RU2666991C1 - Genetic constructs and their mixtures for anti-hiv therapy - Google Patents
Genetic constructs and their mixtures for anti-hiv therapy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2666991C1 RU2666991C1 RU2017132189A RU2017132189A RU2666991C1 RU 2666991 C1 RU2666991 C1 RU 2666991C1 RU 2017132189 A RU2017132189 A RU 2017132189A RU 2017132189 A RU2017132189 A RU 2017132189A RU 2666991 C1 RU2666991 C1 RU 2666991C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- promoter
- gene
- vector
- human
- genetic
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 28
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 77
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 51
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 20
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 claims description 13
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 claims description 13
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 9
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 claims description 8
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 7
- 101000946926 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 7
- 108091026821 Artificial microRNA Proteins 0.000 claims description 6
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 6
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 6
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 6
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 6
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 229940125777 fusion inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 4
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 claims description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 claims description 4
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 4
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 4
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 4
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 claims description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 4
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 claims description 4
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 4
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 101710103773 Histone H2B Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021639 Histone H2B type 1-K Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 claims 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 abstract description 17
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 16
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 7
- 108010017088 CCR5 Receptors Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 32
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 32
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108091087148 miR-20 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091066984 miR-20-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091076199 miR-20-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 108700011778 CCR5 Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091053398 TRIM/RBCC family Proteins 0.000 description 1
- 102000011408 Tripartite Motif Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000048160 human CCR5 Human genes 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской и молекулярной генетике, а именно к генетическим конструкциям, содержащим микроРНК, которые направлены на ингибирование гена рецептора CCR5, и обладающим антивирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека. Изобретение может быть использовано в здравоохранении как противовирусный агент при антиВИЧ терапии.The invention relates to medical and molecular genetics, namely to genetic constructs containing miRNAs that are aimed at inhibiting the CCR5 receptor gene and having antiviral activity against human immunodeficiency virus. The invention can be used in healthcare as an antiviral agent in anti-HIV therapy.
Хемокиновый рецептор CCR5 служит одним из двух корецепторов, которые вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) использует для проникновения в клетку. В популяции был обнаружен полиморфный делетированный вариант гена CCR5Δ32, продуктом которого является нефункциональный белок, и показано, что гомозиготы по CCR5Δ32 устойчивы к заражению R5-тропным вирусом, а наличие этого варианта гена в гетерозиготном состоянии у ВИЧ-инфицированных ассоциируется с более медленным прогрессированием заболевания. При этом каких-либо патологий, сопровождающих данную мутацию корецептора, у его носителей выявлено не было.The chemokine receptor CCR5 is one of two coreceptors that the human immunodeficiency virus (HIV) uses to enter the cell. A polymorphic deleted variant of the CCR5Δ32 gene was discovered in the population, the product of which is a non-functional protein, and it was shown that homozygotes for CCR5Δ32 are resistant to infection with the R5-tropic virus, and the presence of this variant of the gene in the heterozygous state of HIV-infected people is associated with a slower progression of the disease. In this case, any pathologies accompanying this mutation of the coreceptor were not detected in its carriers.
Поэтому подавление экспрессии гена корецептора CCR5 с помощью лентивирусов, доставляющих в геном клеток-мишеней антиCCR5 микроРНК, является перспективной стратегией в генной терапии. Ранее (патент РФ №2426788, опубликован 20.08.2011; МПК C12N 15/86) была создана микроРНК, эффективно подавляющая CCR5, и состоящая из двух одинаковых тандемно повторенных микроРНК. Однако последовательное расположение в структуре лентивирусного вектора одинаковых микроРНК или любых других повторяющихся последовательностей может привести к нежелательным рекомбинационным событиям и, как следствие, генетической нестабильности вектора. По этой причине было решено найти дополнительную микроРНК, эффективно ингибирующую экспрессию CCR5, и заменить ею одну из одинаковых микроРНК.Therefore, suppression of CCR5 coreceptor gene expression with lentiviruses delivering antiCCR5 miRNAs to the target cell genome is a promising strategy in gene therapy. Previously (RF patent No. 2426788, published 08/20/2011; IPC C12N 15/86) a microRNA was created that effectively suppresses CCR5 and consists of two identical tandem repeating microRNAs. However, the sequential arrangement of identical microRNAs or any other repeating sequences in the structure of the lentiviral vector can lead to undesirable recombination events and, as a consequence, the genetic instability of the vector. For this reason, it was decided to find additional miRNA that effectively inhibits the expression of CCR5 and replace it with one of the same miRNAs.
В патенте РФ №2426788 также продемонстрировано, что комбинирование двух и более антивирусных агентов, перечисленных ниже, в одной генетической конструкции обеспечивает синергетический эффект: каждый агент по отдельности в различной степени подавляет репродукцию ВИЧ (от 50% до 90%); одновременное использование нескольких противовирусных агентов замедляет образование мутантных штаммов, а комбинация противовирусных агентов с агентами, придающими резистентность клеткам к ВИЧ, позволяет достичь 95-99% ингибирования ВИЧ и предотвратить появление устойчивых мутантов.The RF patent No. 2426788 also demonstrated that the combination of two or more antiviral agents listed below in one genetic construct provides a synergistic effect: each agent individually suppresses the reproduction of HIV to varying degrees (from 50% to 90%); the simultaneous use of several antiviral agents slows down the formation of mutant strains, and the combination of antiviral agents with agents that confer resistance to HIV cells allows 95-99% inhibition of HIV to be achieved and the emergence of resistant mutants.
В статье Глазковой Д.В., и др. "Подавление экспрессии гена CCR5-рецептора человека с помощью искусственных микроРНК" //Молекулярная биология, 2013, Том 47, №3, С. 475-485 показано, что объединение нескольких микроРНК в один транскрипт (в частности, объединение двух или трех микроРНК mic131g) обеспечивало усиление ингибирования экспрессии CCR5. Из упомянутой статьи известно также, что можно использовать для ингибирования экспрессии CCR5 и комбинации нескольких различных микроРНК и что порядок расположения микроРНК в полицистроне влиял на способность получаемой кассеты ингибировать экспрессию CCR5.In the article by Glazkova D.V. et al. "Suppression of Human CCR5 Receptor Gene Expression Using Artificial MicroRNAs" // Molecular Biology, 2013, Volume 47, No. 3, P. 475-485, it is shown that combining several microRNAs into one transcript (in particular, the combination of two or three micRNA mic131g) provided increased inhibition of CCR5 expression. It is also known from the aforementioned article that it can be used to inhibit the expression of CCR5 and a combination of several different miRNAs and that the arrangement of miRNAs in the polycistron affected the ability of the resulting cassette to inhibit CCR5 expression.
