RU2663104C1

RU2663104C1 - Producing pegylated fragments of gd2-specific antibodies inducing direct cell death of gd2-positive tumor cells, and use thereof in therapy of gd2-positive tumors

Info

Publication number: RU2663104C1
Application number: RU2017116203A
Authority: RU
Inventors: Ирина Викторовна Холоденко; Игорь Игоревич Доронин; Роман Васильевич Холоденко
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет"
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2018-08-01
Also published as: WO2019013674A1

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to the creation of a multivalent protein structure of a new format based on several fragments of antibodies conjugated to a polyethylene glycol molecule, and having an affinity for ganglioside GD2, which can be used in medicine. Said structure is used as an active ingredient in pharmaceutical compositions for treating many types of oncological diseases characterized by the expression of ganglioside GD2 on the surface of tumor cells, such as neuroblastoma, small-cell lung cancer, sarcoma, glioma, retinoblastoma, melanoma and others.EFFECT: invention provides higher efficacy and safety when used in clinical practice due to multivalence and absence of undesirable effector functions compared to monoclonal antibodies against ganglioside GD2.14 cl, 8 dwg, 2 tbl

Description

Область техникиTechnical field

Данное изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, к новым белковым конструкциям на основе фрагментов антител, специфически связывающих ганглиозид GD2, и применению этих конструкций для лечения онкологических заболеваний.This invention relates to biotechnology and medicine, in particular, to new protein constructs based on antibody fragments that specifically bind GD2 ganglioside, and the use of these constructs for the treatment of cancer.

Уровень техникиState of the art

В настоящее время во всем мире остро стоят задачи по разработке новых адресных, высокоэффективных и низкотоксичных методов терапии онкологических заболеваний. Одним из таких наиболее перспективных направлений является иммунотерапия с использованием препаратов на основе моноклональных антител, направленных на таргетные опухолевые молекулы. Мишенями для иммунотерапии рака могут служить не только белки, но и гликосфинголипиды, в частности ганглиозиды. Например, ганглиозид GD2 специфически представлен на поверхности клеток опухолей различного происхождения, включая нейробластомы, меланомы, глиомы, ретинобластомы, меланомы, мелкоклеточный рак легких, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, саркомы Юинга. По некоторым данным, GD2-позитивные опухоли составляют около 10% от общего числа онкологических заболеваний, и для многих из них характерна крайне ограниченная эффективность классических методов терапии.Currently, there are acute challenges around the world to develop new targeted, highly effective and low-toxic methods of cancer treatment. One of the most promising areas is immunotherapy using drugs based on monoclonal antibodies directed to targeted tumor molecules. Not only proteins, but also glycosphingolipids, in particular gangliosides, can serve as targets for cancer immunotherapy. For example, ganglioside GD2 is specifically present on the surface of tumor cells of various origins, including neuroblastomas, melanomas, gliomas, retinoblastomas, melanomas, small cell lung cancer, osteosarcomas, rhabdomyosarcomas, and Ewing sarcomas. According to some reports, GD2-positive tumors account for about 10% of the total number of oncological diseases, and many of them are characterized by extremely limited effectiveness of classical methods of therapy.

Применение антител к GD2 дало существенный эффект, выраженный в супрессии роста и гибели опухолевых клеток в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Несколько препаратов GD2-специфичных моноклональных антител в настоящее время проходят клинические испытания, которые свидетельствуют в пользу перспективности иммунотерапии в лечении GD2-позитивных опухолей (Horta ZP, et al., Immunotherapy, September 2016, Vol. 8, No. 9, Pages 1097-1117). Один препарат, Unituxin (на основе антитела Dinutuximab), связывающий GD2, был одобрен для клинического применения в 2015 году (Ploessl С, et al., Ann Pharmacother, May 2016, 50: 416-422). Unituxin характеризуется значимой эффективностью действия и повышает на 20% 5-летнюю выживаемость пациентов с нейробластомой высокого риска в комбинированной терапии по сравнению с выживаемостью пациентов, получавших только химиотерапию. Однако Unituxin обладает рядом побочных эффектов. Основными из них являются: жар, боль, сыпь, лихорадка, анемия, в основном вызванные гиперактивацией иммунной системы и нейротоксичностью. Было показано, что выявленные побочные эффекты в основном обусловлены связыванием антител с нормальными неопухолевыми клетками, например, с периферическими нейронами, экспрессирующими на своей поверхности ганглиозид GD2. После связывания с клетками происходит взаимодействие Fc-региона полноразмерных антител с эффекторными клетками иммунной системы и белками системы комплемента, что приводит к повреждению периферических нейронов (Yuki N, et al. J Neurol Sci., 1997, 149(2): 127-130). Поэтому, одной из возможных стратегий для уменьшения побочных эффектов является изменение структуры или формата антител для снижения или полной отмены функциональных свойств Fc-региона. Было показано, что Fc-опосредованные цитотоксические функции антител не являются критически необходимыми для обеспечения противоопухолевого эффекта в случае GD2-позитивных опухолей. Например, внесение точечной мутации в GD2-специфичные антитела ch14.18 подавляло способность активировать комплемент-зависимый механизм клеточной гибели (CDC); такая мутация не приводила к снижению противоопухолевых эффектов антител, но при этом снижала побочные эффекты исходных GD2-специфичных ch14.18, проявляющиеся в аллодинии (LS Sorkin et al, Pain, 2010 Apr; 149(1): 135-142). В другой работе (Cochonneau D et al, Cancer Lett., 2013; 333(2): 194-204) с использованием OAc-GD2-специфичных антител 8B6 авторы показали, что однократно введенная внутривенно доза этих антител в NOD/SCID мышей статистически достоверно ингибировала рост опухоли. Поскольку в NOD/SCID мышах в силу отсутствия эффекторных клеток и циркулирующих белков системы комплемента проявление механизмов ADCC и CDC невозможно, то, по-видимому, проявление противоопухолевых эффектов вызывается другими механизмами, например, прямым цитотоксическим действием моноклональных антител. Сильное прямое цитотоксическое действие GD2-специфичных моноклональных антител, характерное для разных типов GD2-позитивных раков, показано в нескольких работах (Doronin I.I., et al., ВМС Cancer. 2014, Apr 28; 14:295; Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May; 20(5):679-88.).The use of antibodies to GD2 had a significant effect, expressed in suppressing the growth and death of tumor cells in experiments both in vitro and in vivo. Several preparations of GD2-specific monoclonal antibodies are currently undergoing clinical trials, which indicate the promise of immunotherapy in the treatment of GD2-positive tumors (Horta ZP, et al., Immunotherapy, September 2016, Vol. 8, No. 9, Pages 1097- 1117). One drug, Unituxin (based on Dinutuximab antibody) that binds GD2, was approved for clinical use in 2015 (Ploessl C, et al., Ann Pharmacother, May 2016, 50: 416-422). Unituxin is characterized by significant efficacy and increases by 20% the 5-year survival of patients with high-risk neuroblastoma in combination therapy compared with the survival of patients receiving only chemotherapy. However, Unituxin has a number of side effects. The main ones are: fever, pain, rash, fever, anemia, mainly caused by hyperactivation of the immune system and neurotoxicity. It was shown that the detected side effects are mainly due to the binding of antibodies to normal non-tumor cells, for example, to peripheral neurons expressing GD2 ganglioside on their surface. After binding to cells, the Fc region interacts with full-sized antibodies with effector cells of the immune system and complement system proteins, which leads to damage to peripheral neurons (Yuki N, et al. J Neurol Sci., 1997, 149 (2): 127-130) . Therefore, one of the possible strategies to reduce side effects is to change the structure or format of antibodies to reduce or completely cancel the functional properties of the Fc region. It has been shown that the Fc-mediated cytotoxic functions of antibodies are not critically necessary to provide an antitumor effect in the case of GD2-positive tumors. For example, the introduction of a point mutation in GD2-specific ch14.18 antibodies suppressed the ability to activate the complement-dependent cell death mechanism (CDC); such a mutation did not lead to a decrease in the antitumor effects of antibodies, but at the same time reduced the side effects of the initial GD2-specific ch14.18, which are manifested in allodynia (LS Sorkin et al, Pain, 2010 Apr; 149 (1): 135-142). In another work (Cochonneau D et al, Cancer Lett., 2013; 333 (2): 194-204) using OAc-GD2-specific antibodies 8B6, the authors showed that a single intravenous dose of these antibodies in the NOD / SCID of mice was statistically significant inhibited tumor growth. Since the manifestation of ADCC and CDC mechanisms is impossible in NOD / SCID mice due to the absence of effector cells and circulating proteins of the complement system, the manifestation of antitumor effects is apparently caused by other mechanisms, for example, the direct cytotoxic effect of monoclonal antibodies. The strong direct cytotoxic effect of GD2-specific monoclonal antibodies, characteristic of different types of GD2-positive cancers, has been shown in several works (Doronin II, et al., IUD Cancer. 2014, Apr 28; 14: 295; Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May; 20 (5): 679-88.).

Классические молекулы антител обладают рядом преимуществ по сравнению с другими терапевтическими белками. Это в первую очередь высокая специфичность к мишени и стабильность в водном растворе, а также продолжительное время циркуляции в кровотоке, обусловленное связыванием с FcRn рецептором. Недостатком классических молекул антител можно считать их большой размер (150 кДа), который затрудняет их проникновение вглубь солидных опухолей. В общем случае Fc-регион антител опосредует цитотоксические свойства антител при связывании с лигандом на поверхности клеток за счет механизмов ADCC и CDC. Также разрабатываются препараты на основе фрагментов антител (Fab-фрагменты, scFv-фрагменты, BiTE и т.д.), которые обладают другими механизмами противоопухолевого действия и используются как в самостоятельном виде (биспецифические и мультивалентные фрагменты антител), так и в составе комплексных систем противоопухолевой терапии (таргетные наночастицы, CAR-T клетки, иммунотоксины и пр.).Classical antibody molecules have several advantages over other therapeutic proteins. This is primarily high target specificity and stability in an aqueous solution, as well as a long circulation time in the bloodstream due to binding to the FcRn receptor. The disadvantage of classical antibody molecules is their large size (150 kDa), which makes it difficult for them to penetrate deep into solid tumors. In the general case, the Fc region of antibodies mediates the cytotoxic properties of antibodies upon binding to a ligand on the surface of cells through the mechanisms of ADCC and CDC. Drugs based on antibody fragments (Fab fragments, scFv fragments, BiTE, etc.) are also being developed, which have other antitumor mechanisms and are used both in an independent form (bispecific and multivalent antibody fragments), and as part of complex systems antitumor therapy (targeted nanoparticles, CAR-T cells, immunotoxins, etc.).

