RU2665175C2

RU2665175C2 - Биоактивный полимерный пористый каркас

Info

Publication number: RU2665175C2
Application number: RU2016123094A
Authority: RU
Inventors: Фёдор Святославович Сенатов; Кирилл Вячеславович Няза; Алексей Валентинович Максимкин; Наталья Юрьевна Анисимова; Михаил Валентинович Киселевский; Виктор Викторович Чердынцев; Сергей Дмитриевич Калошкин; Юрий Захарович Эстрин; Виктор Вячеславович Медведев
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2018-08-28
Also published as: RU2016123094A

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к созданию биосовместимых каркасов для замещения дефектов костной ткани. Биосовместимый каркас в форме биорезорбируемой пористой конструкции медицинского назначения с повышенной остеокондуктивностью на основе термопластичного полимера с добавлением биоактивного керамического компонента может быть заселен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих и состоит из полимерной матрицы полилактида и биоактивного наполнителя гидроксиапатита со средним размером частиц от 100 до 1000 нм с увеличенной адгезией к полимерной матрице. Указаный каркас формируется с помощью 3D-печати методом наплавления нитей с толщиной слоя 50-250 мкм и характеризуется наличием открытой пористости от 30 до 60 об.% и порами в виде каналов со средним диаметром 400-800 мкм. Биоактивный полимерный каркас характеризуется тем, что его эксплуатация возможна до температуры 55°C без изменения функциональных характеристик, каркаса, может быть заселен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани. 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 пр.

Description

Изобретение относится к композиционному каркасу (скаффолд, Scaffold), выполненному в форме биорезорбируемой пористой конструкции медицинского назначения с повышенной остеокондуктивностью на основе термопластичного полимера с добавлением биоактивного керамического компонента, сформированному с помощью 3D-печати методом наплавления нитей (Fused Filament Fabrication, FFF), который может быть заселенен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.

Известно изобретение (WO 2014144488 А1 «3d biomimetic, bi-phasic key featured scaffold for osteochondral repair»), представляющее собой метод создания биосовместимых каркасов на основе полилактида с высокими механическими свойствами, в котором 3D-печать может быть использована для создания структур, которые способствуют восстановлению и/или производству тканей организма.

Недостатком упомянутого изобретения является то, что биосовместимые каркасы, получаемые по предлагаемому его авторами методу, не содержат биоактивного компонента - кальций-фосфатной керамики, который мог бы обладать способностью поставлять минеральные частицы для костных клеток.

Прототипом является изобретение (US 8071007 B1 «Three-dimensional bioresorbable scaffolds for tissue engineering applications»), представляющее собой трехмерные (3D) биологически рассасывающиеся каркасы из резорбируемых полимеров, таких как поликапролактон (PCL), или из композитов резорбируемых полимеров и керамики, таких как поликапролактон / гидроксиапатит (PCL / НА). Включение саморассасывающийся керамики для получения гибридного / композитного материала обеспечивает желательную кинетику резорбции.

Недостатком упомянутого изобретения является то, что основой трехмерных каркасов, предлагаемых его авторами, является поликапролактон, который характеризуется низкой температурой плавления - около 60°С, что ограничивает диапазон температур эксплуатации до потери эксплуатационных характеристик и ограничивает применимость методов стерилизации, таких как стерилизация в автоклаве.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в создании биоактивного полимерного каркаса, который можно заселять мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани, обладающего следующими свойствами:

- составом и структурным сходством с костной тканью, для увеличенной адгезии наполнителя к полимерной матрице,

- повышенной биоактивностью относительно каркаса из чистого полилактида,

- повышенной адгезией клеток к поверхности относительно каркаса из чистого полилактида,

- наличием открытой пористости со средним диаметром пор 400-800 мкм для обеспечения пролиферации клеток,

- способностью обеспечивать миграцию клеток, формирование сосудов и диффузию питательных веществ и кислорода, обеспечивая остеокондуктивность,

- способностью к осуществлению регенерационного подхода при имплантировании каркаса,

- способностью поставлять минеральные частицы для костных клеток,

- высокими механическими свойствами на сжатие: предел прочности пористого каркаса более 40 МПа,

- модулем Юнга, близким к модулю упругости трабекулярной (или губчатой) кости: более 4 ГПа.

