RU2670585C1 - Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system - Google Patents

Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system Download PDF

Info

Publication number
RU2670585C1
RU2670585C1 RU2018114278A RU2018114278A RU2670585C1 RU 2670585 C1 RU2670585 C1 RU 2670585C1 RU 2018114278 A RU2018114278 A RU 2018114278A RU 2018114278 A RU2018114278 A RU 2018114278A RU 2670585 C1 RU2670585 C1 RU 2670585C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lactobacilli
antagonistic activity
agar
cultivation
studied
Prior art date
Application number
RU2018114278A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Марина Алексеевна Сухина
Владимир Григорьевич Жуховицкий
Юрий Анатольевич Шелыгин
Original Assignee
Федеральное Государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical Федеральное Государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2018114278A priority Critical patent/RU2670585C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2670585C1 publication Critical patent/RU2670585C1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention relates to medicine. Method for evaluating the antagonistic activity of the lactobacilli of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by a two-stage cultivation of an antagonist microorganism and a test culture under conditions of a combined system is proposed. Method involves pouring the molten MRS-agar into a Petri dish, the agar is hardened to dissect into two equal parts, remove one and the released volume is filled with a molten agar of the appropriate composition. On the surface of the MRS-agar, an antagonist microorganism is cultured, on the surface of the unseparated half, the test culture is cultured under conditions appropriate to the requirements of the test cultures. Antagonistic activity of the test culture is estimated from the distance (in mm) from the middle of the edge of the lawn of the lactobacilli in the direction perpendicular to it to the frontal point of the edge of the lawn of the test culture.EFFECT: invention provides an accurate assessment of the antagonistic activity of lactobacilli.8 cl, 6 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы и может быть использовано при бактериологической оценке состояния содержимого толстокишечного биотопа для оценки функциональной активности лактобактерий в условиях колопроктологических, хирургических и других стационаров.The invention relates to the field of medicine, in particular to a method for assessing the antagonistic activity of the lactobacillus of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under combined system conditions and can be used for bacteriological assessment of the content of the colonic biotope to assess the functional activity of lactic acid bacteria under conditions Coloproctological, surgical and other hospitals.

Известен способ оценки антагонистической активности лактобацилл толстого кишечника, включающий заполнение рабочего объема пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания рассечение агаровой пластины стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части, удаляют одну их них и освободившийся объем заливают до уровня первоначального агара (MRS-агара) расплавленного триптиказо-соевый агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного Brucella агара с 7% (об./об.) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий, затем выполнение первого этапа культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара и инкубирование созданного посева исследуемой лактобактерий, затем, по завершению первого этапа, нанесение на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и выполнение инкубирования, по завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры, причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерий, (см. Сухина М.А., Бургасова О.А. и др. «Антагонистическая активность лактобацилл толстого кишечника», Журнал Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2012, №1, с 41-49).There is a method of assessing the antagonistic activity of lactobacilli of the large intestine, including filling the working volume of a plastic ventilated Petri dish of a single use with a diameter of 90 mm with 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar medium (MRS-agar) and, after solidification, dissection of the agar plate with a sterile scalpel according to the diameter of the Petri dish into two equal parts, remove one of them and fill the vacated volume to the level of the initial agar (MRS-agar) of molten trypticase-soy agar (TSA) for cultivation whimsical microorganisms, or Sabouraud molten agar for mushroom cultivation, or Columbia molten agar with 5% (v / v) defibrated whole sheep blood for streptococcus cultivation, or Columbia molten agar with 10% (vol / vol), and with a 10% (vol./about.) defibrcated object with a defibrated heart, and 10% (vol / vol.) blood for cultivation of campylobacterium (C. jejuni), or melted Brucella agar with 7% (v / v) of defibrated whole ram blood for cultivation of clostridia, then performing the first stage of cultivation of the antagonist microorganism with uniform application eat 0.1 ml of the patient’s colonic biotope Lactobacillus suspension with a bacterial suspension of 1.0 McF on the surface of MRS agar and incubate the established culture of the investigated lactobacilli, then, at the end of the first stage, apply the second non-seed half of the combined culture system to the surface uniformly 0, 1 ml of the suspension of the test culture with a turbidity of bacterial suspension 1.0 McF and performing incubation, upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism national antagonistic activity of the test culture by the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacillus lawn perpendicular to the frontal point of the edge of the lawn of the test culture, and the length of the measured growth zone of the test culture indicates the magnitude of the delayed antagonistic activity of the investigated lactobacilli relative to it, (see Sukhina MA, Burgasova OA and others. "Antagonistic activity of lactobacilli of the large intestine", Journal of Microbiology, epidemiology and immunology, 2012, №1, 41-49).

Однако известный способ оценки антагонистической активности лактобацилл толстого кишечника при своем использовании имеет следующие недостатки:However, the known method of assessing the antagonistic activity of the lactobacilli of the large intestine, when used, has the following disadvantages:

- недостаточно обеспечивает возможность оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении различных физиологических потребностей каждого микроорганизма,- insufficiently provides the ability to assess the antagonistic activity of lactobacilli in relation to the different physiological needs of each microorganism,

- не обеспечивает заданной точности оценки функциональной антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента,- does not provide the specified accuracy of the assessment of the functional antagonistic activity of the lactobacillus of the patient's colonic biotope,

- не обеспечивает расширения спектра тестируемых микроорганизмов для конкретного пациента,- does not provide for the expansion of the range of tested microorganisms for a particular patient,

- обладает недостаточной диагностической информативностью исследования микрофлоры кишечника пациента,- has insufficient diagnostic information content of the study of the intestinal microflora of the patient,

- не позволяет охарактеризовать функциональную способность лактофлоры и бифидофлоры,- does not allow to characterize the functional ability of lactoflora and bifidoflora,

- не позволяет изучить механизмы формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа.- does not allow to study the mechanisms of formation and functioning of microbiocenoses, aimed at maintaining the colonization resistance of a biotope.

Задачей изобретения является создание способа оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы.The objective of the invention is to create a method for assessing the antagonistic activity of the lactobacilli of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under conditions of a combined system.