Большинство GD2-позитивных новообразований представляют собой солидные опухоли, для которых характерна невысокая противоопухолевая эффективность моноклональных антител, обусловленная большими размерами этих молекул. Кроме того, нежелательные побочные эффекты терапии зачастую обусловлены наличием Fc-опосредованной цитотоксичности. Поэтому, в связи с общим ростом распространенности различных типов онкологических заболеваний в России и в мире, а также отсутствием эффективных и безопасных методов терапии GD2-позитивных опухолей имеется существенная потребность в создании лекарства нового формата на основе антител к GD2. Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения поставленной задачи, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения GD2-позитивных онкологических заболеваний.Most GD2-positive neoplasms are solid tumors, which are characterized by low antitumor efficacy of monoclonal antibodies, due to the large size of these molecules. In addition, undesirable side effects of therapy are often due to the presence of Fc-mediated cytotoxicity. Therefore, due to the general increase in the prevalence of various types of oncological diseases in Russia and in the world, as well as the lack of effective and safe methods of treating GD2-positive tumors, there is a significant need to create a new drug format based on antibodies to GD2. This invention has a number of properties necessary for solving the task, and therefore expands the range of available candidates for the treatment of GD2-positive oncological diseases.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Задачей настоящего изобретения является создание терапевтического агента на основе антител к GD2 и разработка нового эффективного и безопасного способа лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, характеризующимися присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли. Также задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств для подавления пролиферации и индукции гибели GD2-позитивных опухолевых клеток.The present invention is the creation of a therapeutic agent based on antibodies to GD2 and the development of a new effective and safe method for the treatment of patients with cancer, characterized by the presence of GD2 ganglioside on the surface of tumor cells. Another objective of the present invention is to expand the arsenal of tools to suppress the proliferation and induction of death of GD2-positive tumor cells.

Указанные задачи решаются путем создания нового терапевтического агента для лечения онкологических заболеваний, представляющего собой мультивалентную конструкцию, содержащую по меньшей мере два функциональных фрагмента антител, специфически связывающих ганглиозид GD2 и соединенных между собой при помощи ковалентной конъюгации с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). В предпочтительных вариантах изобретения каждый из этих функциональных фрагментов антител содержит по крайней мере (а) один вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий H-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, H-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, и Н-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, и (б) один вариабельный домен легкой цепи, содержащий L-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, L-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5, и L-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 6. Таким образом, данная мультивалентная конструкция способна связывать две или более молекулы ганглиозида GD2. В некоторых вариантах изобретения конъюгация указанных функциональных фрагментов антител может происходить с помощью образования ковалентных связей между тиоловой группой неспаренного С-концевого цистеина фрагмента антитела и малеимидными группами молекулы ПЭГ.These tasks are solved by creating a new therapeutic agent for the treatment of cancer, which is a multivalent construct containing at least two functional antibody fragments that specifically bind GD2 ganglioside and are interconnected by covalent conjugation with a polyethylene glycol (PEG) molecule. In preferred embodiments of the invention, each of these functional antibody fragments contains at least (a) one heavy chain variable domain comprising H-CDR1 with the sequence SEQ ID NO: 1, H-CDR2 with the sequence SEQ ID NO: 2, and H-CDR3 with the sequence of SEQ ID NO: 3, and (b) one variable domain of the light chain containing L-CDR1 with the sequence of SEQ ID NO: 4, L-CDR2 with the sequence of SEQ ID NO: 5, and L-CDR3 with the sequence of SEQ ID NO : 6. Thus, this multivalent construct is capable of binding two or more GD2 ganglioside molecules. In some embodiments of the invention, conjugation of these functional antibody fragments can occur through the formation of covalent bonds between the thiol group of the unpaired C-terminal cysteine of the antibody fragment and the maleimide groups of the PEG molecule.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 7, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 8.In some embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains one heavy chain fragment containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 7, and one fragment light chain containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 8.

В других вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 9, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10.In other embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains one heavy chain fragment containing the sequence of SEQ ID NO: 9, and one light chain fragment containing the sequence of SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная. конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 11.In some embodiments, the invention is multivalent. the construct is characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 12.In some embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 13.In some embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 14.In some embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет линейную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа. В других вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет разветвленную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.In some embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that the polyethylene glycol molecule used for conjugation has a linear structure and a molecular weight of 5 to 40 kDa. In other embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that the polyethylene glycol molecule used for conjugation has a branched structure and a molecular weight of 5 to 40 kDa.

Указанная задача также решается путем создания фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, содержащей вышеописанные варианты мультивалентных конструкций в терапевтически эффективном количестве, а также содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В частном случае реализации изобретения описан способ лечения онкологического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции. Онкологическим заболеванием, для лечения которого применима данная фармацевтическая композиция, является нейробластома, ретинобластома, меланома, мелкоклеточный рак легких, остеосаркома, рабдомиосаркома, глиома, саркома Юинга или любая другая GD2-позитивная опухоль, а также любая опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2. В частных случаях, клеточными субпопуляциями, которые экспрессируют ганглиозид GD2, могут являться раковые стволовые клетки, оставшиеся в организме после прохождения курса лечения GD2-негативной опухоли (например, курса химио- или радиотерапии). В некоторых вариантах изобретения описан способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции.This problem is also solved by creating a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, containing the above-described variants of multivalent constructs in a therapeutically effective amount, and also containing a pharmaceutically acceptable carrier. In the particular case of the invention, a method for treating cancer is described, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the above pharmaceutical composition. An oncological disease for the treatment of which this pharmaceutical composition is applicable is a neuroblastoma, retinoblastoma, melanoma, small cell lung cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, glioma, Ewing sarcoma or any other GD2-positive tumor, as well as any tumor whose individual cell subpopulations express G2 gangliosis . In particular cases, the cell subpopulations that express the GD2 ganglioside can be cancer stem cells that remain in the body after undergoing treatment with a GD2-negative tumor (for example, a course of chemotherapy or radiotherapy). In some embodiments of the invention, a method is described for killing a cell in the body of a subject, on the surface of which there is a GD2 ganglioside, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the above pharmaceutical composition.

При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: создан новый вариант терапевтического агента на основе фрагментов антител к GD2 для лечения онкологических заболеваний, характеризующихся присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли; полученный терапевтический агент обладает рядом свойств, необходимых для его эффективного и безопасного использования: мультивалентность, относительно хорошая стабильность и увеличенное время нахождения в кровотоке, а также отсутствие нежелательных эффекторных функций, присущих полноразмерным антителам;When implementing the invention, the following technical results are achieved: a new version of the therapeutic agent based on fragments of antibodies to GD2 for the treatment of cancer, characterized by the presence of ganglioside GD2 on the surface of tumor cells is created; The resulting therapeutic agent has a number of properties necessary for its effective and safe use: multivalence, relatively good stability and increased residence time in the bloodstream, as well as the absence of undesirable effector functions inherent in full-sized antibodies;

- разработана фармацевтическая композиция на основе мультивалентной конструкции, содержащей фрагменты антител к GD2;- developed a pharmaceutical composition based on a multivalent construct containing fragments of antibodies to GD2;

- разработан новый способ лечения онкологических заболеваний;- a new method for the treatment of cancer;

- разработан новый эффективный способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2.- a new effective method of destroying a cell in a subject’s body has been developed, on the surface of which there is a ganglioside GD2.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

Рис. 1. Схема получения мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител.Fig. 1. Scheme for the preparation of multimeric fragments of GD2-specific antibodies.

1А - получение димеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.1A - preparation of dimers of scFv fragments using PEG-Maleimide2.

1Б - получение димеров Fab-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.1B - obtaining dimers of Fab fragments using PEG-Maleimide2.

1В - получение тетрамеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид4.1B is the preparation of tetramers of scFv fragments using PEG-Maleimide 4.

Рис. 2. Электрофорез образцов scFv-фрагментов GD2-специфичных антител после проведения реакции пегилирования с использованием ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. 1 - белковый состав после реакции конъюгирования scFv-фрагментов с ПЭГ-малеимид2; 2 - исходные scFv-фрагменты; 3 - белковый состав после реакции конъюгирования scFv-фрагментов с ПЭГ-малеимид4.Fig. 2. Electrophoresis of samples of scFv fragments of GD2-specific antibodies after the pegylation reaction using PEG-maleimide2 and PEG-maleimide4. 1 - protein composition after the conjugation reaction of scFv fragments with PEG-maleimide2; 2 - initial scFv fragments; 3 - protein composition after the conjugation reaction of scFv fragments with PEG-maleimide 4.

Рис. 3. А - хроматографическое разделение пегилированных scFv-фрагментов GD2-специфичных антител с использованием ПЭГ-малеимид2. Б - вестерн-блот анализ полученных фракций и исходного образца после реакции пегилирования. 1 - фракция димеров пегилированных scFv; 2 - фракция мономеров пегилированных scFv; 3 - фракция scFv; 4 - общая белковая смесь после реакции пегилирования.Fig. 3. A - chromatographic separation of pegylated scFv fragments of GD2-specific antibodies using PEG-maleimide2. B - Western blot analysis of the obtained fractions and the original sample after the pegylation reaction. 1 - fraction of pegylated scFv dimers; 2 - fraction of pegylated scFv monomers; 3 - scFv fraction; 4 - total protein mixture after the pegylation reaction.

Рис. 4. Оценка связывания с ганглиозидом GD2 исходных и модифицированных scFv-фрагментов GD2-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид2. А - прямой иммуноферментный анализ, на подложке сорбирован ганглиозид GD2. Б - проточная цитофлуориметрия. Окрашивание GD2-позитивной клеточной линии EL-4. К_2Ат - контрольные клетки, окрашенные вторичными анти-видовыми антителами. MFI - средняя интенсивность флуоресценции.Fig. 4. Evaluation of the binding to the ganglioside GD2 of the original and modified scFv fragments of GD2-specific antibodies obtained using PEG-maleimide2. A — direct enzyme immunoassay, ganglioside GD2 sorbed on a substrate. B - flow cytofluorimetry. Staining of the GD2-positive cell line EL-4. K_2At - control cells stained with secondary anti-species antibodies. MFI is the average fluorescence intensity.

Рис. 5. Оценка клеточной гибели под действием scFv-фрагментов GD2-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид, ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. А - МТТ-тест, 72 ч инкубации, Б - PI-тест и 7AAD-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки.Fig. 5. Assessment of cell death by scFv fragments of GD2-specific antibodies obtained using PEG-maleimide, PEG-maleimide2 and PEG-maleimide4. A - MTT test, 72 hours of incubation, B - PI test and 7AAD test, 24 hours of incubation. K - intact cells.