Технический результат достигается следующим образом: формируется биоактивный полимерный пористый каркас на основе биорезорбируемого полилактида и гидроксиапатита путем 3D-печати методом послойного наплавления нити с толщиной слоя 50-250 мкм, диаметром пор 400-800 мкм, открытой пористостью (% об.) от 30 до 60, с сетью каналов. При этом поры по оси X смещены относительно пор по оси Y в декартовой системе координат, образуя пересечение каналов пор и связанную систему пор. При этом размер частиц гидроксиапатита от 100 до 1000 нм. Используется следующее соотношение компонентов (% масс): полилактид - от 85 до 65, гидроксиапатит - от 15 до 35. Также внешняя поверхность порового пространства пересекающихся каналов заселенена мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих. Также каркас выполнен в виде конструкции, обеспечивающей его применение в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.

В предлагаемом в данной заявке изобретении композиционный каркас имеет в качестве полимерной матрицы биорезорбируемый полилактид (ПЛА, PLA), а в качестве биоактивного наполнителя - дисперсный гидроксиапатит со средним размером частиц от 100 до 1000 нм с увеличенной адгезией к полимерной матрице. Степень наполнения гидроксиапатитом - от 15 до 35 масс. %. Биоактивный полимерный пористый каркас формируется с помощью 3D-печати методом наплавления нитей с толщиной слоя 50-250 мкм и характеризуется наличием открытой пористости более 30% об. и порами в виде каналов со средним диаметром 400-800 мкм. Поры по оси X смещены относительно пор по оси Y в декартовой системе координат, что ведет к пересечению каналов пор и образованию связанной системы пор. Модуль Юнга на сжатие полученного таким способом биоактивного полимерного каркаса составляет более 4 ГПа. Микроразмерные поры обеспечивают миграцию клеток, формирование сосудов и диффузию питательных веществ и кислорода, обеспечивая остеокондуктивность. Каркас имеет большое количество ребер жесткости, что придает большую прочность. Эксплуатация каркаса возможна до температуры 55°С без изменения функциональных характеристик. Биоактивный полимерный каркас может быть заселенен мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих для использования в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.

В предлагаемом композиционном каркасе повышение указанных характеристик достигается за счет введения в полимерную матрицу ультрадисперсного порошка гидроксиапатита, обеспечивающего остеоинтегративные характеристики, и применения послойной 3D-печати, позволяющей формировать сложную сеть пор-каналов с дополнительной шероховатостью за счет послойной печати для увеличения остеокондуктивных свойств.

Возможность промышленной применимости предлагаемого каркаса и его использования в медицине подтверждается следующим примером реализации.