Техническим результатом является обеспечение возможности оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении различных физиологических потребностей каждого микроорганизма, обеспечение повышения точности оценки функциональной антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента, обеспечение расширения спектра тестируемых микроорганизмов для конкретного пациента, значительное повышение диагностической информативности исследования микрофлоры кишечника пациента, обеспечение возможности охарактеризовать функциональную способность лактофлоры и бифидофлоры, а также обеспечение возможности изучения механизмов формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа.The technical result is to enable evaluation of antagonistic activity of lactic acid bacteria with respect to different physiological needs of each organism, providing improve the accuracy of estimation of functional antagonistic activity of lactic acid bacteria large intestine of the patient habitat, ensuring the spreading of the microorganisms tested for a particular patient, a significant increase in diagnostic informative study of the microflora of the patient intestines, providing opportunities OHare kterizovat functional capacity and lactoflora bifidoflora, as well as providing opportunities for studying the mechanisms of formation and functioning of microbiocenoses aimed at maintaining the colonization resistance of the biotope.

Технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предложен способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы, характеризующийся тем, что в рабочий объем пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм заливают 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекают стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части, удаляют одну их них и освободившийся объем заливают до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного агара Columbia с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования штамма Helicobacter pylori или расплавленного Brucella агара с 7% (об/об) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий, затем выполняют первый этап культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара и созданный посев исследуемой лактобактерий инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 часов в обогащенной 5-10% (об/об) углекислым газом атмосфере, затем, по завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно наносят 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубируют при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере, при этом культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 часов, культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 часов, культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере СО2 инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов, культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода, культивирование штамма Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СО2) и 5% (об/об) кислорода и культивирование клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часа в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа, по завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры, причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерий, при этом измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий и измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность. При этом в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков применяют тестируемые суспензии с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют грибы Candida albicans и Candida tropicalis. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют штамм Helicobacter pylori NCTC 11639. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют клостридии Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.The technical result in the implementation of the invention is achieved by the fact that a method is proposed for assessing the antagonistic activity of the lactobacillus of the large intestine biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under a combined system, characterized by the fact that the single-use 90-mm diameter of a plastic ventilated Petri dish pour 25 ml of the medium of molten agar De Mann-Rogoza-Sharpe (MRS-agar) and after frozen Cut the agar plate with a sterile scalpel along the diameter of the Petri dish into two equal parts, remove one of them and fill the vacated volume to the level of the initial agar (MRS-agar) 12-13 ml of molten trypticase soy agar (TSA) to cultivate unpretentious microorganisms, or Sabouraud molten agar for mushroom cultivation, or Columbia molten agar with 5% (v / v) defibrated whole sheep blood for streptococcus cultivation, or Columbia molten agar with 10% (v / v) defibrated whole ram blood for cultivation of campylobacter (S. jejuni), or Columbia molten agar with 7% (v / v) defibrated lysed horse blood for cultivation of Helicobacter pylori strain or molten Brucella agar with 7% (vol / vol) defibrated whole ram blood for the cultivation of clostridia, then perform the first stage of microorganization of microorganism -antagonist uniform application of 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the lactobacillus under study in a patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension on the surface of the MRS-agar and the culture of the investigated lactobacilli created is incubated at a temperature of ature 37 ° C for 24-48 hours in an atmosphere enriched with 5-10% (v / v) carbon dioxide, then, upon completion of the first stage, 0.1 ml of the test culture is uniformly applied to the surface of the second non-seeded half of the combined culture system the turbidity of bacterial suspension 1.0 McF and the applied crops are incubated with the following parameters on temperature, incubation time and atmosphere used, while the cultivation of unpretentious microorganisms is carried out in an air atmosphere incubator temperature of 37 ° C for 24 hours, culturing the fungi is performed in the atmosphere of the incubator at 28 ° C for 24 hours, the cultivation of Streptococcus is carried out in a CO 2 incubator atmosphere at a temperature of 37 ° C for 24 hours, culturing Campylobacter carried out at a temperature of 37 ° C for 48 hours a microaerobic nitrogen-based atmosphere containing 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (v / v) oxygen, the cultivation of the Helicobacter pylori strain is carried out at 37 ° C for 48-72 hours in a microaerobic atmosphere for nitrogen based soda rzhaschey 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2) and 5% (v / v) oxygen and culturing Clostridium carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 hours in a strict anaerobic atmosphere at a nitrogen base containing 5% ( V / V) of hydrogen and 10% (V / V) of carbon dioxide, upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the antagonistic activity of the test culture is evaluated according to the value measured in millimeters from the center of the lactobacilli lawn perpendicular to the front point of the gas edge on the test culture, and the length of the measured growth zone of the test culture indicates the magnitude of the delay directed against it antagonistic activity of the investigated lactobacilli, while the measured growth inhibition zone of the test culture up to 1 mm long is regarded as the absence of antagonistic activity of lactobacilli, the measured growth inhibition zone of the test culture from 1 to 10 mm is regarded as a low antagonistic activity of lactobacilli, measured zone of growth inhibition of the test ku Lutes with a length of 11 to 29 mm are regarded as moderate antagonistic activity of lactobacilli and the measured zone of growth inhibition of a strain of lactobacilli with a width of 30 to 45 mm is regarded as a high antagonistic activity. In the process of applying to the surface of the second non-seeded half of the combined cultivation system, test suspensions with a bacterium suspension density of 2.0 McF are used as the test culture of clostridia and streptococci. At the same time, the unpretentious microorganisms Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis and Klebsiella pneumoniae were used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied. At the same time, Candida albicans and Candida tropicalis are used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied. In addition, Streptococcus pyogenes and Streptococcus mitis are used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied. At the same time, Campylobacter jejuni NCTC 11638 is used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied. In addition, Helicobacter pylori NCTC 11639 was used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, and as the investigated strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied. against which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, Clostridium difficile Clostridium perfringens and Clostridium septicum are used.

Способ осуществляют следующим образом. В рабочий объем пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм заливают 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекают стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удаляют одну их них и освободившийся объем заливают до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного агара Columbia с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования Helicobacter pylori или расплавленного Brucella агара с 7% (об/об) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования.The method is as follows. In the working volume of a single-use ventilated plastic Petri dish with a diameter of 90 mm, 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar medium (MRS-agar) are poured and, after solidification, the agar plate is cut into two equal parts with a sterile scalpel. One of them is removed and the vacated volume is poured to the level of the initial agar (MRS-agar) 12-13 ml of molten trypticase-soy agar (TSA) for the cultivation of unpretentious microorganisms, or the molten Sabouraud agar for the cultivation of mushrooms, or molten Columbia agar with 5% v / v) of defibrated whole sheep blood for the cultivation of streptococci, or molten Columbia agar with 10% (v / v) of defibrated whole sheep blood for cultivation of Campylobacter (C. jejuni), or molten Columbia agar with 7% (vol / o) defi shaved horse blood for cultivation of Helicobacter pylori or molten Brucella agar with 7% (v / v) defibrated whole ram blood for clostridia cultivation with the formation of the second half of the combined cultivation system.

