacilli were incubated individually, with a suspension of the test strain B. longum MC-42 (1 × 10 9 CFU / ml, 3 McF) in a 1: 2 ratio for 1 hour in a CO 2 incubator ( BINDER, Germany).

Затем центрифугировали все пробы при 3200 об/мин в течение 15 минут, отмывали клетки тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендировали отмытые клетки В. longum МС-42 в питательный бульон и культивировали при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе, центрифугировали полученные пробы и отделяли супернатанты от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры;Then, all samples were centrifuged at 3200 rpm for 15 minutes, the cells of the test strain B. longum MC-42 were washed three times with 0.9% sodium chloride solution, the washed cells of B. longum MC-42 were resuspended in a nutrient broth and cultured at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator, the samples were centrifuged and supernatants were separated from microbial cells by passage through membrane filters;

Определение влияния каждого супернатанта тест-штамма В. longum МС-42 на антилизоцимную активность, ростовые свойства и биопленкообразование исследуемых культур бифидобактерий и лактобактерий проводили путем добавления его в соотношении 1:9 в питательный бульон с взвесью бифидобактерий и лактобактерий (3 McF), с которой проводилось предварительное соинкубирование. В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо супернатанта В. longum МС-42 использовали эквивалентное количество питательного бульона.The effect of each supernatant of the test strain B. longum MS-42 on the antilysocyme activity, growth properties, and biofilm formation of the studied cultures of bifidobacteria and lactobacilli was determined by adding it in a ratio of 1: 9 to the nutrient broth with a suspension of bifidobacteria and lactobacilli (3 McF), with which preliminary coincubation was performed. As a control at each stage of the research, instead of the supernatant of B. longum MS-42, an equivalent amount of nutrient broth was used.

Для определения антилизоцимной активности (АЛА) бактерий использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].To determine the antilysocyme activity (ALA) of bacteria, a known method was used to determine the antilysocyme activity of microorganisms [RF patent 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Согласно известному способу для определения АЛА в качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяли в физиологическом растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. Для изучения влияния супернатанта В. longum МС-42 на АЛА бифидобактерий и лактобактерий, в одномоментно вносилось по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×106 КОЕ/мл и 100 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов статически при 37°С в CO2-инкубаторе (BINDER, Германия). Контрольные и опытные пробы бифидобактерий и лактобактерий отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получали супернатант. Супернатант бифидобактерий и лактобактерий объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37°С. Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистеролловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.According to the known method for the determination of ALA, the daily agar culture of Micrococcus lysodeikticus (strain No. 2665 GISK named after L.A. Tarasevich) was used as a test culture. The culture was dissolved in physiological saline, the optical density (OD) of the test strain was adjusted to 0.300 (0.28-0.32). On 1/15 M phosphate buffer (pH = 6.2), a lysozyme solution with a concentration of 20 μg / ml was prepared. To study the effect of the supernatant of B. longum MS-42 on ALA of bifidobacteria and lactobacilli, 2800 μl of nutrient broth, 100 μl of a suspension of daily agar culture of bifidobacteria and lactobacilli at a concentration of 0.5 × 10 6 CFU / ml and 100 μl of supernatant B were added simultaneously. . longum MS-42 (experiment) or 100 μl of nutrient broth (control). All samples were incubated for 48 hours statically at 37 ° C in a CO 2 incubator (BINDER, Germany). Control and experimental samples of bifidobacteria and lactobacilli were separated from microbial cells by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes and received a supernatant. The supernatant of bifidobacteria and lactobacilli with a volume of 0.9 ml was mixed with 0.1 ml of the prepared lysozyme solution and incubated for 60-120 min at 37 ° C. Then the mixture of supernatant with lysozyme was placed in a polystyrene plate and a suspension of micrococcus was introduced. The optical density was measured after 30 s and 150 s after the introduction of micrococcus into the wells.

Антилизоцимную активность исследуемой культуры рассчитывали по формуле:Antilysocyme activity of the studied culture was calculated by the formula:

Figure 00000002
где
Figure 00000002
Where

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD;A - antilysocyme activity in micrograms of inactivated lysozyme / ml supernatant * units optical density of the broth culture, μg / ml * OD;

V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);V1 is the volume (0.1 ml) of the lysozyme solution at the initial concentration (20 μg / ml);

V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;V2 is the volume (0.9 ml) of the supernatant of the broth culture of the studied strain;

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл);C is the initial concentration of lysozyme (20 μg / ml);

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;

ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D0(30") - D0(150")];ΔD 0 - change in the optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 seconds [D 0 (30 ") - D 0 (150")];

ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [Dк(30") - Dк(150")].ΔDk is the change in the optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 seconds [D to (30 ") - D to (150")].

Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражали в мкг/мл*OD.The antilysocyme activity of the experimental and control samples was expressed in μg / ml * OD.

Для изучения ростовых свойств (PC) исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий выполнялось измерение оптической плотности биомассы культуры. Для этого применялись 96-луночные стерильные плоскодонные планшеты, в лунки которых одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×106 КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) и 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов статически при 37°С в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета репродуктивных свойств бифидобактерий и лактобактерий проводили замер на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 450 нм. Репродуктивные свойства опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности.To study the growth properties (PC) of the studied strains of bifidobacteria and lactobacilli, the optical density of the biomass of the culture was measured. For this purpose, 96-well sterile flat-bottomed plates were used, in the wells of which 100 μl of nutrient broth, 135 μl of a suspension of daily agar culture of bifidobacteria and lactobacilli at a concentration of 0.5 × 10 6 CFU / ml and 15 μl of B. longum supernatant were applied simultaneously 42 (experiment) and 15 μl of nutrient broth (control). All samples were incubated for 48 hours statically at 37 ° C in a CO 2 incubator (BINDER, Germany). To take into account the reproductive properties of bifidobacteria and lactobacilli, measurements were made on a spectrophotometer (BioTek, USA) at a wavelength of 450 nm. Reproductive properties of experimental and control samples were expressed in arbitrary units of optical density.

Проводили изучение биопленкообразования (БПО) исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета [

Figure 00000003
G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;
Figure 00000003
G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×106 КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов при 37°С в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования бифидобактерий и лактобактерий, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП630).We studied the biofilm formation (BPO) of the studied strains of bifidobacteria and lactobacilli by the photometric method according to the intensity of absorption of the dye (crystal violet) by microbial biofilm adhered to the surface of the well of a polystyrene tablet [
Figure 00000003
GA, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;
Figure 00000003
GA, Pratt LA, Watnick PI, Newman DK, Weaver V.V., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. 100 μl of nutrient broth, 135 μl of suspension of daily agar culture of bifidobacteria and lactobacilli at a concentration of 0.5 × 10 6 CFU / ml and 15 μl of B. longum supernatant MS-42 (experiment) or 15 μl of nutrient broth (control). All samples were incubated for 48 hours at 37 ° C in a CO 2 incubator (BINDER, Germany). To take into account biofilm formation after removing planktonic (free-floating) cells of microorganisms by washing the wells three times with distilled water (200 μl) and drying the plates in air (30 min), the formed biofilms were stained by adding 1% crystal-violet solution to the wells (45 min at room temperature) . The free dye was washed by three times treatment of the wells with distilled water, and the dye fixed in biofilms was extracted by adding 200 μl of 96% ethanol to the samples. The staining intensity of the latter, corresponding to the value of the biofilm formation index of bifidobacteria and lactobacilli, was determined on a spectrophotometer (BioTek, USA) at a wavelength of 630 nm. The biofilm formation index of the experimental and control samples was expressed in arbitrary units of optical density (OD 630 ).