Рис. 6. Оценка клеточной гибели под действием Fab-фрагментов GD2-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид и ПЭГ-малеимид2. А - МТТ-тест, 72 ч инкубации, Б - PI-тест и 7AAD-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки.Fig. 6. Assessment of cell death by Fab fragments of GD2-specific antibodies obtained using PEG-maleimide and PEG-maleimide2. A - MTT test, 72 hours of incubation, B - PI test and 7AAD test, 24 hours of incubation. K - intact cells.

Рис. 7. Динамика падения внутривенно введенных флуоресцентно-меченных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c. А - исходные и модифицированные scFv-фрагменты GD2-специфичных антител. Б - исходные и модифицированные Fab-фрагменты GD2-специфичных антител.Fig. 7. The dynamics of the fall of intravenously introduced fluorescently-labeled antibody fragments in the blood of Balb / c mice. A - initial and modified scFv fragments of GD2-specific antibodies. B - initial and modified Fab fragments of GD2-specific antibodies.

Рис. 8. Динамика падения внутривенно введенных флуоресцентно-меченных мономеров scFv-фрагментов антител, модифицированных молекулами ПЭГ различной молекулярной массы и формы в крови мышей линии Balb/c. Y - обозначает разветвленную структуру молекулы ПЭГ.Fig. 8. The dynamics of the fall of intravenously introduced fluorescently-labeled monomers of scFv antibody fragments modified with PEG molecules of various molecular weights and shapes in the blood of Balb / c mice. Y - denotes the branched structure of the PEG molecule.

Определения и терминыDefinitions and Terms

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.For a better understanding of the present invention, the following are some of the terms used in the present description of the invention.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of the present invention, the terms “includes” and “including” are interpreted as meaning “includes, inter alia,”. These terms are not intended to be construed as “consists of only”.

Под «субъектом» следует понимать человека или другое млекопитающее.By “subject” is meant a human or other mammal.

Ганглиозидом GD2 в настоящем описании называется дисиалоганглиозид, экспрессированный на поверхности опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения со следующей IUPAC формулой: (2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hydroxy-6-(hydroxyrnethyl)oxan-4-yl]oxy-3-amino-6-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl]-2,3-dihydroxypropoxy]-5-amino-4-hydroxy-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)oxane-2-carboxylic acid.GD2 ganglioside in the present description refers to a disialoganglioside expressed on the surface of tumor cells of neuroectodermal origin with the following IUPAC formula: (2R, 4R, 5S, 6S) -2- [3 - [(2S, 3S, 4R, 6S) -6 - [( 2S, 3R, 4R, 5S, 6R) -5 - [(2S, 3R, 4R, 5R, 6R) -3-acetamido-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl) oxan-2-yl] oxy-2 - [(2R, 3S, 4R, 5R, 6R) -4,5-dihydroxy-2- (hydroxymethyl) -6 - [(E) -3-hydroxy-2- (octadecanoylamino) octadec-4-enoxy] oxan- 3-yl] oxy-3-hydroxy-6- (hydroxyrnethyl) oxan-4-yl] oxy-3-amino-6-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl] -2,3-dihydroxypropoxy] -5-amino -4-hydroxy-6- (1,2,3-trihydroxypropyl) oxane-2-carboxylic acid.

Термин «антитело» эквивалентен термину «иммуноглобулин» и означает гликопротеин, состоящий из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепи, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов - СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH и VL-области могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые областями, определяющими комплементарность (H-CDR и L-CDR), разделенные более консервативными областями, именуемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном (то есть, антигенсвязывающую часть антитела). Fc-регион молекулы иммуноглобулина состоит из димера, образованного СН2 и СН3 доменами двух тяжелых цепей; Fc-регион опосредует эффекторные функции антитела, то есть взаимодействие молекулы иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.The term “antibody” is equivalent to the term “immunoglobulin” and means a glycoprotein consisting of two heavy (H) chains and two light (L) chains connected by disulfide bonds. Each heavy chain consists of a variable region of the heavy chain (VH) and a constant region of the heavy chain. The constant region of the heavy chain consists of three domains - CH1, CH2 and CH3. Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region. The constant region of the light chain consists of one domain CL. VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions, referred to as complementarity determining regions (H-CDR and L-CDR), separated by more conservative regions, referred to as framework regions (FR). Each VH and VL region consists of three CDRs and four FRs located from the amino end to the carboxy end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen (i.e., the antigen-binding portion of the antibody). The Fc region of an immunoglobulin molecule consists of a dimer formed by the CH2 and CH3 domains of two heavy chains; The Fc region mediates the effector functions of an antibody, i.e., the interaction of an immunoglobulin molecule with tissues or host factors including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system.

Термин «функциональный фрагмент антитела» в использованном здесь значении означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ганглиозидом GD2). Примеры функциональных фрагментов включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела; (iv) два домена Fv-фрагмента, VL и VH, объединенных при помощи синтетического линкера в одну белковую цепь, в которой VL и VH области спариваются с образованием одновалентной конструкции (известна как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); см., например, Bird et al., Science, 1988, 242:423-426). Указанные фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения функциональные фрагменты антител не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями; в частности, функциональные фрагменты антител могут не содержать Fc-регион.The term “functional antibody fragment” as used herein means one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen (eg, GD2 ganglioside). Examples of functional fragments include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) F (ab ') 2 fragment, a divalent fragment comprising two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody; (iv) two domains of the Fv fragment, VL and VH, joined by a synthetic linker into a single protein chain, in which the VL and VH regions mate to form a monovalent construct (known as a single chain Fv fragment (scFv); see, for example, Bird et al., Science, 1988, 242: 423-426). These antibody fragments are prepared by conventional methods known to those skilled in the art. In preferred embodiments of the present invention, the functional antibody fragments do not have or have reduced effector functions; in particular, functional antibody fragments may not contain an Fc region.

Мультивалентная конструкция по настоящему изобретению может содержать от двух до нескольких функциональных фрагментов антител, каждый из которых способен специфически связываться с ганглиозидом GD2; таким образом, она содержит два или несколько антиген-связывающих участков. Функциональные фрагменты антител в мультивалентной конструкции могут включать вариабельные области, а также, иногда, константные области, выделенные из последовательностей иммуноглобулинов, специфически связывающих GD2. Предпочтительно, но без обязательных ограничений, функциональные фрагменты в составе мультивалентной конструкции по настоящему изобретению не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями. Мультивалентность, т.е. способность связывать сразу несколько молекул антигена, обеспечивает конструкции по настоящему изобретению высокую авидность (стабильность взаимодействия между конструкцией и клеткой, экспрессирующей антигены на поверхности), что в свою очередь обеспечивает улучшенные функциональные свойства конструкции.The multivalent construct of the present invention may contain from two to several functional antibody fragments, each of which is capable of specifically binding to the GD2 ganglioside; thus, it contains two or more antigen-binding sites. Functional antibody fragments in a multivalent construct may include variable regions, as well as, sometimes, constant regions isolated from immunoglobulin sequences that specifically bind GD2. Preferably, but without mandatory restrictions, the functional fragments in the multivalent construct of the present invention do not have or have reduced effector functions. Multivalence, i.e. the ability to bind several antigen molecules at once, provides the constructs of the present invention with high avidity (stability of the interaction between the construct and the cell expressing antigens on the surface), which in turn provides improved functional properties of the construct.

Используемые функциональные фрагменты антител по настоящему изобретению могут представлять собой «химерные» или «гуманизированные» фрагменты антител. Химерные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей из одного вида и последовательности константной области из другого вида. Гуманизированные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности фрагментов человеческих антител, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки каркасной области (FR) заменены остатками аналогичных сайтов из антител грызунов.Used functional fragments of antibodies of the present invention can be a "chimeric" or "humanized" antibody fragments. Chimeric fragments mean antibody fragments that include the sequences of the variable region of the heavy and / or light chains from one species and the sequences of the constant region from another species. Humanized fragments mean antibody fragments that include sequences of fragments of human antibodies in which some residues of the CDR and possibly some residues of the frame region (FR) are replaced by residues of similar sites from rodent antibodies.

В некоторых вариантах изобретения функциональные фрагменты антител согласно изобретению содержат области тяжелых и/или легких цепей, включающие в себя аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям, описанным в Таблице 1 предпочтительных фрагментов антител, где указанные функциональные фрагменты антител сохраняют нужные функциональные свойства согласно изобретению (связывание с ганглиозидом GD2 и индукция клеточной гибели). Гомологичные фрагменты антител могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного фрагмента антител на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.In some embodiments, the functional antibody fragments of the invention comprise heavy and / or light chain regions including amino acid sequences homologous to the amino acid sequences described in Table 1 of the preferred antibody fragments, where the indicated functional antibody fragments retain the desired functional properties of the invention (binding to GD ganglioside and induction of cell death). Homologous antibody fragments can be obtained by mutagenesis (e.g., site-directed or PCR-mediated mutagenesis) of the corresponding nucleic acid molecules, followed by testing the encoded modified antibody fragment to maintain its functions in accordance with the functional assays described herein.

Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью бесплатной программы NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).As used herein, the term “percent homology of two sequences” is equivalent to the term “percent identity of two sequences”. The percentage of identity of two sequences is determined by the number of positions of identical amino acids in these two sequences, taking into account the number of spaces and the length of each space that must be entered for optimal comparison of the two sequences by alignment. The percentage of identity is equal to the number of identical amino acids in these positions, taking into account sequence alignment divided by the total number of positions and multiplied by 100. The percentage of identity of two amino acid sequences can be determined using the NCBI Protein BLAST freeware program (https: //blast.ncbi.nlm. nih.gov/).

Термин «фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или наполнитель» относится к таким носителям, растворителям и/или наполнителям, которые, являясь неактивными ингредиентами, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д. и отвечают разумному соотношению пользы и риска. «Неактивные ингредиенты» входят в состав лекарственного средства или вакцинного препарата для улучшения его растворимости и/или стабильности, а также для улучшения фармакокинетики и более эффективной доставки к специфическим органам или тканям. Неактивные ингредиенты включают в себя множество веществ, известных специалистам в области фармацевтики, таких как вещества для контроля рН или осмотического давления, антибактериальные агенты, антиоксиданты, поверхностно активные вещества (например, полисорбат 20 или 80), криостабилизаторы, консерванты, растворители, загустители, наполнители, носители (микро- или нано-частицы) и другие вещества.The term "pharmaceutically acceptable carrier, solvent and / or excipient" refers to such carriers, solvents and / or excipients that, being inactive ingredients, within the framework of a medical opinion, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation allergic reaction, etc. and meet a reasonable balance of benefits and risks. "Inactive ingredients" are part of a drug or vaccine preparation to improve its solubility and / or stability, as well as to improve pharmacokinetics and more efficient delivery to specific organs or tissues. Inactive ingredients include a variety of substances known to those skilled in the pharmaceutical arts, such as pH or osmotic pressure control agents, antibacterial agents, antioxidants, surfactants (e.g., Polysorbate 20 or 80), cryostabilizers, preservatives, solvents, thickeners, fillers , carriers (micro- or nano-particles) and other substances.