При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют грибы Candida albicans и Candida tropicana. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют штамм Helicobacter pylori NCTC 11639. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют клостридии Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.At the same time, the unpretentious microorganisms Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis and Klebsiella pneumoniae were used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied. At the same time, Candida albicans and Candida tropicana are used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied. In addition, Streptococcus pyogenes and Streptococcus mitis are used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied. At the same time, Campylobacter jejuni NCTC 11638 is used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied. In addition, Helicobacter pylori NCTC 11639 was used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, and as the investigated strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied. against which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, Clostridium difficile Clostridium perfringens and Clostridium septicum are used.

Затем выполняют первый этап культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара.Then, the first stage of cultivation of the antagonist microorganism is carried out by uniformly applying 0.1 ml of the suspension of the studied lactobacillus of the large intestine biotope of a patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension on the surface of MRS-agar.

Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 часов в обогащенной 5-10% (об/об) углекислым газом атмосфере.The created seeding of the investigated lactobacilli is incubated at 37 ° C for 24-48 hours in an atmosphere enriched with 5-10% (v / v) carbon dioxide.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно наносят 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубируют при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере.At the completion of the first stage, 0.1 ml of the suspension of the test culture with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension and the applied crops are incubated under the following parameters for temperature, incubation time and atmosphere used, uniformly applied to the surface of the second half of the combined cultivation system.

При этом культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 часов. При этом культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 часов. При этом культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере СО2 инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов. При этом культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СО2) и 5% (об/об) кислорода. При этом культивирование Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СО2) и 5% (об/об) кислорода. При этом культивирование Clostridium difficile и других видов клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часа в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа. При этом в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков применяют тестируемые суспензии с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF.The cultivation of unpretentious microorganisms is carried out in an air atmosphere incubator temperature of 37 ° C for 24 hours. In this case, the cultivation of fungi is carried out in an atmosphere of an incubator at a temperature of 28 ° C for 24 hours. The cultivation of streptococci is carried out in an atmosphere of CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours. In addition, campylobacter cultivation is carried out at 37 ° C for 48 hours in a nitrogen-based microaerobic atmosphere containing 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (v / v) oxygen. The cultivation of Helicobacter pylori is carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 hours in a nitrogen-based microaerobic atmosphere containing 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (v / v) oxygen. The cultivation of Clostridium difficile and other types of clostridia is carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 hours in a strict nitrogen-based anaerobic atmosphere containing 5% (v / v) hydrogen and 10% (v / v) carbon dioxide. In the process of applying to the surface of the second non-seeded half of the combined culture system, test suspensions with a bacterium suspension density of 2.0 McF are used as the test culture of clostridia and streptococci.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерий Измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий. Измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий. Измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий. Измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the antagonistic activity of the test culture is estimated from the distance measured in millimeters from the middle of the lactobacillus lawn perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. Moreover, the length of the measured growth zone of the test culture indicates the magnitude of the delay directed against it antagonistic activity of the investigated lactic acid bacteria. The measured zone of growth inhibition of the test culture up to 1 mm long is regarded as the absence of antagonistic activity of lactic acid bacteria. The measured zone of growth inhibition of the test culture with a length of 1 to 10 mm is regarded as a low antagonistic activity of lactobacilli. The measured growth inhibition zone of the test culture with a length of 11 to 29 mm is regarded as a moderate antagonistic activity of lactobacilli. The measured zone of growth inhibition of a strain of lactobacilli with a width of 30 to 45 mm is regarded as a high antagonistic activity.

Среди существенных признаков, характеризующих предложенный способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы, отличительными являются:Among the essential features that characterize the proposed method of assessing the antagonistic activity of the lactobacillus of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by the two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under the combined system, the distinctive features are:

- дополнительное заполнение освободившегося рабочего объема чашки Петри до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленным агаром Columbia с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования Helicobacter pylori,- additional filling of the free working volume of the Petri dish to the level of the initial agar (MRS-agar) of 12-13 ml with molten Columbia agar with 7% (v / v) defibrated lysed horse blood for cultivation of Helicobacter pylori,

- инкубирование созданного посева исследуемой лактобактерий при температуре 37°С в течение 24-48 часов в обогащенной 5-10% (об/об) углекислым газом атмосфере,- incubation created by planting the investigated lactobacilli at a temperature of 37 ° C for 24-48 hours in an atmosphere enriched with 5-10% (v / v) carbon dioxide,

- инкубирование по завершению первого этапа, нанесенных посевов при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере для следующих микроорганизмов:- incubation on completion of the first stage, applied crops with the following parameters on temperature, incubation time and atmosphere used for the following microorganisms:

- культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 часов,- cultivation of unpretentious microorganisms is carried out in an air atmosphere incubator temperature of 37 ° C for 24 hours,

- культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 часов,- cultivation of mushrooms is carried out in an atmosphere of an incubator at a temperature of 28 ° C for 24 hours,

- культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере СО2 инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов,- cultivation of streptococci is carried out in an atmosphere of CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours,

- культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода,- cultivation of campylobacter is carried out at a temperature of 37 ° C for 48 hours in a microaerobic atmosphere based on nitrogen containing 10% (V / V) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (V / V) oxygen,

- культивирование Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода,- cultivation of Helicobacter pylori is carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 hours in a nitrogen-based microaerobic atmosphere containing 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (v / v) oxygen,

- культивирование клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часа в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа,- cultivation of clostridia is carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 hours in a strict nitrogen-based anaerobic atmosphere containing 5% (v / v) hydrogen and 10% (v / v) carbon dioxide,

- измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий,- the measured growth inhibition zone of the test culture with a length of up to 1 mm is regarded as the absence of antagonistic activity of lactobacilli,

- измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий,- measured zone of growth inhibition of the test culture with a length of from 1 to 10 mm is regarded as a low antagonistic activity of lactobacilli,

- измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий,- measured zone of growth inhibition of the test culture length from 11 to 29 mm is regarded as a moderate antagonistic activity of lactobacilli,

- измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность.- the measured zone of growth inhibition of a strain of lactobacilli with a width of 30 to 45 mm is regarded as a high antagonistic activity.