Полученные значения АЛА, БПО и PC бифидобактерий и лактобактерий использовали для расчета показателя уровня биосовместимости бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:The obtained values of ALA, BPO and PC of bifidobacteria and lactobacilli were used to calculate the indicator of the level of biocompatibility of bifidobacteria and lactobacilli with the test strain B. longum MS-42 according to the formula:

Figure 00000004
Figure 00000004

где В - показатель уровня биосовместимости, %;where B is an indicator of the level of biocompatibility,%;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП450;RSo - growth properties of strains in the experiment, units OP 450 ;

PCk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП450;PCk - growth properties of the strains in the control, units OP 450 ;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП630;BPOo - biofilm formation of strains in the experiment, units OP 630 ;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП630;BPOk - biofilm formation of strains in the control, units OP 630 ;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*OD;ALAo - antilysocyme activity of the strains in the experiment, μg / ml * OD;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*ODALAk - antilysocyme activity of the strains in the control, μg / ml * OD

Авторами было проведено 72 теста в дублировании, в ходе которых были определены значения показателя уровня биосовместимости культур бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42. Суммированные результаты на основании 3 кратного повторения опытов приведены в таблице 1.The authors conducted 72 duplication tests, during which the values of the indicator of the level of biocompatibility of cultures of bifidobacteria and lactobacilli with the test strain B. longum MS-42 were determined. The summarized results based on 3 repetitions of the experiments are shown in table 1.

Как видно из таблицы 1, у разных исследуемых культур бифидобактерий и лактобактерий уровень биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 определялся как с положительным, так и с отрицательным значением.As can be seen from table 1, in different studied cultures of bifidobacteria and lactobacilli, the level of biocompatibility with the test strain B. longum MC-42 was determined both with a positive and negative value.

Наличие положительного значения показатели уровня биосовместимости свидетельствовало о наличии синергидных взаимодействий между штаммами (синергизм) и их биосовместимости (БС). Синергидные взаимодействия были установлены у В. longum МС-42 с производственными штаммами - В. bifidum №791, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus NK1, L. acidophilus 100 аш и клиническими культурами - В. bifidum 218, В. longum 315, В. adolescentis 189. Данные ассоциации были определены как биосовместимые.The presence of a positive value indicators of the level of biocompatibility indicated the presence of synergistic interactions between strains (synergism) and their biocompatibility (BS). Synergistic interactions were established in B. longum MS-42 with production strains - B. bifidum No. 791, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus NK1, L. acidophilus 100 al and clinical cultures - B. bifidum 218, B. longum 315, B. adolescentis 189. These associations have been identified as biocompatible.

Тогда как, отрицательные значения показателя уровня биосовместимости свидетельствовали о подавляющем влиянии метаболитов тест-штамма В. longum МС-42 на АЛА, PC и БПО культур бифидобактерий и лактобактерий, что означало антагонистические взаимодействия (антагонизм) между микроорганизмами и не позволяло рассматривать данные ассоциации как биосовместимые. Такие ассоциации были установлены у штамма В. longum МС-42 с культурами L. plantarum 8Р-А3 и L. acidophilus К3Ш24, L. plantarum 34.Whereas, negative values of the biocompatibility level indicator testified to the overwhelming effect of metabolites of the test strain B. longum MC-42 on ALA, PC and BPO cultures of bifidobacteria and lactobacilli, which meant antagonistic interactions (antagonism) between microorganisms and did not allow us to consider these associations as biocompatible . Such associations were established in strain B. longum MC-42 with cultures of L. plantarum 8P-A3 and L. acidophilus K3Sh24, L. plantarum 34.

Индифферентное влияние, характеризующееся отсутствием достоверного (р≤0,05) как ингибирующего, так и стимулирующего влияния метаболитов тест-штамма на изучаемые параметры культур бифидобактерий и лактобактерий, свидетельствовало о нейтральных взаимодействиях между культурами и не позволяло рассматривать данные ассоциации как биосовместимые. Наличие отрицательных или положительных значений показателя уровня биосовместимости в данных парах не учитывались. Такие ассоциации были установлены у штамма В. longum МС-42 с культурами В. pseudocatenulatum 138, В. adolescentis 189 и L. acidophilus 15 и считались бионесовместимыми (БНС).The indifferent effect, characterized by the absence of a reliable (p≤0.05) inhibitory and stimulating effect of metabolites of the test strain on the studied parameters of bifidobacteria and lactobacilli cultures, indicated neutral interactions between cultures and did not allow us to consider these associations as biocompatible. The presence of negative or positive values of the indicator of the level of biocompatibility in these pairs were not taken into account. Such associations were established in strain B. longum MC-42 with cultures of B. pseudocatenulatum 138, B. adolescentis 189, and L. acidophilus 15 and were considered biocompatible (BNS).

Далее для определения биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 проводили совместное с ним культивирование в питательном бульоне:Further, to determine the biocompatibility of the studied strains of bifidobacteria and lactobacilli with the test strain B. longum MS-42, a joint cultivation with nutrient broth was carried out with it:

- В. longum МС-42 и В. bifidum №791;- B. longum MS-42 and B. bifidum No. 791;

- В. longum МС-42 и В. bifidum 218;- B. longum MS-42 and B. bifidum 218;

- В. longum МС-42 и L. fermentum 90Т-С4;- B. longum MS-42 and L. fermentum 90T-C4;

- В. longum МС-42 и В. longum 315;- B. longum MS-42 and B. longum 315;

- В. longum МС-42 и L.acidophilus NK 1;- B. longum MS-42 and L. acidophilus NK 1;

- В. longum МС-42 и L.acidophilus 100 аш.- B. longum MS-42 and L. acidophilus 100 ash.

Далее заявляемым способом определяли показатель уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42.Further, by the claimed method, an indicator of the level of biocompatibility of the studied strains of bifidobacteria and lactobacilli with the test strain B. longum MS-42 was determined.

Затем определяли количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) пробиотических и клинических штаммов (специфической активности штаммов).Then determined the number of colony forming units (CFU / ml) of probiotic and clinical strains (specific activity of the strains).

Результаты исследований представлены в таблице 2.The research results are presented in table 2.

В соответствии с требованиями ФСП [Отраслевой стандарт ОСТ 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", 2001, 38 с.] в 1 дозе пробиотического препарата должно содержаться производственных штаммов не менее 109 КОЕ/мл, значение уровня высокой биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 было определено как равное либо больше 50%.In accordance with the requirements of FSP [Industry standard OST 91500.05.001-00 "Standards for the quality of medicines. Fundamentals", 2001, 38 pp.] 1 dose of probiotic preparation must contain production strains of at least 10 9 CFU / ml, the value of the level is high biocompatibility with the test strain B. longum MS-42 was determined to be equal to or greater than 50%.

Как видно из таблиц 2, штаммы В. bifidum №791, В. bifidum 218 и L. fermentum 90Т-С4, имеющие специфическую активность 10×109 КОЕ/мл и выше, характеризовались высоким значением показателя уровня биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 равном либо больше 50% (от 50 до 76%), тогда как КОЕ/мл исследуемых штаммов, имевшим показатель уровня биосовместимости менее 50%, был ниже 10×109 КОЕ/мл и составлял у В. longum 315 - 8,76×108 КОЕ/мл, у L. acidophilus NK 1 - 9,68×107 КОЕ/мл и у L.acidophilus 100 аш - 4,52×106 КОЕ/мл.As can be seen from table 2, strains B. bifidum No. 791, B. bifidum 218 and L. fermentum 90T-C4, having a specific activity of 10 × 10 9 CFU / ml and above, were characterized by a high value of the level of biocompatibility with test strain B. longum MC-42 is equal to or greater than 50% (from 50 to 76%), while CFU / ml of the studied strains, which had a biocompatibility level of less than 50%, was lower than 10 × 10 9 CFU / ml and was B. longum 315 - 8.76 × 10 8 CFU / ml, in L. acidophilus NK 1 - 9.68 × 10 7 CFU / ml and in L. acidophilus 100 al - 4.52 × 10 6 CFU / ml.