В качестве документа, раскрывающего техническое решение, наиболее близкую к рассматриваемой (прототипа), может быть выбран патент РФ №2426788. Раскрываемые в нем решения являются наиболее близкими к рассматриваемым решениям. При этом авторы рассматриваемого технического решения отмечают, что последовательное расположение в структуре лентивирусного вектора согласно прототипу одинаковых микроРНК или любых других повторяющихся последовательностей является недостатком и может привести к нежелательным рекомбинационным событиям и, как следствие, генетической нестабильности вектора.As a document disclosing a technical solution closest to the considered one (prototype), RF patent No. 2426788 can be selected. The solutions disclosed in it are closest to the solutions considered. At the same time, the authors of the considered technical solution note that the sequential arrangement of the lentiviral vector according to the prototype of the same miRNAs or any other repeating sequences is a drawback and can lead to undesirable recombination events and, as a result, the genetic instability of the vector.
Отличие настоящего изобретения от прототипа заключается во введении дополнительной микроРНК, эффективно ингибирующей экспрессию CCR5, и замене одной из одинаковых микроРНК (обозначенной как «old» (SEQ ID NO 1) и идентичной раскрытой в прототипе последовательности) на другую последовательность - «новая микро», которая далее обозначена как «new», или SEQ ID NO 2).The difference of the present invention from the prototype is the introduction of additional miRNAs that effectively inhibits the expression of CCR5, and the replacement of one of the same miRNAs (designated as "old" (SEQ ID NO 1) and identical to that disclosed in the prototype sequence) with another sequence - "new micro", which is hereinafter referred to as “new”, or SEQ ID NO 2).
Задачей настоящего изобретения является создание эффективных противовирусных средств нового поколения, предназначенных для лечения ВИЧ-инфекции.The objective of the present invention is to provide effective new generation antiviral agents for treating HIV infection.
Технические результаты:Technical Results:
- повышение стабильности вектора, ингибирующего экспрессию CCR5, и как следствие, повышение эффективности анти-ВИЧ терапии указанным агентом;- increasing the stability of the vector, inhibiting the expression of CCR5, and as a result, increasing the effectiveness of anti-HIV therapy with the specified agent;
- расширение арсенала противовирусных средств нового поколения, предназначенных для лечения ВИЧ-инфекции.- expansion of the arsenal of new generation antiviral agents for treating HIV infection.
Поставленная задача решается, а технический результат достигается путем создания генетической конструкции для антиВИЧ терапии, которая содержит две или более искусственных микроРНК, которые ингибируют экспрессию гена рецептора человека CCR5.The problem is solved, and the technical result is achieved by creating a genetic construct for anti-HIV therapy, which contains two or more artificial miRNAs that inhibit the expression of the human CCR5 receptor gene.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический результат также достигается тем, что:According to preferred embodiments, the specified technical result is also achieved by the fact that:
- упомянутая конструкция содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4;- said construct comprises a nucleotide sequence selected from
- экспрессия искусственных микроРНК регулируется промотором РНК полимеразы II человека;- the expression of artificial miRNAs is regulated by the RNA polymerase II human promoter;
- промотор РНК полимеразы II человека выбран из списка, включающего промотор гена фактора элонгации EFα, промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK), промотор гена β-актина, убиквитиновый промотор UbC, гистоновый промотор Н2 В (ТН2В), промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, промотор гена Т-клеточного рецептора, промотор гена β-интерферона, промотор гена CD4 человека, промотор гена рецептора CCR5 человека, промотор гена рецептора IL2, генов МНС класса II, гена α-фетопротеина, гена γ-глобина, гена β-глобина, генов кодирующих α- и β-субъединицы гемоглобина человека, гена альбумина, гена коллагеназы, гена металлотионеина (MTII), гена эластазы I, гена c-HA-ras, гена инсулина, промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) (см. Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 1441); цитомега-ловирусный промотор (CMV), самый ранний промотор цитомегаловируса (IE1) (см. Karasuyama et al., J. Exp. Med., 1989, 169: 13); промотор вируса саркомы Рауса (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 1980, 22:787); главный поздний промотор аденовируса (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 3567) или их аналоги;- the human RNA polymerase II RNA promoter is selected from the list including the promoter of the EFα elongation factor gene, the phosphoglycerate kinase (PGK) gene promoter, the β-actin gene promoter, the ubiquitin UbC promoter, the histone H2 B (TH2B) promoter, the human immunoglobulin heavy chain gene promoter, T cell receptor gene, β-interferon gene promoter, human CD4 gene promoter, human CCR5 receptor gene promoter, IL2 receptor gene promoter, MHC class II genes, α-fetoprotein gene, γ-globin gene, β-globin gene, coding genes α- and β-subunits of hemog human lobin, albumin gene, collagenase gene, metallothionein gene (MTII), elastase I gene, c-HA-ras gene, insulin gene, herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase promoter (see Wagner et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA, 1981, 78: 1441); the cytomegalovirus promoter (CMV), the earliest promoter of cytomegalovirus (IE1) (see Karasuyama et al., J. Exp. Med., 1989, 169: 13); Routh sarcoma virus (RSV) promoter (Yamamoto et al., Cell, 1980, 22: 787); the main late promoter of adenovirus (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 3567) or their analogs;
- промотор РНК полимеразы II является регулируемым промотором, причем упомянутый промотор выбран из списка, включающего тетрациклин регулируемый промотор, LacZ регулируемый промотор, экдизон регулируемый промотор;- the RNA polymerase II promoter is a regulated promoter, said promoter being selected from a list of tetracycline regulated promoter, LacZ regulated promoter, ecdysone regulated promoter;
- упомянутая конструкция находится в составе вектора;- said construction is part of a vector;
- в качестве вектора используется лентивирусный вектор на основе одного или нескольких из лентивирусов, выбранных из группы, включающей ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИО, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, лентивирус артрита-энцефалита коз, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек, и/или вирус болезни Джембрана, или вектор, созданный на основе спумавируса;- a lentiviral vector based on one or more of lentiviruses selected from the group of HIV-1, HIV-2, VIO, cattle immunodeficiency virus, goat arthritis-encephalitis lentivirus, equine infectious anemia virus, cat immunodeficiency virus is used as a vector , and / or the membrane disease virus, or a vector based on spumavirus;
- в качестве вектора используется невирусный вектор, созданный на основе векторной системы транспозон/транспозаза;- a non-viral vector created on the basis of the transposon / transposase vector system is used as a vector;
- в качестве вектора используется аденоассоциированный вектор или его производные;- an adeno-associated vector or its derivatives is used as a vector;
- упомянутая конструкция фланкирована последовательностями, имеющими гомологию с последовательностями в заданном участке хромосомы человека и может быть встроена за счет внесения разрыва в этот заданный участок хромосомы с помощью специфической эндонуклеазы, и последующей гомологичной рекомбинации между фланкирующими последовательностями и прилегающими к разрыву участками хромосомы.- the aforementioned construct is flanked by sequences having homology with sequences in a given region of the human chromosome and can be integrated by introducing a gap into this predetermined region of the chromosome using a specific endonuclease, and subsequent homologous recombination between the flanking sequences and the regions of the chromosome adjacent to the gap.
