RU2671412C1 - Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae о1 биовара эль тор с различной эпидемиологической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции - Google Patents
Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae о1 биовара эль тор с различной эпидемиологической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2671412C1 RU2671412C1 RU2018100692A RU2018100692A RU2671412C1 RU 2671412 C1 RU2671412 C1 RU 2671412C1 RU 2018100692 A RU2018100692 A RU 2018100692A RU 2018100692 A RU2018100692 A RU 2018100692A RU 2671412 C1 RU2671412 C1 RU 2671412C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tcpa
- strains
- ctxa
- vsp
- genes
- Prior art date
Links
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title claims description 11
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 101000666752 Theionarchaea archaeon (strain DG-70-1) NAD(+) hydrolase TcpA Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 claims abstract description 44
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 31
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 17
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 claims description 11
- 101150090831 tcpA gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 9
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 6
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 5
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 4
- 241000607343 Vibrio cholerae O1 biovar El Tor Species 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 101150087320 ctxB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 101100148266 Actinobacillus pleuropneumoniae apxIIIC gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 101100005249 Escherichia coli (strain K12) ygcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241001293945 Pyla Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 241001231453 Vibrio albensis Species 0.000 description 1
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 description 1
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003616 anti-epidemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 101150055191 cas3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 101150055502 rtxC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- -1 sodium thiolate Chemical class 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 description 1
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/63—Vibrio
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и предназначено для дифференциации штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. Проводят ПЦР в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит праймеры к генам vc0180, vc0514, ctxA и tcpA. Для токсигенных эпидемически опасных штаммов ctxA+tcpA+VSP+ характерно образование амплифицированных фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514, ctxA и tcpA. Для нетоксигенных ctxA-tcpA+VSP+ штаммов, несущих потенциальную эпидемическую опасность, характерно наличие ампликонов, соответствующих генам vc0180, vc0514 и tcpA. Для нетоксигенных эпидемически безопасных штаммов ctxA-tcpA+VSP- или ctxA-tcpA-VSP- характерно наличие ампликона, соответствующего гену tcpA, или отсутствие всех ампликонов. Изобретение обеспечивает возможность дифференциации штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на токсигенные эпидемически опасные, нетоксигенные потенциально эпидемически опасные и нетоксигенные эпидемически безопасные. 1 ил., 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к идентификации токсигенных эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выявлению нетоксигенных штаммов и их дифференциации на имеющих потенциальную эпидемическую опасность и эпидемически безопасных.
Холера - особо опасная инфекционная болезнь с тяжелым диарейным синдромом. Седьмая пандемия холеры, начавшаяся в 1961 г. и продолжающаяся по настоящее время, была вызвана токсигенными штаммами V.cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор. Постоянно регистрируемые эпидемии холеры в эндемичных по этой инфекции странах Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки создают высокий риск ее заноса на территорию Российской Федерации за счет интенсивной миграции населения [1, 2, 3].
Патогенный и эпидемический потенциал возбудителя холеры Эль Тор обусловлен присутствием в его геноме набора различных генов, определяющих его молекулярно-биологические свойства, ассоциированные не только с развитием инфекционного процесса, но и с эпидемическим распространением болезни. К генам, абсолютно необходимым для развития инфекционного процесса, относятся гены tcpA-F и ctxAB, кодирующие токсин-корегулируемые пили (TCP) и холерный токсин (СТ), продукты которых ответственны за колонизацию тонкого кишечника вибрионами и развитие основного клинического симптома холеры - профузной диареи, соответственно. Эти гены размещены на двух мобильных генетических элементах - на острове патогенности VPI-1 (tcpA-F) и профаге СТХϕ (ctxAB). Эпидемический потенциал штаммов связан с присутствием в геноме возбудителя двух островов пандемичности VSP-I и VSP-II, имеющихся у всех эпидемически опасных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор, выделенных во время 7-й пандемии. Токсигенные штаммы, выделенные до начала 7-ой пандемии, в геноме которых имелся профаг СТХϕ и ОП VPI-1, но отсутствовали острова пандемичности VSP-I и VSP-II, были неспособны к эпидемическому распространению. На этом основании в современный период генотип эпидемически опасных штаммов обозначается как ctxA+tcpA+VSP+ [4, 5, 6].
