RU2674032C1 - Method for producing urokinase entrapped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material - Google Patents
Method for producing urokinase entrapped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material Download PDFInfo
- Publication number
- RU2674032C1 RU2674032C1 RU2018120809A RU2018120809A RU2674032C1 RU 2674032 C1 RU2674032 C1 RU 2674032C1 RU 2018120809 A RU2018120809 A RU 2018120809A RU 2018120809 A RU2018120809 A RU 2018120809A RU 2674032 C1 RU2674032 C1 RU 2674032C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- urokinase
- nanocomposite material
- ratio
- colloidal
- minutes
- Prior art date
Links
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000002069 magnetite nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 22
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 21
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 claims description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 abstract description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 13
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 11
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 11
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 8
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 5
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 230000005520 electrodynamics Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 2
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108010060457 neutrophil basic proteins Proteins 0.000 description 2
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000011860 particles by size Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001350 scanning transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- CYTCTRAEJYIZRX-UHFFFAOYSA-N (9a-hydroxy-3,5a-dimethyl-9-methylidene-2-oxo-3,3a,4,5,6,7,8,9b-octahydrobenzo[g][1]benzofuran-6-yl) acetate Chemical compound C1CC2(C)C(OC(C)=O)CCC(=C)C2(O)C2C1C(C)C(=O)O2 CYTCTRAEJYIZRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000011173 biocomposite Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002065 inelastic X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000012155 injection solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WSSMOXHYUFMBLS-UHFFFAOYSA-L iron dichloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Fe+2] WSSMOXHYUFMBLS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 238000000593 microemulsion method Methods 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229910001172 neodymium magnet Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 231100000456 subacute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
- B82B3/0095—Manufacture or treatments or nanostructures not provided for in groups B82B3/0009 - B82B3/009
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области неорганической химии и биомедицины, а именно к способу получения урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал, и может быть использовано в медицине для топической терапии тромботических состояний конечностей (тромбоза).The invention relates to the field of inorganic chemistry and biomedicine, and in particular to a method for producing urokinase, entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material, and can be used in medicine for topical treatment of thrombotic conditions of limbs (thrombosis).
Тромбоз относится к образованию тромба внутри сосудистой системы. Образование тромба является нормальным ответом на кровотечение и помогает поддерживать гемостаз. Тромбоз может привести к сниженному кровотоку в критических органах, таких как головной мозг (инсульт), легкие (эмболия легких) и миокард (инфаркт миокарда). Венозный тромбоз, который происходит в основном в глубоких венах ног, часто приводит к эмболии легких, когда часть тромба перемещается посредством циркуляции к легким. Атеротромбоз или тромбы, которые образуются в артериях, приводят к острому коронарному синдрому, ишемическому инсульту и ишемии конечностей. Образование тромбов включает несколько последовательных стадий, которые, как правило, начинаются после повреждения кожи или сосудистого повреждения. Циркулирующие тромбоциты в первую очередь прилипают к очагу поврежденных эндотелиальных клеток, и происходит серия событий, которая приводит к активации этих тромбоцитов. Активированные тромбоциты затем вовлекают дополнительные тромбоциты в очаг повреждения, где они агрегируют для образования пробки, до тех пор, пока не образуется стабильный сгусток. Неактивные факторы свертывания, которые всегда присутствуют и циркулируют в кровотоке, затем последовательно активируются в процессе, известном как система свертывания. Система свертывания, в конечном счете, приводит к образованию стабильного фибрин-содержащего тромба. Тромботические нарушения являются группой наследственных и приобретенных нарушений, которые вызывают аномальную активацию гемостатической системы, приводя к повышенному риску венозного и артериального тромбоза.Thrombosis refers to the formation of a thrombus inside the vascular system. A blood clot is a normal response to bleeding and helps maintain hemostasis. Thrombosis can lead to decreased blood flow in critical organs such as the brain (stroke), lungs (lung embolism), and myocardium (myocardial infarction). Venous thrombosis, which occurs mainly in the deep veins of the legs, often leads to pulmonary embolism, when part of the blood clot moves through circulation to the lungs. Aterothrombosis or blood clots that form in the arteries lead to acute coronary syndrome, ischemic stroke and limb ischemia. The formation of blood clots includes several successive stages, which usually begin after skin damage or vascular damage. Circulating platelets primarily adhere to the site of damaged endothelial cells, and a series of events occurs that leads to the activation of these platelets. The activated platelets then draw additional platelets into the lesion, where they aggregate to form a cork, until a stable clot forms. Inactive coagulation factors, which are always present and circulate in the bloodstream, are then sequentially activated in a process known as the coagulation system. The coagulation system ultimately leads to the formation of a stable fibrin-containing thrombus. Thrombotic disorders are a group of hereditary and acquired disorders that cause abnormal activation of the hemostatic system, leading to an increased risk of venous and arterial thrombosis.
Известны суперпарамагнитные наночастицы (US 5928958 А1), к которым прикрепляют органические вещества, имеющие сайты связывания для тканеспецифических соединений, диагностических или фармакологически активных веществ, в том числе урокиназы. В описанном техническом решении органическое вещество прикрепляют к магнитной матрице снаружи. Прикрепление производится с помощью стабилизирующих и связующих агентов, в роли которых выступают производные желатина и фосфорной кислоты. Наличие дополнительных компонентов снижает массовую долю магнитных частиц и ухудшает их магнитные свойства.Known superparamagnetic nanoparticles (US 5928958 A1), to which are attached organic substances having binding sites for tissue-specific compounds, diagnostic or pharmacologically active substances, including urokinase. In the described technical solution, the organic substance is attached to the magnetic matrix from the outside. Attachment is carried out using stabilizing and binding agents, which are derivatives of gelatin and phosphoric acid. The presence of additional components reduces the mass fraction of magnetic particles and degrades their magnetic properties.
Известны нанокомпозиты (KR 100862973 В1), включающие магнитные наночастицы, фармацевтически активный ингредиент, поверхностно-активные вещества, анионоактивный полимерный слой, который окружает магнитные наночастицы и катионный полимерный слой, окружающий анионный полимерный слой. Данные нанокомпозиты так же используются для адресной доставки лекарственных средств и фармацевтически активных соединений, в качестве одного из которых указана урокиназа. Диаметр магнитного нанокомпозита составляет от 5 нм до 200 нм. Метод синтеза заключается в следующем: наночастицы магнетита получают высокотемпературным разложением прекуссоров в органических растворителях. Затем на поверхности наночастиц формируют полимерные покрытия на основе поли (гексодицилцианоацетата) методом микроэмульсии. В дальнейшем в полученные наноконтейнеры возможна загрузка лекарственных средств, в том числе урокиназы, путем нековалентного взаимодействия. Недостатками данного подхода являются наличие дополнительных компонентов, которое снижает массовую долю магнитных частиц и ухудшает магнитные свойства. Поликатионная оболочка содержит соединения, потенциально обладающие токсическим действием, что также может служить существенным препятствием для использования в качестве потенциального лекарственного препарата.Nanocomposites (KR 100862973 B1) are known, including magnetic nanoparticles, a pharmaceutically active ingredient, surfactants, an anionic polymer layer that surrounds magnetic nanoparticles and a cationic polymer layer surrounding an anionic polymer layer. These nanocomposites are also used for targeted delivery of drugs and pharmaceutically active compounds, one of which is urokinase. The diameter of the magnetic nanocomposite is from 5 nm to 200 nm. The synthesis method is as follows: magnetite nanoparticles are obtained by high-temperature decomposition of precursors in organic solvents. Then, polymer coatings are formed on the surface of the nanoparticles based on poly (hexodicylcyanoacetate) by the microemulsion method. Further, in the obtained nanocontainers, it is possible to load drugs, including urokinase, by non-covalent interaction. The disadvantages of this approach are the presence of additional components, which reduces the mass fraction of magnetic particles and degrades the magnetic properties. The polycationic shell contains compounds that are potentially toxic, which can also serve as a significant obstacle to use as a potential drug.