- применение в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков тестируемых суспензий с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF,- application in the process of applying to the surface of the second unseminated half of the combined cultivation system as a test culture of clostridia and streptococci of the test suspensions with a bacterial suspension density of 2.0 McF,

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, неприхотливых микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae.- use as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli, unpretentious microorganisms Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis and Klebsiella pneumoniae was studied.

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, грибов Candida albicans и Candida Tropicalis,- use as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli, Candida albicans and Candida Tropicalis, was studied,

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, стрептококков Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis,- use as the studied strains, in respect of which the antagonistic activity of lactobacilli, Streptococcus pyogenes and Streptococcus mitis, was studied,

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638.- use as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, Campylobacter bacterium Campylobacter jejuni NCTC 11638.

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, штамма Helicobacter pylori NCTC 11639.- use as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, the strain Helicobacter pylori NCTC 11639.

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, клостридий Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.- use as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli, Clostridium Clostridium difficile, Clostridium perfringens and Clostridium septicum was studied.

Клинические исследования и практическое использование предложенного способа оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы показали его высокую эффективность. Предложенный способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы при своем использовании обеспечил возможность оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении различных физиологических потребностей каждого микроорганизма, обеспечил повышение на 60-70% точности оценки функциональной антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента, обеспечил расширение спектра тестируемых микроорганизмов для конкретного пациента Кроме того, предложенный способ обеспечил значительное повышение диагностической информативности исследования микрофлоры кишечника пациента, обеспечил возможность охарактеризовать функциональную способность лактофлоры и бифидофлоры, а также обеспечил возможности изучения механизмов формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа.Clinical studies and practical use of the proposed method for assessing the antagonistic activity of the lactobacillus of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by the two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under conditions of a combined system showed its high efficiency. The proposed method for assessing the antagonistic activity of the lactobacilli of the colic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under combined system conditions ensured an assessment of the antagonistic activity of lactobacteria in relation to the various physiological needs of each microorganism, provided an increase of assessment accuracy by 60-70% functional antagonistic activity of lactobacilli In addition, the proposed method provided a significant increase in the diagnostic information content of the patient’s intestinal microflora, provided an opportunity to characterize the functional ability of lactoflora and bifidoflora, and also provided an opportunity to study the mechanisms of formation and functioning of microbiocenoses aimed at maintaining colonization resistance of the biotope.

Реализация предложенного способа оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы поясняется следующими клиническими примерами.The implementation of the proposed method of assessing the antagonistic activity of the lactobacilli of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under a combined system is illustrated by the following clinical examples.

Пример 1. Пациентка П., 58 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 109 КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae в титре более 108 КОЕ/г. Кроме этого был выделен патогенный микроорганизм Salmonella enterica serovar enteritidis. Для оценки активности лактобактерий пациента был использован способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы.Example 1. Patient P., 58 years old, FSBI "GNCC them. A.N. Redhead "Ministry of Health of Russia. The study of the main microflora of the colon with the determination of the qualitative and quantitative composition of microorganisms. Lactobacilli were isolated in a titer of 10 9 CFU / g and representatives of conditionally pathogenic microflora Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae in a titer of more than 10 8 CFU / g. In addition, the pathogen Salmonella enterica serovar enteritidis was isolated. To assess the activity of the lactobacilli of the patient, a method was used to evaluate the antagonistic activity of the lactobacillus of the large intestine biotope of the patient relative to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under combined system conditions.

В рабочие объемы четырех пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну их них и освободившийся объем залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica serovar enteritidis и Klebsiella pneumoniae.In working volumes of four single-use ventilated plastic Petri dishes with a diameter of 90 mm, 25 ml of molten De Mann-Rogoise-Sharpe agar (MRS-agar) were poured over each and after hardening, the agar plates were cut into two equal parts with a sterile scalpel. Each one of them was removed and the vacated volume was poured to the level of the initial agar (MRS-agar) 12 ml of molten trypticase soy agar (TSA) for the cultivation of undemanding microorganisms with the formation of the second half of the combined cultivation system. At the same time, unpretentious microorganisms Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica serovar enteritidis and Klebsiella pneumoniae were used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в обогащенной 10% (об/об) углекислым газом атмосфере.Then, the first stage of cultivation of the antagonist microorganism was performed. 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the studied lactobacillus of the patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was applied evenly on the surface of MRS-agar. The sowing of the investigated lactobacilli was incubated at 37 ° C for 24 hours in an atmosphere enriched with 10% (v / v) carbon dioxide.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в воздушной атмосфере инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов.At the end of the first stage, 0.1 ml of the suspension of the test culture with a bacterial suspension of 1.0 McF was uniformly applied to the surface of the second half of the combined cultivation system and the applied crops were incubated in an air atmosphere incubator at 37 ° C for 24 hours.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Pseudomonas aeruginosa 8 мм, для Staphylococcus aureus 10 мм, для Salmonella enterica serovar enteritidis 4 мм и для Klebsiella pneumoniae 8 мм, что позволило расценить как низкую антагонистическую активность лактобактерий, не обеспечивающую колонизационную резистентность макроорганизма, не смотря на высокий титр присутствия лактобактерий в толстокишечном биотопе у данной пациентки.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the antagonistic activity of the test culture was estimated from the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacilli lawn in a direction perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. We found that the measured area stunting test culture accounted for Pseudomonas aeruginosa 8 mm for Staphylococcus aureus 10 mm for Salmonella enterica serovar enteritidis 4 mm and Klebsiella pneumoniae 8 mm, which enabled regarded as low antagonistic activity of lactobacilli without providing colonization resistance microorganism , despite the high titer of the presence of lactobacilli in the colic biotope in this patient.

Пример 2. Пациентка П., 58 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 106 КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры грибы Candida albicans и Candida tropicalis в титре более 104 КОЕ/г. Для оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении грибов был использован следующий способ.Example 2. Patient P., 58 years old, FSBI "GNTsK them. A.N. Redhead "Ministry of Health of Russia. The study of the main microflora of the colon with the determination of the qualitative and quantitative composition of microorganisms. Lactobacilli were isolated in a titer of 10 6 CFU / g and representatives of conditionally pathogenic microflora Candida albicans and Candida tropicalis fungi in a titer of more than 10 4 CFU / g. To assess the antagonistic activity of lactobacilli against fungi was used the following method.