Термин «терапевтически эффективное количество» подразумевает такое количество фармацевтической композиции, которое при попадании в организм субъекта будет эффективно индуцировать элиминацию клеток опухоли, экспрессирующих ганглиозид GD2. При применении в комбинированной терапии термин «эффективное количество» относится к комбинации количеств активных ингредиентов, прием которых ведет к превентивному или терапевтическому эффекту при последовательном или одновременном приеме. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида млекопитающего, возраста и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п. Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем изобретении, может быть введена в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения и/или профилактики онкологических заболеваний.The term “therapeutically effective amount” means an amount of a pharmaceutical composition which, when administered to a subject, will effectively induce the elimination of tumor cells expressing GD2 ganglioside. When used in combination therapy, the term "effective amount" refers to a combination of the amounts of active ingredients, the administration of which leads to a preventive or therapeutic effect with sequential or simultaneous administration. The exact amount required can vary from subject to subject depending on the type of mammal, age and general condition of the patient, the severity of the disease, the method of administration of the drug, combined treatment with other drugs, etc. The pharmaceutical composition described in the present invention can be introduced into the patient’s body in any quantity and by any route of administration effective for the treatment and / or prevention of cancer.

Подробное раскрытие изобретенияDetailed Disclosure of Invention

Создание оптимального терапевтического агента на основе антител к GD2.Creation of an optimal therapeutic agent based on antibodies to GD2.

Ганглиозид GD2 характеризуется низким уровнем экспрессии на некоторых типах здоровых клеток организма (в основном, это периферические нейроны, нейроны ЦНС, меланоциты и МСК костного мозга), и практически отсутствует на других здоровых клетках организма. При опухолевой трансформации количество GD2 возрастает в десятки и более раз, составляя до 10% от всех липидов и до 90% от ганглиозидов плазматической мембраны. Стандартные методы терапии GD2-позитивных опухолей обладают сильными побочными эффектами и малоэффективны. Единственный доступный в клинике препарат для таргетной терапии, моноклональное антитело к GD2, также обладает невысокой эффективностью и ярко выраженными побочными эффектами, значительная часть которых обусловлена наличием у антитела Fc-фрагмента и ассоциированной с ним функции активации системы комплемента. Другим недостатком является относительно большой размер антитела (150 кДа), который затрудняет проникновение вглубь опухолей.GD ganglioside is characterized by a low level of expression on some types of healthy cells of the body (mainly peripheral neurons, central nervous system neurons, melanocytes and bone marrow MSCs), and is practically absent on other healthy cells of the body. During tumor transformation, the amount of GD2 increases by tens or more times, amounting to 10% of all lipids and up to 90% of the plasma membrane gangliosides. Standard methods of treatment of GD2-positive tumors have strong side effects and are ineffective. The only drug for targeted therapy available in the clinic, the monoclonal antibody to GD2, also has low efficiency and pronounced side effects, most of which are due to the presence of the Fc fragment and the associated complement activation function in the antibody. Another disadvantage is the relatively large size of the antibody (150 kDa), which makes it difficult to penetrate deep into the tumors.

В качестве альтернативного подхода в настоящем изобретении предлагается использовать GD2-связывающие фрагменты антител без Fc-домена для элиминации GD2-позитивных опухолевых клеток. Ранее авторами было показано, что Fab-фрагменты GD-2-специфичных антител сохраняют способность индуцировать клеточную гибель в опухолевых клетках (Doronin II et al., Bull Exp Biol Med, 2013, Mar; 154(5):658-63), несмотря на отсутствие Fc-ассоциированных эффекторных функций. Этот эффект может быть обусловлен блокированием или изменением сигнальных путей, опосредованных ганглиозидом GD2 (Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May; 20(5):679-88). Тем не менее, GD2-связывающие фрагменты антител без Fc- домена имели существенные недостатки: более короткое время жизни в кровотоке и, иногда, менее эффективная индукция клеточной гибели по сравнению с полноразмерными антителами. Для увеличения продолжительности нахождения фрагментов антител в кровотоке была применена процедура пегилирования - ковалентная конъюгация с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). Этот метод был неоднократно успешно использован для других белковых молекул. Эта процедура действительно увеличивала продолжительность нахождения GD2-связывающих фрагментов антител в кровотоке, но при этом эффективность индукции клеточной гибели опухолевых клеток не всегда была достаточной. Неожиданно было обнаружено, что присоединение двух или более GD2-связывающих фрагментов антител к одной молекуле ПЭГ повышает цитотоксические эффекты GD2-связывающих фрагментов антител к клеткам опухоли. Такая мультивалентная конструкция также обладает достаточно длинным временем жизни в кровотоке, и, потенциально, сниженными побочными эффектами на нервные окончания по сравнению со стандартными антителами. Дело в том, что такая конструкция не будет индуцировать комплемент-зависимую цитотоксичность из-за отсутствия Fc-региона; при этом Fc-независимая цитотоксичность сильно зависит от концентрации GD2 на поверхности клетки, поэтому цитотоксичное действие мультивалентной конструкции будет более специфичным по отношению к опухолевым клеткам, где экспрессия GD2 отличается в сотни раз по сравнению с нормальными клетками (Svennerholm L, et al. Biochim Biophys Acta, 1994, 1214:115-123). Наличие молекулы ПЭГ в составе мультивалентной конструкции улучшает фармакокинетические характеристики молекулы за счет снижения печеночного клиренса и уменьшения поглощения ретикулоэндотелиальной системой; кроме того, пегилирование значительно повышает EPR-эффект (enhanced permeation and retention effect) - свойство препарата преимущественно локализоваться в опухоли при внутривенном введении. Препарат, накопленный в результате пассивной адресной доставки в очаге опухолевого роста, будет активно и избирательно взаимодействовать только с опухолевыми клетками, гиперэкспрессирующими ганглиозид GD2. Таким образом, описанная мультимеризация с использованием молекулы ПЭГ повышает как фармакокинетические, так и фармакодинамические свойства фрагментов антител к GD2.As an alternative approach, the present invention proposes to use GD2-binding antibody fragments without an Fc domain to eliminate GD2-positive tumor cells. Previously, the authors showed that Fab fragments of GD-2 specific antibodies retain the ability to induce cell death in tumor cells (Doronin II et al., Bull Exp Biol Med, 2013, Mar; 154 (5): 658-63), despite the absence of Fc-associated effector functions. This effect may be due to the blocking or alteration of signaling pathways mediated by the ganglioside GD2 (Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May; 20 (5): 679-88). However, GD2-binding antibody fragments without the Fc domain had significant drawbacks: a shorter life span in the bloodstream and, sometimes, a less effective induction of cell death compared to full-sized antibodies. To increase the duration of the presence of antibody fragments in the bloodstream, the pegylation procedure was used - covalent conjugation with a polyethylene glycol molecule (PEG). This method has been repeatedly used successfully for other protein molecules. This procedure really increased the duration of the presence of GD2-binding antibody fragments in the bloodstream, but the efficiency of inducing cell death of tumor cells was not always sufficient. Surprisingly, it was found that the attachment of two or more GD2-binding antibody fragments to a single PEG molecule increases the cytotoxic effects of GD2-binding antibody fragments to tumor cells. This multivalent construct also has a fairly long lifetime in the bloodstream, and potentially reduced side effects on nerve endings compared to standard antibodies. The fact is that such a design will not induce complement dependent cytotoxicity due to the absence of an Fc region; however, Fc-independent cytotoxicity strongly depends on the concentration of GD2 on the cell surface; therefore, the cytotoxic effect of the multivalent construct will be more specific in relation to tumor cells, where the expression of GD2 is hundreds of times different than normal cells (Svennerholm L, et al. Biochim Biophys Acta, 1994, 1214: 115-123). The presence of the PEG molecule in the multivalent construct improves the pharmacokinetic characteristics of the molecule by reducing hepatic clearance and decreasing the absorption of the reticuloendothelial system; in addition, pegylation significantly increases the EPR effect (enhanced permeation and retention effect) - the property of the drug is mainly localized in the tumor when administered intravenously. The drug accumulated as a result of passive targeted delivery in the tumor growth site will only actively and selectively interact with tumor cells that overexpress GD2 ganglioside. Thus, the described multimerization using the PEG molecule enhances both the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of fragments of antibodies to GD2.

Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples are provided in order to disclose the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention.

Способы получения фрагментов GD2-специфичных антителMethods for producing fragments of GD2-specific antibodies

Фрагменты GD2-специфичных антител могут быть произведены с использованием векторов для рекомбинантной экспрессии, известных специалистам. Выбор промоторов и других регуляторных элементов может варьироваться в зависимости от предпочтений специалиста или от выбранной для экспрессии клетки-хозяина. Далее для иллюстрации приведены возможные варианты воплощения изобретения.Fragments of GD2-specific antibodies can be produced using recombinant expression vectors known to those skilled in the art. The choice of promoters and other regulatory elements may vary depending on the preferences of the person skilled in the art or on the host cell selected for expression. The following are illustrations of possible embodiments of the invention.

Рекомбинантные фрагменты антител могут быть получены по меньшей мере в трех системах экспрессии - в клетках E.coli, Pichia Pastoris и СНО. На основании последовательностей вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела 14G2a (Bolesta Е et al., Cancer Res., 2005, Apr 15; 65(8):3410-8) был проведен дизайн конструкций scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител. кДНК scFv- и Fab-фрагментов, оптимизированные для максимальной экспрессии в соответствующей системе были синтезированы в компании Genscript. Аминокислотные последовательности фрагментов антител, используемые в предпочтительных вариантах изобретения, приведены в Таблице 1.Recombinant antibody fragments can be obtained in at least three expression systems — in E. coli, Pichia Pastoris, and CHO cells. Based on the sequences of the variable domains of the light and heavy chains of antibody 14G2a (Bolesta E et al., Cancer Res., 2005, Apr 15; 65 (8): 3410-8), constructs of scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies were designed . cDNAs of scFv and Fab fragments optimized for maximum expression in the corresponding system were synthesized by Genscript. The amino acid sequences of antibody fragments used in preferred embodiments of the invention are shown in Table 1.