Поставленная задача решается также созданием смеси генетических конструкций для антиВИЧ терапии, включающей генетическую конструкцию для антиВИЧ терапии, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4, и одну или более генетические конструкции, содержащие последовательности, выбранные из группы последовательностей, включающей:The problem is also solved by creating a mixture of genetic constructs for anti-HIV therapy, including a genetic construct for anti-HIV therapy, containing a nucleotide sequence selected from
последовательности, кодирующей связанный с мембранной ингибитор слияния С46 [Hildinger М et al. // J Virol. 2001; 75(6): 3038-3042, Egelhofer M et al. // J Virol. 2004; 78(2):568-75.] (SEQ ID NO 7),a sequence encoding a membrane bound fusion inhibitor C46 [Hildinger M et al. // J Virol. 2001; 75 (6): 3038-3042, Egelhofer M et al. // J Virol. 2004; 78 (2): 568-75.] (SEQ ID NO 7),
последовательности, кодирующей неиммуногенный ингибитор слияния V2O (Brauer F., et al. // Antimicrob Agents Chemother. 2013, 57(2), 679-688),a sequence encoding a non-immunogenic V2O fusion inhibitor (Brauer F., et al. // Antimicrob Agents Chemother. 2013, 57 (2), 679-688),
последовательности, кодирующей модифицированный белок из семейства Trim (Chan Е, et al. // Hum. Gene Ther. 2012, 23(11): 1176-85; Yap M.W., et al. // J. Virol. 2006, 80(8): 4061-4067; Turrini F., et al. // DNA and Cell Biology. 2014, 33(4): 191-197; Tabah A.A., et al. // J. Gen. Virol. 2014, 95(Pt 4): 960-967).a sequence encoding a modified protein from the Trim family (Chan E, et al. // Hum. Gene Ther. 2012, 23 (11): 1176-85; Yap MW, et al. // J. Virol. 2006, 80 (8 ): 4061-4067; Turrini F., et al. // DNA and Cell Biology. 2014, 33 (4): 191-197; Tabah AA, et al. // J. Gen. Virol. 2014, 95 (Pt 4): 960-967).
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический результат также достигается тем, что:According to preferred embodiments, the specified technical result is also achieved by the fact that:
- последовательностью, кодирующей модифицированный белок человека из семейства Trim, является последовательность, кодирующая модифицированный белок TRIM5a человека (SEQ ID NO 8) (см. патенты РФ №№2426788 и 2533817, а также Jung U., et al. // Human Gene Therapy, 2015, 26(10): 664-679; Stremlau M., et al. // J. Virol, 2005, 79(5): 3139-3145; Neagu M.R., et al. // J. Clin. Invest. 2009, 119(10): 3035-3047);- the sequence encoding the modified human protein from the Trim family is the sequence encoding the modified human TRIM5a protein (SEQ ID NO 8) (see RF patents Nos. 2426788 and 2533817, as well as Jung U., et al. // Human Gene Therapy 2015, 26 (10): 664-679; Stremlau M., et al. // J. Virol, 2005, 79 (5): 3139-3145; Neagu MR, et al. // J. Clin. Invest. 2009, 119 (10): 3035-3047);
- экспрессия упомянутых конструкций регулируется промотором РНК полимеразы II человека;- the expression of these structures is regulated by the promoter of the RNA polymerase II of man;
- промотор РНК полимеразы II человека выбран из списка, включающего промотор гена фактора элонгации EFα, промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK), промотор гена β-актина, убиквитиновый промотор UbC, гистоновый промотор Н2В (ТН2В), промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, промотор гена Т-клеточного рецептора, промотор гена β-интерферона, промотор гена CD4 человека, промотор гена рецептора CCR5 человека, промотор гена рецептора IL2, генов МНС класса II, гена α-фетопротеина, гена γ-глобина, гена β-глобина, генов кодирующих α- и β-субъединицы гемоглобина человека, гена альбумина, гена коллагеназы, гена металлотионеина (MTII), гена эластазы I, гена c-HA-ras, гена инсулина, промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV), цитомегаловирусный промотор (CMV), самый ранний промотор цитомегаловируса (IE1), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), главный поздний промотор аденовируса или их аналоги;- the human RNA polymerase II RNA promoter is selected from the list including the promoter of the EFα elongation factor gene, the phosphoglycerate kinase (PGK) gene promoter, the β-actin gene promoter, the ubiquitin UbC promoter, the histone H2B (TH2B) promoter, the human immunoglobulin heavy chain gene promoter, T-cell receptor, β-interferon gene promoter, human CD4 gene promoter, human CCR5 receptor gene promoter, IL2 receptor gene promoter, MHC class II genes, α-fetoprotein gene, γ-globin gene, β-globin gene, α coding genes - and β-subunits of hemog human obin, albumin gene, collagenase gene, metallothionein gene (MTII), elastase I gene, c-HA-ras gene, insulin gene, herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase promoter, CMV promoter, the earliest cytomegalovirus promoter (IE1 ), the promoter of Routh sarcoma virus (RSV), the main late promoter of adenovirus or their analogues;
- промотор РНК полимеразы II является регулируемым промотором, причем упомянутый промотор выбран из списка, включающего тетрациклин регулируемый промотор, LacZ регулируемый промотор, экдизон регулируемый промотор;- the RNA polymerase II promoter is a regulated promoter, said promoter being selected from a list of tetracycline regulated promoter, LacZ regulated promoter, ecdysone regulated promoter;
- упомянутые конструкции находятся в составе вектора;- the mentioned structures are part of the vector;
- в качестве вектора используется лентивирусный вектор на основе одного или нескольких из лентивирусов, выбранных из группы, включающей ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИО, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, лентивирус артрита-энцефалита коз, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек, и/или вирус болезни Джембрана, или вектор, созданный на основе спумавируса;- a lentiviral vector based on one or more of lentiviruses selected from the group of HIV-1, HIV-2, VIO, cattle immunodeficiency virus, goat arthritis-encephalitis lentivirus, equine infectious anemia virus, cat immunodeficiency virus is used as a vector , and / or the membrane disease virus, or a vector based on spumavirus;
- в качестве вектора используется невирусный вектор, созданный на основе векторной системы транспозон/транспозаза;- a non-viral vector created on the basis of the transposon / transposase vector system is used as a vector;
- в качестве вектора используется аденоассоциированный вектор или его производные;- an adeno-associated vector or its derivatives is used as a vector;
- упомянутые конструкции фланкированы последовательностями, имеющими гомологию с последовательностями в заданном участке хромосомы человека и могут быть встроены за счет внесения разрыва в этот заданный участок хромосомы с помощью специфической эндонуклеазы, и последующей гомологичной рекомбинации между фланкирующими последовательностями и прилегающими к разрыву участками хромосомы.- the aforementioned constructs are flanked by sequences having homology with sequences in a given region of the human chromosome and can be integrated by introducing a gap into this predetermined region of the chromosome using a specific endonuclease, and subsequent homologous recombination between the flanking sequences and the regions of the chromosome adjacent to the gap.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Сконструирована комбинация двух различных искусственных микроРНК, выключающих экспрессию рецептора CCR5. Показано, что новая комбинация обладает более высокой активностью по сравнению с двойной комбинацией, исследованной ранее. В отличие от комбинации, состоящей из одинаковых микроРНК, новая конструкция не подвергалась перестройкам и делециям.A combination of two different artificial miRNAs was constructed to turn off the expression of the CCR5 receptor. It was shown that the new combination has a higher activity compared to the double combination studied earlier. Unlike the combination consisting of the same miRNAs, the new construct did not undergo rearrangements and deletions.