Между тем результаты ежегодных мониторинговых исследований на холеру свидетельствуют о выделении на территории России не только занесенных эпидемически опасных штаммов. Эпидемиологическая обстановка по холере в настоящее время характеризуется выделением из поверхностных водоемов, а также от людей значительного числа нетоксигенных штаммов. Так, за 2007-2016 гг. [7] было изолировано более 700 таких штаммов. Нетоксигенные штаммы с генотипом ctxA-tcpA-, в геноме которых отсутствуют все ключевые гены патогенности и пандемичности, согласно МУК 4.2.2218 - 07 [8], относят к эпидемически безопасным. Наряду со штаммами ctxA-tcpA- нередко в водных объектах окружающей среды обнаруживаются также нетоксигенные штаммы с другим генотипом, а именно ctxA-tcpA+, которые заслуживают особого внимания. Такие нетоксигенные штаммы способны не только колонизировать тонкий кишечник за счет присутствия TCP, кодируемых генами tcpA, но и приобретать профаг СТXϕ с генами СТ от токсигенных штаммов, поскольку эти пили служат также в качестве рецептора для этого фага. Потенциальная способность к реверсии таких нетоксигенных штаммов в токсигенные через фаговую конверсию долгое время служила основанием считать все выделенные штаммы ctxA-tcpA+ потенциально эпидемически опасными, что, согласно действующим Санитарным правилам [9], требует проведения определенного объема профилактических мер при их выделении. Однако недавно стало известно, что штаммы ctxA-tcpA+ генетически неоднородны и разделяются на две группы, отличающиеся друг от друга по эпидемиологической значимости. В геноме 1-ой группы штаммов (ctxA-tcpA+VSP+) присутствуют острова пандемичности VSP-I и VSP-II, тогда как штаммы второй группы (ctxA-tcpA+VSP-) лишены VSP-I и VSP-II. Более того, изучение их филогении на основе SNP-анализа показало, что штаммы ctxA-tcpA+VSP+ генетически близки к эпидемически опасным и являются их производными, утратившими гены холерного токсина. В то же время штаммы с генотипом ctxA-tcpA+VSP- генетически значительно удалены от эпидемически опасных штаммов и имеют видимо независимое происхождение [10]. Это означает, что штаммы ctxA-tcpA+VSP+ действительно могут представлять потенциальную эпидемическую опасность, обусловленную как возможностью реверсии их в токсигенные, так и присутствием в их геноме двух островов пандемичности, обеспечивающих их способность к эпидемическому распространению. Штаммы 2-ой группы с генотипом ctxA-tcpA+VSP- - эпидемически безопасны, поскольку их реверсия в эпидемически опасные штаммы путем одновременного приобретения 3-х различных участков ДНК, содержащих не только профаг СТХϕ, но и VSP-I и VSP-II, невозможна.
Циркуляция в водоемах и выделение от людей различных штаммов V.cholerae O1 биовара Эль Top ctxA+tcpA+VSP+, ctxA-tcpA+VSP+ и ctxA-tcpA+VSP-, способных в разной степени нанести ущерб здоровью населения и экономике страны, указывают на очевидную потребность в разработке информативного и быстрого способа и тест-системы для одновременной идентификации токсигенных эпидемически опасных штаммов и дифференциации нетоксигенных штаммов на потенциально эпидемически опасные и эпидемически безопасные.
Из источников научно-технической информации известен способ определения серогруппы и биовара холерных вибрионов на основе выявления гена wbeO, входящего в кластер генов gmd-wbeO, встречающихся только у холерных вибрионов O1 серогруппы, и фрагмента гена hlyА, типичного для холерных вибрионов биовара Эль Тор [11].
Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности, позволяющая осуществлять идентификацию природных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп на основе проведения ПЦР со специфическими праймерами к участкам диагностически значимых генов (wbeW, wbfR) и генов вирулентности (ctxA, tcpA), а также оценивать экспрессию генов вирулентности с помощью иммуноферментной тест-системы [12].