Изобретение поясняется чертежом, где на фиг. 1 показана 3D-модель (А), срез (В) и внешний вид напечатанного биоактивного полимерного каркаса с открытой пористостью 35% об. (С). На фиг. 2 показаны варианты расположения пересекающихся каналов. На фиг. 3 показаны примеры микрофотографий биоактивного полимерного каркаса, полученного путем 3D-печати методом послойного наплавления нити с толщиной слоя 50 (А), 150 (В), 250 мкм (С). По микрофотографии можно судить о пористой структуре каркасов. На фиг. 4 показаны примеры микрофотографий вид напечатанного биоактивного полимерного каркаса со средним диаметром 400 (А) и 800 мкм (В). На фиг. 5 показан пример диаграммы деформации биоактивного полимерного каркаса при сжатии с содержанием гидроксиапатита 15 (А) и 30 (В) % масс. Предел прочности пористого каркаса более 40 МПа. На фиг. 6 показан пример кривых ДСК для биоактивного полимерного каркаса с содержанием гидроксиапатита 15% масс. (1 нагрев, охлаждение, 2 нагрев). Первое фазовое превращение происходит при температуре стеклования материала - 61.4°С, т.е эксплуатация каркаса без изменения функциональных характеристик гарантировано возможна до 55°С. На фиг. 7 показан пример заселения внешней поверхности порового пространства мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками мышей: оптическая микроскопия (А), флюоресцентная микроскопия (Б) с окраской антителами к CD 105, коньюгированными с FITC, (В) и (Г) оптическая микроскопия с окраской гематоксилин-эозином. На фиг. 8 показан пример топографии и текстуры поверхности полимерного каркаса с толщиной слоя 250 мкм, заселенный ММСК. На фиг. 9 показан пример замещения дефекта соединительной ткани мыши полимерным каркасом ПЛА/ГАП.

Пример 1.

В качестве исходных материалов использовался полилактид (ПЛА) марки Ingeo 4032D (производства Natureworks LLC, USA), порошок гидроксиапатита ГАП 85-Д (производства НПО «Полистом») со средним размером частиц 1000 нм. Сформирован биоактивный полимерный каркас в количестве 10 штук с содержанием гидроксиапатита 35% масс со средним диаметром пор 400 мкм и толщиной слоя 50 мкм. Объемная пористость - 30% об. Температура стеклования - 62°С, предел прочности на сжатие - 52 МПа, модуль Юнга при сжатии - 4.5 ГПа. Полимерные каркасы ПЛА/ГАП были выполнены в виде прямоугольных пластин размером 4×4 мм.

Для оценки биоактивных свойств полимерных каркасов ПЛА/ГАП 5 образцов в асептических условиях инкубировали с ММСК в течение 7 суток in vitro при 37°С и 5% СО₂. Использовали монокультуру клеток 2-го пассажа, генерированной их CD34-CD45- клеток костного мозга мышей линии СВА. В ходе эксперимента стерильный образец каркаса промывали средой RPMI-1640, помещали на дно лунки планшета Nung и перфузировали клеточной взвесью (5×10⁵ клеток/мл) в объеме 100 мкл. Через 5 минут экспозиции в лунку добавляли 2 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы (HyClon, USA), 25 mM HEPES, 24 mM бикарбонат натрия, L-гутамин, 100 mg/стрептомицина и 100 U/mL пенициллина. По окончании инкубации образцы были фиксированы, окрашены гематоксилин-эозином и проанализированы с использованием световой микроскопии. Вся поверхность образцов полимерных каркасов ПЛА/ГАП была колонизирована полигональными крупными (50-150 мкм) плотно адгезированными клетками с четко очерченным овальным ядром, длинными отростками, экспрессирующими на мембране CD 105 маркеры, что позволило их идентифицировать как ММСК (Фиг. 7). Плотность колонизации соответствовала 40-70 клеток в поле зрения при увеличении ×200. Выбор ММСК в качестве биологического субъекта обоснован их способностью к пролиферации в условиях in vitro и плюрипотеностью, что определяет их способность к направленной дифференцировке в волокна соединительной ткани, клетки сосудов, жировой, хрящевой и костной тканей. Поскольку ММСК являются предшественниками остеобластов, их можно рассматривать в качестве адекватной биологической модели оценки остеокондуктивности заявляемых полимерных каркасов.