Таким образом, проведенные авторами исследования показали, что, развиваясь в ассоциации, в составе микробных консорциумов исследуемые штаммы бифидобактерий и лактобактерий в зависимости от показателя уровня их биосовместимости достигают различного уровня накопления биомассы, т.е. различной численности микробов при совместном культивировании.Thus, the studies carried out by the authors showed that, developing in association, among the microbial consortia, the studied strains of bifidobacteria and lactobacilli, depending on the level of their biocompatibility, reach different levels of biomass accumulation, i.e. different numbers of microbes when co-cultivated.

На следующем этапе экспериментов авторами было установлено, что микроорганизмы, имеющие значение показателя уровня биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 равном либо больше 50%, между собой также имели высокий уровень биосовместимости (табл. 3) и не проявляли антагонистической активности по отношению друг к другу, сохраняя высокую численность (КОЕ/мл) микроорганизмов при совместном культивировании (табл. 4).At the next stage of the experiments, the authors found that microorganisms having a biocompatibility index value with the test strain B. longum MC-42 equal to or greater than 50%, also had a high level of biocompatibility between themselves (Table 3) and did not show antagonistic activity relation to each other, while maintaining a high number (CFU / ml) of microorganisms during co-cultivation (table. 4).

Как видно из таблицы 3, у разных исследуемых культур бифидобактерий и лактобактерий уровень биосовместимости по отношению друг к другу определялся с положительным значением, что свидетельствовало о наличии синергидных взаимодействий между штаммами (синергизм) и их биосовместимости. Значения уровня биосовместимости культур друг к другу составляли от 51 до 61%, что характеризовало высокий уровень биосовместимости микробных культур.As can be seen from table 3, in the different studied cultures of bifidobacteria and lactobacilli, the level of biocompatibility in relation to each other was determined with a positive value, which indicated the presence of synergistic interactions between strains (synergism) and their biocompatibility. The values of the biocompatibility of cultures to each other ranged from 51 to 61%, which characterized a high level of biocompatibility of microbial cultures.

Как видно из таблиц 4 штаммы В. bifidum №791 и L. fermentum 90Т-С4, ранее имеющие высокий показатель уровня биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 (табл. 1), при совместном культивировании также достигали высокой численности 9,2×1010 КОЕ/мл и 9,1×1010 КОЕ/мл, что и отмечалось в микробном консорциуме из трех штаммов (В. bifidum №791, В. bifidum 218 и L. fermentum 90Т-С4), специфическая активность составляла 10×109 КОЕ/мл.As can be seen from table 4, strains of B. bifidum No. 791 and L. fermentum 90T-C4, previously having a high level of biocompatibility with the test strain B. longum MC-42 (table. 1), when co-cultivated also reached a high number of 9, 2 × 10 10 CFU / ml and 9.1 × 10 10 CFU / ml, which was noted in the microbial consortium of three strains (B. bifidum No. 791, B. bifidum 218 and L. fermentum 90T-C4), the specific activity was 10 × 10 9 CFU / ml.

Таким образом, заявляемый способ позволяет определить уровень биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий и использовать полученные данные при получении консорциумов бифидобактерий и/или лактобактерий пробиотического действия, используемых для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.Thus, the claimed method allows to determine the level of biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli and use the data obtained to obtain consortia of bifidobacteria and / or lactobacilli of probiotic action used to obtain starter cultures, probiotic preparations, biologically active additives and food products.

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

1. Выращивают каждый из исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе.1. Each of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli is grown separately in a liquid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator.

2. Бульонные культуры исследуемых штаммов микроорганизмов центрифугируют (3200 об/мин в течение 15 минут), супернатанты отделяют от микробных клеток, пропускают через мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор 0,2 мкм).2. Bouillon cultures of the studied strains of microorganisms are centrifuged (3200 rpm for 15 minutes), supernatants are separated from microbial cells, passed through membrane filters (Millipore, pore diameter 0.2 μm).

3. Параллельно выращивают тест-штамм В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO2-инкубаторе и из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия.3. In parallel, the test strain B. longum MS-42 is grown on a solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator and a one billionth suspension (optical density 3 McF) is prepared from a grown culture in a 0.9% chloride solution sodium.

4. Соинкубируют супернатанты исследуемых бифидобактерий и/или лактобактерий, каждого в отдельности, с одномиллиардной взвесью тест-штамма В. longum МС-42 (1×109 КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия).4. The supernatants of the studied bifidobacteria and / or lactobacilli, each individually, are incubated with a one billionth suspension of the test strain B. longum MC-42 (1 × 10 9 CFU / ml, 3 McF) in a ratio of 1: 2 for 1 hour in CO 2 incubator (BINDER, Germany).

5. После инкубации все пробы центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, клетки тест-штамма В. longum МС-42 трижды отмывают 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендируют в 1,0 мл питательного Schaedler-бульона (BBL, США) и культивируют при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе, после культивирования пробы центрифугируют при 3200 об/мин в течение 15 минут и отделяют супернатанты от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор 0,2 мкм).5. After incubation, all samples are centrifuged, the supernatant is drained, the cells of test strain B. longum MC-42 are washed three times with 0.9% sodium chloride solution, resuspended in 1.0 ml of nutrient Schaedler broth (BBL, USA) and cultured at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator, after cultivation, the samples are centrifuged at 3200 rpm for 15 minutes and supernatants are separated from microbial cells by passage through membrane filters (Millipore, pore diameter 0.2 μm).

6. Параллельно исследуемые штаммы микроорганизмов (каждый исследуемый штамм микроорганизмов в отдельности) выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе и из каждой выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия.6. In parallel, the studied microorganism strains (each studied microorganism strain individually) are grown in solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator, and one billionth suspension (optical density 3 McF) of 0.9 is prepared from each grown culture % solution of sodium chloride.

7. Полученные взвеси исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий смешивают с супернатантами В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8. Причем, супернатант В. longum МС-42 смешивают с взвесью того исследуемого штамма бифидо- и/ лактобактерий с которым ранее был соинкубирован тест-штамм В. longum МС-42 в соответствии с пунктом 4.7. The resulting suspensions of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli are mixed with supernatants of B. longum MS-42 and nutrient broth in a ratio of 1: 1: 8. Moreover, the supernatant of B. longum MC-42 is mixed with a suspension of that test strain of bifidobacteria and / lactobacilli with which the test strain of B. longum MC-42 was previously incubated in accordance with paragraph 4.

8. Готовят контроль. Полученные взвеси исследуемых штаммов микроорганизмов смешивают с питательным бульоном в соотношении 1:9.8. Prepare control. The resulting suspensions of the studied strains of microorganisms are mixed with nutrient broth in a ratio of 1: 9.

9. Опытные и контрольные пробы культивируют при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе.9. Experimental and control samples were cultured at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator.

10. Определяют значения показателя ростовых свойств, антилизоцимной активности и биопленкообразования исследуемых штаммов микроорганизмов опытных и контрольных пробах.10. Determine the values of the indicator of growth properties, antilysocyme activity and biofilm formation of the studied microorganism strains of experimental and control samples.