Известен «Синтез магнитных наночастиц оксида железа» (US №9597672 В2). Наночастицы магнита синтезируют путем совместного соосаждения Fe2+ и Fe3+ в щелочных условиях в атмосфере азота при 25°С (М25) или 90°С (М90). Кислотный раствор (10 мл) солей железа (2,5 г FeCl2,4H2O и 5 г FeCl3, 6H2O) добавляют по каплям к NaOH (11 мл, 15 М) при постоянном перемешивании. Неокисляющие условия достигают путем барботирования всех растворов азотом в течение 15 минут до реакции. Для мгновенного осаждения Fe3O4 захватывают неодимовым магнитом, затем соединение промывают и нейтрализуют и затем хранят в дистиллированной воде до дальнейшего использования. Недостатком данного метода является низкая коллоидная стабильность получаемых наночастиц, в результате чего наблюдается их седиментация и агрегация в течение короткого промежутка времени, что требует введения дополнительных стадий диспергирования и фракционирования наночастиц непосредственно перед получением биокомпозитов.The well-known "Synthesis of magnetic nanoparticles of iron oxide" (US No. 9597672 B2). Magnet nanoparticles are synthesized by co-precipitation of Fe2 + and Fe3 + under alkaline conditions in a nitrogen atmosphere at 25 ° C (M25) or 90 ° C (M90). An acid solution (10 ml) of iron salts (2.5 g of FeCl2.4H2O and 5 g of FeCl3, 6H2O) was added dropwise to NaOH (11 ml, 15 M) with constant stirring. Non-oxidizing conditions are achieved by sparging all the solutions with nitrogen for 15 minutes before the reaction. For instant precipitation, Fe3O4 is captured with a neodymium magnet, then the compound is washed and neutralized and then stored in distilled water until further use. The disadvantage of this method is the low colloidal stability of the resulting nanoparticles, resulting in their sedimentation and aggregation over a short period of time, which requires the introduction of additional stages of dispersion and fractionation of the nanoparticles immediately before obtaining biocomposites.
Решается задача получения эффективного и безопасного лекарственного средства для топической терапии тромботических состояний конечностей.The problem of obtaining an effective and safe drug for the topical treatment of thrombotic conditions of limbs is being solved.
Сущность заключается в том, что способ получения урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал включает получение стабильного гидрозоля наночастиц магнетита путем соосаждения водного раствора смеси хлоридов железа (II) и (III) при соотношении 1,5:1-2.2:1 25% водным раствором аммиака в диапазоне не менее 8 мольных эквивалентов до образования осадка из агрегированных наночастиц магнетита, который отделяют при помощи магнитного поля, после чего надосадочную жидкость декантируют, а осадок промывают деионизированной водой до нейтрального значения уровня рН промывных вод и добавляют денонсированную воду, затем подвергают УЗ-облучению мощность, которого 1 Вт/см3 и выше в течение 75-120 минут, полученный стабильный гидрозоль наночастиц магнетита инкубируют с водным раствором гепарина в соотношении 1:15 в течение 60 минут до формирования стабильного коллоидного раствора, и осуществляют энтрапирование фермента урокиназы в соотношении 10:1 (коллоидный раствор : урокиназа) в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал в течение 60 минут.The essence lies in the fact that the method of producing urokinase entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material involves obtaining a stable hydrosol of magnetite nanoparticles by coprecipitation of an aqueous solution of a mixture of iron (II) and (III) chlorides in a ratio of 1.5: 1-2.2: 1 25% aqueous ammonia in the range of at least 8 molar equivalents until a precipitate forms from aggregated magnetite nanoparticles, which is separated by a magnetic field, after which the supernatant is decanted and the precipitate is washed with deion ized water to neutral pH of the washing water level and water was added denounce, then subjected to ultrasonic irradiation power is 1 W / cm 3 or higher within 75-120 minutes, the resulting stable hydrosol magnetite nanoparticles are incubated with an aqueous solution of heparin in the ratio of 1: 15 for 60 minutes until a stable colloidal solution is formed, and the urokinase enzyme is entraped in a ratio of 10: 1 (colloidal solution: urokinase) into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material for 60 minutes t
Заявляемый способ создания магнитного керамического композита, с энтрапированной урокиназой, обладает эффективным действием, показанным в экспериментах на животных, а также позволяет получить безопасное лекарственное средство, что также показано в доклинических исследованиях (исследована острая, подострая токсичность, а также специфические виды токсичности).The inventive method of creating a magnetic ceramic composite, with entrained urokinase, has the effective effect shown in animal experiments, and also allows you to get a safe drug, which is also shown in preclinical studies (studied acute, subacute toxicity, as well as specific types of toxicity).
Сущность предлагаемого способа поясняется фиг. 1 - фиг. 11.The essence of the proposed method is illustrated in FIG. 1 - FIG. eleven.
На фиг. 1 показано получение тромболитического нанокомпозита методом энтрапирования (прямого захвата) урокиназы в стабильный гидрозоль наночастиц магнетита. Для этого на перовой стадии методом УЗ-ассистируемого синтеза получают стабильный гидрозоль наночастиц магнетита (1) при нейтральных значениях уровня рН и без посторонних примесей. После этого на поверхность наночастиц дополнительно наносят биосовместимое покрытие из кислого серосодержащего гликозаминогликана природного происхождения для увеличения биодоступности материала и увеличению его стабильности в условии организма, получая наночастицы магнетита с модифицированной поверхностью (2), после чего производят контролируемую соконденсацию магнитных наночастиц с ферментом урокиназа, в результате чего происходит формирование нанопористой керамической матрицы, внутри которой находится фермент.In FIG. Figure 1 shows the preparation of a thrombolytic nanocomposite by entraping (direct capture) of urokinase into a stable hydrosol of magnetite nanoparticles. To do this, at the first stage, a stable hydrosol of magnetite nanoparticles (1) is obtained by ultrasonic assisted synthesis at neutral pH levels and without impurities. After that, a biocompatible coating of acidic sulfur-containing glycosaminoglycan of natural origin is additionally applied to the surface of the nanoparticles to increase the bioavailability of the material and increase its stability in the body condition, obtaining magnetite nanoparticles with a modified surface (2), after which controlled co-condensation of the magnetic nanoparticles with the urokinase enzyme is carried out, as a result of which the formation of a nanoporous ceramic matrix occurs, within which the enzyme is located.
Схема синтеза урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал (3), включающая три основных этапа:The synthesis scheme of urokinase entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material (3), which includes three main stages:
I. Получение стабильного гидрозоля наночастиц магнетитаI. Obtaining a stable hydrosol of magnetite nanoparticles
II. Создание биосовместимого покрытия на поверхности наночастиц магнетита из кислого серосодержащего гликозаминогликана природного происхожденияII. Creating a biocompatible coating on the surface of magnetite nanoparticles from acidic sulfur-containing glycosaminoglycan of natural origin
III. Получение керамического нанокомпозитного материала путем энтрапирования урокиназы в матрицу из магнетитаIII. Obtaining a ceramic nanocomposite material by entraping urokinase into a magnetite matrix
I. Получение стабильного гидрозоля наночастиц магнетита.I. Obtaining a stable hydrosol of magnetite nanoparticles.
Цель - разработка оптимальных условий синтеза промежуточного продукта (1) - стабильного гидрозоля наночастиц магнетита. Принципиальная схема синтеза приведена на фиг. 2. Водный раствор смеси хлоридов железа(II) и (III) соосаждали 25% водным раствором аммиака, при этом образовывался осадок из агрегированных наночастиц магнетита. Материал отделяют при помощи магнитного поля, надосадочную жидкость декантируют и промывают осадок деионизированной водой до нейтрального значения уровня рН промывных вод, после чего добавляют деионизированную воду и подвергают УЗ-облучению и получают стабильный гидрозоль.The goal is to develop optimal conditions for the synthesis of intermediate product (1) - a stable hydrosol of magnetite nanoparticles. A schematic diagram of the synthesis is shown in FIG. 2. An aqueous solution of a mixture of iron (II) and (III) chlorides was precipitated with 25% aqueous ammonia, and a precipitate formed from aggregated magnetite nanoparticles. The material is separated using a magnetic field, the supernatant is decanted and the precipitate is washed with deionized water to a neutral pH of the washings, after which deionized water is added and subjected to ultrasonic irradiation and a stable hydrosol is obtained.