В рабочее пространство двух пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну часть их них и в освободившийся объем залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12 мл расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали грибы Candida albicans и Candida tropicalis.In a working space of two single-use ventilated plastic Petri dishes 90 mm in diameter, 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar was poured in each medium and, after solidification, the agar plates were cut into two equal parts with a sterile scalpel across the diameter of the Petri dish. Each one part of them was removed and poured into the empty volume to the level of the initial agar (MRS-agar) with 12 ml of Sabouraud molten agar for the cultivation of fungi with the formation of the second half of the combined cultivation system. At the same time, Candida albicans and Candida tropicalis were used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма -антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 36 часов в обогащенной 7,5% (об/об) углекислым газом атмосфере.Then we performed the first stage of cultivation of the antagonist microorganism. 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the studied lactobacillus of the patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was applied evenly on the surface of MRS-agar. Created by sowing the investigated lactobacilli were incubated at 37 ° C for 36 hours in an atmosphere enriched with 7.5% (v / v) carbon dioxide.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в воздушной атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 48 часов.Upon completion of the first stage, 0.1 ml of the test culture suspension with a bacterial suspension of 1.0 McF was uniformly applied to the surface of the second non-seeded half of the combined culture system and the applied crops were incubated in an air atmosphere incubator at 28 ° C for 48 hours.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Candida albicans 32 мм, и для Candida tropicalis 35 мм, что позволило расценить антагонистическую активность лактобактерий в биотопе пациентки как высокую, обеспечивающую колонизационную резистентность макроорганизма; и характеризовать данный кишечный биотоп как нормоценоз, не смотря на титр лактобацилл 106 КОЕ/г.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the functional antagonistic activity of the test culture was estimated from the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacillus lawn perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. It was found that the measured growth inhibition zone of the test culture was 32 mm for Candida albicans, and 35 mm for Candida tropicalis, which made it possible to regard the antagonistic activity of lactobacilli in the patient's biotope as high, providing the colonization resistance of the microorganism; and characterize this intestinal biotope as normocenosis, despite the titer of lactobacilli 10 6 CFU / g.

Пример 3. Пациентка П., 58 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 108 КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis в титре более 109 КОЕ/г.Example 3. Patient P., 58 years old, FSBI "GNCC them. A.N. Redhead "Ministry of Health of Russia. The study of the main microflora of the colon with the determination of the qualitative and quantitative composition of microorganisms. Lactobacilli were isolated in a titer of 10 8 CFU / g and representatives of conditionally pathogenic microflora of Streptococcus pyogenes and Streptococcus mitis in a titer of more than 10 9 CFU / g.

В рабочее пространство двух пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну их них и в освободившийся объем каждой чашки залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12,5 мл расплавленного агара Columbia с 5% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis.In a working space of two single-use ventilated plastic Petri dishes 90 mm in diameter, 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar was poured in each medium and, after solidification, the agar plates were cut into two equal parts with a sterile scalpel across the diameter of the Petri dish. Each one of them was removed and poured into the empty volume of each cup to the level of the initial agar (MRS-agar) 12.5 ml of molten Columbia agar with 5% (v / v) defibrated whole lamb blood for the cultivation of streptococci with the formation of the second half of the combined cultivation systems. At the same time, Streptococcus pyogenes and Streptococcus mitis were used as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов в обогащенной 5% (об/об) углекислым газом атмосфере.Then, the first stage of cultivation of the antagonist microorganism was performed. 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the studied lactobacillus of the patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was applied evenly on the surface of MRS-agar. The sowing of the investigated lactobacilli was incubated at 37 ° C for 48 hours in an atmosphere enriched with 5% (v / v) carbon dioxide.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 2,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в атмосфере СО2 инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов.Upon completion of the first stage, 0.1 ml of the suspension of the test culture with a turbidity of 2.0 McF bacterial suspension was uniformly applied to the surface of the second half of the combined culture system and the applied crops were incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Streptococcus pyogenes 15 мм и для Streptococcus mitis 19 мм, что позволило расценить как умеренную антагонистическую активность лактобактерий против изученных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the functional antagonistic activity of the test culture was estimated from the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacillus lawn perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. It was found that the measured growth inhibition zone of the test culture was 15 mm for Streptococcus pyogenes and 19 mm for Streptococcus mitis, which made it possible to regard the moderate antagonistic activity of lactobacilli against the studied strains of conditionally pathogenic microorganisms.

Пример 4. Пациентка В., 63 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 109 КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры в титре более 106 КОЕ/г. Кроме этого был выделен Campylobacter jejuni в титре 105 КОЕ/г. Для оценки антагонистической активности лактобактерий против Campylobacter jejuni был использован следующий способ.Example 4. Patient V., 63 years old, FSBI "GNCC them. A.N. Redhead "Ministry of Health of Russia. The study of the main microflora of the colon with the determination of the qualitative and quantitative composition of microorganisms. Lactobacilli were isolated in a titer of 10 9 CFU / g and representatives of conditionally pathogenic microflora in a titer of more than 10 6 CFU / g. In addition, Campylobacter jejuni was isolated in a titer of 10 5 CFU / g. To assess the antagonistic activity of lactobacilli against Campylobacter jejuni, the following method was used.

В рабочее пространство пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм залили 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили одну их них и освободившийся объем залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) 13 мл расплавленного агара Columbia с 10% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638 с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования.A single-use, 90-mm diameter plastic ventilated Petri dish was poured with 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar medium (MRS-agar) and, after solidification, the agar plate was cut into two equal parts with a sterile scalpel across the diameter of the Petri dish. One of them was removed and the vacated volume was filled to the level of the initial agar (MRS-agar) with 13 ml of molten Columbia agar with 10% (v / v) defibrated whole sheep blood for cultivation of Campylobacter bacterium Campylobacter jejuni NCTC 11638 with the formation of the second half of the non-cultivated culture system.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов в обогащенной 10% (об/об) углекислого газа атмосфере.Then, the first stage of cultivation of the antagonist microorganism was performed. 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the studied lactobacillus of the patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was applied evenly on the surface of MRS-agar. Created by sowing the investigated lactobacilli were incubated at 37 ° C for 48 hours in an atmosphere enriched with 10% (v / v) carbon dioxide.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода.Upon completion of the first stage, 0.1 ml of the test culture suspension with a bacterial suspension of 1.0 McF was uniformly applied to the surface of the second non-seeded half of the combined culture system and the applied crops were incubated at 37 ° C for 48 hours in a nitrogen-based microaerobic atmosphere, containing 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2) and 5% (v / v) oxygen.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Campylobacter jejuni NCTC 11638 38 мм, что позволило расценить как высокую антагонистическую активность лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки против Campylobacter jejuni.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the functional antagonistic activity of the test culture was estimated from the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacillus lawn perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. It was established that the measured growth inhibition zone of the test culture was Campylobacter jejuni NCTC 11638 38 mm, which made it possible to regard the high antagonistic activity of the patient's colonic biotope lactobacilli against Campylobacter jejuni.