Для изучения ростовых свойств (PC) исследуемых бифидобактерий и лактобактерий выполняют измерение оптической плотности биомассы культуры. Для этого применяют 96-луночные стерильные плоскодонные планшеты, в лунки которых одномоментно вносят по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×106 КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубируют 48 часов статически при 37°С в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета репродуктивных свойств бифидо- и лактобактерий проводят замер на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 450 нм. Репродуктивные свойства опытных и контрольных проб выражают в условных единицах оптической плотности.To study the growth properties (PC) of the studied bifidobacteria and lactobacilli, the optical density of the biomass of the culture is measured. To do this, use 96-well sterile flat-bottomed plates, in the wells of which simultaneously add 100 μl of nutrient broth, 135 μl of a suspension of daily agar culture of bifidobacteria and lactobacilli at a concentration of 0.5 × 10 6 CFU / ml and 15 μl of supernatant B. longum MC- 42 (experiment) or 15 μl of nutrient broth (control). All samples were incubated for 48 hours statically at 37 ° C in a CO 2 incubator (BINDER, Germany). To take into account the reproductive properties of bifidobacteria and lactobacilli, they are measured on a spectrophotometer (BioTek, USA) at a wavelength of 450 nm. Reproductive properties of experimental and control samples are expressed in arbitrary units of optical density.

Для определения антилизоцимной активности (АЛА) используют известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].To determine the antilysocyme activity (ALA), a known method is used to determine the antilysocyme activity of microorganisms [RF patent 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Согласно известному способу для определения АЛА в качестве тест-культуры используют суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяют в физиологическом растворе, доводят оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовят раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. В одномоментно вносят по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×106 КОЕ/мл и 100 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубируют 48 часов статически при 37°С в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия). Контрольные и опытные пробы отделяют от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получают супернатант. Супернатант бифидобактерий и лактобактерий объемом 0,9 мл смешивают с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубируют 60-120 мин при 37°С.According to the known method for determining ALA as a test culture using the daily agar culture of Micrococcus lysodeikticus (strain No. 2665 GISK them. L.A. Tarasevich). The culture is dissolved in physiological saline, the optical density (OD) of the test strain is adjusted to 0.300 (0.28-0.32). On 1/15 M phosphate buffer (pH = 6.2), a lysozyme solution with a concentration of 20 μg / ml is prepared. 2800 μl of nutrient broth, 100 μl of a suspension of daily agar culture of bifidobacteria and lactobacilli at a concentration of 0.5 × 10 6 CFU / ml and 100 μl of B. longum supernatant MC-42 (experiment) or 100 μl of nutrient broth (control) are added simultaneously. . All samples were incubated for 48 hours statically at 37 ° C in a CO 2 incubator (BINDER, Germany). Control and experimental samples are separated from microbial cells by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes and receive a supernatant. The supernatant of bifidobacteria and lactobacilli with a volume of 0.9 ml is mixed with 0.1 ml of the prepared lysozyme solution and incubated for 60-120 min at 37 ° C.

Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистероловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.Then the mixture of supernatant with lysozyme was placed in a polystyrene plate and a suspension of micrococcus was introduced. The optical density was measured after 30 s and 150 s after the introduction of micrococcus into the wells.

Антилизоцимную активность исследуемой культуры рассчитывают по формуле:The antilysocyme activity of the studied culture is calculated by the formula:

Figure 00000005
где
Figure 00000005
Where

A - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD;A - antilysocyme activity in micrograms of inactivated lysozyme / ml supernatant * units optical density of the broth culture, μg / ml * OD;

V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);V1 is the volume (0.1 ml) of the lysozyme solution at the initial concentration (20 μg / ml);

V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;V2 is the volume (0.9 ml) of the supernatant of the broth culture of the studied strain;

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл).C is the initial concentration of lysozyme (20 μg / ml).

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;

ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D0(30") - D0(150")];ΔD 0 - change in the optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 seconds [D 0 (30 ") - D 0 (150")];

ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [Dк(30") - Dк(150")].ΔD k is the change in optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 seconds [D to (30 ") - D to (150")].

Определение биопленкообразования проводят с использованием фотометрического метода по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета [

Figure 00000003
G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;
Figure 00000003
G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×106 КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов при 37°С в CO2-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания» последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования бифидобактерий и лактобактерий, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП630).The determination of biofilm formation is carried out using the photometric method according to the intensity of absorption of the dye (crystal-violet) by a microbial biofilm adhered to the surface of the well of a polystyrene tablet [
Figure 00000003
GA, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;
Figure 00000003
GA, Pratt LA, Watnick PI, Newman DK, Weaver V.V., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. 100 μl of nutrient broth, 135 μl of suspension of daily agar culture of bifidobacteria and lactobacilli at a concentration of 0.5 × 10 6 CFU / ml and 15 μl of B. longum supernatant MS-42 (experiment) or were simultaneously added to the wells of 96-well sterile flat-bottomed plates. 15 μl of nutrient broth (control). All samples were incubated for 48 hours at 37 ° C in a CO 2 incubator (BINDER, Germany). To take into account biofilm formation after removing planktonic (free-floating) cells of microorganisms by washing the wells three times with distilled water (200 μl) and drying the plates in air (30 min), the formed biofilms were stained by adding 1% crystal-violet solution to the wells (45 min at room temperature) . The free dye was washed by three times treatment of the wells with distilled water, and the dye fixed in biofilms was extracted by adding 200 μl of 96% ethanol to the samples. The staining intensity of the latter, corresponding to the value of the biofilm formation index of bifidobacteria and lactobacilli, was determined on a spectrophotometer (BioTek, USA) at a wavelength of 630 nm. The biofilm formation index of the experimental and control samples was expressed in arbitrary units of optical density (OD 630 ).

12. Рассчитывают показатель уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42:12. Calculate the indicator of the level of biocompatibility of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli with the test strain B. longum MS-42:

Figure 00000006
Figure 00000006

где В - показатель уровня биосовместимости, %;where B is an indicator of the level of biocompatibility,%;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП450;RSo - growth properties of strains in the experiment, units OP 450 ;

PCk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП450;PCk - growth properties of the strains in the control, units OP 450 ;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП630;BPOo - biofilm formation of strains in the experiment, units OP 630 ;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП630;BPOk - biofilm formation of strains in the control, units OP 630 ;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*OD;ALAo - antilysocyme activity of the strains in the experiment, μg / ml * OD;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*OD,ALAk - antilysocyme activity of the strains in the control, μg / ml * OD,

при этом при значении уровня биосовместимости равном либо больше 50% биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой.while with a biocompatibility level equal to or greater than 50%, the biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli is considered high.

Примеры конкретного выполнения способа.Examples of specific performance of the method.

Пример 1.Example 1

Определяли уровень биосовместимости штамма В. bifidum 791 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-3300 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №80) по отношению к тест-штамму В. longum МС-42 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-1987 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №210).The level of biocompatibility of strain B. bifidum 791 was determined (VKPM FSUE GosNIIgenetika, deposit number TsMPM No. B-3300 and GKNM FSBI MNIIEM named after GN Gabrichevsky No. 80) with respect to the test strain B. longum MS-42 (VKPM FSUE GosNIIgenetika , deposit number TsMPM No. V-1987 and SCNM FBUN MNIIEM named after G.N. Gabrichevsky No. 210).

Исследуемый штамм В. bifidum 791 выращивали в жидком питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO2-инкубаторе (BINDER, Германия).The studied strain B. bifidum 791 was grown in a liquid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator (BINDER, Germany).

Из бульонной культуры штамма В. bifidum 791 получали супернатант, отделяя надосадок от бактериальных клеток центрифугированием при 3200 об/мин в 15 минут и фильтрацией внеклеточной жидкости через мембраны «Millipore» с диаметром пор 0,2 мкм.A supernatant was obtained from the broth culture of strain B. bifidum 791, separating the supernatant from the bacterial cells by centrifugation at 3200 rpm for 15 minutes and filtering the extracellular fluid through Millipore membranes with a pore diameter of 0.2 μm.

Параллельно выращивали тест-штамм В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе (BINDER, Германия) и из выросшей культуры готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности 3 McF (1×109 КОЕ/мл) на 0,9% растворе хлорида натрия.At the same time, the test strain B. longum MC-42 was grown on solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator (BINDER, Germany) and a one billionth suspension was prepared from the grown culture according to the 3 McF turbidity standard (1 × 10 9 CFU / ml) in a 0.9% sodium chloride solution.