Для оптимизации процесса получения исследовали влияние следующих параметров: (стехиометрическое соотношение реагентов, температура проведения реакции, время проведения реакции, растворитель, мощность ультразвукового излучения, время ультразвуковой обработки).To optimize the production process, the influence of the following parameters was studied: (stoichiometric ratio of reagents, reaction temperature, reaction time, solvent, ultrasonic radiation power, ultrasonic treatment time).
Систему оценивают по следующим параметрам: кристаллическая фаза получаемого материала, размер получаемых частиц, дзета-потенциал получаемых частиц, стабильность получаемых частиц, выход реакции, степень конверсии реагентов, образующиеся примеси.The system is evaluated by the following parameters: the crystalline phase of the obtained material, the size of the obtained particles, the zeta potential of the obtained particles, the stability of the obtained particles, the reaction yield, the degree of conversion of the reactants, and the resulting impurities.
При исследовании влияния стехиометрических соотношений компонентов меняли соотношение хлорид железа(II): хлорид железа(III) в диапазоне 1:1-3:1. Методами ИК-спектроскопии, рентгеновской порошковой дифракцией и рамановской спектрометрией выявлено, что при соотношениях компонентов менее 1.4:1 кристалическая фаза получаемого материала не соответствует маггемиту. Наночастицы с кристалической фазой магнетита получаются только при соотношении 1.5:1-2.2:1. Варьирование количества добавляемого водного аммиака в диапазоне 5-10 мольных эквивалентов показало, что добавление менее 7 мольных эквивалентов водного аммиака приводит к снижению степени конверсии до 85%, при добавлении 8 эквивалентов и выше происходит 100% конверсия исходных реагентов.When studying the influence of stoichiometric ratios of components, the ratio of iron (II) chloride: iron (III) chloride was changed in the range of 1: 1-3: 1. Using IR spectroscopy, X-ray powder diffraction, and Raman spectrometry, it was found that for component ratios less than 1.4: 1, the crystalline phase of the resulting material does not correspond to maghemite. Nanoparticles with a crystalline phase of magnetite are obtained only at a ratio of 1.5: 1-2.2: 1. Varying the amount of added aqueous ammonia in the range of 5-10 molar equivalents showed that the addition of less than 7 molar equivalents of aqueous ammonia reduces the conversion to 85%, with the addition of 8 equivalents or more, 100% conversion of the starting reagents occurs.
На фиг. 3 и фиг. 4 представлены рамановские спектры и РФА спектры полупродуктов (1), получаемые при различном соотношении компонентов.In FIG. 3 and FIG. Figure 4 shows the Raman spectra and the XRD spectra of intermediates (1) obtained at different ratios of components.
Варьирование температуры в диапазоне 10°С-80°С выявило следующие закономерности: согласно методам рентгеновской порошковой дифракции, методу определения распределения частиц по размеру лазерной дифракцией света, сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии увеличение температуры реакции приводит к увеличению скорости реакции и увеличению размера наночастиц. При температурах ниже 25°С получаются частицы меньше 10 нм, которые плохо поддаются дальнейшим манипуляциям и не пригодны для дальнейшей работы. При температуре выше 25°С получаются частицы крупнее 10 нм, которые не могут быть переведены в стабильный гидрозоль магнетита.Varying the temperature in the range of 10 ° С-80 ° С revealed the following regularities: according to the methods of X-ray powder diffraction, the method of determining the particle size distribution by laser light diffraction, scanning electron microscopy, and transmission electron microscopy, an increase in the reaction temperature leads to an increase in the reaction rate and an increase in the size of nanoparticles . At temperatures below 25 ° C, particles less than 10 nm are obtained, which are poorly amenable to further manipulations and are not suitable for further work. At temperatures above 25 ° C, particles larger than 10 nm are obtained, which cannot be converted into a stable magnetite hydrosol.
На фиг. 5 представлен гидродинамический диаметр полупродуктов (1), полученный при различной температуре:In FIG. 5 shows the hydrodynamic diameter of the intermediates (1) obtained at different temperatures:
а) гидродинамический диаметр полупродукта (1), полученного при температуре менее 25°С;a) the hydrodynamic diameter of the intermediate (1) obtained at a temperature of less than 25 ° C;
б) гидродинамический диаметр полупродукта (1), полученного при температуре 25°С;b) the hydrodynamic diameter of the intermediate (1) obtained at a temperature of 25 ° C;
в) гидродинамический диаметр полупродукта (1), полученного при температуре 30°С.c) the hydrodynamic diameter of the intermediate (1) obtained at a temperature of 30 ° C.
Варьирование времени проведения реакции в диапазоне 1-10 минут выявило следующие закономерности: согласно методам рентгеновской порошковой дифракции, методу определения распределения частиц по размеру лазерной дифракцией света, сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии время реакции менее 5 минут приводит к уменьшению размеров частиц менее 10 нм, снижает дзета-потенциал получаемых частиц меньше 20 мВ и препятствует получению стабильного гидрозоля магнетита. Увеличение времени реакции более 10 минут приводит к росту размеров наночастиц и образованию стабильных агрегатов, которые не могут быть разрушены в дальнейшем методом УЗ-обработки, что снижает итоговый выход наночастиц.Varying the reaction time in the range of 1-10 minutes revealed the following patterns: according to X-ray powder diffraction methods, a method for determining the size distribution of particles by laser light diffraction, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy, the reaction time of less than 5 minutes leads to a decrease in particle size of less than 10 nm , reduces the zeta potential of the resulting particles less than 20 mV and prevents the production of a stable hydrosol of magnetite. An increase in the reaction time of more than 10 minutes leads to an increase in the size of the nanoparticles and the formation of stable aggregates that cannot be destroyed further by ultrasonic treatment, which reduces the final yield of nanoparticles.
Варьирование мощности УЗ-обработки в диапазоне 0,5-2 Вт/см3 показало следующие закономерности: согласно методу определения распределения частиц по размеру лазерной дифракции света, методу электрокинетического рассеяния света и методу определения распределения частиц по размеру лазерной дифракции света применение УЗ-излучения с мощностью менее 1 Вт/см3 увеличивает необходимое время облучения, и приводит к меньшей седиментационной стойкости. Дзета-потенциал частиц оказывается слишком мал и максимум достигает +25 мВ, что является слишком малым значением для обеспечения стабильности системы, что приводит к агрегации частиц и делает невозможным проведения дальнейших стадий синтеза. Применение УЗ-излучения мощностью 1 Вт/см3 и выше приводит к росту дзета-потенциала до +33 мВ, что увеличивает седиментационную устойчивость полупродукта (1). Увеличение мощности излучения не приводит к улучшению параметров системы, таких как дзета-потенциал, и увеличивает издержки на производство.Varying the power of ultrasonic treatment in the range of 0.5-2 W / cm 3 showed the following patterns: according to the method of determining the distribution of particles by size of laser light diffraction, the method of electrokinetic light scattering and the method of determining the distribution of particles by size of laser light diffraction, the use of ultrasound radiation with less than 1 W / cm 3 increases the required exposure time, and leads to less sedimentation stability. The zeta potential of the particles is too small and the maximum reaches +25 mV, which is too small to ensure the stability of the system, which leads to aggregation of particles and makes it impossible to carry out further stages of the synthesis. The use of ultrasonic radiation with a power of 1 W / cm 3 and higher leads to an increase in the zeta potential up to +33 mV, which increases the sedimentation stability of the intermediate (1). An increase in radiation power does not lead to an improvement in system parameters, such as the zeta potential, and increases production costs.