Поскольку выключения только одного рецептора CCR5 может быть недостаточно для ингибирования репликации ВИЧ, по крайней мере, по причине возможного переключения тропности вируса на другой рецептор (CXCR4), необходимо создавать препарат комбинированного действия, в частности, путем объединения нескольких антиВИЧ генов в один вектор либо путем создания смеси (коктейля) вирусных векторов. Поэтому разработанная конструкция микроРНК планируется для лечения ВИЧ-инфекции как самостоятельно, так и в комплексе с другими конструкциями, в частности, ген С46 (ингибитор слияния) и модифицированный ген TPIM5a.Since switching off only one CCR5 receptor may not be enough to inhibit HIV replication, at least because of the possible switching of the virus tropism to another receptor (CXCR4), it is necessary to create a combined drug, in particular, by combining several anti-HIV genes into one vector or by creating a mixture (cocktail) of viral vectors. Therefore, the developed microRNA construct is planned for the treatment of HIV infection both independently and in combination with other constructs, in particular, the C46 gene (fusion inhibitor) and the modified TPIM5a gene.
Последовательности, исследуемые в настоящем изобретении:The sequences studied in the present invention:
- Последовательность, кодирующая искусственную микроРНК (обозначена как SEQ ID NO 1, а также как mic131g или "old"), идентичная последовательности SEQ ID NO 10 в прототипе, экспрессия которой приводит к образованию короткой интерферирующей РНК, направленной против гена рецептора человека CCR5 (miRNA3 CCR5).- The sequence encoding artificial microRNA (designated as
Новая последовательность, кодирующая искусственную микроРНК (обозначена как SEQ ID NO 2, а также как "new" и mic1002).A new sequence encoding artificial microRNA (designated as
- Новая последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic1002 + микроРНК mic131g, обозначенная как "new+old" (SEQ ID NO 3).- A new sequence encoding the artificial miRNA mic1002 + miRNA mic131g, designated as "new + old" (SEQ ID NO 3).
- Новая последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic131g + микроРНК mic1002, обозначенная как "old+new" (SEQ ID NO 4).- A new sequence encoding artificial micRNA mic131g + miRNA mic1002, designated as "old + new" (SEQ ID NO 4).
- Последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic131g + микроРНК mic131g, обозначенная как "old+old" или mic131g*2, или "old*2" (SEQ ID NO 5).- The sequence encoding the artificial miRNA mic131g + miRNA mic131g, designated as "old + old" or mic131g * 2, or "old * 2" (SEQ ID NO 5).
- Последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic131g + микроРНК mic131g + микроРНК mic131g, обозначенная как "old*3" (SEQ ID NO 6).- The sequence encoding artificial miRNA mic131g + miRNA mic131g + miRNA mic131g, designated as "old * 3" (SEQ ID NO 6).
Далее приводятся примеры осуществления изобретения со ссылками на прилагаемые фигуры.The following are examples of carrying out the invention with reference to the accompanying figures.
На фиг. 1 приведены схемы лентивирусных векторов, использованных в данной работе, где:In FIG. 1 shows the scheme of lentiviral vectors used in this work, where:
LTR - длинный концевой повтор,LTR - long terminal repeat,
ψ - упаковочный сигнал лентивирусов,ψ is the packaging signal of lentiviruses,
RRE - элемент, отвечающий за связывание белка rev,RRE is an element responsible for the binding of rev protein,
сРРТ - центральный полипуриновый тракт,SRPT - the central polypurine tract,
MCS - множественный сайт клонирования.MCS is a multiple cloning site.
На фиг. 2 показана оценка целостности структуры новых векторов, где:In FIG. 2 shows the assessment of the integrity of the structure of new vectors, where:
1 - "old+old",1 - "old + old",
2 - "new+old",2 - "new + old",
3 - "old+new",3 - "old + new",
4 - отрицательный контроль-вектор, не содержащий микроРНК.4 - negative control vector that does not contain miRNAs.
На фиг. 3 показано подавление экспрессии CCR5 конструкциями, содержащими различные микроРНК. Векторы, кодирующие короткие шпилечные РНК (далее - кшРНК), включая sh131g, обозначенный как "sh old", и sh1005, обозначенный как "sh new", были использованы как положительные контроли. Вектор, состоящий из трех mic131g (из трех "old" последовательностей), обозначен как "old*3". Отрицательный контроль - вектор, не содержащий микроРНК, обозначен как "К".In FIG. Figure 3 shows inhibition of CCR5 expression by constructs containing various miRNAs. Vectors encoding short hairpin RNAs (hereinafter “kshRNA”), including sh131g, designated as “sh old”, and sh1005, designated as “sh new”, were used as positive controls. A vector consisting of three mic131g (of three "old" sequences) is designated as "old * 3". Negative control - a vector that does not contain miRNAs is designated as "K".
На фиг. 4 показан количественный анализ коротких микроРНК методом ПЦР в реальном времени, совмещенный с обратной транскрипцией.In FIG. Figure 4 shows the quantitative analysis of short miRNAs by real-time PCR combined with reverse transcription.
На фиг. 4А - ПЦР с праймерами к микроРНК "old".In FIG. 4A - PCR with primers for microRNA "old".
На фиг. 4Б - ПЦР с праймерами к микроРНК "new".In FIG. 4B - PCR with primers for microRNA "new".
** - р<0.01, n=3.** - p <0.01, n = 3.
На фиг. 5 показаны результаты измерения количества рецептора CCR5 на клетках MAGI, трансдуцированных лентивирусом с соответствующей микроРНК, с помощью проточной цитометрии.In FIG. Figure 5 shows the results of measuring the amount of CCR5 receptor on MAGI cells transduced with lentivirus with the corresponding miRNA using flow cytometry.
Стрелками обозначено:The arrows indicate:
По оси ординат - увеличение флуоресценции, соответствующее увеличению количества рецептора CCR5.The ordinate shows the increase in fluorescence corresponding to an increase in the number of CCR5 receptors.
По оси абсцисс - увеличение флуоресценции, соответствующее увеличению количества флуоресцентного маркера EGFP.The abscissa shows the increase in fluorescence, corresponding to an increase in the amount of the EGFP fluorescent marker.
АнтиCCR5 а/т - клетки, окрашенные флуоресцентно меченными антителами к CCR5.AntiCCR5 a / t - cells stained with fluorescently labeled antibodies to CCR5.