Супернатант штамма В. bifidum 791 соинкубировали с взвесью тест-штамма В. longum МС-42 (1×109 КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в CO2-инкубаторе (BINDER, Германия).The supernatant of strain B. bifidum 791 was incubated with a suspension of test strain B. longum MC-42 (1 × 10 9 CFU / ml, 3 McF) in a 1: 2 ratio for 1 hour in a CO 2 incubator (BINDER, Germany).

Затем центрифугировали при 3200 об/мин в течение 15 минут, отмывали клетки тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендировали отмытые клетки В. longum МС-42 в питательном бульоне и культивировали при 37°С в течение 48 часов в CO2-инкубаторе, опять центрифугировали и отделяли супернатант от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры.Then centrifuged at 3200 rpm for 15 minutes, washed the cells of the test strain B. longum MC-42 three times with 0.9% sodium chloride solution, the washed cells of B. longum MC-42 were resuspended in a nutrient broth and cultured at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator, again centrifuged and the supernatant was separated from microbial cells by passing through membrane filters.

Параллельно выращивали исследуемый штамм В. bifidum 791 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе и готовили из выросшей культуры одномиллиардную взвесь (1×109 КОЕ/мл, 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия.In parallel, the studied B. bifidum 791 strain was grown on a solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator and one billionth suspension (1 × 10 9 CFU / ml, 3 McF) was prepared from the grown culture in a 0.9% solution sodium chloride.

Готовили опытную пробу путем смешивания полученной взвеси исследуемого штамма В. bifidum 791 с супернатантом тест-штама В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8.An experimental sample was prepared by mixing the obtained suspension of the studied strain of B. bifidum 791 with the supernatant of the test strain B. longum MC-42 and nutrient broth in a ratio of 1: 1: 8.

Параллельно готовили контроль из одномиллиардной взвеси исследуемого штамма В. bifidum 791 с питательным бульоном в соотношении 1:9.In parallel, a control was prepared from a one billionth suspension of the studied strain of B. bifidum 791 with nutrient broth in a ratio of 1: 9.

Опытную и контрольную пробу культивировали при 37°С в течение 48 часов в СО2-инкубаторе.The experimental and control samples were cultured at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator.

Определяли значения показателя ростовых свойств штамма В. bifidum 791 в опытной и контрольной пробе.The values of the growth characteristic of the strain B. bifidum 791 in the experimental and control samples were determined.

Ростовые свойства штамма В. bifidum 791 оценивали по оптической плотности бульонной культуры штамма В. bifidum 791 в 96-луночных стерильных плоскодонных планшетах и выражали в условных единицах оптической плотности, замер проводили на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 450 нм.The growth properties of strain B. bifidum 791 were evaluated by the optical density of the broth culture of strain B. bifidum 791 in 96-well sterile flat-bottomed plates and expressed in arbitrary units of optical density, measurements were performed on a spectrophotometer (BioTek, United States) at a wavelength of 450 nm.

Значения показателя ростовых свойств штамма В. bifidum 791 составили в контроле 0,6 ед. ОП450, в опыте - 0,8 ед. ОП450.The values of the growth characteristics of the strain B. bifidum 791 amounted to 0.6 units in the control. OD 450 , in the experiment - 0.8 units. OP 450 .

Определяли значение показателя антилизоцимной активности штамма В. bifidum 791 в опытной и контрольной пробах.The value of the indicator of antilysocyme activity of strain B. bifidum 791 in the experimental and control samples was determined.

Для определения антилизоцимной активности (АЛА) использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].To determine the antilysocyme activity (ALA) used the known method for determining the antilysocyme activity of microorganisms [RF patent 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры в опыте и контроле по формуле:The antilysocyme activity of the studied culture was calculated in the experiment and control according to the formula:

Figure 00000007
где
Figure 00000007
Where

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD;A - antilysocyme activity in micrograms of inactivated lysozyme / ml supernatant * units optical density of the broth culture, μg / ml * OD;

V1 - объем раствора лизоцима исходной концентрации;V1 is the volume of lysozyme solution in the initial concentration;

V2 - супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;V2 - supernatant of the broth culture of the studied strain;

С - исходная концентрация лизоцима;C is the initial concentration of lysozyme;

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;

ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд;ΔD 0 - change in the optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 seconds;

ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд;ΔD k is the change in optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 seconds;

Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражают в мкг/мл*OD.The antilysocyme activity of the experimental and control samples is expressed in μg / ml * OD.

Рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры в контроле.The antilysocyme activity of the studied culture in the control was calculated.

Figure 00000008
Figure 00000008

А - 0,71 мкг/мл*OD;A 0.71 μg / ml * OD;

V1 - 0,1 мл;V1 - 0.1 ml;

V2 - 0,9 мл;V2 - 0.9 ml;

С - 20 мкг/мл;C - 20 μg / ml;

Y - 0,41;Y 0.41;

ΔD0 - 0,312;ΔD 0 - 0.312;

ΔDk - 0,360.ΔDk - 0.360.

Рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры в опыте.The antilysocyme activity of the studied culture was calculated in the experiment.

Figure 00000009
Figure 00000009

А - 1,8 мкг/мл*OD;A - 1.8 μg / ml * OD;

V1 - 0,1 мл;V1 - 0.1 ml;

V2 - 0,9 мл,;V2 - 0.9 ml;

С - 20 мкг/мл;C - 20 μg / ml;

Y - 0,41;Y 0.41;

ΔD0 - 0,245;ΔD 0 - 0.245;

ΔDk - 0,365;ΔDk - 0.365;

Значения показателя антилизоцимной активности штамма В. bifidum 791, составили в контроле 0,71 мкг/мл*OD, в опыте - 1,8 мкг/мл*OD.The values of the antilysocyme activity index of strain B. bifidum 791 were 0.71 μg / ml * OD in the control and 1.8 μg / ml * OD in the experiment.

Определяли значения показателя биопленкообразования штамма В. bifidum 791 в опытной и контрольной пробах.The biofilm formation index of B. bifidum 791 strain was determined in the experimental and control samples.

Определение биопленкообразования штамма В. bifidum 791 проводили с использованием фотометрического метода [

Figure 00000003
G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;
Figure 00000003
G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм и выражали в условных единицах оптической плотности.The determination of biofilm formation of strain B. bifidum 791 was carried out using the photometric method [
Figure 00000003
GA, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;
Figure 00000003
GA, Pratt LA, Watnick PI, Newman DK, Weaver V.V., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. The optical density was determined on a spectrophotometer (BioTek, USA) at a wavelength of 630 nm and expressed in arbitrary optical density units.

Значения показателя биопленкообразования штамма В. bifidum 791, составили в контроле 0,6 ед. ОП630, в опыте - 0,85 ед. ОП630.The values of the biofilm formation index of strain B. bifidum 791 amounted to 0.6 units in the control. OD 630 , in the experiment - 0.85 units. OP 630 .