Варьирование времени УЗ-обработки в диапазоне 15-135 мин показало следующие закономерности: согласно методу определения распределения частиц по размеру лазерной дифракцией света, методу электрокинетического рассеяния света и методу определения распределения частиц по размеру лазерной дифракцией света УЗ облучение способствует уменьшению гидродинамического диаметра наночастиц и увеличению дзета-потенциала. При времени УЗ обработки менее 75 минут значение дзета-потенциала не достигает порогового значения +30 мВ, что приводит к плохой седиментационной стойкости полупродукта и делает невозможным дальнейшие стадии синтеза. При облучении в течение 75 минут и более величина дзета потенциала становится больше порогового значения, при этом достигает максимального значения при времени обработки 120 минут. Дальнейшее облучение не приводит к изменению параметров системы.Varying the time of ultrasonic treatment in the range of 15-135 min showed the following patterns: according to the method of determining the distribution of particle size by laser light diffraction, the method of electrokinetic light scattering and the method of determining the distribution of particle size by laser diffraction of light, ultrasonic irradiation helps to reduce the hydrodynamic diameter of nanoparticles and increase the zeta potential. When the ultrasound treatment time is less than 75 minutes, the zeta potential does not reach the threshold value of +30 mV, which leads to poor sedimentation stability of the intermediate and makes further synthesis steps impossible. When irradiated for 75 minutes or more, the zeta potential becomes larger than the threshold value, while reaching a maximum value at a processing time of 120 minutes. Further irradiation does not lead to a change in the parameters of the system.
На фиг. 6 представлена зависимость параметров полупродукта (1) от времени УЗ-обработки:In FIG. Figure 6 shows the dependence of the parameters of the intermediate product (1) on the time of ultrasonic treatment:
а) влияние длительности УЗ-обработки на гидродинамический диаметр наночастиц;a) the influence of the duration of ultrasonic treatment on the hydrodynamic diameter of nanoparticles;
б) влияние длительности УЗ-обработки на дзета-потенциал наночастиц.b) the effect of the duration of ultrasonic treatment on the zeta potential of nanoparticles.
Таким образом, суммарный выход целевого продукта по этой схеме составляет более 95% (фиг. 2). Разработанная методика и физико-химические характеристики промежуточного соединения (1) представлены в Лабораторном регламенте получения лекарственного средства. Используя оптимизированные условия синтеза можно получать полупродукт стабильный гидрозоль магнетита в количестве 800 мл/сутки. Потери при этом составляют 5% или 0.8 г наночастиц в пересчете на сухое вещество. При производстве производится 4 л отходов 2 класса опасности (раствор аммиака)Thus, the total yield of the target product according to this scheme is more than 95% (Fig. 2). The developed methodology and physicochemical characteristics of the intermediate compound (1) are presented in the Laboratory Regulation for the Preparation of the Medicinal Product. Using optimized synthesis conditions, it is possible to obtain an intermediate product stable magnetosol hydrosol in an amount of 800 ml / day. Losses in this case amount to 5% or 0.8 g of nanoparticles in terms of dry matter. During production, 4 l of waste of hazard class 2 (ammonia solution) is produced.
II. Получение стабильного гидрозоля наночастиц магнетита, покрытых оболочкой гепарина.II. Obtaining a stable hydrosol of magnetite nanoparticles coated with a heparin membrane.
Цель второго этапа синтеза - разработка препаративного метода получения промежуточного продукта - стабильного гидрозоля наночастиц магнетита, покрытых оболочкой гепарина (фиг. 7). Стабильный гидрозоль наночастиц магнетита инкубировали с водным раствором гепарина, что приводило к сорбции слоя гепарина на поверхности наночастиц магнетита.The purpose of the second stage of the synthesis is to develop a preparative method for the preparation of an intermediate product — a stable hydrosol of magnetite nanoparticles coated with a heparin membrane (Fig. 7). A stable hydrosol of magnetite nanoparticles was incubated with an aqueous solution of heparin, which led to the sorption of a heparin layer on the surface of magnetite nanoparticles.
Оптимизацию схемы синтеза проводили, варьируя соотношение компонентов и время протекания реакции.The synthesis scheme was optimized by varying the ratio of components and the reaction time.
Систему оценивали по следующим параметрам: размер получаемых частиц, дзета-потенциал получаемых частиц, стабильность получаемых частиц, выход реакции, степень конверсии реагентов, образующиеся примеси.The system was evaluated by the following parameters: size of the obtained particles, zeta potential of the obtained particles, stability of the obtained particles, reaction yield, degree of conversion of reagents, impurities formed.
Варьирование стехиометрического соотношения компонентов проводили в диапазоне соотношений наночастицы магнетита : гепарин 100:1-1:1. Методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), определением распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света и методом электродинамического рассеяния света были выявлены следующие закономерности: увеличение количества гепарина в системе приводит к уменьшению дзета-потенциала системы и перезарядке поверхности наночастиц. При соотношении компонентов в диапазоне 100:1-3:1 происходит изменение дзета-потенциала от +33 мВ до -20 мВ и уменьшение седиментационной стабильности наночастиц, что выражается в росте гидродинамического диаметра. При соотношении компонентов 2:1 или 1:1 значение дзета-потенциала достигает значений -40 м, при этом гидродинамический диметр равняется 41 нм. Однако при соотношении компонентов 1:1 по данным ВЭЖХ наблюдается пик, соответствующий свободному гепарину, означающий, что гепарин в реакционной смеси находится в избытке. На фиг. 8 и фиг. 9 представлена зависимость параметров полупродукта (2) от соотношения компонентов.The stoichiometric ratio of the components was varied in the range of magnetite: heparin nanoparticle ratios 100: 1-1: 1. By the methods of high performance liquid chromatography (HPLC), determination of the particle size distribution by laser light diffraction, and electrodynamic light scattering, the following regularities were revealed: an increase in the amount of heparin in the system leads to a decrease in the zeta potential of the system and recharging of the surface of the nanoparticles. When the ratio of the components is in the range of 100: 1-3: 1, the zeta potential changes from +33 mV to -20 mV and the sedimentation stability of the nanoparticles decreases, which is reflected in an increase in the hydrodynamic diameter. When the ratio of the components is 2: 1 or 1: 1, the value of the zeta potential reaches values of -40 m, while the hydrodynamic diameter is 41 nm. However, at a 1: 1 ratio of components according to HPLC, a peak corresponding to free heparin is observed, meaning that there is an excess of heparin in the reaction mixture. In FIG. 8 and FIG. Figure 9 shows the dependence of the parameters of the intermediate product (2) on the ratio of components.
Варьирование времени проведения реакции проводили в диапазоне 10-90 минут. Контролируя процесс методами ВЭЖХ, определением распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света и методом электродиамического рассеяния света были выявлены следующие закономерности: увеличение времени реакции способствует более полному протеканию реакции и формированию стабильного коллоидного раствора. Во время протекания процесса гидродинамический диаметр частиц возрастает с 30 нм до 41 нм, дзета-потенциал изменяется с +33 мВ до -40 мВ, на хроматограмме исчезает пик, соответствующий гепарину. Оптимальным было найдено время 60 минут, после которого не происходит изменения параметров системы.Varying the reaction time was carried out in the range of 10-90 minutes. Controlling the process by HPLC, determining the particle size distribution by laser light diffraction and electrodynamic light scattering revealed the following patterns: an increase in the reaction time promotes a more complete reaction and the formation of a stable colloidal solution. During the process, the hydrodynamic diameter of the particles increases from 30 nm to 41 nm, the zeta potential changes from +33 mV to -40 mV, the peak corresponding to heparin disappears in the chromatogram. The optimum time was found to be 60 minutes, after which there is no change in the system parameters.