Поскольку костная ткань является разновидностью соединительной ткани, то для моделирования возможности возмещения дефектов тканей мезенхимального происхождения образцы полимерных каркасов ПЛА/ГАП (n=5) были имплантированы мышам линии СВА (по 1 образцу на мышь) в искусственно сформированный подкожный дефект соединительной ткани дорсальной поверхности тела площадью 25±4 мм² с соблюдением требований асептики и антисептики. В течение всего периода наблюдения (1 месяц) в области имплантации не наблюдали признаков формирования язв, абсцесса и некроза. По результатам патолого-анатомического исследования было установлено, что имплантированные полимерные каркасы ПЛА/ГАП подверглись частичной биорезорбции, были плотно фиксированы в окружающих тканях без признаков формирования демаркационной линии, вала воспаления, скопления гноя или отека окружающих тканей с полным закрытием площади дефекта. В прилегающих к каркасам тканях наблюдали скопление гистиоцитарных соединительно-тканных клеток, а также активный неоваскулогенез, что свидетельствует о биоактивных свойствах полимерных каркасов.

Модуль Юнга полимерного каркаса при сжатии (4.5 ГПа) адекватен модулю Юнга костной ткани (трабекулярная бедренная кость) без экранирования напряжений при замещении дефекта костной ткани.

Пример 2.

В качестве исходных материалов использовался полилактид марки Ingeo 4032D (производства Natureworks LLC, USA), порошок гидроксиапатита ГАП 85-УД (производства НПО «Полистом») со средним размером частиц 100 нм. Сформирован биоактивный полимерный каркас в количестве 10 штук с содержанием гидроксиапатита 15% масс со средним диаметром пор 800 мкм и толщиной слоя 250 мкм. Объемная пористость - 60% об. Температура стеклования - 61°С, предел прочности на сжатие - 55 МПа, модуль Юнга при сжатии - 4.1 ГПа.

Испытания биологических свойств образцов in vitro и in vivo проводили как описано в Примере 1. В опытах in vitro было установлено, что по окончании эксперимента поверхность образцов полимерных каркасов ПЛА/ГАП (n=5) была колонизирована полигональными крупными (50-150 мкм) плотно адгезированными CD 105+ клетками с четко очерченным овальным ядром, длинными отростками, идентифицированными как ММСК. Плотность колонизации соответствовала 50-100 клеток в поле зрения при увеличении ×200 (Фиг. 8). В опытах in vivo не отмечали признаков формирования язв, абсцесса и некроза в области имплантации образцов полимерных каркасов ПЛА/ГАП (n=5). Было установлено, что имплантированные полимерные каркасы ПЛА/ГАП подверглись частичной биорезорбции, были плотно фиксированы в окружающих тканях без признаков формирования демаркационной линии, вала воспаления, скопления гноя или отека окружающих тканей с полным закрытием площади дефекта. В прилегающих к каркасам тканях наблюдали скопление гистиоцитарных соединительно-тканных клеток, а также активный неоваскулогенез (Фиг. 9), что свидетельствует о биоактивных свойствах полимерных каркасов.

Модуль Юнга полимерного каркаса при сжатии (4.1 ГПа) адекватен модулю Юнга костной ткани (трабекулярная берцовая кость) без экранирования напряжений при замещении дефекта костной ткани.

Claims

1. Биоактивный полимерный каркас для замещения дефектов костной ткани на основе биорезорбируемого полилактида и гидроксиапатита с размером частиц от 100 до 1000 нм, сформированный с помощью 3D-печати методом наплавления нитей с толщиной слоя от 50 до 250 мкм, средним диаметром пор от 400 до 800 мкм, при этом поры по оси X смещены относительно пор по оси Y в декартовой системе координат, образуя пересечение каналов пор и связанную систему пор, открытой пористостью (об.%) от 30 до 60 при следующем соотношении компонентов (мас.%):

полилактид - от 85 до 65,

гидроксиапатит - от 15 до 35.

2. Биоактивный полимерный каркас для замещения дефектов костной ткани по п. 1, у которого внешняя поверхность порового пространства пересекающихся каналов заселена мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками млекопитающих.

3. Биоактивный полимерный каркас для замещения дефектов костной ткани по п. 2, который выполнен в виде конструкции, обеспечивающей его применение в качестве имплантата для замещения дефектов костной ткани.