Известна ПЦР тест-система с использованием праймеров на видоспецифический ген hapA и основные гены вирулентности ctxA, tcpA, toxR, позволяющая одновременно проводить идентификацию штаммов холерных вибрионов и выявлять эпидемически опасные штаммы [13].
Также известен способ детекции и определения биовара, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры с использованием метода мультилокусной ПЦР, которую проводят с использованием трех пар праймеров к генам wbeN, hlyА и ctxA, а также набор для его осуществления [14].
Известен также способ и тест-система для идентификации токсигенных штаммов V.cholerae 01, определения их биовара и дифференциации холерных вибрионов биовара Эль Тор на типичные и измененные варианты методом ПЦР, согласно которому мультиплексную ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит подобранные сочетания праймеров: одна - к генам rfbO1, cas3 и ctxBClass, вторая - к генам rfbO1, rtxC и ctxBEt. Изобретение позволяет выявлять биовар холерных вибрионов O1 серогруппы, определять их токсигенность и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и изменные варианты [15].
Существует способ дифференциации токсигенных генетически изменных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом с помощью мультиплексной ПЦР [14]. Согласно этому способу мультиплексную ПЦР проводят в один прием в одной реакционной смеси, содержащей три пары праймеров к генам vc0497, vc0502 и vc0514. Дифференциацию проводят по структуре VSP-II путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов. Изобретение позволяет в короткие сроки достоверно дифференцировать изоляты V. cholerae биовара Эль Тор по их эпидемическому потенциалу на основе структуры острова пандемичности VSP-II [16].
Описан способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры Эль Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Согласно этому способу, ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит определенное сочетание праймеров. Использование этого способа позволяет определять O1 или O139 серогруппу штаммов (по наличию генов rfbO или rfbR), биовар (по наличию или отсутствию гена rstC), токсигенность (ctxA), принадлежность к геновариантам возбудителя (ctxBclass), а также их эпидемический потенциал (vc0502 и vc0514) [17].
Недостатком всех указанных выше тест-систем является отсутствие возможности одновременно выявлять штаммы с различной эпидемиологической значимостью, так как все предыдущие изобретения предназначены для идентификации и дифференциации по эпидемическому потенциалу только токсигенных штаммов холерных вибрионов. Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке быстрого и информативного способа для одновременной идентификации токсигенных эпидемически опасных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор и дифференциации нетоксигенных штаммов на потенциально эпидемически опасные и эпидемически безопасные.
Техническим результатом изобретения является возможность дифференциации штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на токсигенные эпидемически опасные, нетоксигенные потенциально эпидемически опасные и нетоксигенные эпидемически безопасные по наличию или отсутствию генов, входящих в состав профага СТХϕ (ген ctxA), острова патогенности VPI-1 (ген tcpA) и островов пандемичности VSP-I и VSP-II (гены vc0180, vc0514).
Технический результат достигается способом дифференциации штаммов V.cholerae биовара Эль Тор по их эпидемической опасности методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующимся тем, что ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров SEQ ID NO: 1, 2 к генам из vc0180 и vc0514 (из островов пандемичности VSP-I и VSP-II) в первой, SEQ ID NO: 3 к гену ctxA (из профага СТХ) и SEQ ID NO: 4 к гену tcpA (из острова патогенности VPI-1) во второй. Дифференциацию проводят путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов. Для токсигенных эпидемически опасных штаммов ctxA+tcpA+VSP+ характерно образование четырех амплифицированных фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514, ctxA и tcpA. Для нетоксигенных ctxA-tcpA+VSP+ штаммов холерных вибрионов, несущих потенциальную эпидемическую опасность, характерно наличие трех ампликонов, соответствующих генам vc0180, vc0514 и tcpA, а для нетоксигенных эпидемически безопасных ctxA-tcpA+VSP- или ctxA-tcpA-VSP- характерно наличие только одного ампликона, соответствующего гену tcpA, или отсутствие всех ампликонов, соответственно.