Для экспрессии в E.coli scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pET22b+ по рестриктным сайтам Ndel и Xhol. Идентичность конструкций ожидаемым была подтверждена секвенированием. Для экспрессии конструкции pET22b+/scFv и pET22b+/Fab трансформировали в штаммы Е. coli Rosetta2(DE3)pLysS или HMS174(DE3)pLysS, и проводили индукцию экспрессии по стандартному протоколу, известному специалистам, в течение 4 ч при 25°С или 22 ч при 20°С. Количество, а также локализацию белка оценивали при помощи BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения тотальной фракции белка клетки Е. coli, осажденные из 0.5 л культуры, тщательно ресуспендировали в 5 мл холодного лизирующего буфера (50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0.5 мМ фенилметилсульфонил фторид (PMSF), рН 7.2) и дополнительно охлаждали в течение 15 мин на льду. Затем суспензию обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток. Полученный лизат центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин. при 4°С. Осадок, содержащий клеточный дебрис, удаляли. Перевод белка в конечный буфер (фосфатный буфер (PBS), дополненный 0.02% NaN₃) осуществляли центрифугированием на фильтрах Amicon Ultra-4 с диаметром пор 10 кДа.For expression of scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies in E. coli, the corresponding cDNAs were inserted into the pET22b + vector at the Ndel and Xhol restriction sites. The identity of the constructs expected was confirmed by sequencing. To express the constructs, pET22b + / scFv and pET22b + / Fab were transformed into E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS or HMS174 (DE3) pLysS strains and expression was induced according to the standard protocol known to those skilled in the art for 4 hours at 25 ° C or 22 hours at 20 ° C. The quantity and localization of the protein was evaluated using a BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) in accordance with the manufacturer's instructions. To isolate the total protein fraction, E. coli cells precipitated from 0.5 L of culture were carefully resuspended in 5 ml of cold lysis buffer (50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.2 ) and additionally cooled for 15 min on ice. Then the suspension was treated with ultrasound until complete destruction of the cells. The resulting lysate was centrifuged at 10,000 g for 20 minutes. at 4 ° C. The pellet containing cell debris was removed. Protein was transferred to the final buffer (phosphate buffer (PBS) supplemented with 0.02% NaN ₃ ) by centrifugation on Amicon Ultra-4 filters with a pore diameter of 10 kDa.

Для экспрессии в Pichia pastoris scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pPICZalphaB по сайтам рестрикции Xhol/Notl. При этом пропептид для секреции (альфа-фактор из Saccharomyces cerevisiae) находился в одной рамке считывания с фрагментами антител. Для отщепления альфа-фактора были предусмотрены сайты действия протеаз Кех2 (EKRE) и Ste13 (ЕА ЕА). Клонирование проводили в стандартном штамме Е. coli XL1-blue, селекцию осуществляли при посеве на низко-солевую среду LB с 25 мкг/мл зеоцина. Методом электропорации трансфицировали клетки Pichia pastoris штаммов GS115 и smd1168h согласно инструкции к EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Трансформанты сеяли на среду YPDS-агар с разной концентрацией зеоцина (500-2000 мкг/мл), трансформанты вырастали на 4-5 сутки. Полученные колонии рассевали для получения отдельных клонов, которые высевали на среду BMGH в 24-луночные планшеты и инкубировали при 30°С и 200 об/мин трое суток. Затем клетки собирали центрифугированием при 1500×g и комнатной температуре, и высевали на среду ВММН в 24-луночные планшеты. После чего инкубировали при 30°С и 200 об/мин в течение 4 суток. Каждые сутки добавляли 0,5% метанола. После окончания инкубации клетки отделяли центрифугированием при 5000×g, супернатанты оставляли для анализа.To express scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies in Pichia pastoris, the corresponding cDNAs were inserted into the pPICZalphaB vector at the Xhol / Notl restriction sites. Moreover, the propeptide for secretion (alpha factor from Saccharomyces cerevisiae) was in the same reading frame with antibody fragments. For cleavage of the alpha factor, sites of action of proteases Kech2 (EKRE) and Ste13 (EA EA) were provided. Cloning was carried out in a standard E. coli XL1-blue strain, selection was carried out by plating on low-salt LB medium with 25 μg / ml zeocin. Pichia pastoris cells of strains GS115 and smd1168h were transfected by electroporation according to the instructions for the EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Transformants were seeded on YPDS agar medium with different concentrations of zeocin (500-2000 μg / ml), transformants grew on 4-5 days. The resulting colonies were scattered to obtain individual clones, which were seeded on BMGH medium in 24-well plates and incubated at 30 ° C and 200 rpm for three days. Cells were then harvested by centrifugation at 1500 x g and room temperature, and plated on BMMN medium in 24-well plates. Then they were incubated at 30 ° C and 200 rpm for 4 days. Every day, 0.5% methanol was added. After incubation, the cells were separated by centrifugation at 5000 × g, supernatants were left for analysis.

Для экспрессии в клетках линии СНО scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в векторы для стабильной экспрессии в клетках СНО линии DXB-11, дефицитной по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR). Для Fab-фрагмента получение кодирующей последовательности легкой цепи ДНК проводили методом ПЦР; далее использовали клонирование по сайтам Xbal и Notl в экспрессионный вектор pcDNA3.3 с измененным полилинкером (Thermo Fisher Scientific). Клонирование части тяжелой цепи осуществляли в вектор pOptiVec (Thermo Fisher Scientific) с использованием рестриктных сайтов Xbal и Nhel. Для гена scFv-фрагмента использовали клонирование по сайтам Xbal и Notl в экспрессионный вектор pcDNA3.3. Полученные конструкции проверяли секвенированием. Препараты ДНК очищали с помощью ионообменной хроматографии и использовали для трансфекции клеток DXB-11. Введение экспрессионных конструкций в клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulser Xcell System (BioRad), с использованием смеси плазмид, несущих тяжелую и легкую цепи антитела. Спустя 48 часов после начала трансфекции проводили смену среды культивирования на бессывороточную среду, содержащую 200 мкг/мкл G418 и лишенную гипоксантина и тимидина. Культивирование продолжали 19 дней, в течение которых проводили регулярное измерение клеточной плотности и жизнеспособности. После достижения устойчивых показателей роста (жизнеспособность выше 95% и время удвоения - не более 30 часов) стабильный клеточный пул клонировали лимитирующими разведениями (1 клетка на лунку 96 луночного планшета). В среду для клонирования клеток добавляли низкие концентрации метотрексата (25нМ). Спустя еще 14 дней позитивные по росту клеток лунки анализировали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на предмет секреции фрагментов антител. Колонии с максимальными значения продукции масштабировали до 24 луночных планшетов и подвергали второму раунду амплификации с использованием 100 нМ метотрексата. Клоны с максимальными значениями продуктивности дополнительно амплифицировали при 250 и 500 нМ метотрексата, после чего повторно клонировали методом лимитирующих разведений, как описано выше.For expression of scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies in CHO line cells, the corresponding cDNAs were inserted into vectors for stable expression in CHO cells of the DXB-11 line deficient in the dihydrofolate reductase gene (DHFR). For the Fab fragment, the coding sequence of the DNA light chain was obtained by PCR; Further, cloning at Xbal and Notl sites into the pcDNA3.3 expression vector with modified polylinker (Thermo Fisher Scientific) was used. Partial cloning of the heavy chain was carried out into the pOptiVec vector (Thermo Fisher Scientific) using the restriction sites Xbal and Nhel. For the scFv fragment gene, cloning at the Xbal and Notl sites into the pcDNA3.3 expression vector was used. The resulting constructs were checked by sequencing. DNA preparations were purified by ion exchange chromatography and used to transfect DXB-11 cells. The expression constructs were introduced into cells by electroporation on a Gene Pulser Xcell System (BioRad) instrument using a mixture of plasmids carrying the antibody heavy and light chains. 48 hours after the start of transfection, the culture medium was changed to serum-free medium containing 200 μg / μl G418 and lacking hypoxanthine and thymidine. Cultivation continued for 19 days, during which regular measurements of cell density and viability were performed. Once steady growth was achieved (viability above 95% and doubling time not more than 30 hours), the stable cell pool was cloned by limiting dilutions (1 cell per well of a 96 well plate). Low concentrations of methotrexate (25nM) were added to the cell cloning medium. After another 14 days, cell growth positive wells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the secretion of antibody fragments. Colonies with maximum production values were scaled to 24 well plates and subjected to a second round of amplification using 100 nM methotrexate. Clones with maximum productivity values were further amplified at 250 and 500 nM methotrexate, and then re-cloned by the method of limiting dilutions, as described above.

Полученные финальные клоны с максимальными значениями продуктивности и хорошими показателями роста масштабировали и далее культивировали в суспензионной культуре для получения препаративных количеств фрагментов антител.The resulting final clones with maximum productivity and good growth rates were scaled and further cultured in suspension culture to obtain preparative amounts of antibody fragments.

Выделение и очистка фрагментов антител на примере экспрессии в E.coliIsolation and purification of antibody fragments as exemplified by expression in E. coli

Для очистки scFv-фрагментов к полученным лизатам добавляли 50% суспензии Ni-NTA-агарозы и инкубировали 1 ч при 4°С при легком перемешивании. Затем суспензию переносили в колонку и дважды промывали буфером, содержащим 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол (рН 7.2). Элюцию проводили буфером, содержащим 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол (рН 7.2).To purify scFv fragments, a 50% suspension of Ni-NTA agarose was added to the obtained lysates and incubated for 1 h at 4 ° C with gentle stirring. Then the suspension was transferred to a column and washed twice with buffer containing 50 mm NaH ₂ PO ₄ , 300 mm NaCl, 20 mm imidazole (pH 7.2). Elution was performed with a buffer containing 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole (pH 7.2).

Для выделения и очистки Fab-фрагментов из клеточных лизатов использовали колонку с Protein L агарозой из набора реактивов HiTrap Protein L (GE Healthcare, США). После промывки и активации колонки связывающим буфером на нее наносили лизат клеток E.coli. Колонку промывали от несвязавшихся белков, затем элюировали Fab-фрагменты, используя элюирующий буфер. Очищенные фрагменты собирали в 15 мл пробирку, содержащую 750 мкл нейтрализующего буфера. Нейтрализованный раствор Fab-фрагментов переводили в фосфатный буфер (PBS), содержащий азид натрия (0.02%), центрифугированием через фильтры Amicon Ultra (максимальная пропускающая способность 100 кДа) при 1000 g в течение 20 мин.To isolate and purify Fab fragments from cell lysates, a Protein L agarose column from the HiTrap Protein L reagent kit (GE Healthcare, USA) was used. After washing and activating the column with binding buffer, an E. coli cell lysate was applied to it. The column was washed from unbound proteins, then Fab fragments were eluted using elution buffer. The purified fragments were collected in a 15 ml tube containing 750 μl of neutralization buffer. The neutralized solution of Fab fragments was transferred to phosphate buffer (PBS) containing sodium azide (0.02%) by centrifugation through Amicon Ultra filters (maximum transmittance 100 kDa) at 1000 g for 20 min.

Чистота полученных Fab- и scFv-фрагментов по белковому электрофорезу составила >95%. Полученные препараты были переведены в PBS, рН 7,4, и затем стерилизованы фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.The purity of the obtained Fab and scFv fragments by protein electrophoresis was> 95%. The resulting preparations were transferred to PBS, pH 7.4, and then sterilized by filtration through a 0.22 μm membrane. Protein concentration was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm.