Таким образом, суммарный выход целевого полупродукта (2) по этой схеме составляет 100% (фиг. 7).Thus, the total yield of the target intermediate (2) according to this scheme is 100% (Fig. 7).
Используя оптимизированные условия проведения процесса можно получать полупродукт стабильный гидрозоль магнетита покрытый слоем гепарина в количестве 480 мл/сутки, что соответствует 9,6 гр/сутки, при этом не образуется побочных продуктов и отходов.Using optimized process conditions, it is possible to obtain a semi-product of a stable magnetite hydrosol coated with a layer of heparin in an amount of 480 ml / day, which corresponds to 9.6 g / day, while no by-products and waste are formed.
III. Получение урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материалIII. Obtaining urokinase entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material
Цель третьего этапа синтеза - разработка препаративного метода получения урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал (3). Полученный на предыдущей стадии стабильный гидрозоль наночастиц магнетита, покрытых оболочкой гепарина (2) использовали для энтрапирования фермента урокиназы, получая целевой продукт урокиназу, энтрапированную в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал (3) (фиг. 10).The purpose of the third stage of the synthesis is the development of a preparative method for the production of urokinase entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material (3). The stable hydrosol obtained in the previous stage of magnetoside nanoparticles coated with a heparin shell (2) was used to entrap the urokinase enzyme to obtain the target urokinase product entrapped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material (3) (Fig. 10).
Оптимизацию схемы синтеза проводили, варьируя соотношение компонентов, время протекания реакции, способ конденсации.The synthesis scheme was optimized by varying the ratio of components, the reaction time, and the condensation method.
Систему оценивали по следующим параметрам: размер получаемых частиц, дзета-потенциал получаемых частиц, стабильность получаемых частиц, выход реакции, степень конверсии реагентов, образующиеся примеси.The system was evaluated by the following parameters: size of the obtained particles, zeta potential of the obtained particles, stability of the obtained particles, reaction yield, degree of conversion of reagents, impurities formed.
Варьирование соотношения компонентов в реакционной смеси полупродукт (2) : урокиназа проводили в диапазоне соотношений 20:1-1:1.Variation in the ratio of components in the reaction mixture intermediate (2): urokinase was carried out in the range of ratios 20: 1-1: 1.
Оценка параметров системы методами ВЭЖХ, определением распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света, методом электродиамического рассеяния света и методами спектроскопии в УФ и видимой областях выявили следующие закономерности: увеличение относительного количества фермента в составе композитного материала приводит к увеличению активности композита, однако при соотношениях компонентов полупродукт (2) : урокиназа более 10:1 наблюдается рост количества несвязанного свободного фермента в реакционной смеси, что означает, что достигнут предел иммобилизации. При соотношении компонентов 10:1 наблюдается лишь незначительное количество примеси свободного фермента. На фиг. 11 представлена зависимость параметров полупродукта (2) от соотношения компонентов.Evaluation of system parameters by HPLC, determination of particle size distribution by laser light diffraction, electrodynamic light scattering, and spectroscopy methods in the UV and visible regions revealed the following patterns: an increase in the relative amount of enzyme in the composition of the composite material leads to an increase in the activity of the composite, however, when the ratios of the components intermediate (2): urokinase more than 10: 1 there is an increase in the amount of unbound free enzyme in the reaction mixture, which means so that the limit has been reached immobilization. With a component ratio of 10: 1, only a small amount of free enzyme impurity is observed. In FIG. 11 shows the dependence of the parameters of the intermediate product (2) on the ratio of components.
Варьирование времени протекания процесса проводили в диапазоне 30-120 минут. Контролируя процесс методами ВЭЖХ, определением распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света и методом электродинамического рассеяния света были выявлены следующие закономерности: увеличение времени реакции способствует более полному протеканию реакции и формированию стабильного коллоидного раствора продукта (3). При проведении реакции до 60 минут происходит уменьшение пика, соответствующего свободному ферменту, после периода 60 минут изменения вида хроматограммы не наблюдается.The variation of the process time was carried out in the range of 30-120 minutes. Controlling the process by HPLC, determining the particle size distribution by laser light diffraction and electrodynamic light scattering revealed the following patterns: an increase in the reaction time promotes a more complete reaction and the formation of a stable colloidal solution of the product (3). When carrying out the reaction up to 60 minutes, the peak corresponding to the free enzyme decreases, after a period of 60 minutes there is no change in the appearance of the chromatogram.
Варьирование условий конденсации заключалось в подборе условий высушивания и режима лиофилизации. Для этого продукт (3) лиофилизировали, используя режимы, в которых варьировали изменение температуры полки лиофильной сушилки во времени (таблица 1).The variation of the condensation conditions consisted in the selection of the drying conditions and the lyophilization regime. For this, the product (3) was lyophilized using modes in which the temperature change of the shelf of the freeze dryer in time was varied (table 1).
Таблица 1 - Сравнение режимов лиофилизацииTable 1 - Comparison of lyophilization regimes
Результаты оценивали методами ВЭЖХ, определением распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света, оценивали растворимость в растворителе для инъекций, прозрачность 0,1% раствора. В результате проведенных исследований было установлено, что режимы №2, и №3 соответствуют нормам показателей качества, однако при лиофилизации режимом №1 происходило слишком быстрое размораживание продукта, что приводило к нарушению наноструктуры и потере активности композитного материала, и не соответствовало качеству на суспендируемость. В целях экономии затрат на электроэнергию целесообразно использовать режим №2 Таким образом, суммарный выход целевого соединения урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал составляет 99% (фиг. 10).The results were evaluated by HPLC, determination of particle size distribution by laser light diffraction, solubility in an injection solvent, and transparency of a 0.1% solution. As a result of the studies, it was found that modes No. 2 and No. 3 correspond to the standards of quality indicators, however, during lyophilization with mode No. 1, the product defrosted too quickly, which led to a violation of the nanostructure and loss of activity of the composite material, and did not correspond to the quality of suspendibility. In order to save energy costs, it is advisable to use mode No. 2 Thus, the total yield of the target compound of urokinase, entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material is 99% (Fig. 10).
Эффективность, безопасность и фармакокинетика синтезированного лекарственного препарата.The efficacy, safety, and pharmacokinetics of a synthesized drug.
Выявленная способность представленного образца магнетита растворять экспериментальные тромбы в крупных сосудах у лабораторных животных позволяет предположить возможность использования препарата для лечения тромбозов у человека. Препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) показал эффективность при тромболитической терапии, многократно превышающую таковую для препарата сравнения на двух видах животных.The revealed ability of the presented magnetite sample to dissolve experimental thrombi in large vessels in laboratory animals suggests the possibility of using the drug for the treatment of thrombosis in humans. The MTK-15G preparation (urokinase entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) has shown efficacy in thrombolytic therapy, which is many times higher than that for the comparison drug in two animal species.
По результатам проведенного исследования по полуколичественному определению содержания железа в образцах тканей после магнитной сепарации можно сделать вывод о том, что материал носителя в виде магнитных наночастиц после внутривенного введения препарата довольно быстро перераспределяется из кровяного русла в такие органы, как печень и селезенка. При этом абсолютные значения концентрации магнитных частиц (в пересчете на железо) в печени ниже, чем в селезенке. Однако, превышая по массе селезенку примерно в 50 раз печень становится основным органом, в котором магнитные наночастицы могут в течение некоторого времени сохраняться. По данным ряда исследований, выполненных на животных, общепринятым является мнение о том, что магнетит в виде наночастиц, поступая в печень, постепенно преобразуется в другие соединения железа, которые, как было показано в экспериментах с радиоактивно меченым материалом, могут сохраняться в организме довольно долго, в том числе включаясь в состав гемопротеинов и других железосодержащих белков. По результатам нашего исследования было показано, что в течение семи суток после введения лекарственного препарата МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) его уровень содержания в биосредах снижается практически до фоновых значений.According to the results of a study on the semi-quantitative determination of the iron content in tissue samples after magnetic separation, we can conclude that the carrier material in the form of magnetic nanoparticles after intravenous administration of the drug is quite rapidly redistributed from the bloodstream to organs such as the liver and spleen. Moreover, the absolute values of the concentration of magnetic particles (in terms of iron) in the liver are lower than in the spleen. However, exceeding the mass of the spleen by about 50 times, the liver becomes the main organ in which magnetic nanoparticles can persist for some time. According to a number of studies performed on animals, it is generally accepted that magnetite in the form of nanoparticles, entering the liver, is gradually converted to other iron compounds, which, as shown in experiments with radioactively labeled material, can remain in the body for quite some time , including those included in the composition of hemoproteins and other iron-containing proteins. According to the results of our study, it was shown that within seven days after the administration of the MTK-15G drug (urokinase entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material), its level in biological media decreases almost to background values.