Праймеры к участку гена vc0180 (VSP-I), кодирующего гипотетический белок
SEQ ID NO: 1
- vc0180s-F - 5'-CCCGCTAAACAAATGCCTAAAG-3',
- vc0180s-R - 5'-TTGGCCATCAAGAGAGTAACC-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 719 пн.;
к участку гена vc0514 (VSP-II), кодирующего метил-акцепторный белок хемотаксиса
SEQ ID NO: 2
- vc0514s-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3',
- vc0514s-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 604 пн.;
к участку гена ctxA, кодирующего А-субъединицу холерного токсина
SEQ ID NO: 3
- ctxA-Fs - 5'-GCAGATTCTAGACCTCCTGATG-3',
- ctxA-Rs - 5'-ATGATGAATCCACGGCTCTT-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 525 пн.;
к участку гена tcpA(VPI-1), кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии
SEQ ID NO: 4
- tcpAs-F - 5'-TGACTAAGGCTGCGCAAA-3',
- tcpAs-R - 5'-GCTTCTCAACATGCGTGATATTAG-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 456 пн.
Выбор ДНК-мишеней осуществляли на основании анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей токсигенных эпидемически опасных, нетоксигенных потенциально эпидемически опасных и эпидемически безопасных штаммов, выделенных на территории Российской Федерации и стран бывшего СССР из объектов окружающей среды и от человека в разные годы, а также представленных в международной базе данных GenBank. В качестве первой мишени был выбран ген vc0180, кодирующий гипотетический белок и входящий в состав острова пандемичности VSP-I. Второй мишенью служил ген vc0514, кодирующий метил-акцепторный белок хемотаксиса и входящий в состав острова пандемичности VSP-II. Наличие данных генов характерно для всех типов островов пандемичности. В качестве третьей мишени был выбран ген ctxA, кодирующий А-субъединицу холерного токсина и размещенный на профаге СТХϕ. Для четвертой мишени выбран был ген tcpA, ответственный за синтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии и локализованный на ОП VPI-1. Праймеры рассчитаны авторами с использованием программ IntegratedDNATechnologies (http://eu.idtdna.com/site) и OligoAnalyzer 1.0.2.
Праймеры на гены vc0180, vc0514, ctxA, tcpA обеспечивают образование фрагментов размерами 719 пн, 604 пн, 525 пн, и 456 пн, соответственно, и подобраны таким образом, чтобы минимизировать вероятность их неспецифического отжига. Праймеры были проверены на возможность образования шпилечных структур с высокими температурами плавления, а так же образования димерных соединений как одноименных праймеров, так и разноименных праймеров между собой.
Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР.
Способ дифференциации включает следующие этапы:
1) Выделение ДНК;
2) Проведение ПЦР;
3) Анализ результатов.
Выделение ДНК исследуемых штаммов холерного вибриона проводят с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК. Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Выделение ДНК проводят согласно инструкции к набору.
ПЦР проводят в один этап в двух реакционных смесях по следующей программе: предварительная денатурация при 95°С - 5 мин; 32 цикла из 94°C - 30 с, 56,7°C - 30 с, 72°C - 1 мин, заключительный синтез комплиментарной цепи при температуре 72°С в течение 3 мин.
Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР проводят методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле. Учет результатов ПЦР проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствии с идентификационной таблицей 1.
Способ осуществляют следующим образом.
1) Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа в резиновых или латексных перчатках. Бактериальные взвеси клеток холерного вибриона, выросших на питательной среде, готовят в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора по стандартному образцу мутности 5 единиц (ОСО 42-28-86), что соответствует 1×109 микробных клеток в 1 мл для холерного вибриона. Взвеси гетерологичных микроорганизмов готовят в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц (ОСО 42-28-85), что соответствует 1×109 м.к./мл для кишечной палочки. Затем 10-кратными разведениями в 0,9% стерильного физиологического раствора доводят до концентрации 1×103 м.к./мл.
Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». В пробирки с тестируемыми микробными взвесями (1×109 м.к./мл) в объеме 4,5 мл добавляют 0,5 мл 0,1% натрия мертиолята (разведение 1:1000) до конечной концентрации 0,01% (разведение 1:10000) и прогревают при (56±1)°C в течение 30 мин. Далее отбирают по 0,1 мл микробной взвеси с мертиолятоми переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.
Выделение ДНК исследуемых штаммов холерного вибриона проводят с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК. Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Выделение ДНК проводят согласно инструкции к набору. Выделенную и очищенную ДНК хранят при +4°C.
2) Проведение ПЦР.
Для проведения ПЦР отбирают необходимое количество микропробирок, соответствующе числу исследуемых проб, а также еще по две для каждой реакционной смеси для положительного и отрицательного контролей.
ПЦР проводят в объеме 25 мкл реакционной смеси на 1 пробу исследуемой ДНК. Состав реакционной смеси №1 и №2 представлены в таблице 2. В подготовленную смесь вносят по 10 мкл пробы. В пробирки, обозначенные как отрицательный контроль, вносят по 10 мкл деионизованной воды, а в пробирки с положительным контролем соответственно по 10 мкл ДНК контрольного штамма. В качестве положительного контроля используют ДНК токсигенного штамма V.cholerae Р18899 O1 серогруппы биовара Эль Top (ctxA+tcpA+vc0180+vc0514+).
Амплификацию ДНК осуществляют на программируемом амплификаторе с прогреваемой крышкой с матричным способом регулирования (например, «Mastercycler Gradient», (Eppendorf, Германия) при следующих температурных режимах: температура денатурации - 95°С в течение 5 мин; 32 цикла - денатурация ДНК при температуре 94°С в течение 30 с, отжиг праймеров 56,7°С - 30 с, синтез комплиментарной цепи при температуре 72°С - 1 мин, заключительный синтез комплиментарной цепи при температуре 72°С в течение 3 мин.
3) Анализ результатов.
Для анализа результатов готовят 1,5% агарозный гель. Для приготовления 30 мл 1,5% агарозного геля к 0,45 г агарозы добавляют 30 мл 1×TAE буфера. Агарозу доводят до кипения, охлаждают до 50°С, вносят 0,5 мкг/мл этидия бромида и заливают в специальную ванночку, устанавливают гребенку и оставляют застывать. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. К ПЦР-продукту добавляют 5 мкл буфера для нанесения проб, перемешивают и вносят в лунки геля. Камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 10 В/см. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК проводят в течение 25-30 мин до прохождения лидирующим красителем около 2/3 длины трека.
Оценивают результаты анализа по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. Учет результатов проводят в соответствии с идентификационной таблицей 1.
На фигуре приведена электрофореграмма ампликонов, образованных при постановке мультиплексной ПЦР с праймерами на исследуемые гены-мишени контрольных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор, имеющих разную эпидемическую опасность. На дорожке 1 показано положение четырех ампликонов, соответствующих фрагментам генов ctxA, tcpA, vc0180 и vc0514, характерных для токсигенных эпидемически опасных штаммов (ctxA+tcpA+VSP+). На дорожке 2 регистрируются три ампликона, соответствующие фрагментам генов tcpA, vc0180 и vc0514, характерных для нетоксигенных потенциально эпидемически опасных штаммов (ctxA-tcpA+VSP+). На дорожках 3-4 показано положение одного ампликона, соответствующего фрагменту гена tcpA, или отсутствие ампликонов, соответствующих всем исследуемым фрагментов генов-мишеней, что характерно для нетоксигенных эпидемически безопасных штаммов (ctxA-tcpA+VSP- или ctxA-tcpA-VSP-).
Одновременная амплификация в ПЦР фрагментов четырех генов с образованием ампликонов размером 719, 604, 525 и 456 пн указывает на то, что изучаемый штамм содержит в геноме оба острова пандемичности VSP-I и VSP-II, а также профаг СТХс генами холерного токсина и остров патогенности VPI-1 с генами токсин-корегулирумых пилей. Это означает наличие в пробе токсигенного эпидемически опасного штамма. При амплификации трех фрагментов размером 719, 604 и 456 пн следует говорить о присутствии в геноме только VSP-I и VSP-II, a также VPI-1, что указывает на наличие в пробе нетоксигенного потенциально эпидемически опасного штамма. Образование лишь одного ампликона размером 456 пн, соответствующего фрагменту гена tcpA из VPI-1, или отсутствие всех четырех исследуемых маркерных участков генома размером 719, 604, 525 и 456 пн свидетельствует о наличие в пробе нетоксигенного эпидемически безопасного штамма.