Пример 5. Пациентка В., 63 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 109 КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры в титре более 106 КОЕ/г. Кроме этого был выделен Helicobacter pylori из биоптата желудка. Для оценки антагонистической активности лактобактерий против Helicobacter pylori был использован следующий способ.Example 5. Patient V., 63 years old, FSBI "GNTsK them. A.N. Redhead "Ministry of Health of Russia. The study of the main microflora of the colon with the determination of the qualitative and quantitative composition of microorganisms. Lactobacilli were isolated in a titer of 10 9 CFU / g and representatives of conditionally pathogenic microflora in a titer of more than 10 6 CFU / g. In addition, Helicobacter pylori was isolated from a gastric biopsy. To assess the antagonistic activity of lactobacilli against Helicobacter pylori, the following method was used.

В рабочее пространство трех пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну часть их них и освободившийся объем трех чашек Петри залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12 мл расплавленного агара с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования штамма Helicobacter pylori NCTC 11639 с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования.In the working space of three single-use ventilated plastic Petri dishes 90 mm in diameter, 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar was poured in each medium and, after solidification, the agar plates were cut into two equal parts with a sterile scalpel across the diameter of the Petri dish. Each one part of them was removed and the free volume of three Petri dishes was poured to the level of the initial agar (MRS-agar) with 12 ml of molten agar with 7% (v / v) defibrated lysed horse blood for the cultivation of Helicobacter pylori NCTC 11639 strain with the formation of the second non-seeded half of the combined cultivation system.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в обогащенной 10% (об/об) углекислым газом атмосфере.Then, the first stage of cultivation of the antagonist microorganism was performed. 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the studied lactobacillus of the patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was applied evenly on the surface of MRS-agar. The sowing of the investigated lactobacilli was incubated at 37 ° C for 24 hours in an atmosphere enriched with 10% (v / v) carbon dioxide.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли по 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали при температуре 37°С в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода соответственно в течение 60 и 72 часов.Upon completion of the first stage, 0.1 ml of the suspension of the test culture with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was uniformly applied to the surface of the second unpowered half of the culture system and the applied crops were incubated at 37 ° C in a microaerobic nitrogen-based atmosphere containing 10% (V / V) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (V / V) oxygen, respectively, for 60 and 72 hours.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Helicobacter pylori NCTC 11639 при инкубировании в течение 60 часов 38 мм и при инкубировании в течение 72 часов 35 мм, что позволило расценить как высокую антагонистическую активность лактобактерий против Helicobacter pylori NCTC 11639.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the antagonistic activity of the test culture was estimated from the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacilli lawn in a direction perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. It was found that the measured growth inhibition zone of the test culture was 38 mm for Helicobacter pylori NCTC 11639 and 60 mm incubated for 72 hours, which was regarded as a high antagonistic activity of lactobacilli against Helicobacter pylori NCTC 11639.

Пример 6. Пациентка В., 63 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 109 КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры Clostridium perfringens и Clostridium septicum. в титре более 106 КОЕ/г. Кроме этого была выделена токсигенная Clostridium difficile, продуцирующая токсины А, В и бинарный токсин в титре 108 КОЕ/г. Для оценки антагонистической активности лактобактерий у данной пациентки была использован следующий способ.Example 6. Patient V., 63 years old, FSBI "GNCC them. A.N. Redhead "Ministry of Health of Russia. The study of the main microflora of the colon with the determination of the qualitative and quantitative composition of microorganisms. Lactobacilli were isolated in a titer of 10 9 CFU / g and representatives of the conditionally pathogenic microflora Clostridium perfringens and Clostridium septicum. in a titer of more than 10 6 CFU / g. In addition, toxigenic Clostridium difficile was isolated, producing toxins A, B and binary toxin in a titer of 10 8 CFU / g. To assess the antagonistic activity of lactobacilli in this patient, the following method was used.

В рабочее пространство трех пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания каждую агаровую пластину рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну часть их них и освободившийся объем трех чашек Петри залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12 мл расплавленного агара с 7% (об/об) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых клостридий, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.In the working space of three single-use plastic ventilated Petri dishes with a diameter of 90 mm, 25 ml of De Mann-Rogoza-Sharpe molten agar medium (MRS-agar) was poured and, after solidification, each agar plate was cut into two equal parts with a sterile scalpel. Each one part of them was removed and the free volume of three Petri dishes was filled to the level of the initial agar (MRS-agar) with 12 ml of molten agar with 7% (v / v) defibrated whole ram blood for the cultivation of clostridia with the formation of the second half of the combined cultivation system . At the same time, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, and Clostridium septicum were used as the investigated clostridia, in relation to which the antagonistic activity of lactobacilli was studied.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в микроаэробной атмосфере на основе 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода.Then, the first stage of cultivation of the antagonist microorganism was performed. 0.1 ml of the suspension of the colonic biotope of the studied lactobacillus of the patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension was applied evenly on the surface of MRS-agar. The sowing of the investigated lactobacilli was incubated at 37 ° C in a microaerobic atmosphere based on 10% (v / v) carbon dioxide (CO2) and 5% (v / v) oxygen.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли по 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 2,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в при температуре 37°С в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей соответственно азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа в течение 48 часов.Upon completion of the first stage, 0.1 ml of the suspension of the test culture with a turbidity of bacterial suspension of 2.0 McF was uniformly applied to the surface of the second unpowered half of the culture system and the applied crops were incubated in at 37 ° C in a strict nitrogen-based anaerobic atmosphere containing respectively, nitrogen containing 5% (v / v) hydrogen and 10% (v / v) carbon dioxide within 48 hours.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Clostridium difficile 5 мм, для Clostridium perfringens 10 мм и для Clostridium septicum 15 мм, что позволило расценить как низкую антагонистическую активность лактобактерий против токсигенной Clostridium difficile и Clostridium perfringens и умеренную против Clostridium septicum. Что позволяет сделать вывод о неспособности лактобацилл пациентки обеспечить колонизационную резистентность макроорганизма, несмотря на высокий титр содержания лактобацилл в толстокишечном биотопе пациентки.Upon completion of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, the antagonistic activity of the test culture was estimated from the measured in millimeters distance from the middle of the lactobacilli lawn in a direction perpendicular to the frontal point of the lawn edge of the test culture. It was found that the measured growth inhibition zone of the test culture was 5 mm for Clostridium difficile, 10 mm for Clostridium perfringens and 15 mm for Clostridium septicum, which allowed us to regard the low antagonistic activity of lactobacilli against toxigenic Clostridium difficile and Clostridium perfringens and moderate against Clostridium septicum. This allows us to conclude about the inability of the patient's lactobacilli to ensure colonization resistance of the microorganism, despite the high titer of the content of lactobacilli in the patient's large colonic biotope.