Следует заметить, что оптимальным способом оценки содержания магнитных наночастиц в различных тканях является прижизненное измерение времени релаксации с использованием магнитного резонанса. Примененные в настоящем исследовании методы анализа содержания железа в биосредах после магнитной сепарации дают представление о распределении магнитных частиц по органам и тканям, но не позволяют дать строго количественную оценку содержанию наночастиц в тканях. Сложная пробоподготовка не может гарантировать отсутствие потерь части материала в процессе обработки и отмывки от гемопротеинов, присутствующих во всех тканях и органах. Поэтому к полученным в результате настоящего исследования результатам следует относиться как к характеристикам, позволяющим оценить распределение частиц в тканях, но не дающим строго количественного описания процесса.It should be noted that the optimal way to assess the content of magnetic nanoparticles in various tissues is the intravital measurement of relaxation time using magnetic resonance. The methods used in this study to analyze the iron content in biological media after magnetic separation give an idea of the distribution of magnetic particles in organs and tissues, but do not allow a strictly quantitative assessment of the content of nanoparticles in tissues. Sophisticated sample preparation cannot guarantee the absence of loss of part of the material during processing and washing from hemoproteins present in all tissues and organs. Therefore, the results obtained as a result of this study should be regarded as characteristics that make it possible to assess the distribution of particles in tissues, but do not give a strictly quantitative description of the process.
Что касается фармакокинетики самого фермента урокиназы, то по результатам выполненного исследования можно сказать, что определение активности фермента урокиназы после непродолжительного контакта с биосредами, содержащими белковые ингибиторы сериновых протеиназ (серпины) практически невозможно. Это связано с тем, что ингибиторный потенциал крови и других тканей, где присутствуют эндогенные ингибиторы протеаз, достаточен для того, чтобы полностью ингибировать активность урокиназы в отношении специфического хромогенного субстрата. Это, однако, не исключает того, что фермент, энтрапированный в магнитные наночастицы, может сохранять активность в отношении своих белковых субстратов.As for the pharmacokinetics of the urokinase enzyme itself, according to the results of the study, it can be said that it is practically impossible to determine the activity of the urokinase enzyme after brief contact with biological media containing protein serine proteinase inhibitors (serpins). This is due to the fact that the inhibitory potential of blood and other tissues where endogenous protease inhibitors are present is sufficient to completely inhibit the activity of urokinase in relation to a specific chromogenic substrate. This, however, does not exclude the possibility that the enzyme entraped into magnetic nanoparticles can remain active in relation to its protein substrates.
Проведенные экспериментальные исследования показали, что при остром введении экспериментальным животным (мышам, крысам, кроликам) препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) можно охарактеризовать как малотоксичное средство. Острая токсичность при внутривенном введении мышам самцам и самкам составляет ЛД50=4333000 (2861000÷6561000) МЕ/кг, ЛД16=42293000 МЕ/кг, ЛД84=5379000 МЕ/кг. Острая токсичность при внутривенном введении крысам самцам и самкам составляет ЛД50=2533000 МЕ/кг (1335000÷4806000) МЕ/кг, ЛД16=901000 МЕ/кг, ЛД84=4165000 МЕ/кг.Experimental studies have shown that with acute administration to experimental animals (mice, rats, rabbits), the MTK-15G preparation (urokinase, entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) can be characterized as a low-toxic agent. Acute toxicity after intravenous administration to mice to males and females is LD50 = 4333000 (2861000 ÷ 6561000) IU / kg, LD16 = 42293000 IU / kg, LD84 = 5379000 IU / kg. Acute toxicity after intravenous administration to rats to males and females is LD50 = 2533000 IU / kg (1335000 ÷ 4806000) IU / kg, LD16 = 901000 IU / kg, LD84 = 4165000 IU / kg.
Таким образом, терапевтическая доза препарата для крыс (534 МЕ/кг) составляет 0,02% от его средней токсической дозы, что свидетельствует о большой широте терапевтического действия испытуемого лекарственного средства.Thus, the therapeutic dose of the drug for rats (534 IU / kg) is 0.02% of its average toxic dose, which indicates the wide breadth of the therapeutic effect of the test drug.
После многократного (в течение 14 дней) ежедневного внутривенного введения препарата крысам обоего пола во всем исследованном диапазоне доз не наблюдались изменения в общем состоянии, не проявлялись признаки выраженного токсического действия лекарственного средства.After repeated (within 14 days) daily intravenous administration of the drug to rats of both sexes, no changes in the general condition were observed in the entire dose range studied, and there were no signs of a pronounced toxic effect of the drug.
При этом, признаками токсического действия препарата можно считать повышение ректальной температуры крыс в опытных группах на 14 день внутривенного введения препарата в 5-ти и 10-ти кратной терапевтической дозе, как у самцов, так и у самок. Установлено достоверное повышение активности аминотрансфераз АсАТ, АлАТ после введения испытуемого препарата в 10-ти кратной терапевтической дозе в течение 14-ти дней, как у самцов, так и у самок, а также наблюдалась отчетливая тенденция к понижению показателей гематокрита.Moreover, an increase in the rectal temperature of rats in the experimental groups on the 14th day of intravenous administration of the drug in 5 and 10 times the therapeutic dose in both males and females can be considered signs of the toxic effect of the drug. A significant increase in the activity of aminotransferases AsAT, AlAT was established after administration of the test drug in a 10-fold therapeutic dose for 14 days, both in males and in females, and there was a clear tendency to a decrease in hematocrit.
Препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) также вызывал повышение общей антиоксидантной активности плазмы крови в группах животных, получавших 10-кратную терапевтическую дозу исследуемого препарата. Этот феномен можно объяснить компенсаторным ростом антиоксидантного потенциала в ответ на наличие железа в структуре нанокомпозитного носителя, являющегося естественным активатором свободно - радикальных окислительных процессов.The MTK-15G preparation (urokinase entrained into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) also caused an increase in the total antioxidant activity of blood plasma in animal groups receiving a 10-fold therapeutic dose of the studied drug. This phenomenon can be explained by the compensatory growth of the antioxidant potential in response to the presence of iron in the structure of the nanocomposite carrier, which is a natural activator of free radical oxidative processes.
Однако, эти изменения носили обратимый характер и через 60 дней после отмены препарата показатели не отличались от контрольных.However, these changes were reversible and 60 days after the drug was discontinued, the indicators did not differ from the control.
После многократного (в течение 14 дней) ежедневного внутривенного введения препарата кроликам не наблюдались изменения в общем состоянии, не проявлялись признаки выраженного токсического действия лекарственного средства во всем изученном диапазоне доз.After repeated (within 14 days) daily intravenous administration of the drug to rabbits, no changes in the general condition were observed, no signs of a pronounced toxic effect of the drug were observed in the entire studied dose range.