Специфичность заявляемого способа подтверждена на основе использования штаммов близкородственных видов - V. parahaemolyticus, V. albensis, V. vulnificus, V. anguillarum, V. alginolyticus, а также энтеробактерий - E.coli, S. enteritidis, Sh.sonnei. Кроме того, в анализ были взяты нетоксигенные штаммы V. cholerae не 01/не 0139 серогрупп, не имеющие эпидемической значимости. Результаты ПЦР-тестирования указанных штаммов были отрицательными. Результаты специфичности представлены в таблице 3.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример 1. Для оценки эффективности ПЦР тест-системы использовали 51 штамм V. cholerae биовара Эль Тор. При дифференциации штаммов по эпидемической опасности было установлено, что они разделяются на 4 группы по наличию или отсутствию идентифицируемых генов. К первой группе относятся 5 токсигенных штаммов (ctxA+tcpA+vc0180+vc0514+), имеющие весь набор генетических маркеров эпидемически опасных штаммов (ctxA+tcpA+VSP+). Это означает, что эти штаммы эпидемически опасны. Во вторую группу входят 9 нетоксигенных штаммов ctxA-tcpA+vc0180+vc0574+, которые по составу генов патогенности и эпидемичности относятся к потенциально эпидемически опасным (ctxA-tcpA+VSP+). Третья (24 изолята) и четвертая (13 изолятов) группы состоят из нетоксигенных штаммов ctxA-tcpA+vc0180-vc0514- и ctxA-tcpA-vc0180-vc0514-, которые в отличие от нетоксигенных штаммов второй группы, являются эпидемически безопасными (ctxA-tcpA+VSP- и ctxA-tcpA-VSP-) вследствие отсутствия в их геноме различных протяженных участков ДНК, необходимых для проявления вирулентных и эпидемических свойств возбудителя, приобретение которых в природных условиях невозможно. Результаты оценки эффективности приведены в таблице 4.
Таким образом, разработанный способ для дифференциации штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с различной эпидемиологической значимостью, специфичен и эффективен. Показанная возможность быстрой идентификации токсигенных эпидемически опасных штаммов и дифференциация обнаруженных нетоксигенных штаммов холерных вибрионов на потенциально эпидемически опасные и эпидемически безопасные, позволяет рекомендовать этот способ для использования при проведении мониторинговых исследований окружающей среды и определении объема противоэпидемических мероприятий.
Список литературы
1. Титова С.В., Москвитина Э.А., Крутиков В.Д., Самородова А.В., Тюленева Е.Г., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Архангельская И.В., Иванова С.М., Ковалева Т.В., Водопьянов С.О. Холера: Оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2006-2015 гг. Прогноз на 2016 г. Пробл. особо опасных инф. 2016; 1:20-27.DOI: 10.21055/0370-1069-2016-1 -20-27.
2. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Федоров Ю.М., Подосинникова Л.С, Горобец А.В. Холера в начале ХХIвека. Прогноз. Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 2005; 3:44-48.
3. Москвитина Э.А., Адаменко О.Л., Кругликов В.Д., Титова С.В., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Иванова С.М., Анисимова Г.Б. Холера: эпидемиологическая обстановка в мире в 2005-2014 гг., прогноз на 2015 г. Пробл. особо опасных инф. 2015; 1:18-25.
4. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C, Clayton R.A., Gwinn M.L., Dodson R.J., Haft D.H., Hickey E.K., Peterson J.D., Umayam L., Gill S.R., Nelson K.E., Read T.D., Tettelin H.