Claims (8)

1. Способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы, характеризующийся тем, что в рабочий объем пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм заливают 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекают стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части, удаляют одну их них и создают комбинированную систему заливкой освободившегося объема до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного агара Columbia с 7% (об./об.) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования Helicobacter pylori или расплавленного Brucella агара с 7% (об./об.) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий, затем выполняют первый этап культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерии толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара, и созданный посев исследуемой лактобактерии инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в обогащенной 5-10% (об./об.) углекислым газом атмосфере, затем, по завершении первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно наносят 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF, и нанесенные посевы инкубируют при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере, при этом культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 ч, культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 ч, культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере CO2-инкубатора при температуре 37°С в течение 24 ч, культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 ч в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об./об.) углекислого газа (СО2) и 5% (об./об.) кислорода, культивирование штамма Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 ч в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об./об.) углекислого газа (СО2) и 5% (об./об.) кислорода и культивирование клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 ч в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об./об.) водорода и 10% (об./об.) углекислого газа, по завершении второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерии в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры, причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерии, при этом измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий и измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность.1. A method for evaluating the antagonistic activity of the lactobacilli of the colonic biotope of a patient with respect to a variety of bacteria by two-stage cultivation of the antagonist microorganism and the test culture under combined system conditions, characterized by the fact that de Mann liquid is applied to a single-use 90-mm plastic, ventilated Petri dish of working volume -Rogoza-Sharpe (MRS-agar) and after hardening the agar plate is dissected with a sterile scalpel along the diameter of a Petri dish on the back equal parts, remove one of them and create a combined system by pouring the released volume to the level of the initial agar (MRS-agar) 12-13 ml of molten trypticase-soy agar (TSA) to cultivate undemanding microorganisms, or Sabouraud molten agar to cultivate mushrooms, or Columbia molten agar with 5% (v / v) defibrated whole sheep blood for streptococcus cultivation, or Columbia molten agar with 10% (v / v) defibrated whole sheep blood for campylobacter cultivation st (C. jejuni), or Columbia molten agar with 7% (v / v) of defibrated lysed horse blood for cultivation of Helicobacter pylori or molten Brucella agar with 7% (v / v) of defibrated whole sheep blood for the cultivation of clostridia, then perform the first the stage of cultivation of the antagonist microorganism by uniform application of 0.1 ml of the suspension of the studied colonic biotope lactobacillus of a patient with a turbidity of 1.0 McF bacterial suspension on the surface of MRS-agar, and the established culture of the investigated lactobacillus is incubated at temperatures e 37 ° C for 24-48 h in an atmosphere enriched with 5-10% (v / v) carbon dioxide, then, at the end of the first stage, 0.1 ml of the suspension is uniformly applied to the surface of the second unpowered half of the combined culture system cultures with turbidity of bacterial suspension 1.0 McF, and applied crops are incubated with the following parameters on temperature, incubation time and atmosphere used, while the cultivation of unpretentious microorganisms is carried out in an air atmosphere incubator temperature of 37 ° C for 24 h, ku livirovanie mushrooms carried out in an atmosphere of an incubator at a temperature of 28 ° C for 24 h, the cultivation of streptococci is carried out in an atmosphere of a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C for 24 h, cultivation of campylobacter is carried out at a temperature of 37 ° C for 48 h in a microaerobic atmosphere based on nitrogen containing 10% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ) and 5% (v / v) oxygen, the cultivation of the Helicobacter pylori strain is carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 h in microaerobic a nitrogen-based atmosphere containing 10% (v / v) carbon dioxide of gas (CO 2) and 5% (vol. / vol.) of oxygen and culturing Clostridium carried out at a temperature of 37 ° C for 48-72 h in a strict anaerobic atmosphere at a nitrogen base containing 5% (vol. / vol.) hydrogen and 10% (vol./about.) carbon dioxide, at the end of the second stage of cultivation of the antagonist microorganism, assess the functional antagonistic activity of the test culture by measuring the distance in millimeters from the middle of the lawn edge of the lactobacillus perpendicular to the front point of the lawn edge of the test culture, the length of the measured growth zone of the test culture indicates the magnitude of the delay directed against it antagonistic activity of the investigated lactobacilli, while the measured growth inhibition zone of the test culture up to 1 mm is regarded as the absence of antagonistic activity of the lactobacilli measured length of the test culture from 1 up to 10 mm is regarded as low antagonistic activity of lactobacilli, measured zone of growth inhibition of the test culture for hydrochloric from 11 to 29 mm regarded as moderate antagonist activity measured lactobacilli and lactobacilli strain growth retardation zone width of 30 to 45mm are regarded as high antagonistic activity. 2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков применяют тестируемые суспензии с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF.2. The method according to claim 1, characterized in that in the process of applying to the surface of the second non-seeded half of the combined cultivation system, test suspensions with a bacterial suspension density of 2.0 McF are used as a test culture of clostridia and streptococci. 3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae.3. The method according to p. 1, characterized in that as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, use the unpretentious microorganisms Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis and Klebsiella pneumoniae. 4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют грибы Candida albicans и Candida tropicalis.4. The method according to claim 1, characterized in that the Candida albicans and Candida tropicalis fungi are used as the test strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied. 5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis.5. The method according to claim 1, characterized in that streptococci Streptococcus pyogenes and Streptococcus mitis are used as the test strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied. 6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют кампилобактерии Campylobacter jejuni NCTC 11638.6. The method according to claim 1, characterized in that Campylobacter jejuni NCTC 11638 campylobacter is used as the test strains for which the antagonistic activity of lactobacteria has been studied. 7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют штамм Helicobacter pylori NCTC 11639.7. The method according to p. 1, characterized in that as the studied strains for which the antagonistic activity of lactobacilli was studied, use the strain Helicobacter pylori NCTC 11639. 8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют клостридии Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.8. The method according to claim 1, characterized in that Clostridium difficile, Clostridium perfringens and Clostridium septicum clostridia are used as the test strains for which the antagonistic activity of lactobacilli has been studied.
RU2018114278A 2018-04-18 2018-04-18 Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system RU2670585C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018114278A RU2670585C1 (en) 2018-04-18 2018-04-18 Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018114278A RU2670585C1 (en) 2018-04-18 2018-04-18 Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2670585C1 true RU2670585C1 (en) 2018-10-23