Неокрашенные клетки - клетки без окраски антителами. Исследованные образцы клеток:Unpainted cells are cells without antibody staining. Studied cell samples:
«Нет вектора» - клетки MAGI-CCR5, не трансдуцированные вектором.“No vector” - MAGI-CCR5 cells not transduced by the vector.
«GFP only» - те же клетки, трансдуцированные контрольным вектором, содержащим только EGFP маркер"GFP only" - the same cells transduced with a control vector containing only the EGFP marker
«old*2», «old+new», «new+old» - клетки, трансдуцированные соответствующими векторами, содержащими микроРНК «old*2», «old+new», «new+old».“Old * 2”, “old + new”, “new + old” - cells transduced with the corresponding vectors containing microRNAs “old * 2”, “old + new”, “new + old”.
На фиг. 6 в виде гистограммы представлены данные по количеству CCR5 на поверхности GFP + клеток, нормированные на значение, полученное для клеток GFP only. Эти количественные данные получены при обработке данных проточного цитометра, пример которых представлен на фиг. 5.In FIG. Figure 6 shows a histogram of the number of CCR5 on the surface of GFP + cells normalized to the value obtained for GFP only cells. These quantitative data were obtained by processing the data of a flow cytometer, an example of which is shown in FIG. 5.
«MFI* % мод. клеток» - это средняя интенсивность флуоресценции белка EGFP, умноженная на процент модифицированных клеток."MFI *% mod. cells ”is the average fluorescence intensity of the EGFP protein, multiplied by the percentage of modified cells.
На фиг. 7 представлена динамика вирусной нагрузки ВИЧ в культурах клеток, трансдуцированных различными лентивирусными векторами.In FIG. Figure 7 shows the dynamics of the HIV viral load in cell cultures transduced with various lentiviral vectors.
На фиг. 8 представлена динамика вирусной нагрузки ВИЧ в культурах первичных CD4 + лимфоцитов человека.In FIG. Figure 8 shows the dynamics of HIV viral load in cultures of primary CD4 + human lymphocytes.
На фиг. 9 представлена динамика вирусной нагрузки ВИЧ в культурах клеток MAGI, трансдуцированных различными лентивирусными векторами.In FIG. Figure 9 shows the dynamics of the HIV viral load in MAGI cell cultures transduced with various lentiviral vectors.
«Control cells» - нетрансдуцированные клетки MAGI, используемые в качестве контроля.“Control cells” are non-transduced MAGI cells used as controls.
Примеры осуществления изобретения и реализации назначенияExamples of the invention and the implementation of the purpose
Пример 1. Конструирование новой искусственной микроРНК mic1002 и новых комбинаций микроРНКExample 1. The construction of a new artificial miRNA mic1002 and new combinations of miRNAs
Новая искусственная микроРНК (далее - amiPHK) mic1002, обозначенная как SEQ ID NO 2, а также как "new", была создана на основе эндогенной человеческой микроРНК mir-20, входящей в состав полицистрона mir-17-92, путем замещения нативной антисмысловой цепи mir-20 на антиССК5 последовательность. Антисмысловая последовательность была выбрана на основании данных литературы, в которых была описана короткая шпилечная РНК (кшРНК sh1005), эффективно подавляющая CCR5 и обладающая низкой токсичностью (Shimizu S. et al., Genetic Vaccines and Therapy, 2009, 7:8, https://gvt-journal.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-0556-7-8). Данная кшРНК комплементарна области + 1001 п. н. от стартового кодона, практически в самом конце рамки считывания гена CCR5. На ту же самую область и нацелена новая amiPHK mic1002 (+1002 п. н. от стартового кодона).The new artificial microRNA (hereinafter - amiPHK) mic1002, designated as
Далее авторами были созданы конструкции, объединяющие в своем составе две разные amiPHK - mic131g (из прототипа) и mic1002. В таблице 1 кратко охарактеризованы обе amiPHK. Каждая из них содержит часть микроРНК предшественника, которая комплементарна мРНК CCR5 и связывается с мРНК, так называемая зрелая микроРНК. Остальные последовательности в составе исходной микроРНК нужны для правильного процессирования исходной микроРНК. Всего было создано 2 новых конструкции, содержащих разные amiPHK.Further, the authors created designs combining two different amiPHKs - mic131g (from the prototype) and mic1002. Table 1 summarizes both amiPHKs. Each of them contains a portion of the miRNA of the precursor, which is complementary to CCR5 mRNA and binds to mRNA, the so-called mature miRNA. The remaining sequences in the composition of the initial miRNA are necessary for the proper processing of the original miRNA. A total of 2 new designs were created containing different amiPHKs.
Конструкции "new+old" (SEQ ID NO 3) и "old+new" (SEQ ID NO 4) отличаются друг от друга порядком расположения микроРНК - mic1002 + mic131g и mic131g + mic1002, соответственно. На фиг. 1 показаны схемы всех использованных в данном описании лентивирусных конструкции. Все они содержат маркерный ген: ген устойчивости к пуромицину, который позволяет вести в культуре только те клетки, которые содержат трансген, либо ген флюоресцентного белка EGFP.The constructs "new + old" (SEQ ID NO 3) and "old + new" (SEQ ID NO 4) differ from each other in the order of arrangement of microRNAs - mic1002 + mic131g and mic131g + mic1002, respectively. In FIG. 1 shows diagrams of all lentiviral constructs used in this specification. All of them contain a marker gene: the puromycin resistance gene, which allows you to conduct in culture only those cells that contain a transgene, or the gene for the fluorescent protein EGFP.
Промотор для экспрессии amiPHK - промотор РНК полимеразы II (например, CMV или Ef1a).The promoter for the expression of amiRNA is the promoter of RNA polymerase II (e.g., CMV or Ef1a).
Промотор для контрольных кшРНК - промотор РНК полимеразы III (например, H1).The promoter for control kshRNA is the promoter of RNA polymerase III (for example, H1).
Использование сильного промотора в конструкциях, содержащих кшРНК, обеспечивает высокий уровень экспрессии и, соответственно, возможность использовать такие вектора как положительные контроли в экспериментах по нокдауну CCR5 гена. Таким образом, новые конструкции не содержат в своем составе двух одинаковых amiPHK, как это было в случае с лентивектором mic131g + mic131g ("old+old", или SEQ ID NO 5).The use of a strong promoter in constructs containing kshRNA provides a high level of expression and, accordingly, the ability to use such vectors as positive controls in experiments on knockdown of the CCR5 gene. Thus, the new designs do not contain two identical amiPHKs, as was the case with the mic131g + mic131g lentector ("old + old", or SEQ ID NO 5).