Мультимеризация scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител через пегилированиеMultimerization of scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies through pegylation

Мультимеризация является одной из стратегий улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств фрагментов антител. Больший молекулярный размер мультимеров на основе фрагментов антител способствует увеличению периода полужизни в сыворотке, а также более быстрому поглощению опухолью за счет EPR-эффекта, что приводит к их лучшему накоплению в опухоли по сравнению с исходными IgG антителами или мономерами фрагментов. Кроме того, мультимеризация, как правило, способствует мультивалентности против антигена-мишени, которая приводит не только к более высокой аффинности благодаря эффекту авидности, но также может способствовать улучшению функциональных свойств и компенсировать отсутствие индукции вторичных иммунных функций ADCC и CDC. В случае моноклональных антител к ганглиозиду GD2 Fc-фрагмент полноразмерных антител во многом определяет побочные эффекты, и иммунные механизмы ADCC и CDC имеют ограниченный положительный терапевтический эффект. В связи с этим, создание мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител для терапии онкологических заболеваний имеет значительный потенциал.Multimerization is one of the strategies for improving the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antibody fragments. The larger molecular size of multimers based on antibody fragments increases the half-life in serum, as well as faster tumor uptake due to the EPR effect, which leads to their better accumulation in the tumor compared to the initial IgG antibodies or fragment monomers. In addition, multimerization tends to promote multivalency against the target antigen, which not only leads to higher affinity due to the avidity effect, but can also improve functional properties and compensate for the lack of induction of secondary immune functions of ADCC and CDC. In the case of monoclonal antibodies to the ganglioside GD2, the Fc fragment of full-length antibodies largely determines side effects, and the immune mechanisms of ADCC and CDC have a limited positive therapeutic effect. In this regard, the creation of multimeric fragments of GD2-specific antibodies for the treatment of cancer has significant potential.

В то же время мультимеры фрагментов антител, полученные стандартными способами, такими как использование стерической агрегации, формирования цистеиновых мостиков или кроссшивающих реагентов, часто характеризуются крайне низкой стабильностью и проблемами с масштабированием, что ограничивает перспективы их использования.At the same time, multimers of antibody fragments obtained by standard methods, such as the use of steric aggregation, the formation of cysteine bridges or cross-linking reagents, are often characterized by extremely low stability and scaling problems, which limits the prospects for their use.

Одной из стратегий увеличения времени полужизни терапевтических молекул в кровотоке является увеличение гидродинамического объема молекулы путем связывания с инертными полимерами, такими как полиэтиленгликоль или другими гидрофильными полимерами. Причем только полиэтиленгликоль (ПЭГ)-производные белков одобрены FDA и другими регуляторными ведомствами для использования в медицине. Действительно, слияние или конъюгация различных пептидных молекул с полимерами существенно повышает их время полужизни, что было подтверждено экспериментально и в клинической практике.One strategy for increasing the half-life of therapeutic molecules in the bloodstream is to increase the hydrodynamic volume of the molecule by binding to inert polymers such as polyethylene glycol or other hydrophilic polymers. Moreover, only polyethylene glycol (PEG) derivatives of proteins are approved by the FDA and other regulatory agencies for use in medicine. Indeed, the fusion or conjugation of various peptide molecules with polymers significantly increases their half-life, which was confirmed experimentally and in clinical practice.

Для усиления терапевтического потенциала фрагментов GD2-специфичных антител и улучшения их фармакокинетических свойств авторами было использовано сайт-направленное пегилирование, целью которого было не только увеличение времени циркуляции фрагментов в крови, но и усиление цитотоксических свойств за счет получения стабильных мультимеров фрагментов GD2-специфичных антител. Для получения ди-, три- и тетрамеров фрагментов антител использовали стандартные реагенты ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4 (JenKem Technology USA, https://www.jenkemusa.com). Использованные производные ПЭГ позволяют присоединять к одной молекуле ПЭГ несколько (от 1 до 4) молекул фрагментов. Схемы реакций пегилирования представлены на Рис. 1.To enhance the therapeutic potential of fragments of GD2-specific antibodies and improve their pharmacokinetic properties, the authors used site-directed pegylation, the purpose of which was not only to increase the circulation time of fragments in the blood, but also to enhance cytotoxic properties by obtaining stable multimers of fragments of GD2-specific antibodies. To obtain di-, tri- and tetramers of antibody fragments, standard reagents PEG-maleimide2 and PEG-maleimide4 (JenKem Technology USA, https://www.jenkemusa.com) were used. The used PEG derivatives make it possible to attach several (from 1 to 4) fragment molecules to one PEG molecule. Pegylation reaction schemes are shown in Fig. one.

Для проведения реакции пегилирования scFv- и Fab-фрагментов моноклональных антител к раствору фрагментов (2.5 мг/мл) в буфере для пегилирования (20 mM фосфатный буфер, с добавлением 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, рН 7.5) добавляли стоковый раствор 15 mM ТСЕР до достижения конечной концентрации ТСЕР 0.1 mM. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 90 мин при аккуратном перемешивании. От восстановителя избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4 (максимальная пропускающая способность 10 кДа), либо используя колонки для высаливания Zeba Desalting Columns (TermoFisher, США). Затем к раствору фрагментов антител добавляли соответствующие растворы малеимид-ПЭГ, в различных соотношениях. Инкубация длилась 16-18 ч при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием на шейкере. На Рис. 2 представлены примеры пегилирования фрагментов GD2-специфичных антител (в формате scFv) с использованием ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. Эффективность пегилирования оценивали с помощью ПААГ-электрофореза. После подбора оптимальных условий проведения пегилирования выход реакций составлял не менее 90% (Рис. 1).To carry out the pegylation reaction of scFv and Fab fragments of monoclonal antibodies to a solution of fragments (2.5 mg / ml) in a pegylation buffer (20 mM phosphate buffer, with the addition of 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.5), a stock solution of 15 mM TCEP was added until a final TCEP concentration of 0.1 mM is reached. Incubation was carried out at room temperature for 90 min with gentle stirring. The reducing agent was disposed of by centrifugation through Amicon Ultra-4 filters (maximum transmittance 10 kDa), or using Zeba Desalting Columns salting out columns (TermoFisher, USA). Then, the corresponding solutions of maleimide-PEG in various ratios were added to the solution of antibody fragments. Incubation lasted 16-18 hours at room temperature with gentle stirring on a shaker. In Fig. Figure 2 shows examples of the pegylation of fragments of GD2-specific antibodies (in scFv format) using PEG-maleimide2 and PEG-maleimide4. The effectiveness of pegylation was evaluated using PAGE electrophoresis. After selecting the optimal conditions for pegylation, the yield of reactions was at least 90% (Fig. 1).

Для разделения полученных пегилированных фрагментов и получения чистых фракций, содержащих индивидуальные моно- и мультимеры фрагментов антител, проводили хроматографическую очистку с использованием анионообменной хроматографии или гель-фильтрации.To separate the obtained pegylated fragments and obtain pure fractions containing individual mono- and multimers of antibody fragments, chromatographic purification was carried out using anion exchange chromatography or gel filtration.

В одном из вариантов, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования фрагментов антител проводили катионообменную хроматографию на колонке TSK-GEL SP-5PW с использованием ВЭЖХ-системы Beckman System gold, подвижная фаза: элюирующий буфер (25 мМ СН₃СООН, рН 4.0), линейный градиент 0 mM - 250 mM NaCl (в течение 90 мин при комнатной температуре, скорость потока была выбрана 1 мл/мин).In one embodiment, to separate the obtained products of the pegylation reactions of antibody fragments, cation exchange chromatography was performed on a TSK-GEL column SP-5PW using an Beckman System gold HPLC system, mobile phase: elution buffer (25 mM CH ₃ COOH, pH 4.0), linear gradient 0 mM - 250 mM NaCl (for 90 min at room temperature, a flow rate of 1 ml / min was chosen).

Альтернативно, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования использовали гель-фильтрацию (эксклюзионную хроматографию) - колонку Superdex 200 10/30 GL и элюент PBS, пропущенный через фильтр 0.22 мкм. Скорость потока была выбрана 0.6 мл/мин.Alternatively, gel filtration (size exclusion chromatography) was used to separate the resulting pegylation reaction products — a Superdex 200 10/30 GL column and a PBS eluent passed through a 0.22 μm filter. A flow rate of 0.6 ml / min was chosen.

В качестве иллюстрации, на Рис. 3 представлены хроматограммы разделения scFv-фрагментов после проведения пегилирования с использованием ПЭГ-малеимид2 и разделения модифицированных фрагментов методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200 10/30 GL.As an illustration, in Fig. Figure 3 shows chromatograms of separation of scFv fragments after pegylation using PEG-maleimide2 and separation of modified fragments by gel filtration on a Superdex 200 10/30 GL column.

Оценка антиген-связывающих свойств пегилированных фрагментов GD2-специфичных антител.Evaluation of the antigen-binding properties of pegylated fragments of GD2-specific antibodies.

После хроматографической очистки полученные пегилированные моно- и мультимеры фрагментов антител сравнивали по эффективности связывания с ганглиозидом GD2 стандартными методами, которые известны специалистам, а именно, методами ИФА и проточной цитофлуориметрии.After chromatographic purification, the obtained pegylated mono- and multimers of antibody fragments were compared by the efficiency of binding to GD2 ganglioside using standard methods known to those skilled in the art, namely, ELISA and flow cytometry.

Оценка связывания различных фрагментов GD2-специфичных антител показала, что пегилирование с сохранением мономерной формы фрагментов не приводит к уменьшению взаимодействия с ганглиозидом GD2 относительно непегилированных фрагментов, а пегилирование с образованием мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител показывало значимое увеличение связывания с антигеном (почти в 2 раза по сравнению с scFv и моно-scFv-ПЭГ), что подтверждалось как методом ИФА, так и окрашиванием полученными фрагментами и вторичными FITC-меченными анти-FLAG-антителами GD2-позитивных опухолевых линий с последующей оценкой на проточном цитофлуориметре (Рис 4).An assessment of the binding of various fragments of GD2-specific antibodies showed that pegylation while maintaining the monomeric form of the fragments does not decrease the interaction with the GD2 ganglioside relative to non-pegylated fragments, and pegylation with the formation of multimeric fragments of GD2-specific antibodies showed a significant increase in antigen binding (almost 2 times in comparison with scFv and mono-scFv-PEG), which was confirmed both by ELISA and staining with the obtained fragments and secondary FITC-labeled anti-FLAG antibodies GD2- positive tumor lines followed by flow cytometry (Fig. 4).