Family

ID=63923562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018114278A RU2670585C1 (en) 2018-04-18 2018-04-18 Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2670585C1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2704115C1 (en) * 2018-10-22 2019-10-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН) Method of determining antagonist activity of bacterial strains with respect to pseudomonas aeruginosa
RU2813754C1 (en) * 2023-03-20 2024-02-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Method of stimulating antagonistic activity of lactobacilli

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2412989C1 (en) * 2009-12-08 2011-02-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Method of individual detection of antagonistic activity of probiotic preparations, containing lactobacteria and/or bifidobacteria with respect to opportunistic microorganisms, isolated during diagnostics of intestinal dysbacteriosis
RU2482177C1 (en) * 2012-02-16 2013-05-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации"(ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России) Lactobacillus plantarum BACTERIA STRAIN HAVING WIDE RANGE OF ANTAGONISTIC ACTIVITY WITH RESPECT TO PATHOGENS AND OPPORTUNISTIC PATHOGENS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2412989C1 (en) * 2009-12-08 2011-02-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Method of individual detection of antagonistic activity of probiotic preparations, containing lactobacteria and/or bifidobacteria with respect to opportunistic microorganisms, isolated during diagnostics of intestinal dysbacteriosis
RU2482177C1 (en) * 2012-02-16 2013-05-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации"(ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России) Lactobacillus plantarum BACTERIA STRAIN HAVING WIDE RANGE OF ANTAGONISTIC ACTIVITY WITH RESPECT TO PATHOGENS AND OPPORTUNISTIC PATHOGENS

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЖУХОВИЦКИЙ В.Г., СУХИНА М.А. "Антагонистическая активность лактобацилл толстого кишечника".//Тезисы докладов V Научно-практической конференции "Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ", 17-18 мая 2012, -М. с.15-17. *
ЖУХОВИЦКИЙ В.Г., СУХИНА М.А. "Антагонистическая активность лактобацилл толстого кишечника".//Тезисы докладов V Научно-практической конференции "Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ", 17-18 мая 2012, -М. с.15-17. ИРКИТОВА А.Н. и др. "Сравнительный анализ методов определения антагонистической активности молочнокислых бактерий".//Известия Алтайского государственного университета, серия Биология, 2012, с.41-44. *
ИРКИТОВА А.Н. и др. "Сравнительный анализ методов определения антагонистической активности молочнокислых бактерий".//Известия Алтайского государственного университета, серия Биология, 2012, с.41-44. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2704115C1 (en) * 2018-10-22 2019-10-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН) Method of determining antagonist activity of bacterial strains with respect to pseudomonas aeruginosa
RU2813754C1 (en) * 2023-03-20 2024-02-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Method of stimulating antagonistic activity of lactobacilli

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cinquin et al. New three-stage in vitro model for infant colonic fermentation with immobilized fecal microbiota
Young et al. Morphological analysis of Helicobacter pylori from gastric biopsies and dental plaque by scanning electron microscopy
Wisselink et al. Quantitative susceptibility of Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs in seven European countries to antimicrobial agents licenced in veterinary medicine
Brousseau et al. Effects of probiotics Pediococcus acidilactici strain MA18/5M and Saccharomyces cerevisiae subsp. boulardii strain SB-CNCM I-1079 on fecal and intestinal microbiota of nursing and weanling piglets
Queiroga Prevalence and aetiology of sheep mastitis in Alentejo region of Portugal
Morandi et al. Influence of pH and temperature on the growth of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis
RU2460778C1 (en) Method for producing autoprobiotic of enterocuccus faecium being representative of indigenic host intestinal microflora
RU2670585C1 (en) Method for evaluating antagonistic activity of lactobacilli of colonic biotope of patient with respect to different bacteria by two-stage cultivation of antagonist microorganism and test culture in conditions of combined system
Mukhammadiev et al. Antagonistic properties and biocompatibility as important principles for development of effective and biosafety probiotic drugs
Bayona Rojas Microbiological conditions for culturing Helicobacter Pylori
Schmidtke et al. Induction, characterisation and pathogenicity in rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) of Lactococcus garvieae L-forms
Maritan et al. Gut microbe Lactiplantibacillus plantarum undergoes different evolutionary trajectories between insects and mammals
Sokolova et al. Characteristics of species composition, biochemical and pathogenic nature of the microbiota of mammary gland and the reproductive tract in dairy cows
JP2022076001A (en) Agar medium for microorganism culture
Oktari et al. The optimization of Human Blood Agar (HBA) for Streptococcus pneumonia growth
Jagódka et al. Vaginal aerobic bacteria of healthy bitches and those with fertility problems
WO2021005813A1 (en) Culture medium for selectively separating lactic acid bacterium
Al-Rammahi et al. Bacteriological study of Enterococcus bacteria isolated from different diseases in the female cows
Okuklu Isolation, characterization, and screening probiotic properties of artisanal yoghurt starter strains from Urla region
RU2253674C2 (en) Treatment biological preparation against animal endometritis
Subramaniyan et al. Differential expression of urease genes and ureolytic activity of uropathogenic Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa isolates in different nutritional conditions
Allegro et al. Uptake and replication in Acanthamoeba castellanii of a virulent (pVAPA-positive) strain of Rhodococcus equi and its isogenic, plasmid-cured strain
RU2350648C1 (en) Method of estimation of probiotics opposing activity on basis of lyophilised biomass of anaerobic bacteria in relation to pathogenic micobacteria
RU2484141C1 (en) Elective-differential nutrient medium for extraction of choleraic vibrios
Awad et al. Escherichia Coli associated with Environmental Mastitis in Sheep and Goats Farms: Probable Sources, antibiogram profile and Molecular characterization