Признаками токсического действия препарата можно считать повышение активности аминотрансфераз АсАТ, АлАТ после введения испытуемого препарата в 10-ти кратной терапевтической дозе в течение 14 дней, как у самцов, так и у самок. Кроме того, наблюдалась отчетливая тенденция к понижению показателей гематокрита.Signs of the toxic effect of the drug can be considered an increase in the activity of aminotransferases AsAT, AlAT after administration of the test drug in 10 times the therapeutic dose for 14 days, both in males and in females. In addition, there was a clear downward trend in hematocrit.
Как и в экспериментах на крысах установлено достоверно значимое (р≤0,05) повышение общей антиоксидантной активности плазмы крови в группах животных, получавших 10-кратную терапевтическую дозу исследуемого препарата. Этот феномен можно объяснить компенсаторным ростом антиоксидантного потенциала в ответ на наличие железа в структуре нанокомпозитного носителя, являющегося естественным активатором свободно - радикальных окислительных процессов.As in experiments on rats, a significantly significant (p≤0.05) increase in the total antioxidant activity of blood plasma was established in groups of animals receiving a 10-fold therapeutic dose of the studied drug. This phenomenon can be explained by the compensatory growth of the antioxidant potential in response to the presence of iron in the structure of the nanocomposite carrier, which is a natural activator of free radical oxidative processes.
Отмеченные изменения носили обратимый характер и через 60 дней после отмены препарата не отличались от контрольных показателей.The noted changes were reversible and within 60 days after discontinuation of the drug did not differ from the control indicators.
Патоморфологическое исследование органов подопытных животных (крыс и кроликов) показало, что «подострое» в течение 14 суток внутривенное введение кроликам препарата МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) во всем изученном диапазоне доз не вызывает заметных структурных изменений, нарушений гистологического строения внутренних органов и развития воспалительных и дистрофических процессов.A pathomorphological study of the organs of experimental animals (rats and rabbits) showed that “subacute” for 14 days, intravenous administration of MTK-15G to rabbits (urokinase, entraped into colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) in the entire dose range studied does not cause noticeable structural changes, disturbances the histological structure of internal organs and the development of inflammatory and dystrophic processes.
При изучении местно-раздражающего действия было установлено, что многократное внутривенное введение препарата МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) не вызывает местно-раздражающего действия.When studying the local irritant effect, it was found that repeated intravenous administration of the MTK-15G preparation (urokinase, entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) does not cause a local irritant effect.
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) можно охарактеризовать как малотоксичное средство с большой широтой терапевтического действия. Признаки токсического действия не носят выраженного характера, проявляются при введении больших доз препарата и носят транзиторный характер.Thus, the conducted experimental studies have shown that the MTK-15G preparation (urokinase, entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) can be characterized as a low-toxic agent with a wide range of therapeutic effects. Signs of a toxic effect are not pronounced, appear when large doses of the drug are administered and are transient in nature.
Для оценки аллергизирующих, в том числе анафилактогенных свойств препарата МТК15-Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) использовали различные экспериментальные модели аллергии, воспроизведенные на экспериментальных животных различных видов (морские свинки, крысы, мыши). Анафилактогенные свойства урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал оценивали на модели системной анафилаксии у морских свинок; сенсибилизирующие свойства препарата оценивали при моделировании активной кожной анафилаксии у мышей и при постановке конъюнктивальной пробы у крыс. Тестирование препарата МТК15-Г проводили с использованием 2-х диапазонов доз: терапевтической дозы и 10-ти кратной терапевтической дозы. Препарат считали потенциальным аллергеном, если число сенсибилизированных животных в группе составляло свыше 50%. Если число сенсибилизированных животных в группе по одному из испытанных тестов составляло менее 50%, то наблюдаемые эффекты расценивали как проявление индивидуальной реакции на препарат. Адекватность и чувствительность выбранных экспериментальных моделей аллергии подтверждали постановкой позитивного контроля, проведенного с использованием известных аллергенов.To evaluate the allergenic, including anaphylactogenic, properties of the MTK15-G preparation (urokinase, entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material), various experimental allergy models were used that were reproduced on experimental animals of various species (guinea pigs, rats, mice). The anaphylactogenic properties of urokinase entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material were evaluated on a model of systemic anaphylaxis in guinea pigs; The sensitizing properties of the drug were evaluated by modeling active cutaneous anaphylaxis in mice and by setting up a conjunctival test in rats. Testing of the MTK15-G preparation was carried out using 2 dose ranges: a therapeutic dose and a 10-fold therapeutic dose. The drug was considered a potential allergen if the number of sensitized animals in the group was over 50%. If the number of sensitized animals in the group according to one of the tested tests was less than 50%, then the observed effects were regarded as a manifestation of an individual reaction to the drug. The adequacy and sensitivity of the selected experimental models of allergies was confirmed by setting a positive control conducted using known allergens.
Анализ результатов проведенного экспериментального исследования аллергизирующих, в том числе анафилактогенных свойств препарата МТК15-Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) показал, что при применении препарата возможно развитие аллергических реакций немедленного типа в качестве индивидуальной реакции. Отмечено, что в тесте активной кожной анафилаксии у мышей как при использовании тестируемого препарата в дозах 1 ТД и 10 ТД - частота аллергических реакций составила 10%. В связи с тем, что число выявленных реакций при постановке данного теста составило менее 50%, их можно рассматривать в качестве проявлений индивидуальной чувствительности. В реакциях системной анафилаксии у морских свинок и при постановке конъюнктивальной пробы у крыс аллергизирующих свойств у урокиназы, энтрапированной в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал обнаружено не было.An analysis of the results of an experimental study of the allergenic, including the anaphylactogenic, properties of the MTK15-G preparation (urokinase entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) showed that, when using the drug, it is possible to develop immediate allergic reactions as an individual reaction. It was noted that in the test of active skin anaphylaxis in mice as when using the test drug in doses of 1 TD and 10 TD, the frequency of allergic reactions was 10%. Due to the fact that the number of detected reactions during the formulation of this test was less than 50%, they can be considered as manifestations of individual sensitivity. In the reactions of systemic anaphylaxis in guinea pigs and in the formulation of a conjunctival test in rats, allergic properties were not found in urokinase entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material.
Оценка иммунотоксичности препарата МТК15-Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) включала суммарную оценку состояния гуморального иммунитета (реакция гемагглютинации; определение содержания антителообразующих клеток (АОК) при иммунизации эритроцитами барана), реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей, суммарную оценку состояния клеточной естественной резистентности (фагоцитоз, хемотаксис), лизосомально-катионный тест (ЛКТ - тест), тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ - тест).Evaluation of the immunotoxicity of MTK15-G (urokinase, entraped in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) included a total assessment of the state of humoral immunity (hemagglutination reaction; determination of antibody-forming cells (AOK) during immunization with sheep red blood cells), a delayed-type hypersensitivity reaction in mice, a total assessment natural cellular resistance (phagocytosis, chemotaxis), lysosomal cationic test (LKT test), nitrosine tet recovery Asolo (NST - test).
Проведенные исследования показали, что препарат МТК15-Г не влиял на титры гемагглютининов в реакции гемагглютинации, не вызывал угнетения Т-зависимого антителообразования в АОК тесте. Исследуемый препарат не угнетал хемотаксис нейтрофилов и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов у крыс. Препарат МТК15-Г не менял значения среднего цитохимического коэффициента в лизосомально-катионном тесте и не оказывал существенного влияния на кислородзависимую биоцидность фагоцитов морских свинок в тесте восстановления нитросинего тетразолия.Studies have shown that the MTK15-G preparation did not affect hemagglutinin titers in the hemagglutination reaction, did not cause inhibition of T-dependent antibody formation in the AOK test. The studied drug did not inhibit neutrophil chemotaxis and phagocytic activity of peritoneal macrophages in rats. The MTK15-G preparation did not change the mean cytochemical coefficient in the lysosomal cationic test and did not significantly affect the oxygen-dependent biocidality of guinea pig phagocytes in the nitrosine tetrazolium reduction test.