Оценка цитотоксических эффектов пегилированных фрагментов GD2-специфичных антител.Assessment of the cytotoxic effects of pegylated fragments of GD2-specific antibodies.

Мультимеризация фрагментов антител приводила к усилению антиген-связывающей способности фрагментов антител и, потенциально, к увеличению цитотоксических свойств молекул. В то же время важными параметрами для проявления противоопухолевых эффектов терапевтических молекул является их размер и масса. Например, молекулы с массой более 150 кДа имеют ограниченный потенциал в клинике в силу неспособности проходить через стенки сосудов. В связи с этим, мультимеры фрагментов антител с молекулярной массой более 150 кДа не использовались в дальнейшей работе. Под данное ограничение не попадали и были проанализированы в последующих цитотоксических тестах моно-, ди- и тетра-scFv-ПЭГ, а также моно- и ди-Fab-ПЭГ.Multimerization of antibody fragments led to an increase in the antigen-binding ability of antibody fragments and, potentially, to an increase in the cytotoxic properties of molecules. At the same time, their size and weight are important parameters for the manifestation of the antitumor effects of therapeutic molecules. For example, molecules with a mass of more than 150 kDa have limited potential in the clinic due to the inability to pass through the walls of blood vessels. In this regard, multimers of antibody fragments with a molecular mass of more than 150 kDa were not used in further work. They did not fall under this restriction and were analyzed in subsequent cytotoxic tests by mono-, di- and tetra-scFv-PEG, as well as mono- and di-Fab-PEG.

Сравнительная оценка цитотоксических эффектов, индуцируемых фрагментами GD2-специфичных антител и их пегилированными производными, проводилась с использованием нескольких классических методов, а именно при помощи МТТ-теста, PI-теста, а также при помощи ДНК-красителя 7-AAD. В качестве клеточной модели исследования была использована линия мышиной лимфомы EL-4, которая характеризуется гиперэкспрессией ганглиозида GD2.A comparative assessment of the cytotoxic effects induced by fragments of GD2-specific antibodies and their pegylated derivatives was carried out using several classical methods, namely, using the MTT test, PI test, and also using DNA dye 7-AAD. As the cell model of the study, the mouse lymphoma line EL-4 was used, which is characterized by overexpression of the ganglioside GD2.

МТТ тест проводили с использованием стандартной колориметрической процедуры. Клетки GD2-позитивных опухолевых линий инкубировали в 96-луночных планшетах с последовательными разведениями фрагментов GD2-специфичных антител в течение 72 ч, затем центрифугировали (8 мин, 300 g), осадок суспендировали и добавляли по 30 мкл/лунка раствора МТТ (5 мг/мл в PBS). После выпадения кристаллов формазана (2-4 ч) его растворяли добавлением 100 мкл DMSO. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре для планшетов Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 540 нм.The MTT test was performed using a standard colorimetric procedure. GD2-positive tumor line cells were incubated in 96-well plates with successive dilutions of fragments of GD2-specific antibodies for 72 hours, then centrifuged (8 min, 300 g), the pellet was suspended and 30 μl / well of MTT solution (5 mg / ml in PBS). After crystals of formazan precipitated (2-4 h), it was dissolved by adding 100 μl of DMSO. Optical absorption was measured on a Multiscan FC plate spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) at a wavelength of 540 nm.

Окрашивание пропидиум иодидом (PI) проводили по методике, известной специалистам. Вкратце, после окончания инкубации с фрагментами антител и их пегилированными производными (10 мкг/мл в течение 24 ч), клетки EL-4 осаждали, фиксировали ледяным 70% EtOH в течение 1 ч при 4°С, дважды отмывали в PBS (300 g, 10 мин, 4°С). Затем клетки ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (PBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 10 мкг/мл РНКазы). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США). В каждом образце регистрировали не менее 1×10⁴ клеток. На гистограммах клетки с фрагментированной ДНК, дифференцировали от нормальных клеток по более низкой интенсивности флуоресценции. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.Propidium iodide (PI) staining was performed according to a technique known to those skilled in the art. Briefly, after incubation with antibody fragments and their pegylated derivatives (10 μg / ml for 24 h), EL-4 cells were besieged, fixed with ice-cold 70% EtOH for 1 h at 4 ° C, washed twice in PBS (300 g 10 min, 4 ° C). Then the cells were resuspended in a DNA staining solution (PBS containing 20 μg / ml PI and 10 μg / ml RNase). The measurements were carried out on an EPICS ELITE flow cytometer (Coulter, USA). At least 1 × 10 ⁴ cells were recorded in each sample. In the histograms, cells with fragmented DNA were differentiated from normal cells by lower fluorescence intensities. The results were processed using the WinMDI program.

Оценку проницаемости плазматической мембраны клеток проводили с помощью флуоресцентного ДНК-красителя 7-AAD. Перед окрашиванием клетки однократно отмывали в PBS и к осадку добавляли 0.5 мл раствора 7-AAD (2 мкг/мл). Флуоресценцию клеток регистрировали цитофлуориметрически. В каждом образце регистрировали не менее 1×10⁴ клеток. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.The permeability of the plasma membrane of cells was assessed using 7-AAD fluorescent DNA dye. Before staining, cells were washed once in PBS and 0.5 ml of 7-AAD solution (2 μg / ml) was added to the pellet. Cell fluorescence was recorded cytofluorimetrically. At least 1 × 10 ⁴ cells were recorded in each sample. The results were processed using the WinMDI program.

На Рис. 5 представлены данные цитотоксической активности scFv-фрагментов GD2-специфичных антител и их пегилированных производных (мономеров, димеров и тетрамеров).In Fig. Figure 5 presents the cytotoxic activity of scFv fragments of GD2-specific antibodies and their pegylated derivatives (monomers, dimers, and tetramers).

В МТТ-тесте жизнеспособность клеток EL-4 под действием scFv-фрагментов, а также их мономерных пегилированных производных падала примерно до 75%, в то время как пегилированные димеры scFv-фрагментов снижали жизнеспособность опухолевых клеток примерно до 50%, а в случае тетрамеров scFv-фрагментов жизнеспособность клеток при максимальных концентрациях фрагментов снижалась ниже 40% (Рис. 5А). Методом проточной цитофлуориметрии в PI- и 7-AAD-тестах было также показано, что инкубация клеток с scFv-фрагментами и их пегилированными мономерами приводила к увеличению количества клеток с фрагментированной ДНК и клеток с нарушением целостности плазматической мембраны относительно интактных клеток уже через 24 часа (Рис. 5Б). Данная активность была сравнима для обоих типов белка, и количество мертвых клеток увеличивалось примерно в два раза относительно интактных клеток. В случае пегилированных димеров и тетрамеров scFv-фрагментов индукция клеточной гибели в PI- и 7AAD-тестах усиливалась значительно, и пул клеток с индуцированной клеточной гибелью увеличивался относительно контрольных клеток примерно в 4 и 7 раз, соответственно.In the MTT test, the viability of EL-4 cells under the influence of scFv fragments, as well as their monomeric pegylated derivatives decreased to about 75%, while the pegylated dimers of scFv fragments reduced the viability of tumor cells by about 50%, and in the case of scFv tetramers -fragments, cell viability at maximum fragment concentrations decreased below 40% (Fig. 5A). It was also shown by flow cytometry in PI and 7-AAD tests that incubation of cells with scFv fragments and their pegylated monomers led to an increase in the number of cells with fragmented DNA and cells with a violation of the integrity of the plasma membrane relative to intact cells after 24 hours ( Fig. 5B). This activity was comparable for both types of protein, and the number of dead cells increased approximately two times relative to intact cells. In the case of pegylated dimers and tetramers of scFv fragments, the induction of cell death in PI and 7AAD tests was significantly increased, and the pool of cells with induced cell death increased relative to control cells by about 4 and 7 times, respectively.

В случае Fab-фрагментов цитотоксическая активность немодифицированных белков была выше по сравнению с немодифицированными scFv-фрагментами. Мономеры Fab-фрагментов снижали жизнеспособность на максимальных выбранных концентрациях до 50% по сравнению с контрольными клетками, а димеризация Fab-фрагментов приводила к усилению цитотоксической активности, когда жизнеспособность падала до 30% (Рис. 6). В цитометрических тестах также было получено подтверждение того, что димеризация фрагментов приводит к увеличению функциональной активности белка. Так, исходные Fab-фрагменты и пегилированные мономеры усиливают клеточную гибель примерно в 5 раз, а димеры пегилированных Fab-фрагментов более чем в 10 раз (Рис. 6).In the case of Fab fragments, the cytotoxic activity of unmodified proteins was higher compared to unmodified scFv fragments. Monomers of Fab fragments reduced viability at the maximum selected concentrations by up to 50% compared to control cells, and dimerization of Fab fragments led to an increase in cytotoxic activity when viability dropped to 30% (Fig. 6). In cytometric tests, confirmation was also obtained that fragment dimerization leads to an increase in the functional activity of the protein. Thus, the initial Fab fragments and pegylated monomers enhance cell death by about 5 times, and dimers of pegylated Fab fragments by more than 10 times (Fig. 6).

В целом, для scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител было показано, что сайт-направленное пегилирование с сохранением мономерной формы белка не снижает цитотоксической активности фрагментов антител, в то время как пегилирование, приводящее к образованию мультимерных фрагментов антител, усиливает цитотоксические свойства модифицированных белков.In general, for scFv and Fab fragments of GD2-specific antibodies, it was shown that site-directed pegylation while maintaining the monomeric form of the protein does not reduce the cytotoxic activity of antibody fragments, while pegylation leading to the formation of multimeric antibody fragments enhances cytotoxic properties modified proteins.

Анализ времени циркуляции модифицированных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c.Analysis of the circulation time of modified antibody fragments in the blood of Balb / c mice.