., Richardson D., Ermolaeva M.D., Vamathevan J., Bass S., Qin H., Dragoi I.. Sellers P., McDonald L., Utterback Т., Fleishmann R.D., Nierman W.C, White O., Salzberg S.L., Smith H.O., Colwell R.R., Mekalanos J.J., Venter J.C, Fraser С.M. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholera. Nature. 2000; 406(6795): 477-483.
5. O'shea Y.A., Reen F.J., Quirke A.M., Boyd E.F. Evolutionary genetic analysis of the emergence of epidemic Vibrio cholerae isolates on the basis of comparative nucleotide sequence analysis and multilocus virulence gene profiles../ Clin. Microbiol. 2004; 42(10):4657-4671. DOI: 10.1128/JCM.42.10.4657-4671.2004.
6. Waldor M.K., Makalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous bacteriophage encoding cholera toxin. Science. 1996; V 272 (5270):5819-5825. DOI: 10.1126/science272.5270.1910.
7. Методические указания «Лабораторная диагностика холеры» (ЬУК 4.2.2218 - 07). Москва, 2007.
8. Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Самородова А.В., Кругликов В.Д., Титова С.В., Иванова С.М., Ковалева Т.В., Анисимова Г.Б. Эпидемиологическая обстановка по холере в мире и в России в 2007-2016 гг.Прогноз на 2017 г. Пробл. особо опасных инф. 2017; 1:13-20. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-13-20.
9. «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации». СП 3.1.1.2521-09 от 9.06.2009 г. №43.
10. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Баранихина Е.Ю., Краснов Я.М., Агафонов Д.А., Кутырев В.В. Структура генома и происхождение нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с различной эпидемиологической значимостью. Генетика. 2016; 52(9): 1029-1041. DOI: 10.7868/S0016675816060126.
11. Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Казакова Е.С., Шарова И.Н. Грачева И.В., Валова Т.В., Куличенко А.Н. Разработка метода биотипирования холерных вибрионов с помощью полимеразной цепной реакции. Сборник материалов проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». 2002; 15:59-61.
12. Комплексная гено- и иммуноди агностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ №2404257, опубликован 20.11.10 г.
13. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae elror по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001. 6:11-16.
14. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления. Патент РФ 2360972, опубликован 10.07.10 г.
15. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae 01, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ 2458141, опубликован 10.08.12 г.
16. Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ 2556127, опубликован 10.07.2015.
17. Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры Эль Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Патент №2560280, опубликован 20.08.2015.
ПКО(Положительный контрольный образец): Токсигенный эпидемически опасный штамм с ранее установленным набором генов.
Claims (1)
- Способ дифференциации штаммов V.cholerae биовара Эль Тор с различной эпидемической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующийся тем, что ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров - SEQ ID NO:1,2 к генам vc0180 и vc0514 в первой, SEQ ID NO: 3 к гену ctxA и SEQ ID NO:4 к гену tcpA во второй, дифференциацию проводят путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов, при этом для токсигенных эпидемически опасных штаммов ctxA+tcpA+ VSP+ характерно образование четырех амплифицированных фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514, ctxA и tcpA, для нетоксигенных ctxA-tcpA+VSP+ штаммов холерных вибрионов, несущих потенциальную эпидемическую опасность, характерно наличие трех ампликонов, соответствующих генам vc0180, vc0514 и tcpA, а для нетоксигенных эпидемически безопасных ctxA-tcpA+VSP- или ctxA-tcpA-VSP- характерно наличие одного ампликона, соответствующего гену tcpA, или отсутствие всех ампликонов, соответственно.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018100692A RU2671412C1 (ru) | 2018-01-10 | 2018-01-10 | Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae о1 биовара эль тор с различной эпидемиологической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018100692A RU2671412C1 (ru) | 2018-01-10 | 2018-01-10 | Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae о1 биовара эль тор с различной эпидемиологической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2671412C1 true RU2671412C1 (ru) | 2018-10-31 |
Family