Таким образом, результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что препарат МТК15-Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) не обладает иммунотоксическими свойствами.Thus, the results of an experimental study indicate that the MTK15-G preparation (urokinase entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) does not have immunotoxic properties.
Препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) был протестирован на генотоксичность в цитогенетическом тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и в тесте учета генных мутаций на индикаторных штаммах Salmonella typhimurium для исключения генетических последствий при его применении. Также была исследована способность препарата вызывать повреждения ДНК (тест ДНК-комет). Было продемонстрировано, что препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) в дозах 1 ТД (1000 МЕ/кг) и 10 ТД (10000 МЕ/кг) не вызывает увеличение числа хромосомных аномалий у мышей и не вызывает повреждения ДНК, в дозах 0,044-22 мкл стокового раствора на чашку не проявляет мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса.The MTK-15G preparation (urokinase entrained in a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) was tested for genotoxicity in the cytogenetic test for accounting for chromosome aberrations in mouse bone marrow cells and in the test for accounting for gene mutations on indicator strains of Salmonella typhimurium to eliminate genetic consequences. The ability of the drug to cause DNA damage (DNA-comet test) was also investigated. It was demonstrated that the MTK-15G preparation (urokinase, entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) in doses of 1 TD (1000 IU / kg) and 10 TD (10000 IU / kg) does not cause an increase in the number of chromosomal abnormalities in mice and does not cause damage DNA, at doses of 0.044-22 μl of stock solution per cup, does not show mutagenic activity in the Ames bacterial test.
Таким образом, полученный предлагаемым способом препарат МТК-15Г (урокиназа, энтрапированная в коллоидный магнитный керамический нанокомпозитный материал) может эффективно и безопасно применяться в качестве лекарственного средства для топической терапии тромботических состояний конечностей.Thus, the preparation MTK-15G obtained by the proposed method (urokinase entraped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material) can be effectively and safely used as a medicine for the topical treatment of thrombotic conditions of limbs.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018120809A RU2674032C1 (en) | 2018-06-05 | 2018-06-05 | Method for producing urokinase entrapped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018120809A RU2674032C1 (en) | 2018-06-05 | 2018-06-05 | Method for producing urokinase entrapped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2674032C1 true RU2674032C1 (en) | 2018-12-04 |
Family
ID=64603802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018120809A RU2674032C1 (en) | 2018-06-05 | 2018-06-05 | Method for producing urokinase entrapped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2674032C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2769018C1 (en) * | 2021-08-02 | 2022-03-28 | Антон Анатольевич Зубков | Anchor |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1128601A1 (en) * | 1983-05-10 | 1985-07-15 | Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР | Urocinase immobilized on fibrinogen |
| US5928958A (en) * | 1994-07-27 | 1999-07-27 | Pilgrimm; Herbert | Superparamagnetic particles, process for their manufacture and usage |
| KR100862973B1 (en) * | 2007-06-28 | 2008-10-13 | 연세대학교 산학협력단 | Cationic magnetic nanocomposite for magnetic targeted drug delivery and contrast agent |
| RU2015123155A (en) * | 2015-06-17 | 2017-01-10 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики" (Университет ИТМО) | Magnetosol hydrosol, biocomposite with biomolecules entraped into magnetite and methods for their preparation and use |
| US9597672B2 (en) * | 2011-03-10 | 2017-03-21 | Cornell University | Mesoporous catalysts of magnetic nanoparticles and free-radical-producing enzymes, and methods of use |
-
2018
- 2018-06-05 RU RU2018120809A patent/RU2674032C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1128601A1 (en) * | 1983-05-10 | 1985-07-15 | Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР | Urocinase immobilized on fibrinogen |
| US5928958A (en) * | 1994-07-27 | 1999-07-27 | Pilgrimm; Herbert | Superparamagnetic particles, process for their manufacture and usage |
| KR100862973B1 (en) * | 2007-06-28 | 2008-10-13 | 연세대학교 산학협력단 | Cationic magnetic nanocomposite for magnetic targeted drug delivery and contrast agent |
| US9597672B2 (en) * | 2011-03-10 | 2017-03-21 | Cornell University | Mesoporous catalysts of magnetic nanoparticles and free-radical-producing enzymes, and methods of use |
| RU2015123155A (en) * | 2015-06-17 | 2017-01-10 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики" (Университет ИТМО) | Magnetosol hydrosol, biocomposite with biomolecules entraped into magnetite and methods for their preparation and use |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2769018C1 (en) * | 2021-08-02 | 2022-03-28 | Антон Анатольевич Зубков | Anchor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Prilepskii et al. | Urokinase-conjugated magnetite nanoparticles as a promising drug delivery system for targeted thrombolysis: synthesis and preclinical evaluation | |
| Kang et al. | Biocompatible custom ceria nanoparticles against reactive oxygen species resolve acute inflammatory reaction after intracerebral hemorrhage | |
| Li et al. | Quaternized chitosan/alginate-Fe3O4 magnetic nanoparticles enhance the chemosensitization of multidrug-resistant gastric carcinoma by regulating cell autophagy activity in mice | |
| Lim et al. | Hyaluronan-modified magnetic nanoclusters for detection of CD44-overexpressing breast cancer by MR imaging | |
| Yao et al. | Protective effects and mechanisms of bilirubin nanomedicine against acute pancreatitis | |
| Huang et al. | Polyacrylic acid-coated nanoparticles loaded with recombinant tissue plasminogen activator for the treatment of mice with ischemic stroke | |
| JP7302831B2 (en) | Low endotoxin fucan composition, system and method | |
| Dangi et al. | Targeting liver cancer via ASGP receptor using 5-FU-loaded surface-modified PLGA nanoparticles | |
| Li et al. | CaCO 3 nanoparticles pH-sensitively induce blood coagulation as a potential strategy for starving tumor therapy | |
| RU2659949C1 (en) | Method for preparing a preparation based on magnetic nanoparticles (mnch) of iron oxide for mrt-diagnosis of neoplasms | |
| Shimizu et al. | The behavior of ROS-scavenging nanoparticles in blood | |
| Mu et al. | Collagen-anchored cascade nanoreactors with prolonged intratumoral retention for combined cancer starvation and chemotherapy | |
| RU2674032C1 (en) | Method for producing urokinase entrapped into a colloidal magnetic ceramic nanocomposite material | |
| Shutava et al. | Synergetic effect of polyethylene glycol-grafted chitosan and bovine serum albumin on colloidal stability of polyelectrolyte nanocapsules | |
| Xu et al. | A biomimetic nanodrug self-assembled from small molecules for enhanced ferroptosis therapy | |
| CN109432451A (en) | A kind of preparation method for extra small double targeting bimodal magnetic resonance contrast agents that kidney is removed | |
| Shen et al. | High rapamycin-loaded hollow mesoporous Prussian blue nanozyme targets lesion area of spinal cord injury to recover locomotor function | |
| Huang et al. | Multi-enzyme mimetic iridium nanozymes-based thrombus microenvironment-modulated nanoplatform for enhanced thrombolytic therapy | |
| Mirkasymov et al. | Macrophage blockade using nature-inspired ferrihydrite for enhanced nanoparticle delivery to tumor | |
| Zhang et al. | Iron-Based Nanovehicle Delivering Fin56 for Hyperthermia-Boosted Ferroptosis Therapy Against Osteosarcoma | |
| CN109045056A (en) | Multiple medicine carries medicine targeted nano particle and its preparation method and application | |
| Geng et al. | Reshaping the tumor microenvironment for increasing the distribution of glucose oxidase in tumor and inhibiting metastasis | |
| Jogala et al. | Development of PEG-PLGA based intravenous low molecular weight heparin (LMWH) nanoparticles intended to treat venous thrombosis | |
| Chen et al. | Preparation of a modified silk-based gel/microsphere composite as a potential hepatic arterial embolization agent | |
| AU2022318366A1 (en) | Biocompatible imaging particles, their synthesis and use in imaging techniques |