Полученные значения показателей ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности использовали для расчета показателя уровня биосовместимости исследуемого штамма В. bifidum 791 с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:The obtained values of the indicators of growth properties, biofilm formation and antilysocyme activity were used to calculate the indicator of the level of biocompatibility of the studied strain B. bifidum 791 with the test strain B. longum MS-42 according to the formula:

Figure 00000010
Figure 00000010

где В - показатель уровня биосовместимости, %;where B is an indicator of the level of biocompatibility,%;

РСо - 0,8 ед. ОП450, ростовые свойства штамма в опыте, ед. ОП450;RSo - 0.8 units. OP450, growth properties of the strain in the experiment, units OP 450 ;

PCk - 0,6 ед. ОП450, ростовые свойства штамма в контроле, ед. ОП450;PCk - 0.6 units OP450, growth properties of the strain in the control, units OP 450 ;

БПОо - 0,85 ед.ОП630, биопленкообразование штамма в опыте, ед. ОП630;BPOo - 0.85 units of OP630, biofilm formation of the strain in the experiment, units OP 630 ;

БПОk - 0, 6 ед.ОП630, биопленкообразование штамма в контроле, ед. ОП630;BPOk - 0.6 units of OP630, biofilm formation of the strain in the control, unit OP 630 ;

АЛАо - 1,8 мкг/мл*OD, антилизоцимная активность штамма в опыте, мкг/мл*OD;ALAo - 1.8 μg / ml * OD, antilysocyte activity of the strain in the experiment, μg / ml * OD;

АЛАk - 0, 71 мкг/мл*OD, антилизоцимная активность штамма в контроле, мкг/мл*ODALAk - 0, 71 μg / ml * OD, antilysocyme activity of the strain in the control, μg / ml * OD

Figure 00000011
Figure 00000011

Значение показателя уровня биосовместимости культуры В. bifidum №791 с тест-штаммом В. longum МС-42 равно 76% и согласно заявляемому способу означает высокую биосовместимость штаммов бифидобактерий В. bifidum №791 и В. longum МС-42, что позволяет использовать данные штаммы для получения консорциума штаммов бифидобактерий с высоким уровнем биосовместимости с целью создания пробиотического продукта или препарата.The value of the level of biocompatibility of the culture of B. bifidum No. 791 with the test strain B. longum MC-42 is 76% and according to the claimed method means high biocompatibility of strains of bifidobacteria B. bifidum No. 791 and B. longum MC-42, which allows the use of these strains to obtain a consortium of strains of bifidobacteria with a high level of biocompatibility in order to create a probiotic product or drug.

Для подтверждения высокой биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий было проведено совместное культивирование штаммов В. bifidum №791 и В. longum МС-42 в питательном бульоне с последующим определением численности выросших микроорганизмов - колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Установлено, что численность В. bifidum №791 составляла 14,1×1011 КОЕ/мл и В. longum МС-42 15,2×1011 КОЕ/мл., т.е. исследуемые штаммы не проявляли антагонистической активности по отношению друг к другу, сохраняя высокую численность (КОЕ/мл) микроорганизмов при совместном культивировании.To confirm the high biocompatibility of the studied strains of bifidobacteria, the B. bifidum No. 791 and B. longum MC-42 strains were co-cultured in nutrient broth with subsequent determination of the number of microorganisms grown - colony forming units per milliliter (CFU / ml). It was established that the abundance of B. bifidum No. 791 was 14.1 × 10 11 CFU / ml and B. longum MS-42 15.2 × 10 11 CFU / ml, i.e. the studied strains did not exhibit antagonistic activity in relation to each other, while maintaining a high number (CFU / ml) of microorganisms during co-cultivation.

Пример 2.Example 2

Определяли уровень биосовместимости лактобактерий L. fermentum 90Т-С4 (ГКПМ, №900812) и бифидобактерий В. bifidum 791 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-3300 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №80) согласно заявленному способу аналогично примеру 1.The level of biocompatibility of L. lactobacilli L. fermentum 90T-C4 (GKPM, No. 900812) and bifidobacteria B. bifidum 791 (VKPM FSUE GosNIIgenetika, deposit number TsMPM No. B-3300 and GKNM Federal State Budget Scientific Research Institute named after G.N. the method analogously to example 1.

Были получены следующие количественные значения:The following quantitative values were obtained:

- показатели ростовых свойств штамма L. fermentum 90Т-С4 составили в контроле 0,7 ед. ОП450, в опыте - 1,2 ед. ОП450; показатели биопленкообразования штамма L. fermentum 90Т-С4 составили в контроле 0,54 ед. ОП630, в опыте - 0,92 ед. ОП630; показатели антилизоцимной активности L. fermentum 90Т-С4 составили в контроле 0,9 мкг/мл*OD, в опыте - 1,1 мкг/мл*OD.- indicators of growth properties of the strain L. fermentum 90T-C4 in the control amounted to 0.7 units OD 450 , in the experiment - 1.2 units. OP 450 ; the biofilm formation of the strain L. fermentum 90T-C4 amounted to 0.54 units in the control. OD 630 , in the experiment - 0.92 units. OP 630 ; indicators of antilysocyme activity of L. fermentum 90T-C4 in the control amounted to 0.9 μg / ml * OD, in the experiment - 1.1 μg / ml * OD.

- показатели ростовых свойств штамма В. bifidum 791 составили в контроле 0,6 ед. ОП450, в опыте - 0,8 ед. ОП450; показатели биопленкообразования штамма В. bifidum 791, составили в контроле 0,6 ед. ОП630, в опыте -0,85 ед. ОП630; показатели антилизоцимной активности штамма В. bifidum 791 составили в контроле 0,71 мкг/мл*OD, в опыте - 1,8 мкг/мл*OD.- indicators of growth properties of strain B. bifidum 791 amounted to 0.6 units in the control. OD 450 , in the experiment - 0.8 units. OP 450 ; indicators of biofilm formation of strain B. bifidum 791, amounted to 0.6 units in the control OD 630 , in the experiment -0.85 units. OP 630 ; indicators of the antilysocyme activity of strain B. bifidum 791 were 0.71 μg / ml * OD in the control, and 1.8 μg / ml * OD in the experiment.

Полученные значения показателей ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности использовали для расчета показателя уровня биосовместимости исследуемого штамма L. fermentum 90Т-С4 со штаммом В. longum МС-42 и исследуемого штамма В. bifidum 791 со штаммом В. longum МС-42 согласно заявляемому изобретению по формуле аналогично примеру 1.The obtained values of the indicators of growth properties, biofilm formation and antilysocyme activity were used to calculate the level of biocompatibility of the studied strain L. fermentum 90T-C4 with strain B. longum MC-42 and the studied strain B. bifidum 791 with strain B. longum MC-42 according to the invention according to the formula analogously to example 1.

Показатель уровня биосовместимости культуры L. fermentum 90Т-С4 с тест-штаммом В. longum МС-42 составил 54%, что свидетельствовало о наличии высокой биосовместимости штаммов лактобактерий L. fermentum 90Т-C4 и В. longum МС-42.The level of biocompatibility of the culture of L. fermentum 90T-C4 with the test strain B. longum MC-42 was 54%, which indicated the presence of high biocompatibility of strains of lactobacilli L. fermentum 90T-C4 and B. longum MC-42.

Показатель уровня биосовместимости культуры В. bifidum №791 с тест-штаммом В. longum МС-42 составил 76%, что свидетельствовало о наличии высокой биосовместимости штаммов бифидобактерий В. bifidum №791 и В. longum МС-42.The level of biocompatibility of the culture of B. bifidum No. 791 with the test strain B. longum MC-42 was 76%, which indicated the presence of high biocompatibility of strains of bifidobacteria B. bifidum No. 791 and B. longum MC-42.

Для подтверждения высокой биосовместимости исследуемых штаммов L. fermentum 90Т-С4 и В. bifidum №791 между собой было проведено их совместное культивирование в питательном бульоне с последующим определением численности выросших микроорганизмов - колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Установлено, что численность В. bifidum №791 составляет 9,2×1010 КОЕ/мл и L. fermentum 90Т-С4 - 9,1×1010 КОЕ/мл., т.е. исследуемые штаммы не проявляли антагонистической активности по отношению друг к другу, сохраняя высокую численность (КОЕ/мл) микроорганизмов при совместном культивировании.To confirm the high biocompatibility of the studied strains of L. fermentum 90T-C4 and B. bifidum No. 791, they were jointly cultured in nutrient broth with subsequent determination of the number of grown microorganisms — colony forming units per milliliter (CFU / ml). It was established that the abundance of B. bifidum No. 791 is 9.2 × 10 10 CFU / ml and L. fermentum 90T-C4 is 9.1 × 10 10 CFU / ml, i.e. the studied strains did not exhibit antagonistic activity in relation to each other, while maintaining a high number (CFU / ml) of microorganisms during co-cultivation.