Пример 2. Оценка целостности вектора, встроенного в геном Чтобы выяснить, действительно ли структура новых конструкций "old+new" и "new+old" остается неизменной после того, как были заменены повторяющиеся микроРНК, проведена амплификация с праймерами, фланкирующими область микроРНК, геномной ДНК, выделенной из клеток, трансдуцированных векторами "old+old", "old+new", "new+old".Example 2. Assessment of the integrity of a vector integrated into the genome To determine whether the structure of the new constructs "old + new" and "new + old" really remains unchanged after repeating microRNAs have been replaced, amplification was performed with primers flanking the genomic miRNA region DNA isolated from cells transduced with the vectors "old + old", "old + new", "new + old".
На фиг. 2 можно видеть, как в ампликоне вектора "old+old" (1) появляется дополнительный фрагмент меньшего размера, соответствующий вектору с одной микроРНК "old", который образовался в результате утраты одной из двух микроРНК. В образцах "old+new" и "new+old" такого не наблюдается, в связи с чем можно заключить, что наличие двух разных микроРНК способствует сохранению целостности вектора, что, безусловно, положительно сказывается на его свойствах (в частности, на стабильности).In FIG. 2 you can see how an additional fragment of a smaller size appears in the amplicon of the vector "old + old" (1), corresponding to the vector with one microRNA "old", which was formed as a result of the loss of one of the two microRNAs. In the samples "old + new" and "new + old" this is not observed, and therefore it can be concluded that the presence of two different microRNAs helps to preserve the integrity of the vector, which, of course, has a positive effect on its properties (in particular, stability) .
Пример 3. Оценка эффективности новых конструкцийExample 3. Evaluation of the effectiveness of new designs
С целью оценить эффективность, с которой полученные конструкции способны подавлять CCR5, клетки HT1080-CCR5-EGFP (созданные ранее индикаторные клетки, которые содержат трансген, позволяющий им экспрессировать химерный белок CCR5-EGFP (Глазкова Д.В. и др., Молекулярная биология, 2013, Т. 47, №3, С.475-485) были трансдуцированы лентивирусными частицами, кодирующими кшРНК или микроРНК. Значение MOI (multiplicity of infection, множественность заражения) при этом составило 0,1. Низкое значение MOI было необходимо, чтобы трансдуцированные клетки в итоге содержали одну копию вектора на клетку. После трансдукции клетки отбирались на пуромицине, поскольку все конструкции содержат ген устойчивости к данному антибиотику.In order to evaluate the effectiveness with which the obtained constructs are capable of suppressing CCR5, HT1080-CCR5-EGFP cells (previously created indicator cells that contain a transgene that allows them to express the chimeric CCR5-EGFP protein (Glazkova D.V. et al., Molecular Biology, 2013, T. 47, No. 3, pp. 475-485) were transduced with lentiviral particles encoding kshRNA or miRNA. The MOI (multiplicity of infection) was 0.1. A low MOI was necessary so that the transduced cells eventually contained one copy of vector n cell after transduction, cells were selected on puromycin, since all constructs contain the gene for resistance to this antibiotic.
CCR5-EGFP трансген - белок, состоящий из слитых друг с другом рамок считывания белка CCR5 и белка EGFP. МикроРНК, подавляющие экспрессию CCR5, снижают количество мРНК CCR5-EGFP, вследствие чего подает экспрессия зеленого флуоресцентного белка, что можно измерить с помощью проточной цитометрии. Клетки с таким трансгеном - удобная модель для оценки эффективности микроРНК. В статье Глазковой Д.В. и др. (Глазкова Д.В. и др., Молекулярная биология, 2013, Т. 47, №3, С. 475-485) описано получение последовательности, кодирующей химерный белок, и получение индикаторных клеток.CCR5-EGFP transgene is a protein consisting of fused reading frames of the CCR5 protein and EGFP protein. MicroRNAs that suppress CCR5 expression reduce the amount of CCR5-EGFP mRNA, resulting in the expression of green fluorescent protein, which can be measured by flow cytometry. Cells with this transgene are a convenient model for assessing the effectiveness of miRNAs. In the article Glazkova D.V. et al. (Glazkova D.V. et al., Molecular Biology, 2013, T. 47, No. 3, P. 475-485) describes the production of a sequence encoding a chimeric protein and the production of indicator cells.
Как видно из диаграммы на фиг. 3, обе новые созданные конструкции ("old+new" и "new+old") достаточно эффективно подавляют экспрессию трансгена CCR5-EGFP, и это подавление сопоставимо с конструкцией "old+old". Лентивекторы, содержащие sh131g и sh1005, использовали в качестве положительных контролей в данных экспериментах. Сама по себе новая микроРНК mic1002 ("new") демонстрирует не очень высокую эффективность, но ее комбинации с mic131g ("old"), позволяет снижать экспрессию CCR5-EGFP на 75%. Конструкция "old+new" показала наибольшую ингибирующую способность.As can be seen from the diagram in FIG. 3, both newly created constructs ("old + new" and "new + old") quite effectively suppress the expression of the CCR5-EGFP transgene, and this suppression is comparable to the "old + old" construct. Lentive vectors containing sh131g and sh1005 were used as positive controls in these experiments. By itself, the new mic100 RNA mic1002 ("new") does not show very high efficiency, but its combination with mic131g ("old") allows one to reduce the expression of CCR5-EGFP by 75%. The "old + new" design showed the greatest inhibitory ability.
Также новые конструкции были охарактеризованы с точки зрения эффективности процессинга коротких микроРНК. Данные эффекторные короткие микроРНК (длиной около 23 н.) процессируются из шпилечного предшественника. Известно, что его положение в конструкции, а также характер образованных вторичных структур влияют на конечный выход коротких микроРНК. ПЦР в реальном времени, совмещенная с обратной транскрипцией, использовалась как один из способов оценить количество коротких микроРНК. В данном методе для реверсии используется специфичный для каждой микроРНК праймер, длиной около 50 п. н., обладающий вторичной структурой, и позволяющий, таким образом, амплифицировать даже такие короткие матрицы, как микроРНК. На рис. 4 представлены результаты по измерению экспрессии микроРНК "new" и "old", а также "old+new" и "new+old".Also, new constructs have been characterized in terms of processing efficiency of short miRNAs. These effector short miRNAs (about 23 N long) are processed from the hairpin precursor. It is known that its position in the construct, as well as the nature of the formed secondary structures, affect the final yield of short miRNAs. Real-time PCR combined with reverse transcription was used as one way to estimate the number of short miRNAs. In this method, for reversion, a primer specific for each miRNA is used, with a length of about 50 bp, having a secondary structure, and thus allowing amplification even of such short matrices as miRNAs. In fig. 4 presents the results of measuring the expression of microRNAs "new" and "old", as well as "old + new" and "new + old".
Было обнаружено, что по процессингу обеих микроРНК конструкция "old+new" немного превосходит другую конструкцию, где микроРНК расположены в другом порядке - "new+old". Обнаруженные различия по критерию Манна-Уитни являются статистически достоверными.It was found that in processing both miRNAs, the "old + new" construct is slightly superior to the other construction, where the miRNAs are arranged in a different order - "new + old". Mann-Whitney differences found are statistically significant.