ID=64103495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018100692A RU2671412C1 (ru) | 2018-01-10 | 2018-01-10 | Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae о1 биовара эль тор с различной эпидемиологической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2671412C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2808577C1 (ru) * | 2023-03-22 | 2023-11-29 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ обнаружения жизнеспособных холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров Classical и El Tor в окружающей среде с помощью бактериофага M3 методом количественной ПЦР |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2556127C2 (ru) * | 2014-01-09 | 2015-07-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
| RU2560280C2 (ru) * | 2014-09-23 | 2015-08-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры эль тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
-
2018
- 2018-01-10 RU RU2018100692A patent/RU2671412C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2556127C2 (ru) * | 2014-01-09 | 2015-07-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
| RU2560280C2 (ru) * | 2014-09-23 | 2015-08-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") | Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры эль тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HEIDELBERG J.F. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 2000 Aug 3; 406(6795): 477-83. * |
| СМИРНОВА Н.И. и др. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001; 6: 11-16. * |
| СМИРНОВА Н.И. и др. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001; 6: 11-16. HEIDELBERG J.F. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 2000 Aug 3; 406(6795): 477-83. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2808577C1 (ru) * | 2023-03-22 | 2023-11-29 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ обнаружения жизнеспособных холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров Classical и El Tor в окружающей среде с помощью бактериофага M3 методом количественной ПЦР |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Leyla et al. | Comparison of polymerase chain reaction and bacteriological culture for the diagnosis of sheep brucellosis using aborted fetus samples | |
| Douidah et al. | Identification of five human and mammal associated Arcobacter species by a novel multiplex-PCR assay | |
| Bricker | PCR as a diagnostic tool for brucellosis | |
| Kaynak-Onurdag et al. | Screening Brucella spp. in bovine raw milk by real-time quantitative PCR and conventional methods in a pilot region of vaccination, Edirne, Turkey | |
| Farahani et al. | Molecular detection, virulence genes, biofilm formation, and antibiotic resistance of Salmonella enterica serotype enteritidis isolated from poultry and clinical samples | |
| RU2458141C1 (ru) | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления | |
| Farfán et al. | A new multiplex PCR for differential identification of Shigella flexneri and Shigella sonnei and detection of Shigella virulence determinants | |
| Haghi et al. | Detection of major food-borne pathogens in raw milk samples from dairy bovine and ovine herds in Iran | |
| Ranjbar et al. | Rapid molecular approach for simultaneous detection of Salmonella spp., Shigella spp., and Vibrio cholera | |
| Das et al. | Isolation of Coxiella burnetii from bovines with history of reproductive disorders in India and phylogenetic inference based on the partial sequencing of IS1111 element | |
| Dadar et al. | Molecular diagnosis of acute and chronic brucellosis in humans | |
| Benga et al. | Development of a multiplex PCR assay based on the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodent Pasteurellaceae | |
| JP5884108B2 (ja) | マルチプレックスシャトルｐｃｒによる食中毒原因菌の一括検出法 | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| Bedir et al. | Simultaneous detection and differentiation of pathogenic and nonpathogenic Leptospira spp. by multiplex real-time PCR (TaqMan) assay | |
| Gupta et al. | Single-step PCR for detection of Brucella melitensis from tissue and blood of goats | |
| Kapley et al. | Rapid detection of Salmonella in water samples by multiplex polymerase chain reaction | |
| RU2671412C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae о1 биовара эль тор с различной эпидемиологической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| KR20020069573A (ko) | 다중 중합효소연쇄반응을 이용한 병원성 미생물의검출방법 및 검출키트 | |
| Alishahi et al. | Facile and rapid detection of Vibrio cholerae by multiplex PCR based on ompU, ctxA, and toxR genes | |
| Shivachandra et al. | Molecular diagnostic approaches for haemorrhagic septicaemia [HS]: A Review | |
| Bidhendi et al. | Identification and Serotyping of Salmonella Strains from poultry by PCR-RFLP in Shiraz, Iran | |
| RU2560280C2 (ru) | Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры эль тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| KR100853263B1 (ko) | 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법 | |
| KR20040045871A (ko) | 식중독세균이 보유하는 내열성 용혈독소 관련유전자(ｔｄｈ 관련 독소 유전자)를 총체적으로검출·정량함으로써 용혈독소 생산균을 검출·정량하는 방법 |