Пример 3.Example 3

Для создания консорциума лактобактерий Lactobacillus acidophilus 100аш (L. acidophilus 100 аш) (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ №В-3190) и Lactobacillus acidophilus NK1 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ №В-8957 (В центральной лаборатории ВНИМИ №22/10)) определяли показатель уровня биосовместимости штаммов лактобактерий согласно заявленному способу. Определяли показатель уровня биосовместимости аналогично примеру 1.To create a consortium of lactobacilli Lactobacillus acidophilus 100 ash (L. acidophilus 100 ash) (VKPM FSUE GosNIIgenetika, VKPM No. V-3190) and Lactobacillus acidophilus NK1 (VKPM FSUE GosNIIgenetika, VKPM No. V / 8NII 22) of the central laboratory determined the indicator of the level of biocompatibility of strains of lactobacilli according to the claimed method. The indicator of the level of biocompatibility was determined analogously to example 1.

Были получены следующие количественные значения:The following quantitative values were obtained:

- ростовые свойства штамма L. acidophilus 100аш составили в контроле 0,96 ед. ОП450, в опыте - 1,1 ед. ОП450; биопленкообразование L. acidophilus 100аш в контроле - 0,89 ед. ОП630, в опыте - 1,2 ед. ОП630; антилизоцимная активность L. acidophilus 100аш в контроле - 1,3 мкг/мл*OD, в опыте - 1,3 мкг/мл*OD.- the growth properties of the strain L. acidophilus 100ash amounted to 0.96 units in the control. OP 450 , in the experiment - 1.1 units. OP 450 ; biofilm formation of L. acidophilus 100ash in the control - 0.89 units. OD 630 , in the experiment - 1.2 units. OP 630 ; antilysocyme activity of L. acidophilus 100ash in the control - 1.3 μg / ml * OD, in the experiment - 1.3 μg / ml * OD.

- ростовые свойства штамма L. acidophilus NK1 составили в контроле 1,0 ед. ОП450, в опыте - 1,3 ед. ОП450; биопленкообразование L. acidophilus NK1 в контроле - 0,32 ед. ОП630, в опыте - 0,46 ед. ОП630; антилизоцимная активность L. acidophilus NK1 в контроле - 1,1 мкг/мл*OD, в опыте - 1,3 мкг/мл*OD.- the growth properties of the strain L. acidophilus NK1 amounted to 1.0 in the control. OD 450 , in the experiment - 1.3 units. OP 450 ; biofilm formation of L. acidophilus NK1 in the control - 0.32 units OP 630 , in the experiment - 0.46 units. OP 630 ; antilysocyme activity of L. acidophilus NK1 in the control - 1.1 μg / ml * OD, in the experiment - 1.3 μg / ml * OD.

Полученные значения показателей ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности использовали для расчета показателя уровня биосовместимости исследуемого штамма L. acidophilus 100аш со штаммом В. longum МС-42 и исследуемого штамма L. acidophilus NK1 со штаммом В. longum МС-42 согласно заявляемому изобретению по формуле аналогично примеру 1.The obtained values of the indicators of growth properties, biofilm formation and antilysocyme activity were used to calculate the level of biocompatibility of the studied L. acidophilus 100ash strain with the B. longum strain MC-42 and the studied L. acidophilus NK1 strain with the B. longum strain MC-42 according to the claimed invention according to the formula analogously to example 1.

В результате показатель уровня биосовместимости культуры L. acidophilus 100аш с тест-штаммом В. longum МС-42 составлял 25%, что свидетельствовало об отсутствии высокой биосовместимости L. acidophilus 100аш и В. longum МС-42.As a result, the indicator of the level of biocompatibility of the culture of L. acidophilus 100ash with the test strain B. longum MC-42 was 25%, which indicated the absence of high biocompatibility of L. acidophilus 100ash and B. longum MC-42.

Показатель уровня биосовместимости культуры L. acidophilus NK1 с тест-штаммом В. longum МС-42 составил 33%, что свидетельствовало об отсутствии высокой биосовместимости штаммов лактобактерий L. acidophilus NK1 и В. longum МС-42.The level of biocompatibility of the culture of L. acidophilus NK1 with the test strain B. longum MC-42 was 33%, which indicated the absence of high biocompatibility of strains of lactobacilli L. acidophilus NK1 and B. longum MC-42.

Для подтверждения отсутствия высокой биосовместимости исследуемых штаммов L. acidophilus 100аш и L. acidophilus NK1 между собой было проведено их совместное культивирование в питательном бульоне с последующим определением численности выросших микроорганизмов - колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Установлено, что численность L. acidophilus 100аш составляет 3,3×105 КОЕ/мл и L. acidophilus NK1 - 6,81×106 КОЕ/мл, низкая численность микроорганизмов говорит о том, что исследуемые штаммы проявляли антагонистическую активность по отношению друг к другу при совместном культивировании.To confirm the absence of high biocompatibility of the studied L. acidophilus 100ash and L. acidophilus NK1 strains with each other, they were jointly cultured in nutrient broth with subsequent determination of the number of microorganisms grown - colony forming units per milliliter (CFU / ml). It was established that the number of L. acidophilus 100ash is 3.3 × 10 5 CFU / ml and L. acidophilus NK1 - 6.81 × 10 6 CFU / ml, the low number of microorganisms suggests that the studied strains showed antagonistic activity against each other to a friend during co-cultivation.

Claims (21)

Способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий, включающий следующие этапы:A method for determining the level of biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli, comprising the following steps: - выращивание каждого из исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 ч в СО2-инкубаторе;- growing each of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli separately in a liquid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator; - центрифугирование полученных бульонных культур при 3200 об/мин в течение 15 мин и отделение супернатантов от микробных клеток путем пропускания через мембранные фильтры;- centrifugation of the resulting broth cultures at 3200 rpm for 15 minutes and the separation of supernatants from microbial cells by passing through membrane filters; - выращивание тест-штамма В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 ч в СO2-инкубаторе и приготовление из выросшей культуры одномиллиардной взвеси с оптической плотностью 3 МсF на 0,9% растворе хлорида натрия;- growing test strain B. longum MS-42 in a solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator and preparing from the grown culture a one billionth suspension with an optical density of 3 McF in a 0.9% sodium chloride solution; - соинкубирование супернатантов исследуемых штаммов, каждого в отдельности, с одномиллиардной взвесью тест-штамма В. longum МС-42 в соотношении 1:2 в течение 1 ч в СO2-инкубаторе;- co-incubation of the supernatants of the studied strains, each individually, with a one billionth suspension of the test strain B. longum MS-42 in a ratio of 1: 2 for 1 h in a CO 2 incubator; - центрифугирование всех проб при 3200 об/мин в течение 15 мин, отмывание клеток тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендирование отмытых клеток В. longum МС-42 в питательном бульоне и культивирование при 37°С в течение 48 ч в СО2-инкубаторе, центрифугирование полученных проб и отделение супернатантов от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры;- centrifugation of all samples at 3200 rpm for 15 min, washing the cells of the test strain B. longum MC-42 three times with 0.9% sodium chloride solution, resuspending the washed cells of B. longum MC-42 in a nutrient broth and culturing at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator, centrifuging the samples and separating supernatants from microbial cells by passing through membrane filters; - выращивание каждого исследуемого штамма микроорганизмов в отдельности на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 ч в СО2-инкубаторе и приготовление из каждой выросшей культуры одномиллиардной взвеси с оптической плотностью 3 МсF на 0,9% растворе хлорида натрия;- growing each studied strain of microorganisms separately on a solid nutrient medium at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator and preparing from each grown culture a one billionth suspension with an optical density of 3 MsF in a 0.9% sodium chloride solution; - приготовление опытных проб путем смешивания полученных взвесей исследуемых штаммов с супернатантами В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8, причем проводят смешивание супернатанта В. longum МС-42 соответственно с взвесью того исследуемого штамма, с которым ранее он был соинкубирован;- preparation of experimental samples by mixing the obtained suspensions of the studied strains with supernatants of B. longum MS-42 and nutrient broth in a ratio of 1: 1: 8, moreover, the supernatant of B. longum MS-42 is mixed with a suspension of the studied strain with which it was previously was incubated; - приготовление контроля из полученных взвесей исследуемых штаммов микроорганизмов с питательным бульоном в соотношении 1:9;- preparation of control from the obtained suspensions of the studied strains of microorganisms with nutrient broth in a ratio of 1: 9; - культивирование опытных и контрольных проб при 37°С в течение 48 ч в СО2-инкубаторе;- cultivation of experimental and control samples at 37 ° C for 48 hours in a CO 2 incubator; - определение значения показателя ростовых свойств, антилизоцимной активности и биопленкообразования исследуемых штаммов в опытных и контрольных пробах;- determination of the value of the indicator of growth properties, antilysocyme activity and biofilm formation of the studied strains in experimental and control samples; - расчет показателя уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:- calculation of the indicator of the level of biocompatibility of the studied strains of bifidobacteria and / or lactobacilli with the test strain B. longum MS-42 according to the formula:
Figure 00000012
Figure 00000012
 где В - показатель уровня биосовместимости, %;where B is an indicator of the level of biocompatibility,%; РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП450;RSo - growth properties of strains in the experiment, units OP 450 ; РСk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП450;PCk — growth properties of strains in the control, units OP 450 ; БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП630;BPOo - biofilm formation of strains in the experiment, units OP 630 ; БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП630;BPOk - biofilm formation of strains in the control, units OP 630 ; АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*ОП450;ALAo - antilysocyme activity of the strains in the experiment, μg / ml * OD 450 ; АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*ОП450,ALAk - antilysocyme activity of the strains in the control, μg / ml * OD 450 , при этом при значении показателя уровня биосовместимости, равном либо больше 50%, биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой.in this case, when the value of the indicator of the level of biocompatibility equal to or more than 50%, the biocompatibility of strains of bifidobacteria and / or lactobacilli is considered high.
RU2018116821A 2018-05-04 2018-05-04 Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains RU2676910C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018116821A RU2676910C1 (en) 2018-05-04 2018-05-04 Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018116821A RU2676910C1 (en) 2018-05-04 2018-05-04 Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2676910C1 true RU2676910C1 (en) 2019-01-11

Family

ID=65025022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018116821A RU2676910C1 (en) 2018-05-04 2018-05-04 Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2676910C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2806579C2 (en) * 2023-04-11 2023-11-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук Method for selecting indigenous strains of human intestinal bifidobacteria for their inclusion in probiotic preparations

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2428468C1 (en) * 2010-06-03 2011-09-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Method of individual selection of probiotic preparations containing lactic acid bacilli and/or bifidus bacteria for elimination of opportunistic pathogens recovered from patient examined for intestinal dysbacteriosis
RU2491336C1 (en) * 2012-05-14 2013-08-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Bifidobacterial and lactobacillary consortium for preparing bacterial preparations and dietary supplements for correcting gastrointestinal microflora in individuals of fourteen and older, and method for preparing it, dietary supplement for correcting gastrointestinal microflora in individuals of fourteen and older and bacterial preparation for treating dysbiotic gastrointestinal conditions in individuals of fourteen and older

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2428468C1 (en) * 2010-06-03 2011-09-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Method of individual selection of probiotic preparations containing lactic acid bacilli and/or bifidus bacteria for elimination of opportunistic pathogens recovered from patient examined for intestinal dysbacteriosis
RU2491336C1 (en) * 2012-05-14 2013-08-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Bifidobacterial and lactobacillary consortium for preparing bacterial preparations and dietary supplements for correcting gastrointestinal microflora in individuals of fourteen and older, and method for preparing it, dietary supplement for correcting gastrointestinal microflora in individuals of fourteen and older and bacterial preparation for treating dysbiotic gastrointestinal conditions in individuals of fourteen and older

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
СЕМЕНОВ А.В. "Характеристика отношений между пробиотическими и автохтонными микроорганизмами и алгоритм индивидуального подбора пробиотиков".//Казанский медицинский журнал, 2011, т. 92, N 6, с. 792-795. *
СОЛОВЬЕВА И.В. и др. "Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus".//Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2010, N 2, с. 462-468. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2806579C2 (en) * 2023-04-11 2023-11-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук Method for selecting indigenous strains of human intestinal bifidobacteria for their inclusion in probiotic preparations

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Margalho et al. Biopreservation and probiotic potential of a large set of lactic acid bacteria isolated from Brazilian artisanal cheeses: From screening to in product approach
WO2018218694A1 (en) Bifidobacterium longum having cephalosporin resistance and high expression of sir2 protein, and application thereof
RU2460778C1 (en) Method for producing autoprobiotic of enterocuccus faecium being representative of indigenic host intestinal microflora
CN113234612A (en) Lactobacillus fermentum ZS40 having preventive effect on colitis
Kesen et al. Beneficial characteristics and evaluation criteria of probiotics
Zárate et al. Assessing survival of dairy propionibacteria in gastrointestinal conditions and adherence to intestinal epithelia
TW201540307A (en) Anti-glycosylation agent, life-extending agent and anti-aging agent
CN111088181B (en) Bifidobacterium breve strain BK55 and application thereof in inhibiting clostridium difficile
RU2676910C1 (en) Method for determining level of biocompatability of bifid bacteria and/or lactic bacteria strains
RU2546253C2 (en) Method of obtaining personified autoprobiotic product and method of treating syndrome of irritable bowl with thereof application
Pato et al. Bile and acid tolerance of lactic acid bacteria isolated from tempoyak and their probiotic potential.
CN113913334B (en) Enterococcus faecalis EF-ZA1107-06 and application thereof
RU2506308C1 (en) CONSORTIUM OF PROBIOTIC STRAINS OF Lactobacillus rhamnosus AND Lactobacillus plantarum FOR PRODUCING BACTERIAL PREPARATION AND DIRECT ADMINISTRATION FERMENT FOR PRODUCING FERMENTED MILK AND FERMENTED BEET JUICE
RU2500411C2 (en) Method for individual selection of preparations containing probiotic lactic bacterial strains for effective intravaginal therapy
Sukumar et al. Study of the probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from a variety of Indian fermented food
Ilyazova et al. In vitro simulation of the gastrointestinal tract environment and its interaction with probiotic lactobacilli
Singh et al. Determination of the bioactive potential (Antioxidant activity) of camel milk during fermentation process
TWI600758B (en) Immunnomodulatory Lactobacillus plantarum and use thereof
RU2805505C2 (en) Consortium of strains of bifidobacteria used for preparation of bifid-containing products
WO2007023912A1 (en) Bifidobacterium having effect of inhibiting the adhesion of pathogenic microbes to cells, processed product thereof and food and medicinal composition containing the same
IT201800005355A1 (en) Lactobacillus amylovorus SGL 14: probiotic activity and reduction of enteric oxalate
Acharya et al. Isolation and characterization of probiotics bacteria from curd, pickle and fermented rice and screening of antimicrobial activity
Basavaraju et al. Identification and characterization of probiotics from new sources
RU2553513C2 (en) Method of obtaining bifidogenic factor
Ruiz-Ramírez et al. Probiotic and functional potential of lactic acid bacteria isolated from pulque and evaluation of their safety for food applications