Следует обратить внимание еще на тот факт, что конструкция "old+new" содержит лишь одну копию микроРНК "old", но при этом уровень экспрессии коротких РНК данного типа обнаруживается на том же самом уровне, что и у конструкции с двумя "old" последовательностями ("old+old"). Обнаруженный эффект, по всей видимости, связан с более эффективным процессингом за счет присутствия последовательности "new".It should also be noted that the "old + new" construct contains only one copy of the "old" microRNA, but the level of expression of short RNAs of this type is found at the same level as the construct with two "old" sequences ("old + old"). The discovered effect, most likely, is associated with more efficient processing due to the presence of the "new" sequence.
Пример 4. Оценка способности новых конструкций подавлять экспрессию CCR5 Была оценена способность новых конструкций подавлять экспрессию CCR5 путем непосредственного измерения количества корецептора на поверхности клеток MAGI-CCR5 с помощью моноклональных антител и проточной цитометрии (клетки MAGI CCR5 были получены из США по программе «NIH AIDS Research and Reference Reagent Program»). Эти клетки экспрессируют нативный корецептор CCR5 со встроенного трансгена. Результаты представлены на фиг. 5 и фиг. 6.Example 4. Evaluation of the ability of new constructs to suppress CCR5 expression. The ability of new constructs to suppress CCR5 expression was evaluated by directly measuring the amount of coreceptor on the surface of MAGI-CCR5 cells using monoclonal antibodies and flow cytometry (MAGI CCR5 cells were obtained from the USA under the NIH AIDS Research program and Reference Reagent Program "). These cells express the native CCR5 coreceptor from the inserted transgene. The results are presented in FIG. 5 and FIG. 6.
В результате получилось, что обе новые конструкции "old+new" и "new+old" превосходят (статистически значимо) по своим ингибирующим свойствам конструкцию "old+old".As a result, it turned out that both new constructions "old + new" and "new + old" are superior (statistically significant) in their inhibitory properties to the construction "old + old".
Пример 5. Оценка устойчивости трансдуцированных клеток MAGI CCR5 к ВИЧ Клетки MAGI CCR5, экспрессирующие CCR5 на своей поверхности, чувствительны к заражению R5-тропным ВИЧ. По этой причине данная клеточная линия может быть использована в вирусологических экспериментах по оценке устойчивости модифицированных клеток к вирусу. Для трансдукции использовали лентивектора, содержащие конструкции "old+new" и "new+old" и ген EGFP в качестве маркера. Трансдуцированные лентивекторами конструкции "old+new" и "new+old" клетки MAGI CCR5 были заражены R5-тропным ВИЧ. Для инфекции использовали макрофаг тропный вирус NL(AD8) (Freed, Е.О., et al. // J. Virol. 1995, 69(6): 3949-3954). В течение опыта измерялась вирусная нагрузка в зараженных культурах. В результате было обнаружено, что все исследуемые конструкции - "old+new", "new+old" и "old+old" - способны ограничивать рост вируса в культуре (см. фиг. 7), причем подавление вируса при использовании конструкций "old+new" и "new+old" более выражено, чем при использовании конструкции old+old".Example 5. Assessment of the resistance of transduced MAGI CCR5 cells to HIV MAGI CCR5 cells expressing CCR5 on their surface are susceptible to infection with R5-tropic HIV. For this reason, this cell line can be used in virological experiments to assess the resistance of modified cells to the virus. For transduction, lentivectors were used containing the constructs "old + new" and "new + old" and the EGFP gene as a marker. The old + new and new + old constructs transduced with lentive vectors, MAGI CCR5 cells were infected with R5-tropic HIV. For infection, macrophage NL virus (AD8) was used (Freed, E.O., et al. // J. Virol. 1995, 69 (6): 3949-3954). During the experiment, viral load was measured in infected cultures. As a result, it was found that all the studied constructs - "old + new", "new + old" and "old + old" - are able to limit the growth of the virus in culture (see Fig. 7), and the suppression of the virus using the "old + new "and" new + old "are more pronounced than using the old + old construct."
Пример 6. Оценка устойчивости трансдуцированных CD4+ лимфоцитов человека к ВИЧExample 6. Evaluation of the resistance of transduced CD4 + human lymphocytes to HIV
Клетки CD4+ лимфоцитов человека были получены из крови здоровых доноров. Полученные клетки были трансдуцированы лентивекторами конструкций "old+new" или "old+old", содержащими ген EGFP в качестве маркера или контрольным вектором К, содержащим только EGFP, при MOI=10. В результате были получены культуры, содержащие 38%, 39% и 48% трансдуцированных клеток соответственно. Далее культуры лимфоцитов были заражены R5-тропным вирусом NL(AD8). В течение опыта измерялась вирусная нагрузка в зараженных культурах. В результате было обнаружено, что конструкция "old+new" более эффективно подавляет рост вируса в культуре, чем конструкция "old+old" (см. фиг. 8).Human CD4 + lymphocyte cells were obtained from the blood of healthy donors. The resulting cells were transduced with lentivectors of the "old + new" or "old + old" constructs containing the EGFP gene as a marker or control vector K containing only EGFP at MOI = 10. As a result, cultures were obtained containing 38%, 39% and 48% of transduced cells, respectively. Further, lymphocyte cultures were infected with the R5-tropic virus NL (AD8). During the experiment, viral load was measured in infected cultures. As a result, it was found that the "old + new" construct more effectively inhibits virus growth in culture than the "old + old" construct (see FIG. 8).
Пример 7. Приготовление смесей генетических конструкцийExample 7. The preparation of mixtures of genetic constructs
Используя исходные суспензии индивидуальных векторов "old+new", модифицированный Trim5a и С46, были приготовлены две смеси лентивирусных векторов. Суспензии векторов были очищены с помощью ультрацентрифугирования на сахарозе, для каждой суспензии, был измерен титр. Смеси приготавливались непосредственно после размораживания очищенных суспензий.Using initial suspensions of individual vectors "old + new" modified by Trim5a and C46, two mixtures of lentiviral vectors were prepared. Suspensions of vectors were purified by sucrose ultracentrifugation; for each suspension, titer was measured. Mixtures were prepared immediately after thawing the purified suspensions.
Приготовление смеси №1:Preparation of the mixture No. 1:
3 мкл суспензии вектора "old+new" (титр 5,4*108) смешали с 36 мкл суспензии вектора, кодирующего модифицированный Trim5a человека (титр 4,0*107). 13 мкл смеси №1 использовали для трансдукции 5*104 клеток MAGI CCR5.3 μl of the suspension of the vector "old + new" (titer 5.4 * 10 8 ) was mixed with 36 μl of the suspension of the vector encoding the modified human Trim5a (titer 4.0 * 10 7 ). 13 μl of mixture No. 1 was used for transduction of 5 * 10 4 MAGI CCR5 cells.