Одной из основных целей пегилирования полученных рекомбинантных фрагментов GD2-специфичных антител являлось увеличение времени циркуляции в крови, которое для немодифицированных фрагментов является коротким. Для подтверждения увеличения этого фармакокинетического параметра фрагментов антител за счет их модификации путем пегилирования было проведено сравнение времени нахождения флуоресцентномеченных модифицированных и исходных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c. Для этого была проведена пришивка флуоресцентного красителя Sulfo-Cyanine5 активированного эфира (Sulfo-Cy5) к исходным и пегилированным фрагментам антител. К раствору фрагментов антител добавляли краситель в молярном избытке 10:1. После проведения реакции очистку от несвязанного красителя проводили методом гель-фильтрации, соотношение молекул белка к красителю в конъюгате составило примерно 1:1. Выбор данного флуоресцентного красителя был обусловлен длинноволновым максимумом испускания (662 нм), который позволяет избежать вклада аутофлуоресценции сыворотки крови при оценке интенсивности флуоресценции фрагментов антител в циркулирующей крови. Флуоресцентно-меченные образцы фрагментов антител (100-150 мкл) вводились мышам внутривенно в количестве 150 мкг/мышь (7,5 мг/кг). Контрольным мышам вводился PBS. Через определенные временные интервалы из хвостовой вены мышей проводили отбор крови для последующего получения сыворотки и измерения флуоресценции конъюгата, которая позволяет определить количество фрагментов антител в плазме крови. Полученные сыворотки разводили в 10 раз PBS и проводили измерение интенсивности флуоресценции на планшетном флуориметре Glomax multi detection system (Promega, США) с возбуждением при 625 нм и испусканием при 660-720 нм. На Рис. 7 показаны результаты экспериментов на примере фрагментов антител, модифицированных молекулами ПЭГ с молекулярной массой 10000 Да.One of the main goals of the pegylation of the obtained recombinant fragments of GD2-specific antibodies was to increase the circulation time in the blood, which is short for unmodified fragments. To confirm the increase in this pharmacokinetic parameter of antibody fragments due to their modification by pegylation, we compared the residence time of the fluorescently labeled modified and initial antibody fragments in the blood of Balb / c mice. For this, the fluorescent dye Sulfo-Cyanine5 activated ester (Sulfo-Cy5) was stitched to the original and pegylated antibody fragments. Dye in a molar excess of 10: 1 was added to the solution of antibody fragments. After the reaction, the unbound dye was purified by gel filtration; the ratio of protein to dye molecules in the conjugate was approximately 1: 1. The choice of this fluorescent dye was determined by the long-wavelength maximum of emission (662 nm), which avoids the contribution of autofluorescence of blood serum in assessing the intensity of fluorescence of antibody fragments in circulating blood. Fluorescence-labeled samples of antibody fragments (100-150 μl) were administered to mice intravenously in an amount of 150 μg / mouse (7.5 mg / kg). Control mice were injected with PBS. At certain time intervals, blood was taken from the tail vein of mice for subsequent serum production and measurement of conjugate fluorescence, which allows the determination of the number of antibody fragments in blood plasma. The resulting sera were diluted 10-fold with PBS and fluorescence intensity was measured on a Glomax multi detection system flatbed fluorimeter (Promega, USA) with excitation at 625 nm and emission at 660-720 nm. In Fig. 7 shows the results of experiments on the example of antibody fragments modified with PEG molecules with a molecular weight of 10,000 Da.

Пегилирование приводит к значительному увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови мышей, как в случае мономеров, так и мультимеров фрагментов антител. Немодифицированные scFv- и Fab-фрагменты выводятся быстро, уже через 30 мин после введения в циркуляции остается менее 10% и 15% от введенного образца, соответственно, через 2,5 ч после введения - только 5 и 8%, соответственно. На этих же временных интервалах в случае пегилированных образцов количество циркулирующих фрагментов антител значительно выше. Так, через 0,5 и 2,5 часа после введения пегилированных мономеров scFv-фрагментов остается более 50% и 20%, а в случае пегилированных мономеров Fab-фрагментов в крови сохраняется 58% и 26% от введенного образца. Мультимеризация приводит к значительному увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови мышей, особенно четко эта закономерность прослеживается для пегилированных тетрамеров scFv-фрагментов и пегилированных димеров Fab-фрагментов. Для данных модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител мультимеризация за счет пегилирования приводит к увеличению времени полувыведения фрагментов антител с нескольких минут до нескольких часов (Рис. 7). Так же было показано, что увеличение молекулярной массы ПЭГ и использование молекул ПЭГ разветвленной Y-образной формы (ПЭГ40 Y, https://www.jenkemusa.com/product/y-mal-40k) приводит к увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови (Рис. 8).Pegylation leads to a significant increase in the circulation time of antibody fragments in the blood of mice, both in the case of monomers and multimers of antibody fragments. Unmodified scFv and Fab fragments are rapidly excreted; within 30 minutes after administration, less than 10% and 15% of the introduced sample remains in circulation, respectively, 2.5 hours after administration, only 5 and 8%, respectively. At the same time intervals in the case of pegylated samples, the number of circulating antibody fragments is much higher. So, after 0.5 and 2.5 hours after the introduction of the pegylated monomers of scFv fragments, more than 50% and 20% remains, and in the case of pegylated monomers of Fab fragments, 58% and 26% of the injected sample remains in the blood. Multimerization leads to a significant increase in the circulation time of antibody fragments in the blood of mice; this pattern is especially clearly seen for pegylated tetramers of scFv fragments and pegylated dimers of Fab fragments. For these modified fragments of GD2-specific antibodies, multimerization due to pegylation leads to an increase in the half-life of antibody fragments from several minutes to several hours (Fig. 7). It was also shown that an increase in the molecular weight of PEG and the use of branched Y-shaped PEG molecules (PEG40 Y, https://www.jenkemusa.com/product/y-mal-40k) leads to an increase in the circulation time of antibody fragments in the blood (Fig. 8).

Из рисунка видно, что пегилирование линейными молекулами ПЭГ приводит к снижению выведения белка из циркуляции по сравнению с исходными фрагментами и находится в прямой зависимости от молекулярной массы использованных молекул ПЭГ. Пегилирование фрагментов антител молекулами ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа и разветвленной Y-образной формой приводит к значительно увеличенному времени циркуляции модифицированных фрагментов антител в крови (Рис. 8). Даже через неделю после введения более 2% от введенного образца scFv-ПЭГ40 Y находится в циркуляции.It can be seen from the figure that pegylation by linear PEG molecules leads to a decrease in protein excretion from circulation compared to the original fragments and is directly dependent on the molecular weight of the used PEG molecules. Pegylation of antibody fragments with PEG molecules with a molecular mass of 40 kDa and a branched Y-shape leads to a significantly increased circulation time of the modified antibody fragments in the blood (Fig. 8). Even a week after administration, more than 2% of the injected scFv-PEG40 Y sample is in circulation.

Оценка стабильности пегилированных фрагментов GD2-специфичных антител в сравнении с немодифицированными фрагментами.Assessment of the stability of pegylated fragments of GD2-specific antibodies in comparison with unmodified fragments.

По литературным данным пегилирование увеличивает стабильность рекомбинантных белков в растворе (Lawrence РВ, Price JL Curr Opin Chem Biol. 2016 34:88-94). Для подтверждения этих данных в контексте фрагментов GD2-специфичных антител мы провели температурный стресс-тест для исходных и модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител. В данном тесте использовались 4 варианта пегилированных scFv-фрагментов антител, различающихся молекулярной массой молекул ПЭГ (2 кДа, 10 кДа, 20 кДа и 40 кДа), а также исходные немодифицированные scFV-фрагменты. Все фрагменты в PBS в концентрации 1 мг/мл инкубировались в течение месяца при 37°С. В определенные временные точки проводили центрифугирование образцов при 15 тыс. g в течение 20 мин с целью осаждения агрегировавшего белка. После центрифугирования определялась концентрация белков в надосадочной жидкости и с аликвотой образца проводился ИФА с целью сравнения антиген-связывающих свойств фрагментов до и после стресс-теста (Таблица 2).According to published data, pegylation increases the stability of recombinant proteins in solution (Lawrence PB, Price JL Curr Opin Chem Biol. 2016 34: 88-94). To confirm these data in the context of fragments of GD2-specific antibodies, we conducted a temperature stress test for the initial and modified fragments of GD2-specific antibodies. In this test, we used 4 variants of pegylated scFv fragments of antibodies differing in the molecular weight of PEG molecules (2 kDa, 10 kDa, 20 kDa, and 40 kDa), as well as the initial unmodified scFV fragments. All fragments in PBS at a concentration of 1 mg / ml were incubated for a month at 37 ° C. At certain time points, samples were centrifuged at 15 thousand g for 20 min in order to precipitate the aggregated protein. After centrifugation, the concentration of proteins in the supernatant was determined and ELISA was performed with an aliquot of the sample in order to compare the antigen-binding properties of the fragments before and after the stress test (Table 2).

Как видно из Таблицы 2, пегилирование более высокомолекулярными молекулами приводит как к образованию меньшего количества агрегатов в растворе, так и к практически полному сохранению антиген-связывающей способности фрагментов антител. В случае исходных фрагментов антител или пегилированных молекулой ПЭГ 2 кДа наблюдается падение стабильности и антиген-связывающих свойств белка уже через неделю после начала стресс-теста.As can be seen from Table 2, pegylation with higher molecular weight molecules leads to both the formation of fewer aggregates in solution and to almost complete preservation of the antigen-binding ability of antibody fragments. In the case of initial fragments of antibodies or pegylated with a PEG 2 kDa molecule, a decrease in the stability and antigen-binding properties of the protein is observed a week after the start of the stress test.

Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be understood that various modifications are possible without departing from the gist of the present invention.

Claims

1. A multivalent construct that specifically binds a GD2 ganglioside, containing two, three or four functional antibody fragments that specifically bind a GD2 ganglioside and interconnected by covalent conjugation with a polyethylene glycol molecule.

2. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that each of the antibody fragments in the construct contains at least

(i) one variable domain of the heavy chain containing H-CDR1 with the sequence SEQ ID NO: 1, H-CDR2 with the sequence SEQ ID NO: 2, and H-CDR3 with the sequence SEQ ID NO: 3, and

(ii) one light chain variable domain comprising L-CDR1 with the sequence SEQ ID NO: 4, L-CDR2 with the sequence SEQ ID NO: 5, and L-CDR3 with the sequence SEQ ID NO: 6.

3. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains one heavy chain fragment containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 7, and one light chain fragment containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 8.

4. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains one heavy chain fragment containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 9, and one light chain fragment containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 10.

5. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 11.

6. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 12.

7. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 13.

8. The multivalent construct according to claim 1, characterized in that it contains two, three or four functional antibody fragments, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 14.

9. The multivalent construction according to claim 1, characterized in that the polyethylene glycol molecule used for conjugation has a linear structure and a molecular weight of 5 to 40 kDa.

10. The multivalent construction according to claim 1, characterized in that the polyethylene glycol molecule used for conjugation has a branched structure and a molecular weight of 5 to 40 kDa.

11. A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising a multivalent construct according to any one of claims. 1-10 in a therapeutically effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the cancer is a GD2-positive tumor or tumor, the individual cell subpopulations of which express a GD2 ganglioside.

12. A method of treating an oncological disease, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the oncological disease is a GD2-positive tumor or tumor, individual cell subpopulations of which express a GD2 ganglioside.

13. The treatment method according to claim 12, in which the GD2-positive tumor is a neuroblastoma, retinoblastoma, melanoma, small cell lung cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, glioma or Ewing sarcoma.

14. A method of destroying a cell in the body of a subject, on the surface of which is a GD2 ganglioside, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition according to claim 11.