Приготовление смеси №2:Preparation of the mixture No. 2:
3 мкл суспензии вектора "old+new" (титр 5,4*108) смешали с 9 мкл суспензии вектора, кодирующего белок С46 (титр 1,7*108). 4 мкл смеси №2 использовали для трансдукции 5*104 клеток MAGI CCR5.3 μl of the suspension of the vector "old + new" (titer 5.4 * 10 8 ) was mixed with 9 μl of the suspension of the vector encoding C46 protein (titer 1.7 * 10 8 ). 4 μl of mixture No. 2 was used for transduction of 5 * 10 4 MAGI CCR5 cells.
Пример 8. Оценка эффективности смесей генетических конструкций на клетках MAGICCR5Example 8. Evaluation of the effectiveness of mixtures of genetic constructs on MAGICCR5 cells
Клетки MAGI CCR5, экспрессирующие CCR5 на своей поверхности, были трансдуцированы или лентивектором "old+new", или лентивектором, кодирующим модифицированный белок Trim, или лентивектором, кодирующим белок С46 с множественностью инфекции равной 20 (MOI=20). Параллельно была проведена трансдукция клеток MAGI CCR5 смесью векторов №1, содержащих вектор "old+new" 10 MOI и вектор, кодирующий модифицированный ген Trim 10 MOI (13 мкл смеси на 5*104 клеток), или смесью векторов №2, содержащих вектор "old+new" 10 MOI и вектор, кодирующий белок С46 10 MOI (4 мкл смеси на 5*104 клеток). Трансдуцированные клетки MAGI CCR5 были заражены R5-тропным вирусом NL(AD8) и далее раз в два дня отбирали часть питательной среды для измерения РНК ВИЧ, и вместо нее добавляли свежую питательную среду.MAGI CCR5 cells expressing CCR5 on their surface were transduced with either an "old + new" lentivector, a lentivector encoding a modified Trim protein, or a lentvector encoding a C46 protein with an infection multiplicity of 20 (MOI = 20). In parallel, MAGI CCR5 cells were transduced with a mixture of vectors No. 1 containing the "old + new" 10 MOI vector and a vector encoding the modified
Результаты измерения вирусной нагрузки приведены на фиг. 9. Было показано, что в клетках, трансдуцированных смесью векторов №1 и 2, подавление роста вируса более выражено, чем в клетках, трансдуцированных отдельными векторами. Причем подавление вирусной нагрузки было почти в 10 раз эффективнее с помощью смесей векторов по сравнению с отдельным вектором "old+new".The results of measuring viral load are shown in FIG. 9. It was shown that in cells transduced with a mixture of vectors No. 1 and 2, inhibition of virus growth is more pronounced than in cells transduced with individual vectors. Moreover, the suppression of viral load was almost 10 times more effective with the help of mixtures of vectors compared to a separate vector "old + new".
Claims (19)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132189A RU2666991C1 (en) | 2017-09-14 | 2017-09-14 | Genetic constructs and their mixtures for anti-hiv therapy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132189A RU2666991C1 (en) | 2017-09-14 | 2017-09-14 | Genetic constructs and their mixtures for anti-hiv therapy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2666991C1 true RU2666991C1 (en) | 2018-09-13 |
Family
ID=63580541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017132189A RU2666991C1 (en) | 2017-09-14 | 2017-09-14 | Genetic constructs and their mixtures for anti-hiv therapy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2666991C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324738C2 (en) * | 2006-06-16 | 2008-05-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | GENETIC CONSTRUCTION ON BASIS OF VECTOR PLASMID pEGFP-N1 PRODUCING siPHK-INHIBITORS OF REPRODUCTION OF THE HUMAN IMMUNE DEFICIENCY VIRUS OF THE 1 TYPE (ITS VARIANTS) |
| RU2426788C1 (en) * | 2010-03-01 | 2011-08-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) | Genetic make-ups for anti-hiv therapy |
| WO2017139065A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-17 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv vaccination and immunotherapy |
-
2017
- 2017-09-14 RU RU2017132189A patent/RU2666991C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324738C2 (en) * | 2006-06-16 | 2008-05-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | GENETIC CONSTRUCTION ON BASIS OF VECTOR PLASMID pEGFP-N1 PRODUCING siPHK-INHIBITORS OF REPRODUCTION OF THE HUMAN IMMUNE DEFICIENCY VIRUS OF THE 1 TYPE (ITS VARIANTS) |
| RU2426788C1 (en) * | 2010-03-01 | 2011-08-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) | Genetic make-ups for anti-hiv therapy |
| WO2017139065A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-17 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv vaccination and immunotherapy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2562868C2 (en) | Double vector for suppression of human immunodeficiency virus | |
| JP2752788B2 (en) | Recombinant therapy for infection and hyperproliferative disorders | |
| US11788101B2 (en) | Genomic insulator elements and uses thereof | |
| KR102663972B1 (en) | HIV immunotherapy without pre-immunization phase | |
| CN106967685B (en) | Transgenic lymphocytes co-expressing anti-EGFRvIII chimeric antigen receptor and immune checkpoint inhibitory molecules and uses thereof | |
| JP2019504868A (en) | Excision of retroviral nucleic acid sequences | |
| AU2018336042B2 (en) | Retroviral vectors | |
| JP2024045608A (en) | Vector system for expressing regulatory RNA | |
| CN108342363B (en) | Transgenic lymphocytes co-expressing anti-MSLN chimeric antigen receptor and immune checkpoint inhibitory molecules and uses thereof | |
| CN114941011B (en) | Lentiviral vector and application thereof | |
| EP2138580B1 (en) | Vector for gene therapy | |
| US20100247486A1 (en) | Recombinant virus vector originating in HHV-6 or HHV-7, method of producing the same, method of transforming host cell using the same, host cell transformed thereby and gene therapy method using the same | |
| RU2426788C1 (en) | Genetic make-ups for anti-hiv therapy | |
| US20180127470A1 (en) | Cell Lines | |
| Liu et al. | A novel approach to block HIV-1 coreceptor CXCR4 in non-toxic manner | |
| RU2666991C1 (en) | Genetic constructs and their mixtures for anti-hiv therapy | |
| Omelchenko et al. | Protection of lymphocytes against HIV using lentivirus vector carrying a combination of TRIM5α-HRH genes and microRNA against CCR5 | |
| WO2021070956A1 (en) | siRNA EXPRESSION VECTOR | |
| Terskikh et al. | Long-term persistence of a nonintegrated lentiviral vector in mouse hematopoietic stem cells | |
| RU2533817C1 (en) | Improving genetic constructs for providing high efficacy of anti-hiv therapy | |
| Glazkova et al. | Downregulation of human CCR5 gene expression with artificial microRNAs | |
| WO2022256414A1 (en) | Rna recognition complex and uses thereof | |
| Mauer | HIV-1 Infection Modulates CD4+ T Cell Gene Expression to Induce a Quiescent Phenotype | |
| TW202321456A (en) | Nucleic acid for producing retroviral vector | |
| KR20230147060A (en) | Engineered NK cells and cancer treatment methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE4A | Change of address of a patent owner |
Effective date: 20200818 |